ES2588438T3 - Materiales y métodos para la recogida hipotérmica de sangre entera - Google Patents

Abstract

Un método para el almacenamiento hipotérmico de sangre entera, comprendiendo el método: (a) diluir un volumen de una muestra de sangre entera en un volumen de solución de preservación adaptada al equilibrio osmótico celular a temperaturas hipotérmicas, de tal forma que la relación de sangre entera con respecto a la solución de preservación es de al menos aproximadamente 1:0, 1 en volumen; y (b) mantener la mezcla de sangre entera/solución de preservación de aproximadamente 2 oC a aproximadamente 18 oC; en el que la mezcla de sangre entera/solución de preservación está exenta de un reactivo anticoagulante introducido de manera exógena, y la solución de preservación comprende: una solución acuosa de electrolitos que contiene iones de potasio a un intervalo de concentración de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mM, iones de sodio a un intervalo de concentración de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 mM, iones de magnesio a un intervalo de concentración de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mM, iones de cloro a un intervalo de concentración de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mM, e iones de calcio a un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 mM; un anión impermeante; manitol; un agente oncótico macromolecular; al menos un azúcar simple; un sustrato para la regeneración de ATP, y un tampón de pH biológico eficaz en condiciones hipotérmicas fisiológicas.

Description

Materiales y metodos para la recogida hipotermica de sangre entera.

5 ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Las tecnicas de biopreservacibn de celulas sangufneas (BC) eficaces para mantener la viabilidad y la funcibn ex vivo representan la base de los bancos de sangre modernos. Los procesos de rutina, tales como la recogida, el almacenamiento y el transporte, que se realizan por los centros de donacibn y los servicios de transfusion, se basan 10 en la capacidad de prevenir o retrasar los efectos bioqufmicos, bioffsicos y morfolbgicos perjudiciales de la preservacibn de BC ex vivo. El campo de la biopreservacion de BC se impulsa en gran medida por la necesidad clfnica de los productos de BC.

El mantenimiento de la calidad y seguridad de los productos sangufneos usados clmicamente requiere tecnicas 15 eficaces para la preservacibn de la viabilidad y la funcion de BC. Los danos a las BC inducidos por la biopreservacion tienen un impacto significativo sobre la eficacia de la transfusibn y se pueden vincular a efectos pro- inflamatorios e inmunomoduladores, un aumento de las infecciones, un aumento de la duracion de la estancia en el hospital, y un aumento de la morbilidad y la mortalidad.

20 La mejora de las practicas de almacenamiento de BC hipotbrmico puede tener un enorme efecto sobre la disponibilidad de unidades de sangre para transfusibn, la seguridad y la calidad; adembs, extendiendo los tiempos de almacenamiento hipotermicos mejora la logfstica de la sangre por la disminucibn de las perdidas de BC debido a la expiracion y el transporte, y mejorando el almacenamiento de sangre autologo y remoto. Durante los ultimos 25 anos, la investigacion de la biopreservacion de BC se ha centrado en las modificaciones de la composicion de 25 solucion de almacenamiento, los protocolos de extraccion de sangre, y los dispositivos en un esfuerzo para alargar el almacenamiento hipotermico de BC.

Sin embargo, las tecnicas para el almacenamiento Ifquido de BC han permanecido relativamente sin cambios desde su creacion en la decada de 1940, y el progreso en la mejora de la calidad y la funcibn de los BC almacenados 30 hipotermicamente ex vivo ha sido muy lento. El enfoque actual de la medicina transfusional ha pasado de extender los tiempos de almacenamiento a la mejora de la calidad de los productos sangufneos almacenados hipotbrmicamente.

Un objeto de la presente invencibn es proporcionar metodos y materiales mejorados para la recogida y transporte 35 hipotermico de sangre entera que mejoren ambos la calidad y extiendan la viabilidad de la sangre entera, incluyendo la sangre del cordon umbilical, y los componentes aislados a partir de la misma.

RESUMEN DE LA INVENCION

40 Existe la necesidad, satisfecha por las realizaciones de la presente invencibn, de una mejor calidad y tiempos de mantenimiento extendidos para las unidades de sangre entera o componentes de la misma. Como se desvela en el presente documento, esto se realiza cuando dichos materiales biologicos se conectan con y/o estbn contenidos en un entorno rico en nutrientes bptimo en condiciones hipotermicas. Ademas, la utilizacibn de dichas soluciones sin suero y sin protefnas como el entorno hipotermico preferido crea una circunstancia optima que permite una 45 compatibilidad de preservacibn criogenica para las cblulas entre las soluciones de transporte y crioprotectoras, ademas de eliminar el riesgo de transmisibn biologico xenografico.

