CN105211051A - 一种培养后的nk细胞的冻存液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞冻存液技术领域，具体涉及一种培养后的NKT细胞的冻存液及其制备方法，本发明的培养后的NK细胞的冻存液包含茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，由于其采用自体血清，不存在外源动物病毒的污染及外源蛋白质的引入，安全性高；其中加入的茶多酚、葡萄籽提取物(原花青素)、维生素C不仅能有效的抑制细胞氧化，保持细胞的活性，对人体无任何伤害，而且冻存复苏后细胞的状态基本接近冻存前的状态，冻存效果好。

Description

一种培养后的NK细胞的冻存液及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞冻存液技术领域，具体涉及一种培养后的NK细胞的冻存液及其制备方法。

背景技术

细胞冻存是长期保存维持细胞活性的一种有效方法，其冻存经过低温冷冻保存和超低温冷冻保存两个阶段，低温冷冻保存可以降低细胞的代谢，而超低温(-198℃的液氮中)冷冻保存可以保存活细胞物质代谢和几乎完全停止细胞生长，在超低温冻存是，调节和控制细胞生长代谢的各种酶的活性受到抑制，使细胞内的生化反应十分缓慢，甚至停止，从而保持了细胞的活性。

但是如果单纯的冻存，在冻存过程中细胞会受到两个方面的损伤：第一，在冻存的过程中，胞外的水分首先结冰，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，造成细胞死亡，属于渗透性损伤；第二，由于低温导致细胞胞内部形成冰晶会破坏细胞内的结构，属于机械损伤。因此结合以上两点原因，必须解决冷冻的速度，及冻存剂的配方，复苏时融冻的速度也直接影响细胞的活性。

细胞冻存液是指用于保护细胞免受冷冻损失的物质，一般可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冻存液主要是小分子物质，易溶于水，与水分子结合能力强，容易通过细胞膜进入细胞内，降低细胞的冰点，提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成，从而减小冰晶的损伤。

近几年NK细胞对治疗癌症等疾病的研究及应用较为广泛，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关。其占循环中淋巴细胞族群的5-10％，可以分泌穿孔素及肿瘤坏死因子，摧毁目标细胞，有重要的治疗意义，因此，NK细胞通过冻存保存其活性和功能也尤为重要。为了避免长时间的培养而增加的成本、培养时间超过最佳对数生长期后细胞的生长状态及活性的下降而影响细胞的治疗质量和患者多次采血而增加的伤痛等问题，保存培养后的NK细胞也成了必要的方法之一，也因此保存的冻存液也直接影响到了细胞冻存的质量，最主要的是细胞冻存后复苏的活率，这样还可以将健康状态下的NK细胞保存起来，以防将来不时之需。

现有技术主要是采取胎牛血清(FBS)、二甲基亚砜(DMSO)和RPMI-1640培养基按不同比例配制冻存液来进行NK细胞培养后的保存，或是采用自体血清代替胎牛血清进行冻存。虽然前一种方法保存细胞的时间长，但是采用胎牛血清配制的冻存液，就引入了外源蛋白，增加了病原污染的风险。采用自体血清代替胎牛血清能够完全杜绝外源污染物感染的风险，但是冻存后复苏培养的NK细胞活性低。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种临床安全性高，同时又能很好的保持冻存细胞活性的细胞冻存液，用于冻存培养后的NK细胞。

本发明还提供一种培养后的NK细胞的冻存液的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现该目的：

一种培养后的NK细胞的冻存液，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：0.5～2，其中：

溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为3～6：1；

自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该细胞的冻存液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0.5～5mg/ml、0.125～0.5mg/ml、0.5～5mg/ml。

作为优选的，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：0.5～1，其中：

溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为3～5：1；

自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该细胞的冻存液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0.5～2.75mg/ml、0.125～0.3125mg/ml、0.5～2.75mg/ml。

作为另一优选的，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：1～2，其中：

溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为5～6：1；

自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该自体血清混合液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为2.75～5mg/ml、0.3125～0.5mg/ml、2.75～5mg/ml。

一种培养后的NK细胞的冻存液的制备方法，包括以下步骤：

1)自体血清混合液的配制：分别称取适量茶多酚、葡萄籽提取物和维生素C加入自体血清中，制得自体血清混合液；

2)溶液A的配制：向步骤1)中制得的自体血清混合液中缓慢加入DMSO，自体血清混合液与DMSO的体积比为3～6：1，制得溶液A，置于2～8℃度冰箱预冷，备用；

3)将预冷后的溶液A取出，缓慢加入到自体血清中，溶液A和自体血清的体积比为1：0.5～2，制得冻存液，其中，茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0.5～5mg/ml、0.125～0.5mg/ml、0.5～5mg/ml。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的培养后的NK细胞的冻存液包含茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，由于其采用自体血清，不存在外源动物病毒的污染及外源蛋白质的引入，安全性高；其中加入的茶多酚、葡萄籽提取物(原花青素)、维生素C不仅能有效的抑制细胞氧化，保持细胞的活性，对人体无任何伤害，而且冻存复苏后细胞的状态基本接近冻存前的状态，冻存效果好。

