CN104673747B - 一种血小板裂解液的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种血小板裂解液的制备方法及其应用。该制备方法包括：将血小板在20～24℃振荡保存1～5d，采用反复冻融法和超声法进行处理，离心、收集上清液，去除纤维蛋白，获得血小板裂解液。本发明提供的血小板裂解液的制备方法可明显提高血小板裂解液中细胞因子含量，且可进行细胞因子的定量平衡，有利于减少产品批间的差异，可达到稳定的促进人源性细胞生长的作用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种血小板裂解液的制备方法及其应用。
背景技术
间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是成体干细胞的一种，具有干细胞的共性和很强的自我增殖能力。MSCs具有良好的多向分化潜能，可用于特定组织器官的损伤修复；能够参与构成支持造血的微环境，促进造血恢复，与造血干细胞共同移植能够降低GVHD的发生率；具有免疫调节和易化移植的作用，免疫原性低，输注人体安全可靠；因此MSCs在临床的应用研究越来越受到关注。骨髓、脐带血中MSCs含量极少，大约每104～105单个核细胞中含有1个MSC。人体细胞治疗所需的细胞数量为1×106/kg，一个50kg的成人所需输注的细胞量为5×107。因此，MSCs在运用于临床之前，需在体外进行扩增。目前MSCs的体外培养扩增体系主要是基础培养基添加一定浓度的胎牛血清，但有导致朊病毒或者某些未知动物传染病传播风险，及培养过程中动物源蛋白或肽对间充质干细胞免疫排斥的可能，甚至输注后亦无明显疗效；有研究表明，MSC在培养过程中可吞噬培养基中的蛋白，内含牛血清蛋白，可使受者体内产生抗牛蛋白抗体，引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注干细胞治疗后治疗失效；且市售部分胎牛血清含有病毒，因此如何保障细胞培养的安全性尤为关键。
目前对人源细胞的体外培养体系进行了很多研究，培养基添加物，包括成人血清、血小板衍生物、血小板裂解液、凝血酶激活血小板释放因子、脐血清等，已成为新的热点。为了减少异种蛋白的污染，也可采用添加各种营养成分组成的完全的通用型的无血清培养基，适用于培养贴壁和悬浮哺乳动物细胞；支持杂交瘤形成时的细胞融合，支持单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞和成纤维细胞系的细胞生长。这些无血清培养基(Serum Free Medium，SFM)都可在cGMPs洁净车间里生产，可以消除来自血清的不均一性，因而质量稳定；但有其缺陷，配制无血清培养液必须使用高质量的水，在无血清培养基中通常要加入激素和生长因子，有化学限定性，价格昂贵；细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便，针对性强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。而对于血清添加物，有采用胎牛血清等，成分不明确；保存期短(至多一年)，不能排除血清中含有易变物质；使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)，血清含一些对细胞产生毒性的物质，影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；还可能带入支原体、病毒等污染，对细胞产生潜在影响，可能导致疾病传染等；而且血清制作批间差异大，成分不能保持一致，生产标准化困难，质量不稳定，价格昂贵，使用不方便。因此，研制替代培养用血清的替代品具有重要的意义。