La presente invencibn se basa en el descubrimiento de que puede usarse una solucion de preservacibn hipotermica para recoger sangre entera y aislar componentes celulares de la misma como se expone en el presente documento. 50 Cualquier solucion de preservacibn que se formula para reducir la acumulacion de radicales libres en las celulas que experimentan una preservacibn hipotermica para ayudar a mediar el nivel de necrosis y apoptosis post- almacenamiento, disminuyendo directamente de esta manera el nivel de muerte celular durante y tras el intervalo de preservacibn, es adecuada para su uso. Ademas, se observan beneficios adicionales cuando se realiza un almacenamiento congelado a largo plazo de componentes celulares aislados usando una solucion de 55 criopreservacion formulada para abordar los aspectos biologicos moleculares de las celulas durante el proceso de criopreservacion reduciendo directamente de esta manera el nivel de muerte celular de aparicibn retardada inducida por la criopreservacion y mejorando la viabilidad y la funcibn celular post-preservacibn. Atravbs de la modulacion de la respuesta bioqufmica celular al proceso de preservacibn, tal solucion de preservacibn puede mejorar la viabilidad y la funcionalidad celular eliminando al mismo tiempo la necesidad de incluir suero, proteinas o altos niveles de

agentes citot6xicos. En base a estos descubrimientos, son ahora posible preparaciones y manipulaciones de sangre entera que no se habian descrito previamente, incluyendo, por ejemplo, sangre del corddn umbilical, que son inesperados y superan las limitaciones de las preparaciones y protocolos convencionales.

5 En un aspecto, la invencidn se refiere a un mdtodo para el almacenamiento hipotermico de sangre entera como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende una mezcla de sangre entera y una solucidn de preservacidn adaptada al equilibrio osmdtico celular a temperaturas hipotermicas como se define en las 10 reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La presente invencion puede describirse de forma ilustrativa en referencia al dibujo adjunto, en el que:

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La figura 1 es un grdfico de barras que muestra viabilidad de las celulas sangufneas despuds del almacenamiento hipotermico en HYPOTHERMOSOL®, de acuerdo con una realizacidn ilustrativa de la invencidn.

La figura 2 es un grafico de barras que muestra la recuperacion de cdlulas nucleadas, y celulas CD34 y 20 CD45 positivas viables, de acuerdo con una realizacidn ilustrativa de la invencion.

La figura 3 es un grafico de barras que compara la viabilidad celular media de las muestras sanguineas recogidas en bolsas pre-rellenadas con HYPOTHERMOSOL® en comparacidn con los valores medios de muestras sangufneas recogidas en bolsas que contienen anticoagulante, de acuerdo con una realizacidn ilustrativa de la invencidn.

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DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Existe la necesidad, satisfecha por las realizaciones de la presente invencidn, de una mejor calidad y tiempos de mantenimiento extendidos para las unidades de sangre entera o componentes de la misma. Como se desvela en el 30 presente documento, esto se realiza cuando dichos materiales biologicos entran en contacto con y/o estan contenidos en un entorno rico en nutrientes optimo en condiciones hipotermicas. Ademas, la utilizacion de dichas soluciones sin suero y sin protefnas como el entorno hipotermico preferido crea una circunstancia optima que permite una compatibilidad de preservacion criogenica para las celulas entre las soluciones de transporte y crioprotectoras, ademas de eliminar el riesgo de transmision biologico xenografico. Tal solucion preferida es 35 HYPOTHERMOSOL®. Una vez que se aplica HYPOTHERMOSOL® o un equivalente funcional del mismo a la sangre entera, se produce una accion directa de osmosis que permite que las cdlulas se saturen completamente con HYPOTHERMOSOL®. Esto es dptimo cuando se usan adicionalmente junto con su homdlogo crioconservante qufmicamente compatible, tal como CRYOSTOR™ (BioLife Solutions, Inc., Bothell, WA) o un equivalente funcional del mismo.

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La linea HYPOTHERMOSOL® de soluciones de preservacion esta disefiada para preparar y conservar cdlulas, tejido y organos para entornos hipotdrmicos (es decir, baja temperatura, por ejemplo, aproximadamente 2-10 °C) y almacenamiento o trasporte hipotermico a corto plazo. Por ejemplo, HYPOTHERMOSOL® se ha disefiado para abordar los requisitos moleculares de cdlulas aisladas durante un proceso de preservacidn hipotdrmico (por ejemplo, 45 aproximadamente 2-10 °C). Se ha formulado para reducir la acumulacion de radicales libres en las celulas que se someten a preservacidn hipotdrmica, lo que ayuda a medir el nivel de necrosis y apoptosis post-almacenamiento reduciendo directamente de esta manera el nivel de muerte celular durante y tras el intervalo de preservacidn. Por ejemplo, se ha demostrado que HTS-FRS es muy eficaz en la preservacidn de tejidos de miocardio y de rihon, ambos de los cuales tienen elevadas demandas energdticas que pueden conducir a la acumulacion de radicales 50 libres.

Como se contempla en el presente documento, un entorno, condicion o solucidn hipotdrmica se refiere a un entorno, condicidn o solucidn a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 18grados Celsius, preferiblemente de aproximadamente 0 a aproximadamente 15grados Celsius, mas preferiblemente de 55 aproximadamente 2 a aproximadamente 18grados Celsius, pero mas preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 grados Celsius, incluso mas preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 grados Celsius, y mucho mds preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 grados Celsius.

