CN108029677A - 一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法 - Google Patents

一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种内皮祖细胞的冻存液，包括以下含量的组分：混合糖电解质注射液80‑100mL、维生素C 2‑8mg/mL、维生素E 2‑8mg/mL、海藻糖3‑12g/mL、人血白蛋白注射液60‑75mL和珍珠草提取液5‑15mg/mL。冻存方法包括：将内皮祖细胞加入冻存液中，然后将温度降至‑20～‑25℃冻存1‑2h，然后以5℃/h的速率降温至‑40～‑45℃冻存2‑4h，再以5℃/h的速率降温至‑75～‑80℃冻存2‑4h，最后转移至液氮中保存。该冻存液配方简单，各组分相互配合，协同作用，可明显提高内皮祖细胞的冻存效果，不管是复苏后的活率还是增殖方面都可以保持较好的状态和良好的干细胞特性。

Description

一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法。
背景技术
血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，即能分化为成熟血管内皮细胞的细胞祖细胞，又称血管母细胞或血管内皮干细胞，来源于骨髓的原始细胞，与人类胚胎时期的成血管细胞和HUVEC相似，在一定条件下可诱导分化成为成熟的ECs。1997年，Asahara等首次分离并证实成年人外周血中存在着能分化成为血管内皮细胞的内皮祖细胞，并在体内证实了其生成血管的能力，人们开始了对内皮祖细胞各方面的研究。目前，内皮祖细胞先后从脐带、脂肪、骨髓和胎肝中被分离出来，并且内皮祖细胞的功能应用研究也取得了一定成果，为临床应用奠定了基础。骨髓中含有丰富细胞，如间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞等，骨髓中的血管内皮祖细胞可以游走到创伤组织参加新血管形成，并能分化为内皮细胞，促进局部血管生成和血管新生。目前已有研究者将EPCs用于治疗缺血性疾病，并取得了良好的治疗效果，具有再生和分化能力的EPCs已逐渐成为治疗血管系统疾病的理想细胞材料，因此，EPCs已成为近年来生命科学研究的热点。
现有的细胞冻存液用于骨髓内皮祖细胞时，冻存效果不佳，不能很好的保持内皮祖细胞的活性。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法，该冻存液冻存效果好，能很好的保持内皮祖细胞的活性。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种内皮祖细胞的冻存液，包括以下含量的组分：混合糖电解质注射液80-100mL、维生素C 2-8mg/mL、维生素E 2-8mg/mL、海藻糖3-12g/mL、人血白蛋白注射液60-75mL和珍珠草提取液5-15mg/mL。
进一步地，一种内皮祖细胞的冻存液，包括以下含量的组分：混合糖电解质注射液100mL、维生素C 6mg/mL、维生素E 5mg/mL、海藻糖10g/mL、人血白蛋白注射液65mL和珍珠草提取液12mg/mL。
进一步地，人血白蛋白注射液中白蛋白的质量体积百分浓度为20％。
进一步地，珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1-3:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入6-8倍重量的蒸馏水，在90-95℃加热6-8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
采用上述冻存液冻存内皮组细胞的方法，包括：将内皮祖细胞加入冻存液中，然后将温度降至-20～-25℃冻存1-2h，然后以5℃/h的速率降温至-40～-45℃冻存2-4h，再以5℃/h的速率降温至-75～-80℃冻存2-4h，最后转移至液氮中保存。
进一步地，将内皮祖细胞加入冻存液中，然后将温度降至-20℃冻存2h，然后以5℃/h的速率降温至-45℃冻存2h，再以5℃/h的速率降温至-80℃冻存3h，最后转移至液氮中保存。
进一步地，内皮祖细胞的冻存密度为1-5×106个/mL。
进一步地，内皮祖细胞的冻存密度为3×106个/mL。
本发明提供的一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法，具有以下有益效果：
(1)本发明冻存液中不含有动物源血清，可避免引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。
(2)二甲基亚砜有一定的毒性作用，浓度过高也会引起较高的渗透压，不利于细胞复苏，本发明冻存液中不含有二甲基亚砜，不会对细胞产生毒性，同时还有利于细胞的复苏。
(3)本发明冻存液配方简单，各组分相互配合，协同作用，可明显提高内皮祖细胞的冻存效果，不管是复苏后的活率还是增殖方面都可以保持较好的状态，并保持良好的干细胞特性。
具体实施方式
实施例1
一种内皮祖细胞的冻存液，包括以下含量的组分：混合糖电解质注射液80mL、维生素C 2mg/mL、维生素E 2mg/mL、海藻糖3g/mL、人血白蛋白注射液60mL和珍珠草提取液5mg/mL。
其中，人血白蛋白注射液中白蛋白的质量体积百分浓度为20％。
珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入6倍重量的蒸馏水，在90℃加热6h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
采用上述冻存液冻存内皮组细胞的方法，包括：取融合度为80％的P3代内皮祖细胞，用PBS清洗一遍，然后向细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分为三管，400g离心5min，去上清，加入上述冻存液中至细胞密度为1×106个/mL，然后将温度降至-20℃冻存1h，然后以5℃/h的速率降温至-40℃冻存2h，再以5℃/h的速率降温至-80℃冻存2h，最后转移至液氮中保存。
实施例2
一种内皮祖细胞的冻存液，包括以下含量的组分：混合糖电解质注射液100mL、维生素C 8mg/mL、维生素E 8mg/mL、海藻糖12g/mL、人血白蛋白注射液75mL和珍珠草提取液15mg/mL。
其中，人血白蛋白注射液中白蛋白的质量体积百分浓度为20％。
珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为3:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入8倍重量的蒸馏水，在90℃加热8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
