CN115463154A - 一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法及应用 - Google Patents
一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，涉及生物技术领域，包括以下步骤：血小板裂解液的制备；外泌体的提取；血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备；血小板裂解液和外泌体复合物的制备。本发明制备方法操作简单、成本较低且可控性强。
Description
技术领域
本发明涉及血小板裂解液和外泌体技术领域，具体涉及一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法及应用。
背景技术
血小板裂解物和外泌体都能促进细胞的增殖，促进处于休眠期的干细胞分化，从而达到修复伤口的作用，然而单一的血小板裂解物或单一的外泌体效果不佳，且保存条件较为苛刻，将血小板裂解物和外泌体制备成复合凝胶不仅可以更大程度的发挥两者对伤口修复的作用，同时解决了其保存和运输的问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
本发明提供了一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将肝素钠处理的全血加入红细胞沉降液，充分混匀后室温下自然沉降20min；
S2、准备若干个50ml离心管，每管加入18-22ml淋巴细胞分离液；
S3、将S1中上清缓缓加入到S2中，每管25ml；
S4、1750-1850rpm/min离心18-22min，将血小板层收集到新的离心管中；
S5、将S4获得的血小板层1800-2000rpm/min离心8-12min，去上清，收集沉淀合并至同一个离心管中；
S6、2500-3000rpm/min离心10分钟，去除细胞碎片；
S7、5000rpm/min离心10min进一步去除细胞碎片；
S8、0.22μm滤膜过滤除菌备用；
S9、收集脐带间充质干细胞培养用的培养基收集浓缩液为外泌体浓缩液；
S10、0.22μm过滤除菌；
S11、将S8、S10中所得血小板裂解液和外泌体浓缩液1：1混合，得到待用料，再加入添加剂，充分混匀。
优选地，所述S1中的全血按照1:1的量加入红细胞沉降液中。
所述S5收集沉淀合并至同一个离心管后还采用-80℃冻存12小时以上37℃快速复融，重复至少6次。
优选地，所述S9中采用Pellicon超滤系统收集50KD-100KD的浓缩液为外泌体浓缩液。
优选地，所述添加剂为羟乙基纤维素、PE9010。
优选地，所述羟乙基纤维素的加入量为待用料的1％。
优选地，所述PE9010的加入量为待用料的0.1％。
本发明还提供了一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法在烧烫伤的修复、糖尿病足的修复中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明外泌体的提取；血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备；血小板裂解液和外泌体复合物的制备。上述制备方法操作简单、成本较低且可控性强；S4中离心可见明显分层，最上层为血小板及血浆层，第二层为PBMC层，第三层为淋巴细胞分离液层，第四层为红细胞层，吸取血小板及血浆层时可留2-3mm；S5中去上清时可留2-3mm上清；S8和S10内毒素检测及无菌检测均为阴性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将肝素钠处理的全血加入红细胞沉降液，充分混匀后室温下自然沉降20min；
S2、准备若干个50ml离心管，每管加入18-22ml淋巴细胞分离液；
S3、将S1中上清缓缓加入到S2中，每管25ml；
S4、1750-1850rpm/min离心18-22min，将血小板层收集到新的离心管中；
S5、将S4获得的血小板层1800-2000rpm/min离心8-12min，去上清，收集沉淀合并至同一个离心管中；
S6、2500-3000rpm/min离心10分钟，去除细胞碎片；
S7、5000rpm/min离心10min进一步去除细胞碎片；
S8、0.22μm滤膜过滤除菌备用；
S9、收集脐带间充质干细胞培养用的培养基收集浓缩液为外泌体浓缩液；
S10、0.22μm过滤除菌；
S11、将S8、S10中所得血小板裂解液和外泌体浓缩液1：1混合，得到待用料，再加入添加剂，充分混匀。
本实施例的S1中的全血按照1:1的量加入红细胞沉降液中。
所述S5收集沉淀合并至同一个离心管后还采用-80℃冻存12小时以上37℃快速复融，重复至少6次。
本实施例的S9中采用Pellicon超滤系统收集50KD-100KD的浓缩液为外泌体浓缩液。
本实施例的添加剂为羟乙基纤维素、PE9010。
本实施例的羟乙基纤维素的加入量为待用料的1％。
本实施例的PE9010的加入量为待用料的0.1％。
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法在烧烫伤的修复、糖尿病足的修复中的应用。
实施例1.
