KR102284517B1 - 인간 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법 및 생성 촉진용 배지의 제조 방법 - Google Patents

인간 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법 및 생성 촉진용 배지의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본원 발명에서 제시하는 배지에서의 줄기세포의 배양은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성이 현저하게 향상되는 효과를 가진다. 즉, 본원 발명에 따르면, 세포 또는 세포배양액으로부터 분비되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법을 통하여 상업적 및/또는 임상적으로 유용하게 활용될 수 있는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 수득하여 이를 경제적이면서도 효율적으로 생산할 수 있고, 특히 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 생산하는 종래의 방법과 비교하여 이의 대량 생산이 가능하다는 장점을 가진다.

Description

인간 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법 및 생성 촉진용 배지의 제조 방법{Method for promoting the production of exosomes and/or extracellular vesicles derived from human mesenchymal stem cells and method for producing a medium for promoting the production thereof}
본원 발명은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법 및 배양 배지 조성에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈청 대체제(Serum replacement), 소듐 피루베이트(Sodium pyruvate), 인슐린(Insulin), 트랜스페린(Transferrin) 및 소듐 셀레나이트(Sodium selenite)를 사용하는 고농도의 세포외 소포체의 생성 촉진 방법 및 촉진용 배지에 관한 것이다.
세포외 소포체(Extracelluar vesicles; EVs)는 대부분의 진핵세포(세균, 고세균 또는 진핵생물 등) 에서 생성되는 인지질 이중층 형태의 작은 소낭(Exosomes 30~100nm; Microvisicles 100~1,000nm)으로, 분비되는 기작과 그 크기에 따라 다양한 명칭(Exosomes, Microvesicles, Ectosomes, Membrane vesicles, Nanovesicles 또는 Outer membrane vesicle 등)으로 불린다. 세포외 소포체는 정상 세포에서부터 비정상 세포 등에 이르기까지 다양한 생리적 또는 병리적 상태를 반영하기에, 질병의 진단과 치료에 활용하기 용이하다.
특히, 인간 지방조직으로부터 단리된 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells; MSCs) 유래 세포외 소포체(MSC-drived extracellular vesicles)는 다른 정상 체세포로부터 유래된 경우와 비교하여 그 생성되는 양이 많아 확보하기 쉬우며, 세포표면항원 (HLA-DP, -DQ, -DR)의 발현 정도가 낮아 면역원성을 유발할 가능성이 낮고 분열하지 않기 때문에 종양발생 가능성을 배재할 수 있다(Hamid et al. Clinics 2012; 67(2): 99-106. doi: 10.6061/clinics/2020(02)03).
뿐만 아니라, 줄기세포가 분비하는 세포외 소포체(MSC-drived extracellular vesicles)는 작은 소낭의 형태이기에 자유로이 세포에서 세포로의 전달이 용이하여 줄기세포가 분비하는 다양한 물질들(대사물질, 단백질, 지질 및 핵산 등)을 이용해 주변 세포의 활성을 조절할 수 있다.
한편, 세포외 소포체를 이용한 치료현황으로는 아토피 피부염 마우스 모델을 통한 항 아토피 효과(Cho et al. Stem cell Res. Ther. 2018; 9: 187-191. doi: 9:187.10.1186/s13287-018-0939-5), 알츠하이머 병 마우스 모델을 통한 베타-아밀로이드 펩타이드 유도성 신경세포사멸의 개선효과(Lee et al. Brain Res. 2018; 1691: 87-93. doi: 10.1016/j.brainres.2018.03.034) 그리고 Huntington 모델에서는 신경 보호효과가 있는 것으로 보고된 바 있다(Lee et al. Eur. J. Neurosci. 2016; 44: 2114-2119. doi: 10.1111/ejn.13275).
상기와 같은 우수한 안정성과 효능이 있음에도 불구하고, 세포외 소포체는 인간 중간엽 줄기세포 배양액(MSC-conditioned media) 내의 세포분비물질(grown factors or/and cytokines) 중 인간 중간엽 줄기세포 유래 세포외 소포체의 절대량이 부족하기에 대량생산이 어렵다는 한계점이 존재하는 실정이다. 따라서, 줄기세포 배양액 내의 세포외 소포체를 고농도로 생산하는 세포외 소포체 생성 촉진용 배지의 개발이 요구된다.