血小板来源于人类，输注人体内不会引起异种蛋白的免疫，且能够释放多种生长因子，在组织修复以及细胞生长等方面起着重要的作用，越来越多的研究者关注人血小板裂解产物用于细胞培养的安全性和有效性。血小板含有三种主要的颗粒：α颗粒、致密颗粒和溶酶颗粒，具有黏附、聚集及释放等多种生物功能。α颗粒是血小板内最大和最多的分泌型颗粒，含有血管和组织形成过程中的重要生长因子。血小板在活化时会释放各种血小板源性细胞因子，包括血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF–β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)，这些生长因子可以刺激成纤维细胞、平滑肌细胞和造骨细胞的增殖，并能吸引多种细胞成分参与损伤组织的修复，并可以诱导MSCs及内皮细胞进行有丝分裂、分化及复制，可促进组织愈合。其中，PDGF是一种成纤维细胞的有丝分裂原，能强力地诱导成纤维细胞的再生，增加肉芽组织内成纤维细胞的量，促进成纤维细胞分化并诱导成纤维细胞分泌其他细胞因子，促进细胞基质成分(胶原、透明质酸等)的合成、分泌，从而加速伤口的愈合，PDGF还能降低瘢痕组织的形成。TGF-β参与体内许多炎症反应和组织修复，是体内多功能的基础抗炎细胞因子。TGF-β的含量与胶原的合成、伤口愈合时间、伤口愈合组织的张力、以及瘢痕的密度有一定的关联。VEGF也称血管通透性因子或促血管素，在创伤愈合血管生成过程中，尤其是毛细血管形成的早期阶段，内源性VEGF基因表达明显增加，VEGF在新生毛细血管内皮细胞胞质内呈强阳性，能促进血管内皮细胞的增殖和肉芽组织的形成。因此，利用血小板所含的这些细胞因子可以作为体外细胞培养用的营养添加剂，人血小板裂解产物的研究越来越受到关注。
许多研究表明，采用反复冻融法可获得用于细胞培养用的血小板裂解液(PL)，但由于制备量小，对裂解产物中各种细胞因子含量的控制未有明确要求，导致其效果差异很大；也有采用机采血小板来进行较大量制备的报道，但未研究如何进行有效的血小板活化以达到最大限度地获得细胞因子，因此，如何进行有效的血小板活化成为了研究的热点。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种血小板裂解液的制备方法及其应用。该血小板裂解液的制备方法可明显提高血小板裂解液中细胞因子含量，且可进行细胞因子的定量平衡，有利于减少产品批间的差异，可达到稳定的促进细胞生长的作用；采用本发明制备方法所制备的血小板裂解液可代替小牛血清培养细胞；本发明采用健康献血者的血小板为原料，且进行了严格的化验检查，从而保证了安全性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种血小板裂解液的制备方法，包括如下步骤：
将血小板在20～24℃振荡保存1～5d，采用反复冻融法和超声法进行处理，离心、收集上清液，去除纤维蛋白，获得血小板裂解液。
本发明提供了一种采用反复冻融法和超声法复合方法促进血小板活化，以获得更高水平细胞因子的血小板裂解产物大量制备方法，与反复冻融法或超声法等单一方法相比，该制备方法可明显提高血小板裂解液中细胞因子含量，且可进行细胞因子的定量平衡，有利于减少产品批间的差异，可达到稳定的促进人源性细胞生长的作用。
作为优选，血小板为单采血小板或浓缩血小板。
作为优选，所述超声的功率为100W～400W。
优选地，超声的功率为200～300W。
更优选地，超声的功率为285W。
在本发明提供的一些实施例中，超声具体为：超声3～6s，停止超声3～6s。
作为优选，超声具体为：超声5s，停止超声5s。
在本发明提供的一些实施例中，超声的次数为5～15次。
作为优选，超声的次数为10次。
在本发明提供的一些实施例中，反复冻融具体为：在-80℃冻存24h，在37℃融解，共冻融1～5次。
作为优选，反复冻融为：在-80℃冻存24h，在37℃融解，共冻融3次。
在本发明提供的一些实施例中，采用反复冻融法和超声法进行处理具体为：先采用反复冻融法进行处理，然后采用超声法进行处理。但本发明并非限定于此种方式，先采用超声法进行处理，然后采用反复冻融法进行处理，同样能够实现本发明的目的。
作为优选，血小板在22℃振荡保存3d～5d。
在本发明提供的一些实施例中，去除纤维蛋白采用的物质为葡萄糖酸钙，也可以采用氯化钙等无机钙化合物。
本发明还提供了由本发明制备方法制得的血小板裂解液。
本发明还提供了血小板裂解液的保存方法，对多份血小板裂解液进行混合，或以AB型血清或血浆进行稀释以达到产品中主要细胞因子含量一致，除菌，在低于6℃条件下保存。
在本发明提供的一些实施例中，在2～6℃条件下保存可达30天，在-80℃条件下保存可达1年。
本发明还提供了一种细胞培养方法，采用本发明制备方法制得的血小板裂解液培养细胞。
在本发明提供的一些实施例中，本发明制备方法制得的血小板裂解液适于培养人源细胞，如人脐带、胎盘或骨髓间充质干细胞等。
本发明提供了一种血小板裂解液的制备方法及其应用。该制备方法包括：将血小板在20～24℃振荡保存1～5d，采用反复冻融法和超声法进行处理，离心、收集上清液，去除纤维蛋白，获得血小板裂解液。本发明至少具有如下优势之一：
