CN116077448B

CN116077448B - 人间充质干细胞注射液及其应用

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Publication number: CN116077448B
Application number: CN202310343157.3A
Authority: CN
Inventors: 佟曼; 王美霞; 钱其军
Original assignee: Beijing Cell Therapy Group Co ltd
Current assignee: Beijing Cell Therapy Group Co ltd
Priority date: 2023-04-03
Filing date: 2023-04-03
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2043-04-03
Also published as: CN116077448A

Abstract

本发明提供了一种人间充质干细胞注射液可用于治疗股骨头坏死（ONFH），包括人间充质干细胞和人间充质干细胞注射液冻存辅料；所述人间充质干细胞注射液冻存辅料包括临床注射液和冷冻保护剂组合物。所述临床注射液包括0.9%氯化钠注射液、多种维生素注射液和复方氨基酸注射液；所述临床注射液还包括选自人血白蛋白注射液和右旋糖酐40葡萄糖注射液中的至少1种，选自复方电解质注射液和葡萄糖注射液中的至少1种，以及生物素。本发明的人间充质干细胞注射液安全性高，可直接注射如人体；冻存细胞复苏周细胞活率高，达90%以上；免疫调节能力强，诱导后高表达IDO，能抑制T淋巴细胞增殖，能够促进成骨分化；应用简便，无需程序降温，随取随用。

Description

人间充质干细胞注射液及其应用

技术领域

本发明涉及细胞治疗药物领域，更具体地，涉及人间充质干细胞注射液及其应用。

背景技术

股骨头坏死（ONFH）是由外伤、激素应用和酗酒等因素导致股骨头塌陷和功能障碍的疾病。人间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）广泛存在于胎儿和成人各组织中，具有自我更新和多向分化潜能，以及独特的免疫调节和促进损伤组织修复功能。一方面，MSC通过与免疫细胞间的相互作用及旁分泌可溶性因子对免疫细胞进行调控，介导免疫反应平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境。另一方面，MSC通过分泌功能因子、补充或替代病损组织细胞等方式参与损伤组织器官的重建。结合MSC的自我更新能力，通过体外扩增可生产出满足临床用量的MSC治疗产品。

MSC移植联合髓心减压（CD）是治疗SONFH极具前景的新方法。研究表明利用患者自体骨髓间充质干细胞（BM-MSC）移植联合CD治疗非创伤性ONFH疗效显著，800余髋中70.8%非创伤性ONFH髋达到临床评价终点。但仍有近30%患者未达临床终点，BM-MSC移植数量不足、生物有效性欠佳是导致失败的关键因素。

因此，亟待研发安全性和生物学有效性得到验证充分、应用简便的人间充质干细胞注射液，满足日益迫切的临床应用和工业生产需求。

发明内容

本发明第一方面提供了一种人间充质干细胞注射液冻存辅料，用于制备人间充质干细胞注射液，可直接注射入人体，并能够提高间充质干细胞的成骨分化。所述人间充质干细胞注射液冻存辅料包括临床注射液和冷冻保护剂组合物；所述临床注射液包括0.9%氯化钠注射液，以及选自多种维生素注射液、人血白蛋白注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、复方氨基酸注射液、复方电解质注射液和葡萄糖注射液中的至少2种。

优选地，所述临床注射液包括0.9%氯化钠注射液和多种维生素注射液，以及选自右旋糖酐40葡萄糖注射液、人血白蛋白注射液、复方氨基酸注射液、复方电解质注射液、葡萄糖注射液中的至少1种。

进一步优选地，所述临床注射液包括0.9%氯化钠注射液、多种维生素注射液和复方氨基酸注射液；所述临床注射液还包括选自人血白蛋白注射液和右旋糖酐40葡萄糖注射液中的至少1种。

进一步优选地，所述临床注射液包括0.9%氯化钠注射液、多种维生素注射液和复方氨基酸注射液；所述临床注射液还包括选自人血白蛋白注射液和右旋糖酐40葡萄糖注射液中的至少1种，选自复方电解质注射液和葡萄糖注射液至少1种。

进一步优选地，为了提高人间充质干细胞注射液治疗ONFH的效果，所述临床注射液还包括生物素，可以促进成骨分化。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，0.9%氯化钠注射液的浓度为50-95% v/v，优选为50-85% v/v。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，多种维生素注射液的浓度为0-5% v/v，优选为0.1-5% v/v，更优选为1-2% v/v。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，复方氨基酸注射液的浓度为1-15% v/v，优选为8-12% v/v。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，人血白蛋白注射液的浓度为0-15% v/v，优选为0-12% v/v，更优选为4-12% v/v。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，右旋糖酐40葡萄糖注射液的浓度为0-10% v/v，优选为0-8% v/v，更优选为1-8% v/v，进一步优选为5-8% v/v。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，人血白蛋白注射液和右旋糖酐40葡萄糖注射液的浓度之和为0-20% v/v，优选为5-15% v/v。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，复方电解质注射液的浓度为0-15% v/v，优选为1-15% v/v。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，葡萄糖注射液的浓度为0-15% v/v，优选为0-12% v/v，更优选为4-12% v/v。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，复方电解质注射液和葡萄糖注射液的浓度之和为0-20% v/v，优选为5-15% v/v。

