CN107412118A - 从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法。具体地说，从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法，其包括以下步骤：(1)血小板富集；(2)血小板裂解物制备，根据血小板浓度将步骤(1)富集的血小板样本稀释；化学裂解：按照沉淀体积：激活剂＝1：5‑10进行血小板激活；室温静止，进行离心，分别收集上清液和沉淀，上清液至4摄氏度冰箱保存；物理裂解：将上一步骤收集的沉淀进行37摄氏度/‑80摄氏度反复冻融三次裂解，得裂解物；将上面步骤收集的上清液和裂解后产物充分混匀得裂解物；(3)血小板源性活性因子冻干与保存。还涉及一种冻干粉。本发明方法具有如本发明说明书所述有益效果。

Description

从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法，特别是涉及从来源于自体的胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法。本发明制得的活性因子可以搭配溶媒，直接用于美容护肤方面，包括美容、祛斑、修复疤痕等，或者添加到各种制剂的美容护肤产品中。这些制剂产品可以包括针剂、面霜、乳液、水液、或常见的各种制剂。本发明制得的活性因子还可以直接涂抹受损皮肤表面或微针注射，用于创伤愈合。

背景技术

近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。

干细胞在美容中的应用，最早是干细胞在整形外科中的运用，它是目前研究较多的一种干细胞美容技术。而在整形外科中应用得较多的干细胞种类主要亦是人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞等。

传统上所谓的干细胞美容术，一般都是直接注射干细胞针剂。而这种注射用干细胞的来源主要是从流产的胚胎中提取的，所以难免会引起免疫排斥反应，而且存在一定的论理问题。即使是采用自体干细胞，如人脂肪间充质干细胞，但是在干细胞的培养扩增过程中亦难免会引入外源性的蛋白(胎牛血清)，容易引起免疫排斥反应。所以，科学家们最近提出一种新干细胞应用方法，细胞培养上清活性因子及细胞裂解液的应用。

将细胞因子添加到美容化妆品，不仅具有一般化妆品的保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色等，越来越受到人们的关注。

含细胞因子的化妆品现已在多个国家上市，尤其是在以美容整形行业最为发达的韩国，细胞因子化妆品尤为甚行。我国亦有多家规模较大的干细胞公司开发出了细胞因子化妆品。但市面上的细胞因子化妆品一般采用干细胞培养上清液直接掺入或经冻干后掺入化妆品基质的方式制造，细胞因子含量较低，且含有大量糖分等其它杂质，使用这些化妆品后反而会造成皮肤干燥等不适感。

研究表明细胞培养上清液含有各种具有生物活性的细胞因子，它的应用可以避免干细胞美容时的产生的免疫排斥反应。但是，液态的培养上清在常温保存时间短，这就阻碍了它的推广和应用。

另外，针对目前的干细胞分选技术，比较常见是的磁珠分选，但常规的分选中，磁珠会随同干细胞一同进行后续的培养，即磁珠并没有从干细胞上脱离下来，这样对于干细胞的后期生产，必定会产生一定的影响，虽然有一些方法，如加入一些菌或者其他物质进行降解，但这样也相当于加入了其他的外源蛋白质等成分，造成对干细胞的二次污染，所以实际上并没有解决上述问题。

目前也有一些对干细胞培养上清液进行提取纯化的报道，但效果依然不佳，例如公告号为CN102600057B的专利公开了一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，对得到的细胞培养液采用单一的3000D滤膜进行超滤截留，其去掉了部分杂质，但是糖类等杂质仍未除掉，并且还导致细胞因子大量损失，修复效果不佳，而且同样也会造成皮肤干燥等不适感，实际应用价值较低。

本领域仍然期待有新的方法获得细胞活性因子，例如期待有新的方法从胎盘中富集血小板和提取活性因子。

发明内容

本发明目的在于提供一种以有效的性能来从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法。已经出人意料的发现，使用本发明方法可以实现本发明一个或多个方面的有益效果并制取活性因子。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法，其包括以下步骤：