대한민국 등록특허공보 제 10-2132457호 (2020.07.03.) 대한민국 등록특허공보 제 10-2159915호 (2020.09.19.)
본원 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 인간 인간 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진용 배지를 제공하는 데에 있다.
본원 발명의 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 연구한 결과, 소듐 피루베이트, 인슐린, 트렌스페린 및 소듐 셀레나이트를 포함하는 복합조성물이 처리된 배지에서 줄기세포를 배양할 경우, 상기 소듐 피루베이트는 탄소원, 상기 인슐린은 포도당 및 아미노산의 흡수 촉진제, 상기 트랜스페린은 철분 운반체 및 상기 소듐 셀레나이트는 항산화제로 작용하여, 상기 배양에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성이 현저하게 향상됨을 발견하였다.
본원 발명에서 제시하는 배지에서의 줄기세포의 배양은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성이 현저하게 향상되는 효과를 가진다. 즉, 본원 발명에 따르면, 세포 또는 세포배양액으로부터 분비되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법을 통하여 상업적 및/또는 임상적으로 유용하게 활용될 수 있는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 수득하여 이를 경제적이면서도 효율적으로 생산할 수 있고, 특히 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 생산하는 종래의 방법과 비교하여 이의 대량 생산이 가능하다는 장점을 가진다.
도 1은 알파-엠이엠(α-MEM)을 기반으로, 대조군 및 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate), 혈청 대체제(Serum replacement) 및 소듐 피루베이트, 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트를 포함하는 복합조성물 중에서 하나 이상 선택되는 조성물 또는 이들의 조합을 첨가한 배양 배지의 상이한 4가지 배양 조건을 도시한다.
도 2는 도 1의 배양 조건 각각에 따른 배양액 내의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성률을 CD63 발현량으로 확인한 효소 결합 면역 침강 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 분석 결과를 도시한다.
도 3은 도 1의 배양 조건 각각에 따른 배양액 내의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성률을 나노입자추적분석기(Nanoparticle tracking analysis; NTA)로 측정한 개수 결과를 도시한다.
도 4는 도 1의 배양 조건 각각에 따라 생성된 배양액 내의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 크기를 나노입자추적분석기로 측정한 결과를 도시한다.
도 5는 도 1의 배양 조건 각각에 따른 배양액 내의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성률을 CD63 및 CD9으로 확인한 유세포분석(Flow Cytometry, FCM) 결과를 도시한다.
도 6은 도 1의 배양 조건 각각에 따라 생성된 배양액 내의 입자를 PKH67로 라벨링한 후, 이미징 유세포분석기(Amnis Image Stream MK II, Luminex, USA)를 사용하여 확인한 입자, 즉 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 이미지를 도시한다.
본원 발명의 발명자들은 인간 중간엽 줄기세포, 특히 인간 지방 조직에서 분리된 중간엽 줄기세포에서 유래된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 제조에 있어 혈청 대체제 및 소듐 피루베이트, 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트를 포함하는 복합조성물이 처리된 배지의 적용이 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성이 현저히 향상됨을 발견하였다.
본원 발명의 한 실시 양태에서, 상기 혈청 대체제의 농도는 5 내지 15%, 바람직하게는 7 내지 12% 보다 바람직하게는 9 내지 11%의 범위, 가장 바람직하게는 10%일 수 있다.
본원 발명의 한 실시 양태에서, 상기 소듐 피루베이트의 농도는 500 내지 2000μM, 바람직하게는 700 내지 1600μM, 보다 바람직하게는 900 내지 1300μM의 범위, 가장 바람직하게는 1000μM일 수 있다.
본원 발명의 한 실시 양태에서, 상기 인슐린의 농도는 0.86 내지 3.44μM, 바람직하게는 0.96 내지 2.44μM, 보다 바람직하게는 1.06 내지 2.08μM의 범위, 가장 바람직하게는 1.72μM일 수 있다.