附图说明

图1为冻存前的NK细胞形态图。

图2为冻存后的实验组1的NK细胞形态图。

图3为冻存后的实验组2的NK细胞形态图。

图4为冻存后的实验组3的NK细胞形态图。

图5为冻存后的对照组的NK细胞形态图。

图6为冻存前后的NK细胞杀伤活性曲线图。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。

实施例1、

本实施例提供一种培养后的NK细胞的冻存液的制备方法，包括以下步骤：

1)自体血清混合液的配制：分别称取适量茶多酚、葡萄籽提取物和维生素C加入自体血清中，制得自体血清混合液；

2)溶液A的配制：向步骤1)中制得的自体血清混合液中缓慢加入DMSO，自体血清混合液与DMSO的体积比为3～6：1，制得溶液A，置于2～8℃度冰箱预冷，备用；

3)将预冷后的溶液A取出，缓慢加入到自体血清中，溶液A和自体血清的体积比为1：0.5～2，制得冻存液，其中，茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0.5～5mg/ml、0.125～0.5mg/ml、0.5～5mg/ml。

实施例2、

本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NK细胞的冻存液，由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：0.5，其中：

溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为3：1；

自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该自体血清混合液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0.5mg/ml、0.125mg/ml、0.5mg/ml。

实施例3、

本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NK细胞的冻存液，由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：2，其中：

溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为6：1；

自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该自体血清混合液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为5mg/ml、0.5mg/ml、5mg/ml。

实施例4、

本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NK细胞的冻存液，由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：1，其中：

溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为4.5：1；

自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该自体血清混合液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为2.75mg/ml、0.3125mg/ml、2.75mg/ml。

对比例1、

本对比例配制常规细胞冻存液，所述常规细胞冻存液为含有10％DMSO的FBS。

实施例5、NK细胞的扩增培养及收集

1、外周血单核球的分离

1)采集10～80ml的外周血，将其与生理盐水按体积比1：1的比例混匀，将混匀后的血液混合液与淋巴细胞分离液按体积比2:1的比例缓慢的加至淋巴细胞分离液上层，3000rpm离心20min；

2)离心后离心管的从上到下看，分别为血浆、白膜层，即单个核细胞层(PBMC)、淋巴细胞分离液、红细胞层，抽取PBMC层，将收集到的PBMC用生理盐水洗涤重悬后，1500rpm离心10min，重复洗涤两次，收集到PBMC；

2、NK细胞的扩增培养

1)将上述1中收集到的PBMC用RPMI1640基础培养基重悬，按1*10⁶个/ml密度接种于NK细胞试剂盒中诱导培养NK细胞，置于37℃，浓度为5％的CO₂培养箱中培养；

2)诱导5天后，进行补液，全量补加IL-2500U/ml，补液前细胞密度不大于3*10⁶个/ml，补液后细胞密度在0.5-1.0*10⁶个/ml，每隔3天补液和补加细胞因子。

3)直至第14天收集细胞。

实施例6、对培养后的NK细胞的冻存试验

1)分别利用实施例2～4制备的冻存液作为实验组1～3对培养后的NK细胞进行冻存，利用对比例1制备的常规细胞冻存液作为对照组对培养后的NK细胞进行冻存。

实验组1：用实施例2制备的NK细胞冻存液重悬NK细胞，细胞密度为10⁶个/ml细胞悬液，每个冻存管1ml/管。

实验组2：用实施例3制备的NK细胞冻存液重悬NK细胞，细胞密度为10⁶个/ml细胞悬液，每个冻存管1ml/管。

实验组3：用实施例4制备的NK细胞冻存液重悬NK细胞，细胞密度为10⁶个/ml细胞悬液，每个冻存管1ml/管。

对照组：用对比例1制备的常规细胞冻存液重悬NK细胞，细胞密度为10⁶个/ml细胞悬液，每个冻存管1ml/管。

2)将上述各冻存管先放入冻存盒中，再将冻存盒放入程序降温仪中进行冻存，然后再将冻存管迅速的转移至液氮中冻存。

实施例7、NK细胞的复苏

1)将恒温水浴锅加热至37℃，迅速取出上述各组在液氮中冻存了半年(180天)的细胞冻存管，转移至水浴锅中恒温水浴，直至完全溶解，再将溶解后的细胞悬液移至加有完全培养基的离心管中洗涤离心；

2)将上述离心后的细胞用完全培养基重悬培养24h，按10⁶/ml个细胞接种于培养瓶中，全量添加IL-2500U/ml细胞生长因子，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