(1)血小板富集

11)将胎盘放入无菌托盘中，弃除血污块；

12)用无菌的剪刀将胎盘剪碎，并用0.9％氯化钠生理盐水进行组织表面和内部冲洗，挤压收集胎盘血后，弃除组织；

13)将上一步骤收集的胎盘血经无菌的300目滤网过滤，混匀后取样进行血常规检测；

14)将上一步骤经过滤的胎盘血收集至250ml离心瓶中，500-2000g，10-15min离心，收集上清；

15)将上一步骤收集的上清转移至新的50ml离心管中，2400-5000g，10-20min离心后，收集沉淀，弃上清；

16)将上一步骤收集的沉淀进行重悬，得到血小板样本，取样进行血常规检测(主要用于富集后血小板含量检测，一般富集后血小板浓度是富集前的15-80倍，即富集系数为15-80倍，示例性的结果见表1)；

(2)血小板裂解物制备

21)根据血小板浓度将步骤(1)富集的血小板样本稀释2-20倍；

22)化学裂解：按照沉淀体积：激活剂(例如，其中含有氯化钙、葡萄糖酸钙或凝血酶)＝1：5-10进行血小板激活；

23)室温静止0.5-1小时后(例如间隔20min进行混合一次)，进行3000-5000g离心，5-10min，分别收集上清液和沉淀，上清液至4摄氏度冰箱保存；

24)物理裂解：将上一步骤收集的沉淀进行37摄氏度/-80摄氏度反复冻融三次裂解，间隔10min-15min/次，得裂解物；

25)将上面步骤收集的上清液和裂解后产物充分混匀得裂解物；

(3)血小板源性活性因子冻干与保存

以-80摄氏度冰箱直接冻存，或者制成冻干粉；

制成冻干粉时在裂解物溶液中添加重量/体积百分数为0.5％-6％的冻干保护剂，或者不添加冻干保护剂(示例性的，冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、壳聚糖或其组合)，分装至1-2.5ml/支，冷冻干燥成干粉剂。

根据本发明第一方面的方法，其中在对活性因子进行冻干时，依次进行两步干燥：冷冻干燥、解析干燥。

根据本发明第一方面的方法，其中在对活性因子进行冻干时，冻干机使用程序：

预冷冻：3.5h(冻干机程序里有预冷冻温度，无需自己设定，预冷冻无需开启真空泵)——>

冷冻干燥a：-40度2h，(真空泵会在程序下自动开启，真空度值为0.014mbar)——>

冷冻干燥b：-22度12h(主要的干燥步骤)——>0度2h(作为冷冻干燥到解析干燥的过渡)

解析干燥：35度2-5h。

根据本发明第一方面的方法，其中胎盘储存样本的采集包括如下步骤：

在手术室无菌环境下，胎盘储存盒取出打开，取出无菌采集袋；

新生儿娩出后，在距新生儿脐部10cm处用两把止血钳夹住脐带；

从两钳间剪断脐带，结扎，消毒；

胎盘放入无菌采集袋中，加入胎盘保护液；

无菌采集袋封口，放入胎盘储存盒内密封；

运输温度控制在2-24摄氏度，运输时间控制在24小时内。

根据本发明第一方面的方法，其中在步骤22)的化学裂解中，所用的激活剂为1％葡萄糖酸钙，例如该激活剂中还添加有0.02％纤维蛋白原。已经出人意料的发现，向激活剂中补加微量的纤维蛋白原时，对于获得具有高PDGF-BB浓度的产物是极其有益的；例如在本发明实施例1中，使用含有0.02％纤维蛋白原的1％葡萄糖酸钙作为激活剂时，在表2测定的因子含量中，三个样本的PDGF-BB浓度均达590pg/ml以上；但是，如果参照该实施例1，不同的仅是在该激活剂中不添加纤维蛋白原时，PDGF-BB浓度仅有表2数值的约43～55％，显著低于表2数值。另外当使用其它氯化钙或凝血酶作为激活剂时，不论添加纤维蛋白原与否，PDGF-BB浓度仅有表2数值的约27～51％。这表明，在裂解时使用1％葡萄糖酸钙+0.02％纤维蛋白原是极其有益的。