Son especialmente importantes los beneficios obtenidos al usar los materiales y mdtodos de la presente invencidn

junto con HYPOTHERMOSOL® de forima coordinada con sus productos asociados especialmente formulados de la familia CRYOSTOR™ de soluciones de preservacibn cuando se desea un almacenamiento en congelacion a largo plazo. Disenado para preparar y preservar celulas en entornos a temperatura ultra baja (por ejemplo, de aproximadamente -80 °C a aproximadamente -196 °C), CRYOSTOR™ proporciona un entorno protector y seguro 5 para celulas y tejidos durante el proceso de congelacion, almacenamiento y descongelacion. CRYOSTOR™, un miembro de la plataforma HYPOTHERMOSOL® de BioLife, esta formulado unicamente para abordar los aspectos de la biologia molecular de las celulas durante el proceso de criopreservacibn, reduciendo directamente de esta manera el nivel de muerte celular de aparicion retardada inducida por la criopreservacibn y mejorando la viabilidad y la funcion celular despues de la descongelacibn. A traves de la modulacion de la respuesta bioquimica celular al 10 proceso de criopreservacion, CRYOSTOR™ proporciona una mejor viabilidad y funcionalidad celular, eliminando al mismo tiempo la necesidad de incluir suero, protelnas o altos niveles de agentes citotoxicos. Por ejemplo, CRYOSTOR™ CS-5 es un medio de criopreservacion de formula exclusiva que contiene sulfoxido de dimetilo al 5 % (DMSO). CRYOSTOR™ ha demostrado mejorar significativamente la viabilidad y la funcion celular tras la criopreservacion en comparacion con los planteamientos de medio de cultivo + suero + DMSO convencionales. 15 Ademas de mejorar la supervivencia y la funcion celular general, CRYOSTOR™ CS-5 tambien proporciona la ventaja de ser un medio de criopreservacibn sin protelnas y sin suero completamente definido.

Se entiende que, cuando se hace referencia de principio a fin, HYPOTHERMOSOL® y CRYOSTOR™ se identifican y se denominan como soluciones de preservacibn y criopreservacibn ejemplares, respectivamente, y que la presente 20 invencibn contempla HYPOTHERMOSOL® y CRYOSTOR™ como realizaciones ejemplares de soluciones de preservacibn y criopreservacibn, respectivamente, adecuadas para su uso con la sangre, celulas, materiales y metodos expuestos en el presente documento. Se entiende adicionalmente que la presente invencibn tambien contempla equivalentes funcionales tanto de HYPOTHERMOSOL® como de CRYOSTOR™; todo lo que se precisa es que una solucibn de preservacibn o criopreservacibn cumpla los requisitos funcionales expuestos en el presente 25 documento y los realice de una manera comparable al usarse de acuerdo con las presentes ensefianzas. Los equivalentes funcionales de HYPOTHERMOSOL® o CRYOSTOR™ pueden identificarse y reconocerse facilmente por el experto que pone en practica las ensefianzas desveladas en el presente documento.

Los usos de una solucibn de preservacibn hipotermica para la recogida hipotbrmica, transporte hipotermico y 30 almacenamiento hipotbrmico provisional de productos de sangre entera, incluyendo componentes celulares aislados de los mismos, no se habian desvelado hasta ahora. De hecho, la recogida hipotbrmica de productos de sangre entera como se describe en el presente documento es contraria a las metodologfas convencionales. Es decir, segun se describe en el presente documento, la sangre entera se diluye significativamente (al menos aproximadamente 1 parte de sangre con respecto a 0,1 partes de solucibn de preservacibn) tras la recogida y despues se transporta 35 y/o se almacena. Ademas, es contraria a las metodologfas convencionales para recoger sangre entera en ausencia de un anticoagulante como se describe en el presente documento, asf como inesperado que las poblaciones especificas de celulas puedan ser aun facilmente aisladas de dichas preparaciones diiuidas de sangre entera usando metodologlas de recoleccibn de cblulas convencionales y, de manera importante, que dichas celulas aisladas tengan al menos una viabilidad tanto pre-preservacion como post-preservacion al menos comparable, si no 40 mejorada. Estos resultados inesperados estan relacionados directamente con el entorno hipotermico bptimo proporcionado por una solucibn de preservacibn tal como HYPOTHERMOSOL®, o un equivalente funcional del mismo, asf como el entorno criotermico bptimo proporcionado por una solucibn de criopreservacibn tal como CRYSTOR™, o un equivalente funcional del mismo.

45 Al utilizar CRYOSTOR™, o un crioprotector similar que se exceda en el proceso criogenico permitiendo una mayor viabilidad post-descongelacion de las cblulas con concentraciones reducidas de un agente crioprotector (10% o menos de DMSO), reduciendo de esta manera la toxicidad potencial, es importante apreciar la relacion entre el fluido de transporte de nutrientes HYPOTHERMOSOL® y el medio de criopreservacibn compatible CRYOSTOR™. Por ejemplo, dado que la solucibn de nutrientes es capaz de penetrar la biologia celular de los componentes de la 50 sangre del cordon umbilical, prepara de manera autonoma las celulas para una saturacion posterior del crioconservante seleccionado requerido para el proceso criogenico. Es significativo que no sea necesario ningbn lavado de la solucibn de nutrientes antes del contacto posterior con el crioconservante. Esta optimizacibn del proceso a traves de la eliminacion de cualquier etapa de lavado para eliminar la solucibn de matriz de nutriente permite una mayor viabilidad celular y reduce el dano, lo que a su vez disminuye la posibilidad de daho celular. 55 Tambien pueden afiadirse de forma optima enzimas, productos qufmicos y/o nutrientes adicionales para mejorar la viabilidad celular.