在一个或多个实施方案中，所述冷冻保护剂组合物包括丙二醇和海藻糖。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，丙二醇的浓度为1-15% v/v，优选为1-12% v/v。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞注射液冻存辅料中，海藻糖的浓度为1-15 μM，优选为8-12μM。

本发明第二方面提供一种人间充质干细胞注射液，包括人间充质干细胞和人间充质干细胞注射液冻存辅料。

在一个或多个实施方案中，所述人间充质干细胞来源于骨髓、脐带、脂肪组织、脐血、胎盘、羊膜、（胎盘）绒毛膜、牙髓、胸腺、滑膜、胎儿血或肝脏。

在一个或多个实施方案中，人间充质干细胞的密度1E6-4E7活细胞/mL。

本发明的第三方面提供一种冻存组合物，用于人间充质干细胞的冻存。所述冻存组合物包括本发明任一实施例的人间充质干细胞注射液冻存辅料。

本发明的第四方面提供一种临床注射液，所述临床注射液可用人间充质干细胞及其他细胞的人体注射。所述的临床注射液为本发明任一实施例的人间充质干细胞注射液冻存辅料中的临床注射液。

本发明还提供本发明任一实施方案所述的人间充质干细胞注射液冻存辅料、或人间充质干细胞注射液、冻存组合物或临床注射液在制备含有间充质干细胞的制剂中的应用。

本发明还提供由本文任一实施方案所述的人间充质干细胞注射液在制备药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述药物用于治疗骨科疾病和/或衰老相关疾病。

本发明还提供一种药物组合物，包含有效量的本文任一实施方案所述的方法制备的人间充质干细胞注射液和药学上可接受的辅料。

本发明还提供一种细胞冻存制剂，包括前述由本文任一实施方案所述的方法获得的人间充质干细胞和冻存组合物。

本发明还提供一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，包含向所述受试者施用有效量的本文任一实施方案所述的药物组合物。一些实施方案中，所述疾病或病症是骨科疾病和/或衰老相关疾病。

本发明的有益效果：

（1）原料级别和安全性高：本发明人间充质干细胞注射液采用临床复方制剂和药用级别辅料，不含DMSO，对体外溶血性能无影响、无刺激及皮肤致敏性、无全身急性毒性反应。

（2）生物学有效性高：本发明的冻存辅料冻存细胞复苏后活率高，可达90%以上，对于最优选的技术方案，细胞活率高达97%。复苏后的免疫调节能力强，经炎症因子（IFN-γ联合TNF-α）诱导后高表达IDO，与T淋巴细胞共培养，能抑制T淋巴细胞增殖。

（3）促进成骨分化：本发明的人间充质干细胞注射液还包含生物素，可以提高人间充质干细胞注射液的成骨分化能力，从而提高ONFH的治疗效果。

（4）应用简便：本发明人间充质干细胞注射液无需程序性降温，可直接冻存至-80℃，满足大批量工业生产要求。本发明人间充质干细胞注射液适用于多种来源的间充质干细胞，且可冻存细胞的密度范围为1E6-4E7个活细胞/mL注射液，适用范围广。随取随用，复苏后可直接输注。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出使用辅料1-51和CryoStor® CS10，采用程序性降温方法冻存脐带间充质干细胞1个月，复苏后0小时细胞活率图，n≥3，冻存前细胞活率≥95%。

图2示出使用辅料21-39、45-51和CryoStor® CS10，采用程序性降温和非程序性降温方法冻存骨髓间充质干细胞1个月，复苏后0小时细胞活率图，n≥3，冻存前细胞活率≥95%。

图3示出使用辅料33、34和38采用非程序性降温方法冻存脂肪间充质干细胞1个月，复苏后72小时细胞形态图，Scale bar = 100 μm。

图4示出使用辅料45-51和CryoStor® CS10，采用非程序性降温方法冻存牙髓间充质干细胞复苏后，使用IFN-γ和TNF-α处理MSC诱导IDO mRNA表达水平图，n≥3。