根据本发明第一方面的方法，其中在制备冻干粉时，在裂解物溶液中添加重量/体积百分数为2.5％的海藻糖，例如其中还添加有葡聚糖，例如海藻糖与葡聚糖的重量比为1：0.05。已经出人意料的发现，向以海藻糖为冻干保护剂的冻干粉中添加微量葡聚糖对于所得冻干粉中HGF因子的稳定性是非常有益的。即，本发明实施例1所得冻干粉在室温下放置3月后，对于同一冻干粉，其在3月时其中HGF含量相对于0月时的相对含量为96.3～98.1％；但是当未添加此葡聚糖时，同法测定的3月相对于0月的相对含量为84.3～87.1％，表明添加葡聚糖后冻干粉中的HGF的稳定性显著提高。已经发现，不论是否添加葡聚糖，冻干粉中的EGF、PDGF-BB、和FGF三者稳定性未见显著差异。在另外的补充试验中，当将海藻糖用甘露醇或壳聚糖代替时，不论是否与葡聚糖组合所得冻干粉在经室温3月处置后，各冻干粉在3月时其中HGF含量相对于0月时的相对含量为76.5～85.7％。而EGF、PDGF-BB、和FGF三者稳定性与使用海藻糖时的基本相同。

根据本发明第一方面的方法，其中所述活性因子选自：EGF、PDGF-BB、FGF、HGF及其组合。

进一步的，本发明第二方面提供了一种包含活性因子的冻干粉，所述活性因子是通过从胎盘中富集血小板并提取获得的。

根据本发明第二方面的冻干粉，其中所述活性因子选自：EGF、PDGF-BB、FGF、HGF及其组合。

根据本发明第二方面的冻干粉，其中包含活性因子以及冻干保护剂。

根据本发明第二方面的冻干粉，其中包含活性因子以及冻干保护剂，所述冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、壳聚糖或其组合。在一个实施方案中，所述冻干保护剂选自海藻糖，例如其中还包含葡聚糖，例如海藻糖与葡聚糖的重量比为1：0.05。

根据本发明第二方面的冻干粉，其中从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法包括以下步骤：

(1)血小板富集

11)将胎盘放入无菌托盘中，弃除血污块；

12)用无菌的剪刀将胎盘剪碎，并用0.9％氯化钠生理盐水进行组织表面和内部冲洗，挤压收集胎盘血后，弃除组织；

13)将上一步骤收集的胎盘血经无菌的300目滤网过滤，混匀后取样进行血常规检测；

14)将上一步骤经过滤的胎盘血收集至250ml离心瓶中，500-2000g，10-15min离心，收集上清；

15)将上一步骤收集的上清转移至新的50ml离心管中，2400-5000g，10-20min离心后，收集沉淀，弃上清；

16)将上一步骤收集的沉淀进行重悬，得到血小板样本，取样进行血常规检测(主要用于富集后血小板含量检测，一般富集后血小板浓度是富集前的15-80倍，即富集系数为15-80倍，示例性的结果见表1)；

(2)血小板裂解物制备

21)根据血小板浓度将步骤(1)富集的血小板样本稀释2-20倍；

22)化学裂解：按照沉淀体积：激活剂(例如，其中含有氯化钙、葡萄糖酸钙或凝血酶)＝1：5-10进行血小板激活；

23)室温静止0.5-1小时后(例如间隔20min进行混合一次)，进行3000-5000g离心，5-10min，分别收集上清液和沉淀，上清液至4摄氏度冰箱保存；

24)物理裂解：将上一步骤收集的沉淀进行37摄氏度/-80摄氏度反复冻融三次裂解，间隔10min-15min/次，得裂解物；

25)将上面步骤收集的上清液和裂解后产物充分混匀得裂解物；

(3)血小板源性活性因子冻干与保存

以-80摄氏度冰箱直接冻存，或者制成冻干粉；

制成冻干粉时在裂解物溶液中添加重量/体积百分数为0.5％-6％的冻干保护剂，或者不添加冻干保护剂(示例性的，冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、壳聚糖或其组合)，分装至1-2.5ml/支，冷冻干燥成干粉剂。

根据本发明第二方面的冻干粉，其中在对活性因子进行冻干时，依次进行两步干燥：冷冻干燥、解析干燥。

根据本发明第二方面的冻干粉，其中在对活性因子进行冻干时，冻干机使用程序：

预冷冻：3.5h(冻干机程序里有预冷冻温度，无需自己设定，预冷冻无需开启真空泵)——>

冷冻干燥a：-40度2h，(真空泵会在程序下自动开启，真空度值为0.014mbar)——>

冷冻干燥b：-22度12h(主要的干燥步骤)——>0度2h(作为冷冻干燥到解析干燥的过渡)