本发明提供的血小板裂解液的制备方法可明显提高血小板裂解液中细胞因子含量，且可进行细胞因子的定量平衡，有利于减少产品批间的差异，可达到稳定的促进人源性细胞生长的作用；
采用本发明制备方法所制备的血小板裂解液可代替小牛血清培养细胞；
本发明采用健康献血者的血小板为原料，且进行了严格的化验检查，从而保证了安全性。
附图说明
图1示培养前UMSC细胞(2×105cells/well)形态(P5)(显微镜100×)；
图2示各种条件下UMSC细胞培养24h形态(P6)(显微镜100×)；其中1示DMEM/F12(serum-free)处理组；2示DMEM/F12+10％FBS处理组；3示DMEM/F12+10％PL-1(3d PC-80℃/37℃冻融超声复合)处理组；4示DMEM/F12+10％PL-2(3d PC-超声)处理组；5示DMEM/F12+10％PL-3(3d PC-80℃/37℃冻融)处理组；
图3各种条件下UMSC细胞培养48h形态(P6)(显微镜100×)；其中1示DMEM/F12(serum-free)处理组；2示DMEM/F12+10％FBS处理组；3示DMEM/F12+10％PL-1(3d PC-80℃/37℃冻融超声复合)处理组；4示DMEM/F12+10％PL-2(3d PC-超声)处理组；5示DMEM/F12+10％PL-3(3d PC-80℃/37℃冻融)处理组；
图4各种条件下UMSC细胞培养18h形态(P7)(显微镜100×)；其中1示DMEM/F12(serum-free)处理组；2示DMEM/F12+10％FBS处理组；3示DMEM/F12+10％PL-1(3d PC-80℃/37℃冻融超声复合)处理组；4示DMEM/F12+10％PL-2(3d PC-超声)处理组；5示DMEM/F12+10％PL-3(3d PC-80℃/37℃冻融)处理组；
图5各种条件下UMSC细胞培养48h形态(P7)(显微镜100×)；其中1示DMEM/F12(serum-free)处理组；2示DMEM/F12+10％FBS处理组；3示DMEM/F12+10％PL-1(3d PC-80℃/37℃冻融超声复合)处理组；4示DMEM/F12+10％PL-2(3d PC-超声)处理组；5示DMEM/F12+10％PL-3(3d PC-80℃/37℃冻融)处理组；
图6各种条件下UMSC细胞培养72h形态(P7)(显微镜100×)；其中1示DMEM/F12(serum-free)处理组；2示DMEM/F12+10％FBS处理组；3示DMEM/F12+10％PL-1(3d PC-80℃/37℃冻融超声复合)处理组；4示DMEM/F12+10％PL-2(3d PC-超声)处理组；5示DMEM/F12+10％PL-3(3d PC-80℃/37℃冻融)处理组。
具体实施方式
本发明公开了一种血小板裂解液的制备方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的血小板裂解液的制备方法及其应用中所用仪器或试剂均可由市场购得：
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 血小板裂解液的制备及效果试验
(一)血小板样品来源、实验分组及血小板裂解液的制备
选取单采血小板(来自解放军重庆血站)捐献者10名：男性7名，女性3名，年龄18-55岁，均符合献血(单采血小板)标准且无任何疾病史。收集单采血小板的同时收集10份单采血浆(30mL/份)作为“血浆0d”组；单采血小板收集后置于22℃振荡箱中保存，保存1d，留取10份单采血小板(30mL/份)离心分离得到10份血浆(30mL/份)作为“1d”组，同时留取10份单采血小板(90mL/份)用于血小板裂解液制备，待单采血小板保存3d后同样留取10份单采血小板(30mL/份)离心分离得到10份血浆(30mL/份)作为“3d”组，同时留取10份单采血小板(90mL/份)用于血小板裂解液制备。
对用于制备血小板裂解液的单采血小板(保存1d和3d的单采血小板)平均分为3组，即每种处理方式各制备30mL，经4000g，20min，收集上清液，最终获得PC1d冻融组，PC1d超声组，PC1d复合组，PC3d冻融组，PC3d超声组，PC3d复合组。
血小板裂解液三种不同的处理方法见表1，试验分组见表2。
表1 血小板裂解产品的制备方法