图5使用辅料45、46和CryoStor® CS10，采用非程序性降温方法冻存脂肪间充质干细胞复苏后，MSC对T细胞增殖抑制图，n≥3。

图6使用辅料45-51和CryoStor® CS10，采用非程序性降温方法冻存脂肪间充质干细胞复苏后，MSC成骨分化茜素红染色面积图，n≥3。

图7使用辅料48，采用非程序性降温方法冻存脂肪间充质干细胞复苏后，MSC成骨分化茜素红染色图，Scale bar = 100 μm。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明的实施例中所使用的试剂来源如下：

多种维生素注射液，南京优科制药有限公司。

右旋糖酐40葡萄糖注射液，山东科伦药业有限公司。

人血白蛋白注射液，德国百合制药厂，注册号为国药准字S10920009。

复方电解质注射液，河北天成药业股份有限公司，注册号为国药准字H20123411。

葡萄糖注射液，湖南科伦制药有限公司。

复方氨基酸注射液（18AA-V-SF），湖北一半天制药有限公司。

0.9%氯化钠注射液，石家庄四药有限公司。

丙二醇（CAS号57-55-6），苏州捷易龙药用辅料有限公司。

海藻糖（CAS号6138-23-4），Hayashibara公司，货号R007001。

CryoStor® CS10，Stemcell Technologies公司，货号07940。

EasySep™ Hμman T Cell Isolation Kit， Stemcell Technologies公司，货号17951。

CTS™ DPBS，Thermo Fisher公司，货号A1285602。

IFN-γ，Peprotech公司，货号AF-300-02。

TNF-α，Peprotech公司，货号AF-300-01A。

RNAeasy plμs动物总RNA抽提试剂盒(离心柱式)，碧云天公司，货号R0032。

PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser，TAKARA公司，货号RR047A。

TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plμs)，TAKARA公司，货号RR820A。

CFDA SE，BD Biosciences公司，货号565082。

PHA，Sigma公司，货号L8902。

StemPro™ 骨生成分化试剂盒，Thermo Fisher公司，货号A1007201。

实验方法：

1.人间充质干细胞注射液的程序降温冻存方法，包括以下步骤：

1）人间充质干细胞注射液冻存辅料和CryoStor® CS10保存于2-8℃，随取随用；

2）弃掉旧的培养基，加入2 mL CTS™ DPBS洗一遍；

3）加入CTS™ TrypLE™ Select溶液，加入的量以刚好盖过培养皿底部为宜，37℃消化 3 min；

4）待细胞集落消化到比较松散的贴壁状态时，小心弃掉CTS^TMTrypLE^TMSelect溶液，用完全培养基（α-MEM+5% ΜltraGRO^TM-Advanced）轻轻清洗一次；

5）用0.9%氯化钠注射液重悬细胞，200g离心5min，弃掉上清；

6）用2-8℃注射液辅料或CryoStor® CS10重悬细胞，分装到冻存袋中，推荐1E6-4E7个人间充质干细胞/mL注射液辅料密度冻存；

7）将冻存袋放入2-8℃冰箱，放置30 min后转移到-20℃冰箱中;

8) 将冻存袋放入-20℃冰箱，放置2 h后转移到-80℃冰箱中;

9) 将冻存袋放入-80℃冰箱，放置过夜后转移到液氮罐中。

2. 人间充质干细胞的非程序降温冻存方法，包括以下步骤：

1) 人间充质干细胞注射液冻存辅料和CryoStor® CS10保存于2-8℃，随取随用；

2) 弃掉旧的培养基，加入2 mL CTS™ DPBS洗一遍；

3) 加入CTS™ TrypLE™ Select溶液，加入的量以刚好盖过培养皿底部为宜，37℃消化 3 min；

4) 待细胞集落消化到比较松散的贴壁状态时，小心弃掉CTS^TMTrypLE^TMSelect溶液，用完全培养基（α-MEM+5% ΜltraGRO^TM-Advanced）轻轻清洗一次；

5) 用0.9%氯化钠注射液重悬细胞，200g离心5min，弃掉上清；

6) 用2-8℃注射液辅料或CryoStor® CS10重悬细胞，分装到冻存袋中，推荐1E6-4E7个人间充质干细胞/mL注射液辅料或冻存液密度冻存；

7) 将冻存袋直接放入-80℃冰箱过夜，一周内转移到液氮罐中。

3. 人间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：

1）室温下预热人间充质干细胞完全培养基（α-MEM+5% ΜltraGRO^TM- Advanced）；

2）从液氮库中取出人间充质干细胞注射液，用干冰将其转移到细胞房；

3）将冻存袋浸入37℃水浴中，轻轻旋转冻存袋，当只剩下一个冰晶时，从水浴锅中取出冻存袋，在其外面喷上70%酒精，然后置于超净台中；

4）将解冻后的人间充质干细胞注射液转移至50 mL离心管，缓慢加入适量人间充质干细胞完全培养基（α-MEM+5% ΜltraGRO^TM-Advanced）；

5）200 g，离心5 min，弃去上清，用适量人间充质干细胞完全培养基（α -MEM+5%ΜltraGRO^TM-Advanced）重悬细胞，7000/cm²接种于培养瓶中;