解析干燥：35度2-5h。

根据本发明第二方面的冻干粉，其中胎盘储存样本的采集包括如下步骤：

在手术室无菌环境下，胎盘储存盒取出打开，取出无菌采集袋；

新生儿娩出后，在距新生儿脐部10cm处用两把止血钳夹住脐带；

从两钳间剪断脐带，结扎，消毒；

胎盘放入无菌采集袋中，加入胎盘保护液；

无菌采集袋封口，放入胎盘储存盒内密封；

运输温度控制在2-24摄氏度，运输时间控制在24小时内。

根据本发明第二方面的冻干粉，其中在步骤22)的化学裂解中，所用的激活剂为1％葡萄糖酸钙，例如该激活剂中还添加有0.02％纤维蛋白原。

根据本发明第二方面的冻干粉，其中在制备冻干粉时，在裂解物溶液中添加重量/体积百分数为2.5％的海藻糖，例如其中还添加有葡聚糖，例如海藻糖与葡聚糖的重量比为1：0.05。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

通过本发明从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法，所得活性因子用途是非常广泛的，例如所得活性因子搭配溶媒(溶媒可以是超纯水或透明质酸溶液或化妆水等)，可直接用于美容护肤方面，包括美容、祛斑、修复疤痕等。或者所得活性因子添加到各种制剂的美容护肤产品中。所得产品包括针剂、面霜、乳液、水液、或常见的各种制剂。这些制剂可以直接涂抹受损皮肤表面或微针注射，用于创伤愈合。

本发明方法中，胎盘内血小板含量高，其来源于自体，不存在免疫排斥等反应。胎盘可以进行回收再利用，“变废为宝”。冻干粉制剂便于长途运输和长期保存。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

实施例1：从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法

一、志愿者筛选

确认产妇产前诊断时无HTLV，梅毒，艾滋，丙肝，乙肝等传染性疾病。确认采集前《健康调查问卷》中无遗传性或其它重大疾病，过敏性疾病等。

二、样本的采集

在手术室无菌环境下，胎盘储存盒取出打开，取出无菌采集袋；

新生儿娩出后，在距新生儿脐部10cm处用两把止血钳夹住脐带；

从两钳间剪断脐带，结扎，消毒；

胎盘放入无菌采集袋中，加入胎盘保护液；

无菌采集袋封口，放入胎盘储存盒内密封；

运输温度控制在2-24摄氏度，运输时间控制在24小时内。

三、方法

1、血小板富集

1)将胎盘放入无菌托盘中，弃除血污块。

2)用无菌的剪刀将胎盘剪碎，并用0.9％氯化钠生理盐水进行组织表面和内部冲洗，挤压收集胎盘血后，弃除组织。

3)将步骤1-2)收集的胎盘血经无菌的300目滤网过滤，混匀后取样进行血常规检测。

4)将步骤1-3)经过滤的胎盘血收集至250ml离心瓶中，500-2000g，10-15min离心，收集上清[本实施例试验中的离心条件是1000g、15min]。

5)将步骤1-4)收集的上清转移至新的50ml离心管中，2400-5000g，10-20min离心后，收集沉淀，弃上清[本实施例试验中的离心条件是3000g、15min]。

6)将步骤1-5)收集的沉淀进行重悬，取样进行血常规检测(主要用于富集后血小板含量检测，一般富集后血小板浓度是富集前的15-80倍，即富集系数为15-80倍)，见表1。

表1.富集系数

样本	富集前浓度(*106)	富集后浓度(*106)	富集系数
				1	126	9976	79.17
2	303	7098	23.42
				3	214	3947	18.44
4	396	6767	17.09

2、血小板裂解物制备

1)根据血小板浓度将步骤1-6)富集的血小板样本稀释2-20倍[本实施例中稀释10倍]。

2)化学裂解：按照沉淀体积：激活剂(例如，1％氯化钙、1％葡萄糖酸钙或1％凝血酶；本实施例用的激活剂为1％葡萄糖酸钙，并且该激活剂中还添加有0.02％纤维蛋白原)＝1：5-10进行血小板激活。