采用上述冻存液冻存内皮组细胞的方法，包括：取融合度为80％的P3代内皮祖细胞，用PBS清洗一遍，然后向细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分为三管，400g离心5min，去上清，加入上述冻存液中至细胞密度为5×106个/mL，然后将温度降至-25℃冻存2h，然后以5℃/h的速率降温至-45℃冻存4h，再以5℃/h的速率降温至-80℃冻存4h，最后转移至液氮中保存。
实施例3
一种内皮祖细胞的冻存液，包括以下含量的组分：混合糖电解质注射液85mL、维生素C 4mg/mL、维生素E 4mg/mL、海藻糖5g/mL、人血白蛋白注射液65mL和珍珠草提取液8mg/mL。
其中，人血白蛋白注射液中白蛋白的质量体积百分浓度为20％。
珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为2:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入8倍重量的蒸馏水，在90℃加热8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
采用上述冻存液冻存内皮组细胞的方法，包括：取融合度为80％的P3代内皮祖细胞，用PBS清洗一遍，然后向细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分为三管，400g离心5min，去上清，加入上述冻存液中至细胞密度为2×106个/mL，然后将温度降至-20℃冻存1.5h，然后以5℃/h的速率降温至-40℃冻存2.5h，再以5℃/h的速率降温至-80℃冻存2.5h，最后转移至液氮中保存。
实施例4
一种内皮祖细胞的冻存液，包括以下含量的组分：混合糖电解质注射液95mL、维生素C 6mg/mL、维生素E 6mg/mL、海藻糖8g/mL、人血白蛋白注射液70mL和珍珠草提取液12mg/mL。
其中，人血白蛋白注射液中白蛋白的质量体积百分浓度为20％。
珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入8倍重量的蒸馏水，在90℃加热8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
采用上述冻存液冻存内皮组细胞的方法，包括：取融合度为80％的P3代内皮祖细胞，用PBS清洗一遍，然后向细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分为三管，400g离心5min，去上清，加入上述冻存液中至细胞密度为4×106个/mL，然后将温度降至-25℃冻存1.5h，然后以5℃/h的速率降温至-45℃冻存3.5h，再以5℃/h的速率降温至-80℃冻存3.5h，最后转移至液氮中保存。
实施例5
一种内皮祖细胞的冻存液，包括以下含量的组分：混合糖电解质注射液100mL、维生素C 6mg/mL、维生素E 5mg/mL、海藻糖10g/mL、人血白蛋白注射液65mL和珍珠草提取液12mg/mL。
其中，人血白蛋白注射液中白蛋白的质量体积百分浓度为20％。
珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入8倍重量的蒸馏水，在90℃加热8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
采用上述冻存液冻存内皮组细胞的方法，包括：取融合度为80％的P3代内皮祖细胞，用PBS清洗一遍，然后向细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分为三管，400g离心5min，去上清，加入上述冻存液中至细胞密度为3×106个/mL，然后将温度降至-20℃冻存2h，然后以5℃/h的速率降温至-45℃冻存2h，再以5℃/h的速率降温至-80℃冻存3h，最后转移至液氮中保存。
对比例1
冻存液包括以下体积百分比的组分：90％FBS+10％DMSO。
冻存方法，包括：取融合度为80％的P3代内皮祖细胞，用PBS清洗一遍，然后向细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分为三管，400g离心5min，去上清，加入上述冻存液中至细胞密度为3×106个/mL，然后置于-80℃冻存2天，再转移至液氮中保存。
对比例2
冻存液包括以下体积百分比的组分：20％右旋糖酐40+20％珍珠草提取液+50％FBS+10％DMSO。
冻存方法，包括：取融合度为80％的P3代内皮祖细胞，用PBS清洗一遍，然后向细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分为三管，400g离心5min，去上清，加入上述冻存液中至细胞密度为3×106个/mL，然后置于-80℃冻存2天，再转移至液氮中保存。
对比例3
冻存液包括以下体积百分比的组分：20％复方氨基酸注射液+20％珍珠草提取液+50％人血蛋白注射液+10％DMSO。
冻存方法，包括：取融合度为80％的P3代内皮祖细胞，用PBS清洗一遍，然后向细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分为三管，400g离心5min，去上清，加入上述冻存液中至细胞密度为3×106个/mL，然后置于-80℃冻存2天，再转移至液氮中保存。
对比例4
冻存液与实施例5中冻存液相同，但冻存方法不同。
冻存方法，包括：取融合度为80％的P3代内皮祖细胞，用PBS清洗一遍，然后向细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分为三管，400g离心5min，去上清，加入上述冻存液中至细胞密度为3×106个/mL，然后置于-80℃冻存2天，再转移至液氮中保存。
试验例1
将实施例1-5和对比例1-4冻存的细胞半年后取出复苏，复苏的方法为：
1、从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快熔化；
2、从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀，然后1000r/min离心5min；
3、弃去上清液，加入培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度为3×106个/mL，接种培养瓶，于37℃培养箱静置培养。
复苏后计数细胞回收率、细胞活率及7天后的细胞数：
细胞回收率＝复苏后细胞数/冻存时细胞数*100％；
细胞活率：细胞复苏后取样，用0.4％台盼蓝1:1染色后，置于显微镜下，计算活细胞数及死细胞数，细胞活率＝活细胞数/总细胞数*100％；
细胞增殖情况：把复苏后的细胞，按10000个细胞每孔接种于12孔板中，连续培养，每天取样计数，作三个重复，观察细胞的增殖情况。
试验结果如下：
由上述结果可知，在细胞回收率、细胞活率和7天后细胞数量上，实施例组明显高于对比例组，说明本发明提供的冻存液及冻存方法冻存效果佳，且能保持内皮祖细胞很好的细胞活性。