6）快速左右移动培养板，使细胞在孔中均匀分散，然后将培养瓶轻轻放入37℃，5%CO₂的培养箱中；

7）第二天，吸弃旧培养基，加入新鲜人间充质干细胞完全培养基（α -MEM+5% ΜltraGRO^TM-Advanced），直到细胞密度达到90%。

4. 人间充质干细胞计数和活率检测方法，包括以下步骤：

1）将冻存袋浸入37℃水浴中，轻轻旋转冻存袋，当只剩下一个冰晶时，从水浴锅中取出冻存袋，在其外面喷上70%酒精，然后置于超净台中；

2）使用50 mL移液管轻柔吹打10次，混匀细胞悬液；

3）使用2-20 μL移液枪取12 μL细胞悬液与12 μL AO/PI吹打混匀，然后取20 μL加入计数板内，用全自动荧光分析仪选择细胞类型为MSC进行计数；记录下测得的细胞活率、活细胞浓度、细胞直径等数据。

5.人间充质干细胞进行表面标志物免疫荧光染色和流式细胞分析的方法，包括以下步骤：

1）加入200 μL含1E6个活细胞悬液至1.5 mL离心管中，离心并弃上清。每管中再加入1 mL CTS™ DPBS重悬，离心并弃上清；

2）每管加入100 μL CD105/CD73/CD90/CD11b/CD19/CD31/CD34/HLA-DR抗体或相应Isotype control。轻轻振荡充分混匀后，置于4℃冰箱避光孵育30 min；

3）每管加入1 mL CTS™ DPBS离心；

4）弃上清，每管加入1 mL CTS™ DPBS重悬，离心；

5）弃上清，每管加入500 μL CTS™ DPBS重悬，流式细胞仪检测各组细胞表面CD105/CD73/CD90/CD11b/CD19/CD31/CD34/HLA-DR分子的表达。

6.人间充质干细胞诱导IDO表达能力检测的方法，包括以下步骤：

1）按照上述方法，计算人间充质干细胞悬液活细胞密度；

2）按照4E5活细胞/cm²接种，在人间充质干细胞完全培养基（α-MEM+5% ΜltraGRO^TM-Advanced）中添加IFN-γ（20 ng/mL）和TNF-α（20 ng/mL）将培养瓶轻轻放入37℃，5% CO₂的培养箱中培养24h。同时设立未添加IFN-γ（20 ng/mL）和TNF-α（20 ng/mL）处理的人间充质干细胞为对照组；

3）按照RNAeasy动物总RNA抽提试剂盒产品说明书进行人间充质干细胞总RNA提取，加入适量DEPC水溶解；

4）按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser产品说明书进行反转录试验，获得20μl cDNA溶液；

5）先吸取5μl cDNA原液，再加入45μl 灭菌水，混匀，获得cDNA模板；

6）IDO PCR Forward Primer序列：ATATGCCACCAGCTCACAGG；PCR Reverse Primer序列：AGCTTTCACACAGGCGTCAT；

GAPDH PCR Forward Primer序列：GTTCGACAGTCAGCCGCAT；PCR Reverse Primer序列：GGCGCCCAATACGACCAAAT；

7）RT-PCR实验：

TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plμs）（2X） 10 μl

PCR Forward Primer（10 μM） 0.8 μl

PCR Reverse Primer（10 μM） 0.8 μl

DNA 模板 2 μl

灭菌水 6.4 μl

Total 20 μl

7）PCR反应程序：

95℃ 30s，（95℃ 5s、60℃ 30s）*40循环，95℃ 5s，60℃ 1min，95℃ 30s。

8）计算公式：

样品A测得CT值：IDO = a，GAPDH = b；样品B测得CT值：IDO = c，GAPDH = d；若以样品A作为ctrl，即1时，则B表达IDO值为：2^{-(c-d) - (a-b)}。

7.人间充质干细胞抑制T淋巴细胞增殖检测方法，包括以下步骤：

1）间充质干细胞样本MSC铺板：提前 1 天使用原 MSC 完全培养基将 MSC 按 1E5cells/孔铺于12孔板中，于 5% CO₂、37 ℃ 细胞培养箱中培养18~ 24 h；