实施例8、NK细胞冻存前后的形态观察

将冻存前后的各组NK细胞在倒置显微镜下观察细胞形态，形态观测结果如图1～5所示，观测结果表明，3组实验组复苏后的NK细胞与冻存前的细胞形态冻存前后无明显差异，细胞饱满，透亮光泽，而且有较多的细胞结团，相对对照组，本发明的细胞冻存液对细胞冻存的影响较小。

实施例9、各组NK细胞冻存前与复苏后的各项指标检测

1)NK细胞冻存前后的活率检测

将冻存前后的NK细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞活率，如下表1所示。

表1NK细胞冻存前后细胞活率

组别	细胞活率
		冻存前NK细胞	98.9％
冻存后NK细胞－实验组1	97.2％
		冻存后NK细胞－实验组2	97.1％
冻存后NK细胞－实验组3	98.5％
		冻存后NK细胞－对照组	80.6％

从标1可以看出实验组冻存后复苏的细胞活率接近冻存前，尤其是实验组3的结果最佳，而实验组的细胞活率都高于对照组，说明本发明的细胞冻存液能够保持细胞的活性，冻存复苏后细胞的状态基本接近冻存前的状态，冻存效果好。

2)NK细胞冻存前后的杀伤活力检测

将冻存前后的培养后的NK细胞进行杀伤活性的检测，采用乳酸脱氢酶(LDH)法，以K562细胞为靶细胞，分别检测各组冻存前后的NK细胞，即效应细胞的杀伤活力。效靶比分别为40：1、20：1、10：1、5：1的细胞数比例将效应细胞及靶细胞加入96孔板，靶细胞数为10⁴个/孔，每种效靶比设4个平行孔，每孔200ul。均采用RPMI1640培养基重悬。于37℃，5％CO₂培养箱中孵育4h，然后用LDH-CytotoxicityColorimetricAssayKitII(美国，BioVision，货号：K313-500)试剂盒进行检测，采用酶标仪检测波长在490nm时的吸光值(A)。杀伤活力的计算公式为：NK细胞活性(％)＝(实验-NK细胞自发-K562自发)/(K562最大-K562自发)×100％，结果如附图6所示。

从附图6的结果可以看出各组NK细胞对K562细胞的杀伤活随效靶比的增高而增强，实验组的NK细胞复苏后与冻存前细胞杀伤活力均无明显差异，而对照组复苏后的NK细胞在不同的效靶比时杀伤活力均明显低于冻存前的细胞。

3)NK细胞冻存前后免疫表型检测

将冻存前与复苏后的收集的NK细胞用PBS重悬NK细胞，密度为10⁶个/ml，加入FITC标记的CD16和PE标记的CD56抗体，室温避光孵育30min后，用流式细胞仪检测，检测具有相应免疫表型的细胞比例(％)，检测结果如表2所示：

表2NK细胞冻存前后的免疫表型检测结果

组别	CD16+CD56+
		冻存前NK细胞	90.7±0.41
冻存复苏后的NK细胞－实验组1	89.1±0.24
		冻存复苏后的NK细胞－实验组2	89.3±0.15

冻存复苏后的NK细胞－实验组3	90.1±0.82
		冻存复苏后的NK细胞－对照组	80.1±1.79

从表2的结果可以看出，冻存前后的NK细胞的免疫表型存在一定差异，实验组比对照组的免疫表型检测结果高，说明本发明的细胞冻存液的冻存效果更好。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种培养后的NK细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：0.5～2，其中：

溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为3～6：1；

自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该细胞的冻存液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0.5～5mg/ml、0.125～0.5mg/ml、0.5～5mg/ml。

2.根据权利要求1所述的培养后的NK细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：0.5～1，其中：

溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为3～5：1；

自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该细胞的冻存液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0.5～2.75mg/ml、0.125～0.3125mg/ml、0.5～2.75mg/ml。

3.根据权利要求1所述的培养后的NK细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：1～2，其中：

溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为5～6：1；

自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该自体血清混合液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为2.75～5mg/ml、0.3125～0.5mg/ml、2.75～5mg/ml。

4.一种培养后的NK细胞的冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)自体血清混合液的配制：分别称取适量茶多酚、葡萄籽提取物和维生素C加入自体血清中，制得自体血清混合液；

2)溶液A的配制：向步骤1)中制得的自体血清混合液中缓慢加入DMSO，自体血清混合液与DMSO的体积比为3～6：1，制得溶液A，置于2～8℃度冰箱预冷，备用；

3)将预冷后的溶液A取出，缓慢加入到自体血清中，溶液A和自体血清的体积比为1：0.5～2，制得冻存液，其中，茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0.5～5mg/ml、0.125～0.5mg/ml、0.5～5mg/ml。