3)室温静止0.5-1小时后(间隔20min进行混合一次)，进行3000-5000g离心，5-10min，分别收集上清液和沉淀，上清液至4摄氏度冰箱保存[本实施例试验中的离心条件是4000g、8min]。

4)物理裂解：将步骤2-3)收集的沉淀进行37摄氏度/-80摄氏度反复冻融三次裂解，间隔10min-15min/次。

5)将步骤2-3)收集的上清液和步骤2-4)收集的裂解后产物充分混匀，得裂解物。

3、血小板源性活性因子冻干与保存

将一半的裂解物以-80摄氏度冰箱直接冻存。

其余的裂解物制成冻干粉；制成冻干粉需要在裂解物溶液中添加重量/体积百分数为2.5％的冻干保护剂(本实施例使用的冻干保护剂为海藻糖，并且其中还添加有葡聚糖，海藻糖与葡聚糖的重量比为1：0.05)，分装至2ml/支，按照冻干程序(过程分为两步，第一步为冷冻干燥，第二步为解析干燥)。

1)冻干机使用程序：

预冷冻：3.5h(冻干机程序里有预冷冻温度，无需自己设定，预冷冻无需开启真空泵)——>

冷冻干燥a：-40度2h，(真空泵会在程序下自动开启，真空度值为0.014mbar)——>

冷冻干燥b：-22度12h(主要的干燥步骤)——>0度2h(作为冷冻干燥到解析干燥的过渡)

解析干燥：35度2-5h

2)进行冻干处理，制成冻干粉。

冻干粉呈疏松的多孔组织。该冻干粉在室温下可以长期保存。

4、血小板源性因子含量检测

取冻干粉9支分别用2ml溶媒(超纯水)稀释，采用R&D公司的重组人员抗体包被的酶联免疫试剂盒分析干细胞活性因子的含量(见表2)。

表2.因子含量

本发明所得活性因子的用途例如但不限于：搭配溶媒(溶媒可以是超纯水或透明质酸溶液或化妆水等)，可直接用于美容护肤方面，包括美容、祛斑、修复疤痕等；或添加到各种制剂的美容护肤产品中；所得产品包括针剂、面霜、乳液、水液、或常见的各种制剂；可以直接涂抹受损皮肤表面或微针注射，用于创伤愈合。

本发明从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法，其中胎盘内血小板含量高，其来源于自体，不存在免疫排斥等反应。胎盘可以进行回收再利用，“变废为宝”。冻干粉制剂便于长途运输和长期保存。

Claims (10)

1.从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法，其包括以下步骤：

(1)血小板富集

11)将胎盘放入无菌托盘中，弃除血污块；

12)用无菌的剪刀将胎盘剪碎，并用0.9％氯化钠生理盐水进行组织表面和内部冲洗，挤压收集胎盘血后，弃除组织；

13)将上一步骤收集的胎盘血经无菌的300目滤网过滤，混匀后取样进行血常规检测；

14)将上一步骤经过滤的胎盘血收集至250ml离心瓶中，500-2000g，10-15min离心，收集上清；

15)将上一步骤收集的上清转移至新的50ml离心管中，2400-5000g，10-20min离心后，收集沉淀，弃上清；

16)将上一步骤收集的沉淀进行重悬，得到血小板样本，取样进行血常规检测(主要用于富集后血小板含量检测，一般富集后血小板浓度是富集前的15-80倍，即富集系数为15-80倍，示例性的结果见表1)；

(2)血小板裂解物制备

21)根据血小板浓度将步骤(1)富集的血小板样本稀释2-20倍；

22)化学裂解：按照沉淀体积：激活剂(例如，其中含有氯化钙、葡萄糖酸钙或凝血酶)＝1：5-10进行血小板激活；

23)室温静止0.5-1小时后(例如间隔20min进行混合一次)，进行3000-5000g离心，5-10min，分别收集上清液和沉淀，上清液至4摄氏度冰箱保存；

24)物理裂解：将上一步骤收集的沉淀进行37摄氏度/-80摄氏度反复冻融三次裂解，间隔10min-15min/次，得裂解物；

25)将上面步骤收集的上清液和裂解后产物充分混匀得裂解物；

(3)血小板源性活性因子冻干与保存

以-80摄氏度冰箱直接冻存，或者制成冻干粉；

制成冻干粉时在裂解物溶液中添加重量/体积百分数为0.5％-6％的冻干保护剂，或者不添加冻干保护剂(示例性的，冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、壳聚糖或其组合)，分装至1-2.5ml/支，冷冻干燥成干粉剂。