2）T淋巴细胞准备：将血袋中的血（含抗凝剂）使用无菌注射器抽出平均分装到50mL离心管中；使用Thermo Fisher的离心机2500 g离心10 min，设置参数升7降7；抽出中间白膜层转移至新的50 mL离心管中，每管20 mL；加入30 mL常温DPBS稀释血样，轻柔充分混匀；根据样本量，准备若干50 mL离心管（30 mL稀释血样/管），每管加入15 mL Ficoll备用（不要碰到管壁上部），室温放置；将30 mL稀释血样缓慢加到 Ficoll 上（按Ficoll溶液：稀释好的血液为1：2），室温，800 g，离心 20 min，设置参数升1降0。离心结束后，从下往上分为红细胞层、Ficoll层、白膜层、血浆层。弃血浆层至白膜层上方5 mL刻度处，用1 mL枪头缓慢吸取细胞白膜层至新50 mL离心管中，加至少3倍体积DPBS至50 mL；室温400 g，离心 10min，设置参数升9降9；弃去上清（不要倒尽上清），每管用 1 mL DPBS重悬细胞，加DPBS至50 mL，室温400 g，离心10 min，设置参数升9降9；弃去上清，用培养基重悬接种，放入37℃5% CO₂培养箱培养。按照EasySep™ Hμman T Cell Isolation Kit产品说明书分离获得T淋巴细胞；

3）实验设置：A组：MSC独培养对照组，仅需将原完全培养基替换为DMEM/F12完全培养基；B组：T淋巴细胞未染色对照组；C组：T淋巴细胞染色对照组（T淋巴细胞+CFDA SE）；D组：T淋巴细胞活化染色对照组(T淋巴细胞+CFDA SE+PHA终浓度为1 mg/mL)；E组：T淋巴细胞活化染色与MSC共培养实验组(T淋巴细胞+CFDA SE+PHA终浓度为1 mg/mL+MSC)。MSC 与T淋巴细胞共培养的细胞数比例1:5；

4）共培养96小时后收集T淋巴细胞进行增殖抑制检测：取出 12 孔板吸取上清（含T淋巴细胞）至对应提前标记好的 15 mL 离心管。加入 1 mL PBS 轻轻吹打孔底 2 次，并收集至同一个 15 mL 离心管中。室温离心 400 g，5 min，去除上清。在上述离心管加入 2mL PBS 轻轻涡旋 3 s 混匀，室温离心400 g，5 min，去除上清，流式上机检测；

5）计算公式：

人间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的抑制率Y=（A-C）/A*100%。式中：Y—抑制率；A—单独T淋巴细胞（刺激）CFDA SE子代细胞的百分比；C—与人间充质干细胞共培养T淋巴细胞（刺激）CFDA SE子代细胞的百分比。

8.人间充质干细胞成骨分化能力检测方法，包括以下步骤：

1）培养皿的包被。将0.1%明胶加入到待包被培养皿中，加入量参考下表，摇匀液体使其覆盖整个底面。然后放置在37℃培养箱中至少30 min。30 min后，弃去明胶，待培养皿晾干后，用于接种细胞；

2）将生长状态良好的MSCs用TrypLE^TMExpress Enzyme消化成单细胞，以1E4个细胞/cm²的密度接种至预先包被明胶的培养皿中；

3）分化D0，当MSCs汇合度达70%时，吸弃培养基，加入平衡至37℃的StemPro™ 骨生成分化培养基，起始分化；

4）分化D1-D14，每3天更换平衡至37℃的StemPro™ 骨生成分化培养基：

5）D14-D28，每3天半量更换平衡至37℃的StemPro™ 骨生成分化培养基；

6）茜素红染色。吸弃培养基，用1×PBS润洗2次。加入4%多聚甲醛溶液（1 ml培养液/12孔板孔），室温固定30 min。吸弃4%多聚甲醛溶液，用1×PBS润洗2次。加入1 ml茜素红染液，室温孵育3-5min。吸弃茜素红染液，用1×PBS润洗2-3次，洗去浮色。显微镜下观察成骨染色效果。

9.人间充质干细胞注射液冻存辅料体外溶血检测、刺激与皮肤致敏检测和急性全身毒性检测均由江苏科标医学检测有限公司进行。

实施例1 人间充质干细胞注射液冻存辅料的配制

配制方法如下：

人间充质干细胞注射液冻存辅料1-51的组成及对比例如表1所示，其中0.9%氯化钠注射液、多种维生素注射液、人血白蛋白注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、复方氨基酸注射液、复方电解质注射液、葡萄糖注射液和丙二醇的用量单位为%v/v，海藻糖的用量单位为μM，生物素的用量单位为μg/mL。

表1 人间充质干细胞注射液冻存辅料的组成及对比例

实施例2 人间充质干细胞的制备

本发明中人间充质干细胞样品来源于脐带、骨髓、脂肪、牙髓组织，供者包含0-50岁健康人群，性别不限。采用第5代细胞人间充质干细胞制备人间充质干细胞注射液，人间充质干细胞在人间充质干细胞注射液中的浓度为1E6-4E7活细胞/mL。