Claims (8)

1.一种内皮祖细胞的冻存液，其特征在于，包括以下含量的组分：混合糖电解质注射液80-100mL、维生素C 2-8mg/mL、维生素E 2-8mg/mL、海藻糖3-12g/mL、人血白蛋白注射液60-75mL和珍珠草提取液5-15mg/mL。
2.根据权利要求1所述的内皮祖细胞的冻存液，其特征在于，包括以下含量的组分：混合糖电解质注射液100mL、维生素C 6mg/mL、维生素E 5mg/mL、海藻糖10g/mL、人血白蛋白注射液65mL和珍珠草提取液12mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的内皮祖细胞的冻存液，其特征在于，人血白蛋白注射液中白蛋白的质量体积百分浓度为20％。
4.根据权利要求1或2所述的内皮祖细胞的冻存液，其特征在于，珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1-3:1混合，然后进行CO2超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入6-8倍重量的蒸馏水，在90-95℃加热6-8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。
5.采用权利要求1-4任一项所述的冻存液冻存内皮祖细胞的方法，其特征在于，包括：将内皮祖细胞加入冻存液中，然后将温度降至-20～-25℃冻存1-2h，然后以5℃/h的速率降温至-40～-45℃冻存2-4h，再以5℃/h的速率降温至-75～-80℃冻存2-4h，最后转移至液氮中保存。
6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，将内皮祖细胞加入冻存液中，然后将温度降至-20℃冻存2h，然后以5℃/h的速率降温至-45℃冻存2h，再以5℃/h的速率降温至-80℃冻存3h，最后转移至液氮中保存。
7.根据权利要求5或6所述的冻存方法，其特征在于，内皮祖细胞的冻存密度为1-5×106个/mL。
8.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，内皮祖细胞的冻存密度为3×106个/mL。
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