2.根据权利要求1的方法，其中在对活性因子进行冻干时，依次进行两步干燥：冷冻干燥、解析干燥。

3.根据权利要求1的方法，其中在对活性因子进行冻干时，冻干机使用程序：

预冷冻：3.5h(冻干机程序里有预冷冻温度，无需自己设定，预冷冻无需开启真空泵)——>

冷冻干燥a：-40度2h，(真空泵会在程序下自动开启，真空度值为0.014mbar)——>

冷冻干燥b：-22度12h(主要的干燥步骤)——>0度2h(作为冷冻干燥到解析干燥的过渡)

解析干燥：35度2-5h。

4.根据权利要求1的方法，其中胎盘储存样本的采集包括如下步骤：

在手术室无菌环境下，胎盘储存盒取出打开，取出无菌采集袋；

新生儿娩出后，在距新生儿脐部10cm处用两把止血钳夹住脐带；

从两钳间剪断脐带，结扎，消毒；

胎盘放入无菌采集袋中，加入胎盘保护液；

无菌采集袋封口，放入胎盘储存盒内密封；

运输温度控制在2-24摄氏度，运输时间控制在24小时内。

5.根据权利要求1的方法，其中在步骤22)的化学裂解中，所用的激活剂为1％葡萄糖酸钙。

6.根据权利要求1的方法，其中在制备冻干粉时，在裂解物溶液中添加重量/体积百分数为2.5％的海藻糖。

7.根据权利要求1的方法，其中所述活性因子选自：EGF、PDGF-BB、FGF、HGF及其组合。

8.包含活性因子的冻干粉，所述活性因子是通过从胎盘中富集血小板并提取获得的。

9.根据权利要求8的冻干粉，其中：

所述活性因子选自：EGF、PDGF-BB、FGF、HGF及其组合；

其中包含活性因子以及冻干保护剂；和/或

其中包含活性因子以及冻干保护剂，所述冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、壳聚糖或其组合。

10.根据权利要求8的冻干粉，根据本发明第二方面的冻干粉，其中从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法包括以下步骤：

(1)血小板富集

11)将胎盘放入无菌托盘中，弃除血污块；

12)用无菌的剪刀将胎盘剪碎，并用0.9％氯化钠生理盐水进行组织表面和内部冲洗，挤压收集胎盘血后，弃除组织；

13)将上一步骤收集的胎盘血经无菌的300目滤网过滤，混匀后取样进行血常规检测；

14)将上一步骤经过滤的胎盘血收集至250ml离心瓶中，500-2000g，10-15min离心，收集上清；

15)将上一步骤收集的上清转移至新的50ml离心管中，2400-5000g，10-20min离心后，收集沉淀，弃上清；

16)将上一步骤收集的沉淀进行重悬，得到血小板样本，取样进行血常规检测(主要用于富集后血小板含量检测，一般富集后血小板浓度是富集前的15-80倍，即富集系数为15-80倍，示例性的结果见表1)；

(2)血小板裂解物制备

21)根据血小板浓度将步骤(1)富集的血小板样本稀释2-20倍；

22)化学裂解：按照沉淀体积：激活剂(例如，其中含有氯化钙、葡萄糖酸钙或凝血酶)＝1：5-10进行血小板激活；

23)室温静止0.5-1小时后(例如间隔20min进行混合一次)，进行3000-5000g离心，5-10min，分别收集上清液和沉淀，上清液至4摄氏度冰箱保存；

24)物理裂解：将上一步骤收集的沉淀进行37摄氏度/-80摄氏度反复冻融三次裂解，间隔10min-15min/次，得裂解物；

25)将上面步骤收集的上清液和裂解后产物充分混匀得裂解物；

(3)血小板源性活性因子冻干与保存

以-80摄氏度冰箱直接冻存，或者制成冻干粉；

制成冻干粉时在裂解物溶液中添加重量/体积百分数为0.5％-6％的冻干保护剂，或者不添加冻干保护剂(示例性的，冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、壳聚糖或其组合)，分装至1-2.5ml/支，冷冻干燥成干粉剂。