详见下表2。

表2 人间充质干细胞样品

实施例3 人间充质干细胞注射液配方研究-使用不同辅料冻存复苏后人间充质干细胞活率对比试验

以样品1为受试细胞，以辅料1-51为受试辅料，以CryoStor® CS10为对比例，按照本发明中程序性降温冻存方法对样品1进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后0小时进行细胞活率检测，如图1所示。所有的辅料冻存复苏后，0小时细胞的活率均高于70%；辅料31-35、39、45-51冻存复苏后，0小时细胞的活率达90%以上；与对比例相比，最优选的辅料35、39、45-51冻存复苏后，0小时细胞的活率高达97%，高于对比例。

实施例4 人间充质干细胞注射液配方研究-使用不同降温方法冻存复苏后人间充质干细胞活率对比试验

以样品2为受试细胞，以实施例3中复苏后0小时细胞活率≥85.0%的辅料为受试辅料（辅料21-39、45-51），以CryoStor® CS10为对比例，按照本发明中程序性降温和非程序性降温冻存方法对样品2进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后0小时进行细胞活率检测，如图2所示。结果表明，采用程序性降温和非程序性降温复苏后细胞活率接近，因而可以采用非程序性降温，操作更加简便。

实施例5 人间充质干细胞注射液配方研究-冻存复苏后不同时间点人间充质干细胞活率检测

以样品3为受试细胞，以实施例4中程序性降温和非程序性降温方法冻存复苏后0小时细胞活率≥95.0%的辅料为受试辅料（辅料35、39、45和46），按照本发明中非程序性降温冻存方法对样品3进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后0小时、24小时、48小时和72小时进行细胞活率检测。

由表3可以看出，使用辅料35、39、45和46冻存人间充质干细胞样品3，复苏后0小时、24小时48小时和72小时细胞活率可达90%以上，较少/无延迟冷冻损伤。

表3冻存复苏后不同时间点人间充质干细胞活率

（n≥3，冻存前细胞活率≥95%）

实施例6 人间充质干细胞注射液普适性研究-冻存多种不同来源人间充质干细胞复苏后细胞活率检测

以样品1-4为受试细胞，以辅料45和46为受试辅料，按照本发明中非程序性降温冻存方法对样品1-4进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后0小时进行细胞活率检测。

由表4可以看出，使用辅料45和46冻存人间充质干细胞样品1-4，复苏后0小时细胞活率可达90%以上，适用于多种来源的间充质干细胞。

表4冻存多种不同来源人间充质干细胞复苏后细胞活率

（n≥3，冻存前细胞活率≥95%）

实施例7 人间充质干细胞注射液普适性研究-冻存不同细胞密度的人间充质干细胞复苏后细胞活率检测

以样品1、5-8为受试细胞，以辅料35和39为受试辅料，按照本发明中非程序性降温冻存方法对样品1、5-8进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后0小时进行细胞活率检测。

由表5可以看出，使用辅料35和39冻存1E6-4E7个活细胞/mL的人间充质干细胞，复苏后0小时细胞活率可达90%以上，适用范围广。

表5冻存不同细胞密度的人间充质干细胞复苏后细胞活率

（n≥3，冻存前细胞活率≥95%）

实施例8 人间充质干细胞注射液质量研究-复苏后人间充质干细胞形态和标志蛋白表达水平检测

以样品3为受试细胞，以辅料33、34和38为受试辅料，按照本发明中非程序性降温冻存方法对样品3进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后72小时进行细胞形态观察和细胞表征流式分析。

由图3可以看出，以辅料33、34和38为受试辅料对样品3进行冻存，复苏后72小时细胞贴壁生长，呈现均一的纺锤形和梭形的成纤维细胞形态，符合T/CSCB 0003-2021人间充质干细胞团体标准要求。

表6冻存人间充质干细胞复苏后细胞表征（n≥3）

由表6可以看出，以辅料33、34和38为受试辅料对样品3进行冻存，复苏后72小时细胞标志蛋白CD105、CD73和CD90阳性率均≥95%，CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR阳性率均≤2%，符合T/CSCB 0003-2021人间充质干细胞团体标准要求。

实施例9 人间充质干细胞注射液生物学有效性研究-复苏后人间充质干细胞诱导IDO表达能力检测

以样品4为受试细胞，以辅料45-51为受试辅料，以CryoStor® CS10为对比例，按照本发明中非程序性降温冻存方法对样品4进行冻存。冻存1个月后进行复苏，按照本发明中使用IFN-γ和TNF-α处理MSC诱导IDO表达检测方法（实时荧光定量PCR法）进行检测。