Aunque la combinacion de la utilizacibn de HYPOTHERMOSOL® y CRYOSTOR™ crea un protocolo de congelacion criogenica optima para la compatibilidad entre la solucibn de nutrientes y el medio de criopreservacibn, pueden

usarse de forma 6ptima otros crioprotectores que comprenden uno o mas agentes seleccionados entre el grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, lactosa, glucosa, DMSO, propilenglicol, etilenglicol, un dextrano, glicerol, almiddn de hidroxietilo, polivinilpirrolidona, formamida, 1-2-propanodiol, etanol, metanol y polietileno.

5 Actualmente, el trasplante de sangre del corddn umbilical ofrece la posibilidad de curar una diversidad de leucemias y linfomas, mieloma multiple y otros trastornos de las celulas plasmaticas, SCID y otros trastornos del sistema inmune hereditarios, sindrome de Hurler y otros trastornos metabdlicos heredados, trastornos mielodispldsicos y mieloproliferativos, y otras neoplasias, incluyendo varios canceres infantiles.

10 La recoleccion eficaz para el almacenamiento de sangre del cordon umbilical necesita que el cordon umbilical del neonato se corte muy pronto, en 30 segundos desde el nacimiento (vaginal o por cesdrea), antes de que deje de palpitar, desviando de esta manera la sangre valiosa lejos del neonato. La cantidad de sangre que se extrae de la recoleccion del cordon es de 100 ml de media (variando de 60 ml a 180 ml), equivalente a 1/3-1/2 del volumen de sangre total del neonato. Una recogida de sangre del cordon umbilical adecuada requiere al menos 75-80 ml para 15 asegurar que habrd celulas suficientes para usarse en el trasplante. Despues de la recogida, la unidad de sangre del cordon umbilical se envla a un laboratorio para el procesamiento y criopreservacidn.

Existen dos metodos de recogida de sangre del cordon umbilical de la vena umbilical: antes de expulsar la placenta (in utero), y despues (ex utero). Con el metodo de recogida ex utero, la sangre del cordon umbilical se recoge 20 despues de la expulsidn de la placenta y el cordon umbilical del recidn nacido se pinza. La tecnica de recogida establecida es colocar la placenta en una estructura de soporte esteril con el corddn umbilical colgando a traves del soporte. La sangre se recoge por drenaje por gravedad produciendo 40-150 ml de sangre del cordon umbilical. Se realiza un metodo de recogida similar in utero, excepto que la sangre del corddn umbilical se recoge despuds de que se haya expulsado el bebd pero antes de la expulsion de la placenta.

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Una vez recogidas, las celulas pueden aislarse en la suspensidn de sangre entera de HYPOTHERMOSOL®. Las suspensiones se cargan en Ficoll-Hypaque y la densidad se centrifugo a x435 g durante 30 min. Las celulas mononucleares se eliminan cuidadosamente de la capa de interfase y se lavan dos veces con HBSS mds EDTA. Los recuentos de celulas nucleadas totales se realizan usando un contador Coulter.

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Como alternativa, las celulas mononucleares se alslan de la sangre entera, tal como, por ejemplo, sangre del corddn umbilical usando PrepaCyte® (BioE; St. Paul, MN). A modo de ejemplo, se mezclan volumenes iguales de PrepaCyte®-WBC (BioE; St. Paul, MN) y sangre del cordon umbilical en tubos conicos de 50 ml. A continuacion, usando un agitador basculante, los tubos se mezclan completamente suavemente (durante 20 minutos a 35 temperatura ambiente; ~15balanceos completos, hacia atras y hacia delante, por minuto). Despues de esto, los tubos se transfieren a una gradilla, los tapones se aflojan y las celulas se dejan en reposo (sin perturbation o movimiento) durante 30 minutos a temperatura ambiente para que se produzca la agregacidn y la precipitacidn. Despuds de observar una capa de sobrenadante transparente y una capa de globulos rojos, se usa una pipeta de transferencia para eliminar lenta y suavemente el sobrenadante (que contiene las celulas mononucleares) teniendo 40 cuidado de no perturbar las celulas precipitadas en la capa de gldbulos rojos. A continuaci6n, el sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo de centrifuga y se centrifuga a 400 x g durante 10 minutos. Finalmente, las cdlulas se suspenden de nuevo en medio fresco para un procesamiento adicional.

Cabe senalar que una vez que la sangre entera se recupera, esta debe procesarse y usarse de acuerdo con la 45 presente invention tan pronto como sea posible para impedir la coagulation y para mantener cualquier cdlula que pueda estar presente y viva. Cuanto mas espere un operador para proporcionar la sangre entera con los metodos y elementos apropiados como se indica en el presente documento, menos seran las oportunidades de una recuperacidn maxima de celulas viables.

50 En un punto de interes relacionado, pueden recogerse celulas madre adicionales de fuentes no sangufneas a partir de la placenta a traves de un banco de placenta y sangre del cordon umbilical. Despues de que el profesional de la salud extraiga la sangre del corddn umbilical, la placenta se envia al laboratorio de cdlulas madre, donde se procesa para obtener celulas madre adicionales. Almacenando las celulas madre obtenidas de la placenta, asi como de la sangre del cordon umbilical, las familias pueden guardar hasta dos veces el numero celulas madre CD34+ para su 55 uso en trasplantes. Tener tantas de estas celulas madre como sea posible es mddicamente importante: las investigaciones publicadas muestran que el tamano del trasplante de celulas madre (especialmente el ndmero de celulas CD34+) es consecuentemente un factor significativo en el logro de un tratamiento exitoso y la supervivencia del paciente.