본원 발명의 한 실시 양태에서, 상기 트랜스페린의 농도는 0.03 내지 0.14μM 바람직하게는 0.04 내지 0.13μM, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.12μM의 범위, 가장 바람직하게는 0.07μM일 수 있다.
본원 발명의 한 실시 양태에서, 상기 소듐 셀레나이트의 농도는 0.01 내지 0.08μM, 바람직하게는 0.02 내지 0.07μM, 보다 바람직하게는 0.03 내지 0.06μM의 범위, 가장 바람직하게는 0.04μM일 수 있다.
이하 하기의 실시예를 통해 본원 발명을 보다 상세하게 설명하나, 이는 본원 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것이고, 본원 발명을 하기의 실시예에 한정하고자 하는 의도가 아님이 이해되어야 할 것이며, 특히 당업자가 쉽게 포함시킬 수 있는 성분의 첨가나 제조순서의 변경 및 사용장치의 변경과 같은 범위는 하기의 실시예에 자명하게 포함되는 것으로 이해되어야 할 것이다.
실시예 1: 인간 지방 유래 인간 중간엽 줄기세포의 배양
ATCC (American Type Culture Collection) 에서 구입한 인간 지방 유래 인간 중간엽 줄기세포를 페놀 레드(Phenol Red)와 콜린 클로라이드(Choline chloride)가 제외된 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mixture), 1% 페니실린 스트렙토마이신(Penicillin streptomycin), 5% 인간 혈소판 용해물(human Platelet Lysate, hPL)을 포함하는 계대배양용 배지에서 37℃ 5% CO2의 배양기 조건으로 배양하였다.
실시예 2: 복합조성물을 이용한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성량 증대
실시예 1에서 배양된 인간 지방 유래 인간 중간엽 줄기세포를 각각 P3(Passage number 3) 에서 1×106/dish의 농도로 분주하고, 2시간 이후 각각의 배양액을 제거한 후 PBS로 3회 세척하였다. 세척한 지방 유래줄기세포는 도 1에 제시된 방법과 같이 항생제 및 페놀 레드와 콜린 클로라이드가 배제된 α-MEM 배지를 기반으로, 음성 대조군 및 인간 혈소판 용해물, 혈청 대체제 및 소듐 피루베이트, 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트를 포함하는 복합조성물 중에서 하나 이상 선택되는 조성물 또는 이들의 조합을 처리한 배양 배지의 상이한 4가지 배양 조건에서 각각 24시간 동안 배양하였다.
각각의 배양액에 대해 1,500 rpm에서 5 분간 원심 분리를 수행하여 불순물을 제거한 후, 얻어진 상등액을 0.22㎛ 주사식 여과기로 여과하여 줄기세포 배양액을 수득하였다. 수득한 배양액 내의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 함량을 측정하기 위해 엑소좀 양성 마커인 CD63의 발현 수준을 효소결합면역흡착검사법(Phosphatidyl-Serine CaptureTM Exosome ELISA Kit, FUJIFILM, Japan)를 사용하여 이를 확인하였다.
도 2는 배양 배지에 추가적으로 혈청 대체제(10%) 및 소듐 피루베이트(1000μM), 인슐린(1.72μM), 트랜스페린(0.07μM) 및 소듐 셀레나이트(0.04μM)를 포함하는 복합조성물을 사용하는 배양 조건으로 처리된 그룹을 포함한, 상기 4가지 배양 조건에서 수득된 배양액 내의 세포외 소포의 생성률을 CD63으로 확인한 ELISA 결과이다.
도 2를 참조하면, 상기의 혈청 대체제(10%) 및 상기 복합조성물을 처리한 그룹에서 세포외 소포 표시인자인 CD63 발현이 음성 대조군과 비교하여 2,346% 증가됨이 확인된다. 이는 상기 복합조성물이 지방 유래줄기세포가 배출하는 세포외 소포체의 생성량 증가에 매우 효과적인 물질임을 의미한다.