表2 试验分组
| 分组 | 处理 |
| 血浆0d | —— |
| PC1d | 22℃振荡箱中保存1d |
| PC 1d冻融 | 22℃振荡箱中保存1d；采用冻融法制备 |
| PC 1d超声 | 22℃振荡箱中保存1d；采用超声法制备 |
| PC 1d复合 | 22℃振荡箱中保存1d；采用复合法制备 |
| PC 3d | 22℃振荡箱中保存3d |
| PC 3d冻融 | 22℃振荡箱中保存3d；采用冻融法制备 |
| PC 3d超声 | 22℃振荡箱中保存3d；采用超声法制备 |
| PC 3d复合 | 22℃振荡箱中保存3d；采用复合法制备 |
纤维蛋白去除：在上述各组加入葡萄糖酸钙于血小板裂解液中混匀，37℃孵育1h，4000g离心20min，移出上清液即血小板裂解液，备用。
(二)检测细胞因子含量
留取少量标本按照试剂盒说明书测定PDGF(PDGF-AB，PDGF-BB)，VEGF165、TGF-β1，同时测定对照组血浆，以及当天处理前血浆细胞因子含量。
1、VEGF的测定(试剂盒说明书进行)
(1)标准品的稀释：取1mL样品稀释液加入标准品管内(10000pg/mL)，静置10min，反复颠倒混匀。取200μL 10000pg/mL标准品加入有800μL样品稀释液的EP管内，混匀(2000pg/mL)，从中吸取300μL混合液加入等体积样品稀释液(1000pg/mL)。依此类推，制作浓度依次为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL和31.25pg/mL的标准品。
(2)生物素标记的抗人VEGF抗体工作液的准备：每孔需要100μL计算总的用量(实验中应多配制100-200μL)，用抗体稀释液稀释抗体，配制为1：100的工作液，轻轻混匀备用。
(3)样品的稀释：待测血清按1：1比例稀释，100μL样品与100μL样品稀释液混合。
(4)七个标准品和样品取100μL加入反应孔，同时保留一孔作为空白显色对照，37℃反应90min。
(5)甩去酶标板内液体，在吸水纸上拍干。每孔依次加入100μL生物素抗人VEGF抗体工作液(空白显色孔除外)。37℃反应60min。
(6)亲和素-过氧化物混合物(ABC)工作液的配制：每孔需要100μL计算总的用量(实验中应多配制100-200μL)，用ABC稀释液稀释亲和素-过氧化物混合物ABC，配制为1：100的工作液，轻轻混匀备用。
(7)0.01M PBS洗涤3次，在吸水纸上拍干。每孔依次加入100μL亲和素-过氧化物酶复合物工作液。37℃反应30min(空白显色孔除外)。
(8)0.01M PBS洗涤5次，在吸水纸上拍干。每孔依次加入90μL TMB显色剂，37℃避光反应12～16min。(肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显)。
(9)每孔依次加入100μL TMB终止液。
(10)将酶标板放入酶标仪内，读取450nm处OD值。
(11)所有OD值减去空白显色对照孔的OD值后以标准曲线的拟合方程计算出所有样本的VEGF含量。
2、PDGF的测定(试剂盒说明书进行)
(1)标准品的稀释：取1mL样品稀释液加入标准品管内(10000pg/mL)，静置10min，反复颠倒混匀。取200μL 10000pg/mL标准品加入有800μL样品稀释液的EP管内，混匀(2000pg/mL)，从中吸取300μL混合液加入等体积样品稀释液(1000pg/mL)。依此类推，制作浓度依次为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL和31.25pg/mL的标准品。
(2)生物素标记的抗人PDGF抗体工作液的准备：每孔需要100μL计算总的用量(实验中应多配制100-200μL)，用抗体稀释液稀释抗体，配制为1：100的工作液，轻轻混匀备用。
(3)样品的稀释：待测血清按1：20比例稀释，10μL样品与190μL样品稀释液混合。
(4)七个标准品和样品取100μL加入反应孔，同时保留一孔作为空白显色对照，37℃反应90min。
(5)甩去酶标板内液体，在吸水纸上拍干。每孔依次加入100μL生物素抗人PDGF抗体工作液(空白显色孔除外)。37℃反应60min。
(6)亲和素-过氧化物混合物(ABC)工作液的配制：每孔需要100μL计算总的用量(实验中应多配制100-200μL)，用ABC稀释液稀释亲和素-过氧化物混合物ABC，配制为1：100的工作液，轻轻混匀备用。