En resumen, se ha descubierto que puede usarse una solucibn de preservation hipotermica para recoger sangre entera y aislar los componentes celulares de la misma como se expone en el presente documento, Cualquier solution de preservation que se formula para reducir la acumulacibn de radicales libres en las celulas que experimentan una preservation hipotbrmica para ayudar a mediar el nivel de necrosis y apoptosis post- 5 almacenamiento, reduciendo directamente de esta manera el nivel de muerte celular durante y tras el intervalo de preservation, es adecuada para su uso. Ademas, se observan beneficios adicionales cuando se realiza un almacenamiento congelado a largo plazo de componentes celulares aislados usando una solucibn de criopreservacion formulada para abordar los aspectos biologicos moleculares de las cblulas durante el proceso de criopreservacion reduciendo directamente de esta manera el nivel de muerte celular de aparicibn retardada inducida 10 por la criopreservacion y mejorando la viabilidad y la funcion celular post-descongelacibn. Atraves de la modulation de la respuesta bioqufmica celular al proceso de criopreservacion, tal solution de criopreservacion puede mejorar la viabilidad y la funcionalidad celular eliminando al mismo tiempo la necesidad de incluir suero, proteinas o altos niveles de agentes citotoxicos.

15 Como se contempla en el presente documento y se ilustra en otra parte en el presente documento, una solution de preservacibn preferida estb exenta de proteinas y suero, esta adaptada para el equilibrio osmotico celular del tejido, y es qufmicamente compatible con un crioprotector. Una solution de preservacibn es preferiblemente HYPOTHERMOSOL® (BioLife Solutions, Inc., Bothell, WA).

20 La invencibn se ilustrara adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Metodos

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Preservacibn de celulas aisladas (criotermica e hipotermica).

Protocolo de criopreservacion

30 Suspender el sedimento celular directamente en CRYOSTOR™ frlo (2-8 °C) y transferir la muestra a un criovial enfriado previamente. Incubar las muestras a 2-8 °C durante 10 min, despues congelar las muestras siguiendo un protocolo estbndar (1 °C/min) con un congelador de velocidad controlada o un recipiente de congelation de baho de isopropanol Nalgene "Mr. Frosty" usando un protocolo de congelador mecbnico en 2 etapas (2 horas a - 20 °C/2 horas a -80 °C), despues transferir las muestras a nitrogeno liquido para su almacenamiento. Las muestras 35 pueden recuperarse retirando la muestra del nitrogeno liquido y poniendolas inmediatamente en un bafio de agua a 37 °C durante 2-4 min para calentar las muestras hasta que se descongelen (la agitacibn suave de la muestra durante el intervalo de descongelacion conseguira una descongelacion uniforme de la muestra). Una vez que la muestra se ha derretido a fase de aguanieve, transferir inmediatamente las muestras a un entorno estbril y diluir en medio de cultivo a 37 °C para su cultivo celular.

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Protocolo de preservacibn hipotermica

Suspender el sedimento celular directamente en HYPOTHERMOSOL® frio (2-8 °C) y almacenar la suspension celular a 2-8 °C durante 1-3 dias. Si las celulas se colocan en placas para su cultivo y posterior utilization, colocar en 45 placas las celulas en medio de cultivo y cultivar a 37 °C hasta que las celulas se fijen. Despues, las placas pueden almacenarse a 2-8 °C reemplazando el medio de cultivo celular por HYPOTHERMOSOL® y colocando las cblulas en placas en frio durante 1-3 dias. Tras el almacenamiento, retirar las cblulas del frio, reemplazar el HYPOTHERMOSOL® con medio de cultivo y poner las cblulas en incubacibn. Despubs de un intervalo de recuperation, las celulas estarbn lista para su utilization en diferentes aplicaciones.

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Recoaida de sangre. Recogida por venopuncibn aseptica tipica en bolsas de sangre estbndares, o las pre-rellenadas con volumenes de HYPOTHERMOSOL® como se indica en otro lugar en el presente documento.

Aislamiento de celulas mononucleares de suspensiones de sangre v HYPOTHERMOSOL®. Las suspensiones se 55 cargan sobre Ficoll-Hypaque y la densidad se centrifuga a x435 g durante 30 min. Las celulas mononucleares se retiran cuidadosamente de la capa de interfase y se lavan dos veces con HBSS y EDTA. Los recuentos de celulas nucleadas totales se realizaron usando un contador Coulter.

Como alternativa, las celulas mononucleares se aislan de la sangre del cordbn umbilical usando PrepaCyte®. Para

ello, se mezclan voliimenes iguales de PrepaCyte®-WBC y sangre del cordon umbilical en tubos cbnicos de 50 ml. A continuacibn usando un agitador basculante, los tubos se mezclan completamente suavemente (durante 20 minutos a temperatura ambiente; ~15 balanceos completos, hacia atras y hacia delante, por minuto). Despues de esto, los tubos se transfieren a una gradilla, los tapones se aflojan y las cblulas se dejan en reposo (sin perturbacibn o 5 movimiento) durante 30 minutos a temperatura ambiente para que se produzca la agregacidn y la precipitacibn. Despuds de observar una capa de sobrenadante transparente y una capa de glbbulos rojos, se usa una pipeta de transferencia para eliminar lenta y suavemente el sobrenadante (que contiene las cdlulas mononucleares) teniendo cuidado de no perturbar las celulas precipitadas en la capa de glbbulos rojos. A continuacibn, el sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo de centrifuga y se centrifuga a 400 x g durante 10 minutos. Finalmente, las celulas se 10 suspenden de nuevo en medio fresco para un procesamiento adicional.