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将肝素钠处理的全血加入红细胞沉降液，充分混匀后室温下自然沉降20min；
S2、准备若干个50ml离心管，每管加入18ml淋巴细胞分离液；
S3、将S1中上清缓缓加入到S2中，每管25ml；
S4、1750rpm/min离心18min，将血小板层收集到新的离心管中；
S5、将S4获得的血小板层1800rpm/min离心8min，去上清，收集沉淀合并至同一个离心管中；
S6、2500rpm/min离心10分钟，去除细胞碎片；
S7、5000rpm/min离心10min进一步去除细胞碎片；
S8、0.22μm滤膜过滤除菌备用；
S9、收集脐带间充质干细胞培养用的培养基收集浓缩液为外泌体浓缩液；
S10、0.22μm过滤除菌；
S11、将S8、S10中所得血小板裂解液和外泌体浓缩液1：1混合，得到待用料，再加入添加剂，充分混匀。
本实施例的S1中的全血按照1:1的量加入红细胞沉降液中。
所述S5收集沉淀合并至同一个离心管后还采用-80℃冻存12小时以上37℃快速复融，重复至少6次。
本实施例的S9中采用Pellicon超滤系统收集50KD-100KD的浓缩液为外泌体浓缩液。
本实施例的添加剂为羟乙基纤维素、PE9010。
本实施例的羟乙基纤维素的加入量为待用料的1％。
本实施例的PE9010的加入量为待用料的0.1％。
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法在烧烫伤的修复、糖尿病足的修复中的应用。
实施例2.
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将肝素钠处理的全血加入红细胞沉降液，充分混匀后室温下自然沉降20min；
S2、准备若干个50ml离心管，每管加入22ml淋巴细胞分离液；
S3、将S1中上清缓缓加入到S2中，每管25ml；
S4、1850rpm/min离心22min，将血小板层收集到新的离心管中；
S5、将S4获得的血小板层2000rpm/min离心12min，去上清，收集沉淀合并至同一个离心管中；
S6、3000rpm/min离心10分钟，去除细胞碎片；
S7、5000rpm/min离心10min进一步去除细胞碎片；
S8、0.22μm滤膜过滤除菌备用；
S9、收集脐带间充质干细胞培养用的培养基收集浓缩液为外泌体浓缩液；
S10、0.22μm过滤除菌；
S11、将S8、S10中所得血小板裂解液和外泌体浓缩液1：1混合，得到待用料，再加入添加剂，充分混匀。
本实施例的S1中的全血按照1:1的量加入红细胞沉降液中。
所述S5收集沉淀合并至同一个离心管后还采用-80℃冻存12小时以上37℃快速复融，重复至少6次。
本实施例的S9中采用Pellicon超滤系统收集50KD-100KD的浓缩液为外泌体浓缩液。
本实施例的添加剂为羟乙基纤维素、PE9010。
本实施例的羟乙基纤维素的加入量为待用料的1％。
本实施例的PE9010的加入量为待用料的0.1％。
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法在烧烫伤的修复、糖尿病足的修复中的应用。
实施例3.
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将肝素钠处理的全血加入红细胞沉降液，充分混匀后室温下自然沉降20min；
S2、准备若干个50ml离心管，每管加入20ml淋巴细胞分离液；
S3、将S1中上清缓缓加入到S2中，每管25ml；
S4、1800rpm/min离心20min，将血小板层收集到新的离心管中；
S5、将S4获得的血小板层1900rpm/min离心10min，去上清，收集沉淀合并至同一个离心管中；
S6、2800rpm/min离心10分钟，去除细胞碎片；
S7、5000rpm/min离心10min进一步去除细胞碎片；
S8、0.22μm滤膜过滤除菌备用；
S9、收集脐带间充质干细胞培养用的培养基收集浓缩液为外泌体浓缩液；
S10、0.22μm过滤除菌；
S11、将S8、S10中所得血小板裂解液和外泌体浓缩液1：1混合，得到待用料，再加入添加剂，充分混匀。
本实施例的S1中的全血按照1:1的量加入红细胞沉降液中。
所述S5收集沉淀合并至同一个离心管后还采用-80℃冻存12小时以上37℃快速复融，重复至少6次。
本实施例的S9中采用Pellicon超滤系统收集50KD-100KD的浓缩液为外泌体浓缩液。
本实施例的添加剂为羟乙基纤维素、PE9010。
本实施例的羟乙基纤维素的加入量为待用料的1％。
本实施例的PE9010的加入量为待用料的0.1％。
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法在烧烫伤的修复、糖尿病足的修复中的应用。
实施例4.