(7)0.01M PBS洗涤3次，在吸水纸上拍干。每孔依次加入100μL亲和素-过氧化物酶复合物工作液。37℃反应30min(空白显色孔除外)。
(8)0.01M PBS洗涤5次，在吸水纸上拍干。每孔依次加入90μL TMB显色剂，37℃避光反应12～16min。(肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显)。
(9)每孔依次加入100μL TMB终止液。
(10)将酶标板放入酶标仪内，读取450nm处OD值。
(11)所有OD值减去空白显色对照孔的OD值后以标准曲线的拟合方程计算出所有样本的PDGF含量。
3、TGF-β1的测定(试剂盒说明书进行)
(1)标准品的稀释：取1mL样品稀释液加入标准品管内(10000pg/mL)，静置10min，反复颠倒混匀。取100μL 10000pg/mL标准品加入有900μL样品稀释液的EP管内，混匀(1000pg/mL)，从中吸取300μL混合液加入等体积样品稀释液(500pg/mL)。依此类推，制作浓度依次为250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、和15.6pg/mL的标准品。
(2)生物素标记的抗人TGF-β1抗体工作液的准备：每孔需要100μL计算总的用量(实验中应多配制100-200μL)，用抗体稀释液稀释抗体，配制为1：100的工作液，轻轻混匀备用。
(3)样品的稀释：待测血清按1：100比例稀释，1μL样品与99μL样品稀释液混合。
(4)七个标准品和样品取100μL加入反应孔，同时保留一孔作为空白显色对照，37℃反应90min。
(5)甩去酶标板内液体，在吸水纸上拍干。每孔依次加入100μL生物素抗人TGF-β1抗体工作液(空白显色孔除外)。37℃反应60min。
(6)亲和素-过氧化物混合物(ABC)工作液的配制：每孔需要100μL计算总的用量(实验中应多配制100-200μL)，用ABC稀释液稀释亲和素-过氧化物混合物ABC，配制为1：100的工作液，轻轻混匀备用。
(7)0.01M PBS洗涤3次，在吸水纸上拍干。每孔依次加入100μL亲和素-过氧化物酶复合物工作液。37℃反应30min(空白显色孔除外)。
(8)0.01M PBS洗涤5次，在吸水纸上拍干。每孔依次加入90μL TMB显色剂，37℃避光反应12～16min。(肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显)。
(9)每孔依次加入100μL TMB终止液。
(10)将酶标板放入酶标仪内，读取450nm处OD值。
(11)所有OD值减去空白显色对照孔的OD值后以标准曲线的拟合方程计算出所有样品的TGF-β1含量。
采用SPSS 10.0统计软件分析实验数据。检测结果用表示，采用两组独立样本的t检验。以P<0.05或<0.01为差异有统计学意义。血小板裂解液各种生长因子含量的变化见表3：
表3 各种处理方式下血小板裂解液中生长因子含量的比较(n＝10，)
| 分组 | PDGFAB(pg/mL) | PDGFBB(pg/mL) | VEGF165(pg/mL) | TGF-β1(pg/mL) |
| 血浆0d | 36.079±15.54 | 33.258±21.23 | 26.661±5.42 | 55.556±6.16 |
| PC 1d | 2030.085±1130.80 | 671.632±144.20 | 47.045±4.53 | 220.403±58.06 |
| PC 1d冻融 | 11240.423±2801.77▲△ | 6685.731±1775.68▲△ | 142.808±34.33▲△ | 6699.162±1834.61▲△ |
| PC 1d超声 | 3524.024±705.16▲△ | 4703.167±178.30▲△ | 247.642±24.41▲△ | 3090.301±397.49▲△ |
| PC 1d复合 | 12499.350±3151.99▲△ | 7594.990±1820.07▲△ | 283.550±35.188▲△ | 7375.777±1880.48▲△ |
| PC 3d | 5866.572±859.31 | 641.69±80.58 | 122.652±10.59 | 3930.022±827.68 |