Para el cultivo de celulas mononucleadas, los sedimentos celulares se suspenden de nuevo con 20 ml de medio de cultivo celular de cultivo estandar y se ponen en placas en un matraz T-75. El medio de cultivo celular usando es una mezcla de medio Eagle modificado por Dulbecco al 60% y medio MCDB 105 al 40 % complementado con FCS al 15 10 % y Penicilina-Estreptomicina al 1 %.

Citometria de fluio

Recuento de celulas nucleadas total. Un recuento de celulas nucleadas total (TNC) representa todas las celulas 20 nucleadas que incluyen glbbulos rojos nucleados. El recuento de celulas nucleadas total (TNC) junto con la dosis de celulas CD34+ ha demostrado ser un determinante crucial de la recuperacion hematopoybtica y el resultado general tras el UCBT, y la dosis celular limitada de unidades UCB individuales es claramente la barrera mas importante para un uso mbs generalizado, especialmente en adultos. El TNC se obtiene tlpicamente mediante el uso de un contador coulter, pero el nurnero puede obtenerse mediante una diversidad de medidas.

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Protocolo multi-plex para TNC, viabilidad (7-AADL CD34 v CD45.

Las celulas mononucleares pueden cuantificarse por el subtipo en muestras sanguineas usando metodos inmunofluorescentes y citometria de flujo. Se usan anticuerpos para cuantificar y purificar las celulas madre 30 progenitoras hematopoyeticas para investigation y para trasplante clfnico de mbdula osea. Las celulas observadas como CD34+ son de una forma primitiva y no diferenciada, y se consideran cblulas madre hematopoyeticas pluripotentes.

Para determinar la viabilidad y los recuentos de celulas nucleadas, incluyendo subpoblaciones de CD34 y CD45, 35 obtener un tubo de 12 x 75 mm y transferir 2 ml de solution de tampon hemolitica de amonio al tubo. A continuacibn, si no se ha hecho ya, realizar un recuento celular en el espbcimen para determinar el volumen necesario. Ahadir el volumen calculado de muestra al tubo y agitar vorticialmente para permitir la lisis de los glbbulos rojos. Una vez lisados, centrifugar el tubo en la centrifuga a 1500 rpm durante 2 minutos. Decantar el sobrenadante y lavar con 2 ml de solucion de lavado. Centrifugar la muestra y realizar un lavado de nuevo. Tras el lavado, eliminar el sobrenadante 40 y ahadir anticuerpos de tincibn 7-AAD (eBioscience, catalogo ntimero 00-6993-50), CD34 (Becton Dickenson, catalogo nCimero 340669) y CD45 (Becton Dickenson, catalogo nurnero 340664). Suspender de nuevo el sedimento en solucion de tincibn y poner el tubo/muestra a 4 °C durante 20-30 minutos. Tras la incubacion, ahadir solucion de lavado y centrifugar. Decantar el sobrenadante, ahadir la solucion de flujo y realizar la citometria de flujo.

45 Ensavo UFC. El ensayo de unidades formadoras de colonias es una tecnica citologica para medir la capacidad funcional de las cblulas madre ensayando su actividad. El ensayo es basicamente una evaluacibn de las celulas individuales y la capacidad de clonarse en toda una colonia de cblulas idbnticas.

Una vez que las cblulas mononucleares se separan y se recogen, realizar un recuento celular y registrar el nurnero 50 total antes de la criopreservacion. Usando el nurnero total, deben prepararse dos concentraciones celulares separadas (tipicamente 3 x 104/ml y 1 x 105/ml) en metilcelulosa. Observacibn, las cblulas deben ponerse en placas en un volumen de 1 ml por cada una de 4 placas a una relacion de 1:10 (v:v) celulas con respecto a metilcelulosa. Debido a la viscosidad de la metilcelulosa, debe prepararse un volumen total de 5 ml (celulas, metilcelulosa y medio) con el fin de colocar en placas de 4-1 ml. A partir del recuento celular del especimen, multiplicar cada una de las 55 concentraciones celulares deseadas por 5 para determinar el nurnero total de cblulas necesarias. Ahadir el nurnero apropiado de celulas y medio (IMDM) a la metilcelulosa hasta un volumen total de 5 ml y mezclar el contenido. Distribuir 1 ml de la suspension a cada una de las placas de cultivo tisular de 4-10 x 35 mm. Mover suavemente para girar el contenido de cada placa de manera que todo el fondo de la placa se cubra uniformemente. Colocar las placas en una placa de Petri mayor junto con una placa de hidratacibn que contiene agua destilada esteril. Poner los

cultivos en una incubadora de CO2 al 5 % a 37 °C y almacenar durante 14 dfas. Tras la incubation, las colonias se contaran. Los tipos de colonias contados son: Unidad formadora de brotes eritroide (UFB-e), unidad formadora de colonias (UFC), y a veces unidades formadoras de colonias mixtas (UFC-Mix). Una vez contadas, los c&lculos se realizan en base al niimero inicial de celulas para determinar el nCimero total de cada tipo de colonia para un 5 producto. Si las celulas se preparan para la criopreservacidn, los ensayos de colonias pueden configurarse de una manera similar a partir de cultivos de post-descongelacion para determinar el numero de colonias y la eficacia del proceso de preservacidn.