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将肝素钠处理的全血加入红细胞沉降液，充分混匀后室温下自然沉降20min；
S2、准备若干个50ml离心管，每管加入19ml淋巴细胞分离液；
S3、将S1中上清缓缓加入到S2中，每管25ml；
S4、1780rpm/min离心19min，将血小板层收集到新的离心管中；
S5、将S4获得的血小板层1850rpm/min离心9min，去上清，收集沉淀合并至同一个离心管中；
S6、2600rpm/min离心10分钟，去除细胞碎片；
S7、5000rpm/min离心10min进一步去除细胞碎片；
S8、0.22μm滤膜过滤除菌备用；
S9、收集脐带间充质干细胞培养用的培养基收集浓缩液为外泌体浓缩液；
S10、0.22μm过滤除菌；
S11、将S8、S10中所得血小板裂解液和外泌体浓缩液1：1混合，得到待用料，再加入添加剂，充分混匀。
本实施例的S1中的全血按照1:1的量加入红细胞沉降液中。
所述S5收集沉淀合并至同一个离心管后还采用-80℃冻存12小时以上37℃快速复融，重复至少6次。
本实施例的S9中采用Pellicon超滤系统收集50KD-100KD的浓缩液为外泌体浓缩液。
本实施例的添加剂为羟乙基纤维素、PE9010。
本实施例的羟乙基纤维素的加入量为待用料的1％。
本实施例的PE9010的加入量为待用料的0.1％。
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法在烧烫伤的修复、糖尿病足的修复中的应用。
实施例5.
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将肝素钠处理的全血加入红细胞沉降液，充分混匀后室温下自然沉降20min；
S2、准备若干个50ml离心管，每管加入21ml淋巴细胞分离液；
S3、将S1中上清缓缓加入到S2中，每管25ml；
S4、1820rpm/min离心21min，将血小板层收集到新的离心管中；
S5、将S4获得的血小板层1950rpm/min离心11min，去上清，收集沉淀合并至同一个离心管中；
S6、2850rpm/min离心10分钟，去除细胞碎片；
S7、5000rpm/min离心10min进一步去除细胞碎片；
S8、0.22μm滤膜过滤除菌备用；
S9、收集脐带间充质干细胞培养用的培养基收集浓缩液为外泌体浓缩液；
S10、0.22μm过滤除菌；
S11、将S8、S10中所得血小板裂解液和外泌体浓缩液1：1混合，得到待用料，再加入添加剂，充分混匀。
本实施例的S1中的全血按照1:1的量加入红细胞沉降液中。
所述S5收集沉淀合并至同一个离心管后还采用-80℃冻存12小时以上37℃快速复融，重复至少6次。
本实施例的S9中采用Pellicon超滤系统收集50KD-100KD的浓缩液为外泌体浓缩液。
本实施例的添加剂为羟乙基纤维素、PE9010。
本实施例的羟乙基纤维素的加入量为待用料的1％。
本实施例的PE9010的加入量为待用料的0.1％。
本实施例的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法在烧烫伤的修复、糖尿病足的修复中的应用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (8)
1.一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将肝素钠处理的全血加入红细胞沉降液，充分混匀后室温下自然沉降20min；
S2、准备若干个50ml离心管，每管加入18-22ml淋巴细胞分离液；
S3、将S1中上清缓缓加入到S2中，每管25ml；
S4、1750-1850rpm/min离心18-22min，将血小板层收集到新的离心管中；
S5、将S4获得的血小板层1800-2000rpm/min离心8-12min，去上清，收集沉淀合并至同一个离心管中；
S6、2500-3000rpm/min离心10分钟，去除细胞碎片；
S7、5000rpm/min离心10min进一步去除细胞碎片；
S8、0.22μm滤膜过滤除菌备用；
S9、收集脐带间充质干细胞培养用的培养基收集浓缩液为外泌体浓缩液；
S10、0.22μm过滤除菌；
S11、将S8、S10中所得血小板裂解液和外泌体浓缩液1：1混合，得到待用料，再加入添加剂，充分混匀。
2.根据权利要求1所述的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述S1中的全血按照1:1的量加入红细胞沉降液中。
3.根据权利要求1所述的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述S5收集沉淀合并至同一个离心管后还采用-80℃冻存12小时以上37℃快速复融，重复至少6次。
4.根据权利要求1所述的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述S9中采用Pellicon超滤系统收集50KD-100KD的浓缩液为外泌体浓缩液。
5.根据权利要求1所述的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述添加剂为羟乙基纤维素、PE9010。
6.根据权利要求5所述的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述羟乙基纤维素的加入量为待用料的1％。
7.根据权利要求5所述的一种血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述PE9010的加入量为待用料的0.1％。
8.一种如权利要求1-7任一项所述血小板裂解液和外泌体复合凝胶的制备方法在烧烫伤的修复、糖尿病足的修复中的应用。
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