| PC 3d冻融 | 19610.987±3738.03▲△ | 5429.184±1824.53▲△ | 128.379±46.69 | 8820.789±1755.45▲△ |
| PC 3d超声 | 12424.746±10430.26▲△ | 8397.039±611.93▲△ | 374.552±32.48▲△ | 14686.780±7164.89▲△ |
| PC 3d复合 | 21787.807±3831.48▲△ | 9446.669±1870.14▲△ | 425.866±47.86▲△ | 16346.386±1799.34▲△ |
注：▲表示与血浆0d组相比较，P<0.05，差异显著；△表示与同时相点PC相比较，P<0.05，差异显著。
由表3的试验结果可知，正常血浆中含有一定水平的血小板源性生长因子，血小板经不同方式处理后这些因子含量明显升高(表3)。保存3d的单采血小板中生长因子的含量显著高于保存1d时的含量；三种不同的血小板裂解液制备方法中，采用冻融和超声复合的方法可显著提高生长因子的含量。
(三)血小板裂解液的分装和保存
按照制备出的各种批次血小板裂解液中总体细胞因子水平，将其用AB型血浆或血清进行一定的稀释，使用0.2μm滤器常规除菌处理，使其达到含有稳定细胞因子(PDGFAB>18000pg/mL；PDGFBB>8000pg/mL；VEGF165>300pg/mL；TGF-β1>12000pg/mL，为本研究中复合方法得到的最低值)的含量；剂量50mL为1包装单位(可采用朔料血袋或玻璃瓶)；保存于2-6℃，时间1年。
实施例2 血小板裂解液用于脐血间充质干细胞(UMSC)培养实例
按照10％的比例加入细胞培养基中(如DMEM-F12)进行脐血间充质干细胞(UMSC)培养，观察细胞生长情况。分别设置无血清基质、小牛血清组和以各组血小板裂解液(PL)替代组。共5组细胞培养条件，(1)DMEM/F12(serum-free，无血清)；(2)DMEM/F12+10％FBS；(3)DMEM/F12+10％PL-1(3d PC-80℃/37℃冻融超声复处理)；(4)DMEM/F12+10％PL-2(3d PC-超声处理)；(5)DMEM/F12+10％PL-3(3d PC-80℃/37℃冻融处理)。各种条件下UMSC细胞培养不同时间后的形态见图1至图6。
由图1至图6的试验结果可知，与胎牛血清相比，采用本发明制备的血小板裂解液培养的细胞在形态上无明显差别，生长良好。可见，采用本发明制备的血小板裂解液完全可以替代胎牛血清用于细胞培养。
由上述试验结果，得出如下结论：
1.血小板制剂中PDGFAB、PDGFBB、VEGF165和TGF-β1含量较血浆中含量明显升高；
2.活化血小板制剂中各生长因子含量较新鲜血小板制剂中含量高；
3.采用复合方法制备的血小板裂解液中各生长因子含量比单一因素处理时更高；
4.采用本方法所制备的血小板裂解液代替小牛血清(比例均10％)培养细胞时细胞生长良好，可达到替代的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种血小板裂解液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将血小板在20～24℃振荡保存1～5d，采用反复冻融法和超声法进行处理，离心、收集上清液，去除纤维蛋白，获得血小板裂解液；所述反复冻融具体为：在-80℃冻存24h，在37℃融解，共冻融1～5次；
所述超声功率为100W～400W，所述超声具体为：超声3～6s，停止超声3～6s，所述超声的次数为5～15次。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述血小板在22℃振荡保存3d～5d。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述去除纤维蛋白采用的物质为葡萄糖酸钙或无机钙化合物。
4.如权利要求1至3中任一项所述的制备方法制得的血小板裂解液。
5.如权利要求4所述血小板裂解液的保存方法，其特征在于，将血小板裂解液，或用AB型血浆或血清进行稀释后的血小板裂解液，除菌，在低于6℃条件下保存。
6.一种细胞培养方法，其特征在于，采用权利要求1至3中任一项所述制备方法制得的血小板裂解液培养细胞。
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