실시예 3: 나노파티클 트랙킹 분석(Nanoparticle tracking analysis, NTA)
실시예 2에서 수득된 배양액 1㎖을 사용하여, Blue 488nm 레이저가 장착된 NanoSight NS300(Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 MSC-엑소좀 분석을 수행하였다. 희석된 MSC-엑소좀을 분석하기 위해 카메라 레벨을 15로 유지하고 평균 10초 길이의 비디오를 초당 25프레임의 프레임 속도로 촬영했으며, 데이터는 NTA 3.4 소프트웨어로 분석하였다.
도 3 및 도 4를 참조하면, 상기 복합조성물을 처리한 그룹에서 세포외 소포체의 개수가 음성 대조군과 비교하여 2,122% 증가됨이 확인되고, 나노입자추적분석기(NTA)로 상기의 세포외 소포체의 평균 크기를 측정한 결과 상기 복합조성물을 처리한 그룹의 세포외 소포체가 가장 작은 크기(mean: 95.3±4.3nm)의 범위로 존재함이 확인된다.
실시예 4: 형광라벨 유세포 분석(Fluoresent label flow cytometry)
실시예 2에서 수득된 각각의 배양액(100㎕)에 세포외 소포체의 세포표면 표식인자(Surface marker antibody)인 CD63 및 CD9 FACS용 항체 10㎕를 각각 첨가하여 40분 동안 암실에서 반응시켰다. 이후 PBS 200㎕를 첨가한 후, FACS(AttuneNxT, ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 세포외 소포체의 생성률을 확인하였다.
도 5를 참조하면, 상기 복합조성물을 처리한 그룹에서 CD63 및 CD9을 발현하는 입자가 전체 입자 중 각각 56.3% 그리고 37.5%를 차지하고 있음이 확인된다.
실시예 5: 형광라벨 이미지 유세포 분석(Fluorescent label Imaging flow cytometry)
실시예 2에서 수득된 각각의 배양액(100㎕)에 세포외 소포체의 세포표면 표식인자인 PKH67-FITC(Sigma, USA)용 항체 10㎕를 각각 첨가하여 40분 동안 암실에서 반응시켰다. 이후 PBS 200㎕를 첨가한 후, FACS(Amnis ImageStream Mk ll, Luminex, USA)를 이용하여 세포외 소포체의 이미지를 확인하였다.
도 6을 참조하면, 상기 복합조성물을 처리한 그룹에서 얻어진 입자가 세포외 소포체 마커인 PKH67로 라벨링됨에 따라, 상기 입자는 세포외 소포체임이 시각적으로 확인된다.

Claims (6)

  1. 인간 중간엽 줄기세포를 인간 혈소판 용해물(Human platelet lysate), 혈청 대체제(Serum replacement), 소듐 피루베이트(Sodium pyruvate), 인슐린(Insulin), 트랜스페린(Transferrin) 및 소듐 셀레나이트(Sodium selenite)를 포함하는 복합조성물로 처리된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈청 대체제의 농도는 5 내지 15%인, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 소듐 피루베이트의 농도는 500 내지 2000μM; 상기 인슐린의 농도는 0.86 내지 3.44μM; 상기 트랜스페린의 농도는 0.03 내지 0.14μM 및 상기 소듐 셀레나이트의 농도는 0.01 내지 0.08μM인, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법.
  4. 인간 혈소판 용해물, 혈청 대체제, 소듐 피루베이트, 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트로 이루어지는 복합조성물을 포함하는, 인간 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem cells; MSCs) 유래 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진용 배지의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 소듐 피루베이트의 농도는 500 내지 2000μM; 상기 인슐린의 농도는 0.86 내지 3.44μM; 상기 트랜스페린의 농도는 0.03 내지 0.14μM 및 상기 소듐 셀레나이트의 농도는 0.01 내지 0.08μM인, 생성 촉진용 배지의 제조 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 인간 중간엽 줄기세포는 인간 지방 조직에서 유래된 중간엽 줄기세포인, 생성 촉진 방법.
KR1020210005791A 2021-01-15 2021-01-15 인간 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법 및 생성 촉진용 배지의 제조 방법 KR102284517B1 (ko)

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