Ensayos de viabilidad

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ALAMAR BLUE™

ALAMAR BLUE™ es soluble y estable en medio de cultivo y no es toxico. Por lo tanto, se permite el control continuo de las celulas en cultivo. Especfficamente, ALAMAR BLUE™ no altera la viabilidad de las celulas cultivadas varias 15 veces ya que se controla por exclusion de azul de tripano. Se ha descubierto que las celulas cultivadas en presencia de ALAMAR BLUE™ y analizadas posteriormente por citometrla de flujo para CD44, CD45RB, CD4 y antlgeno termoestable producen ntimeros similares de celulas viables y celulas que expresan antlgeno como las celulas no expuestas a ALAMAR BLUE™. Dado que ALAMAR BLUE™ no es tbxico, las celulas bajo estudio pueden devolverse al cultivo 0 usarse para otros fines, incluyendo estudios histologicos. Las medidas de proliferacidn con 20 ALAMAR BLUE™ pueden hacerse espectrofotometricamente controlando la absorcion del medio de cultivo celular complementado con ALAMAR BLUE™ a dos longitudes de onda. Como alternativa, las medidas de proliferation con ALAMAR BLUE™ pueden hacerse fluoromdtricamente.

Calcelna-AM

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El ensayo de Calceina-AM proporciona un metodo sencillo, rapido y preciso para medir la viabilidad celular y/o la citotoxicidad. La Calcelna-AM es un compuesto no fluorescente e hidrofobo que permea facilmente las celulas vivas intactas. La hidrdlisis de Calcelna-AM por las esterasas intracelulares produce calcelna, un compuesto hidrofilo, fuertemente fluorescente que se retiene bien en el citoplasma celular. Las cdlulas cultivadas en placas pueden 30 tenirse y cuantificarse en menos de dos horas.

Una evaluacidn inmediatamente posterior a la descongelacion tiende a dar datos incompletos e imprecisos con respecto a la viabilidad y la funcion de la muestra; por lo tanto, se recomienda que la evaluacidn de la viabilidad se realice de 24 a 48 horas despues de la descongelacion. La evaluacion de la viabilidad y el rendimiento 35 inmediatamente despues de la descongelacion puede ser util para evaluar la extensidn de la muerte celular de aparicion retardada (es decir, al comparar los valores 1 hora post-descongelacion con los valores 24 horas post- descongelacion); sin embargo, al determinar la eficacia de la preservation, se garantiza una evaluacion con especial atencion y comparacidn de tanto los rendimiento como la viabilidad entre los valores previos a la congelation, los valores posteriores a la descongelacidn y 24-48 h post-descongelacidn. Esto permitira una determinacidn precisa del 40 estado de la muestra y la eficacia de preservacidn.

Eiemplo 1: Recoqida de sanare entera hipotermica.

Recogida de sangre del cordon umbilical (sin tejido del cordon). Despues de la expulsion del neonato, pinzar y cortar 45 el cordon umbilical, despues seguir uno de dos enfoques:

Metodo de sistema cerrado

Despues de la expulsidn de la placenta, los extremos proximal y distal del cordon umbilical se frotan con alcohol, se 50 dejar secar y se frotan de nuevo con tintura de yodo. Una aguja 16G fijada a una bolsa de recogida de sangre que contiene un volumen de HYPOTHERMOSOL® se inserta en el sitio proximal lo mas cerca posible de la pinza. La sangre comenzara a llenar la bolsa a travds de drenaje por gravedad. Despues, el extremo distal se canula inmediatamente con un angiocateter 16G. Una jeringa de 50 ml pre-rellenada con HYPOTHERMOSOL® se fija a la canula a traves de un luer-lock, y la sangre se lava abundantemente del corddn umbilical a la bolsa de recogida. 55 Debe usarse un total de 150 ml de solucidn (3 jeringas) para lavar por completo la sangre en la bolsa de recogida. Despues de la recogida, la bolsa se cierra hermeticamente atando tres nudos en el tubo de la Ifnea de recogida, dejando al menos 6 pulgadas de tubo expuesto entre los nudos y la bolsa.

Metodo de recogida alternativo

El extremo proximal del cordbn umbilical puede sumergirse en un recipiente de recogida de 250 ml que contiene 50 ml de HYPOTHERMOSOL® y anticoagulante y despues se quita la pinza, o puede usarse una aguja 16G fijada a una bolsa de recogida de sangre de 250 ml como se describe en el metodo de sistema cerrado. Despues, la sangre 5 se "exprime" aplicando presibn al cordbn entre el pulgar y el fndice en gancho y tirando suavemente en una direccion distal-proximal. Este proceso puede repetirse hasta que se recoja el volumen de sangre deseable.

Eiemolo 2: Las celulas sanaulneas almacenadas en condiciones hipotermicas conservan la viabilidad post- sedimentacibn.