使用IFN-γ和TNF-α处理新鲜样本4细胞诱导IDO表达量升高3.07±0.38倍，使用IFN-γ和TNF-α处理辅料45冻存样品4复苏后细胞诱导IDO表达量升高3.97±0.70倍，使用IFN-γ和TNF-α处理辅料46冻存样品4复苏后细胞诱导IDO表达量升高3.47±0.35倍，使用IFN-γ和TNF-α处理辅料47冻存样品4复苏后细胞诱导IDO表达量升高3.43±0.69倍，使用IFN-γ和TNF-α处理辅料48冻存样品4复苏后细胞诱导IDO表达量升高3.65±0.66倍，使用IFN-γ和TNF-α处理辅料49冻存样品4复苏后细胞诱导IDO表达量升高3.82±0.40倍，使用IFN-γ和TNF-α处理辅料50冻存样品4复苏后细胞诱导IDO表达量升高3.34±0.83倍，使用IFN-γ和TNF-α处理辅料51冻存样品4复苏后细胞诱导IDO表达量升高3.29±0.65倍，使用IFN-γ和TNF-α处理CryoStor® CS10冻存样品4复苏后细胞诱导IDO表达量升高3.13±0.31倍。使用配对t检验对图4数据进行统计学分析，任意两组间均无显著差异（p >0.05）。人间充质干细胞注射液具有免疫调节能力。

实施例10 人间充质干细胞注射液生物学有效性研究-复苏后人间充质干细胞抑制T淋巴细胞增殖能力检测

以样品3为受试细胞，以辅料45和46为受试辅料，以CryoStor® CS10为对比例，按照本发明中非程序性降温冻存方法对样品3进行冻存。冻存1个月后进行复苏，按照本发明中抑制T细胞增殖的检测方法（CFSE标记法）进行检测。

结果表明，T细胞培养组CFSE标记的T细胞占比为67.6±6.30%，T细胞-新鲜样品3共培养组CFSE标记的T细胞占比为34.7±4.90%，T细胞-辅料45冻存复苏样品3共培养组CFSE标记的T细胞占比为33.2±2.90%，T细胞-辅料46冻存复苏样品3共培养组CFSE标记的T细胞占比为38.5±2.13%，T细胞- CryoStor® CS10冻存复苏样品3共培养组CFSE标记的T细胞占比为42.9±2.62%。使用抑制率公式进行计算，如图5所示，新鲜样品3对T细胞增殖的抑制率为48.7±2.97%，辅料45冻存复苏样品3对T细胞增殖的抑制率为50.3±8.24%，辅料46冻存复苏样品3对T细胞增殖的抑制率为42.6±7.75%，CryoStor® CS10冻存复苏样品3对T细胞增殖的抑制率为35.9±9.52%。使用配对t检验对图5数据进行统计学分析，样本3-辅料45组、样本3-辅料46组与样本3-CryoStor® CS10均存在显著差异（p <0.05），其余任意两组间均无显著差异（p >0.05）。人间充质干细胞注射液具有更强的T细胞增殖抑制能力。

实施例11 人间充质干细胞注射液生物学有效性研究-复苏后人间充质干细胞成骨分化能力检测

以样品6为受试细胞，以辅料45-51为受试辅料，以CryoStor® CS10为对比例，按照本发明中非程序性降温冻存方法对样品6进行冻存。冻存1个月后进行复苏，按照本发明中成骨分化的检测方法（茜素红染色法）进行检测。

如图6所示，辅料45冻存复苏样品6成骨分化茜素红染色面积为25.33±4.16%，辅料46冻存复苏样品6成骨分化茜素红染色面积为25.33±5.51%，辅料47冻存复苏样品6成骨分化茜素红染色面积为42.67±4.51%，辅料48冻存复苏样品6成骨分化茜素红染色面积为64.33±8.33%，辅料49冻存复苏样品6成骨分化茜素红染色面积为52.00±8.89%，辅料50冻存复苏样品6成骨分化茜素红染色面积为60.00±8.00%，辅料51冻存复苏样品6成骨分化茜素红染色面积为57.67±14.98%，CryoStor® CS10冻存复苏样品6成骨分化茜素红染色面积为25.33±7.51%。图7为使用辅料48，采用非程序性降温方法冻存脂肪间充质干细胞复苏后，MSC成骨分化茜素红染色图。

使用配对t检验对图6数据进行统计学分析，样本6-辅料48组、样本6-辅料50组、样本6-辅料51组与样本6-CryoStor® CS10均存在显著差异（p <0.05），人间充质干细胞注射液具有更强的成骨分化能力。

实施例12 人间充质干细胞注射液安全性研究-人间充质干细胞注射液体外溶血检测

以辅料45为受试辅料，以0.9%氯化钠注射液为阴性对照组，以超纯水为阳性对照着，按照GB/T 16886.4-2003进行体外溶血试验检测。

表7人间充质干细胞注射液体外溶血试验结果（n=3）

由表7可以看出，阴性对照管的吸光度为0.016±0.001，阳性对照管的吸光度应为0.860±0.035。根据GB/T 16886.4-2003的评价标准，阴性对照管的吸光度应不大于0.03且阳性对照管的吸光度应为0.8±0.3，判定本次试验正常。受试辅料管的吸光度为0.020±0.001，溶血率小于5%，判定辅料45对溶血性能无影响。

实施例13 人间充质干细胞注射液安全性研究-人间充质干细胞注射液皮肤致敏检测

以辅料48为受试辅料，以0.9%氯化钠注射液为阴性对照组，按照GB/T 16886.10-2017，采用豚鼠最大剂量法进行刺激与皮肤致敏试验检测。

表8人间充质干细胞注射液皮肤致敏试验结果（n≥5）

按照Magnμsson和Kligman分级标准对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应进行描述并分级。由表8可以看出，阴性对照组的致敏阳性率为0%，阳性对照组的致敏阳性率为100%，判定本次试验正常。在本次试验条件下，辅料48的浸提液未引起皮肤致敏反应，致敏阳性率为0%。

实施例14 人间充质干细胞注射液安全性研究-人间充质干细胞注射液急性全身毒性试验

以辅料48为受试辅料，以0.9%氯化钠注射液为阴性对照组，按照GB/T 16886.11-2011，进行全身毒性试验检测。

表9人间充质干细胞注射液急性全身毒性试验结果（n=5）

注：—表示未见异常症状。

按照GB/T 16886.11-2011，评价标准为：1）在72小时观察期内，试验组动物的反应不大于对照组动物，则判定试验样品合格。2）如试验组动物有2只以上（含2只）出现死亡，或2只以上（含2只）出现抽搐或俯卧，或3只以上（含3只）出现体重下降超过10%，则判断试验样品不符合实验要求。由表9可以看出，试验组动物的反应与阴性对照组动物反应相同。在本次试验条件下，辅料48的浸提液未引起急性毒性反应。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，在本发明的基础上做出的各种变化、变动、替换和变性，仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种人间充质干细胞注射液冻存辅料，其特征在于，所述人间充质干细胞注射液冻存辅料包括临床注射液和冷冻保护剂组合物；所述临床注射液包括0.9%氯化钠注射液、多种维生素注射液和复方氨基酸注射液；所述临床注射液还包括选自人血白蛋白注射液和右旋糖酐40葡萄糖注射液中的至少1种，以及选自复方电解质注射液和葡萄糖注射液中的至少1种；所述冷冻保护剂组合物包括丙二醇和海藻糖；

所述0.9%氯化钠注射液的浓度为50-95% v/v，所述多种维生素注射液的浓度为0.1-5%v/v，所述复方氨基酸注射液的浓度为1-15% v/v，所述人血白蛋白注射液的浓度为0-15%v/v，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液的浓度为0-10% v/v，所述人血白蛋白注射液和右旋糖酐40葡萄糖注射液的浓度之和为5-15% v/v，所述复方电解质注射液的浓度为0-15% v/v，所述葡萄糖注射液的浓度为0-15% v/v，所述丙二醇的浓度为1-15% v/v，所述海藻糖的浓度为1-15 μM。

2.根据权利要求1所述的人间充质干细胞注射液冻存辅料，其特征在于，所述临床注射液还包括生物素，所述生物素的浓度为0-100μg/mL。

3.根据权利要求2所述的人间充质干细胞注射液冻存辅料，其特征在于，在冻存辅料中，所述0.9%氯化钠注射液的浓度为50-85% v/v，所述多种维生素注射液的浓度为1-2% v/v，所述复方氨基酸注射液的浓度为8-12% v/v，所述复方电解质注射液和葡萄糖注射液的浓度之和为5-15% v/v，所述生物素的浓度为10-100μg/mL。

4.根据权利要求1所述的人间充质干细胞注射液冻存辅料，其特征在于，所述丙二醇的浓度为1-12% v/v，所述海藻糖的浓度为8-12μM。

5.一种人间充质干细胞注射液，其特征在于，包括人间充质干细胞和权利要求1-4中任一项所述的人间充质干细胞注射液冻存辅料。

6.根据权利要求5所述的人间充质干细胞注射液，所述人间充质干细胞来源于骨髓、脐带、脂肪组织、脐血、胎盘、羊膜、胎盘绒毛膜、牙髓、胸腺、滑膜、胎儿血或肝脏；在人间充质干细胞注射液中，人间充质干细胞的密度为1E6-4E7活细胞/mL。

7.权利要求1-4任一项所述的人间充质干细胞注射液冻存辅料或权利要求5或6所述的人间充质干细胞注射液在制备含有间充质干细胞的制剂或药物的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物用于治疗骨科疾病和/或衰老相关疾病。