10

Se recogio sangre del cordon umbilical en sitios donantes por venopuncibn en bolsas de sangre que contenfan citrato-fosfato-dextrosa (Baxter US Healthcare). Despues de determinar que la unidad es de "calidad de investigacion" (TNC s 9 x 108), la unidad se dividib uniformemente en dos bolsas de transferencia. Se anadio HYPOTHERMOSOL® frfo (2-8 °C) a una bolsa en una relacibn 1:1 con el volumen de sangre y se almacenb a 4 °C. 15 La otra mitad de la unidad sirvio como control y se mantuvo a temperatura ambiente. Las muestras se procesaron despues de 24 horas y las recuperaciones del recuento total de celulas nucleadas viables se determinaron a traves de citometrla de flujo despues de la sedimentacibn y de nuevo, despues de la reduccibn plasmbtica. Los controles se mantuvieron a temperatura ambiente la misma duracion. Los resultados se expresaron como porcentaje de recuperacion en comparacion con las recuperaciones de recuento de celulas nucleadas total de la sangre inicial 20 extrafda en el momento de la recogida.

Para determinar si HTS-FRS + Hetastarch puede actuar como una solucibn de sedimentacibn por gravedad para racionalizar el procesamiento de la sangre del cordbn umbilical y mejorar la recuperacion y la viabilidad de los TNC, tres unidades de sangre del cordbn umbilical se dividieron cada una por la mitad y se procesaron con las siguientes 25 soluciones: 1) Solucibn de sedimentacibn estandar: Hetastarch (40 %), NaCI al 0,9 % (48%), ACD-A al 6 % (12 %); 2) HTS-FRS (60 %), Hetastarch (40 %). Despues de 1 hora, la sangre que contema solucibn de sedimentacibn estbndar sedimentb por completo; sin embargo, la sangre que contenla solucibn de sedimentacibn HTS-FRS necesito 90 minutos para sedimentar. La sangre diluida 1:1 con HTS-FRS y almacenada a 4 °C demostro recuperaciones del 74,52 % post-sedimentacibn y un 72,12 % de reduccibn post-plasmatica en comparacion con las 30 recuperaciones del 90,98 % post-sedimentacibn y un 93,98% de reduccibn post-plasmatica a partir de muestras no diluidas almacenadas a temperatura ambiente, probando que las celulas sangufneas almacenadas en HYPOTHERMOSOL® conservan su viabilidad despubs de la sedimentacibn y un procesamiento adicional.

Eiemolo 3: Las cblulas sanaulneas almacenadas en condiciones hipotermicas durante extensos periodos conservan 35 la viabilidad.

Se recogio sangre del cordbn umbilical en el momento de la cirugla en los sitios donantes de 3 secciones C programadas por venopuncion en bolsas de recogida (Pall Medical) que se habian rellenado previamente con 35 ml de HYPOTHERMOSOL® frfo (4 °C). No se afiadio anticoagulante. Los voltlmenes de recogida fueron 87,3, 72 y 40 85 ml. Las unidades se almacenaron hasta 72 horas a 4 °C y se controlaron cada 24 horas para comprobar la coagulacion por determinacion visual de la formacibn de cobgulos. La viabilidad TNC se determinb en cada punto temporal usando 7-AAD y citometrfa de flujo. No se observo coagulacion en ningun punto temporal y, como se muestra en la figura 1, la viabilidad celular se mantuvo durante 72 horas de almacenamiento en frfo en comparacion con el valor inicial (extraccion de sangre inicial en el momento de la recogida). En la figura 1, las barras de error son 45 error estandar +/- 1 de la media. Estos datos demuestran que la viabilidad celular se conserva durante extensos periodos de almacenamiento hipotermico de sangre entera en HYPOTHERMOSOL®. Adembs, estos datos validan el uso de HYPOTHERMOSOL® para almacenar la sangre entera durante extensos periodos en ausencia de anticoagulantes.

50 Eiemplo 4: Los tipos celulares sianificativos se preservaron v podian recuperarse al recoaerse v almacenarse en condiciones hipotbrmicas.

Se recogib sangre del cordbn umbilical de tres donantes como se ha descrito en el Ejemplo 3. No se afiadio anticoagulante. Despues de 24, 48 y 72 h de almacenamiento a 4 °C en HYPOTHERMOSOL®, se retiraron 25 ml de 55 muestra de la sangre del cordbn umbilical para su procesamiento; se tomb 1 ml de alfcuota para el ensayo de pre- procesamiento y los 24 ml restantes se procesaron usando metodos de procesamiento de sangre del cordbn umbilical convencionales. Se utilizb citometrfa de flujo para determinar el rendimiento pre-procesamiento, la recuperacion TNC, la viabilidad usando 7-AAD, y la positividad de CD34 y CD45. Como se muestra en la figura 2, en comparacion con el valor inicial (extraccibn de sangre inicial en el momento de la recogida), los recuentos de celulas

TNC, CD34+ y CD45+ disminuyeron ligeramente las primeras 24 horas, pero se estabilizaron durante el resto del almacenamiento en frfo de 72 horas. En la figura 2, las barras de error son error estendar +/-1 de la media.

Despues del agotamiento de los globulos rojos y el plasma, la poblacibn de celulas nucleadas total se suspendio de 5 nuevo en 10 ml de IMDM para un ensayo post-procesamiento. Se utilizd citometrfa de flujo para determinar el rendimiento post-procesamiento, la recuperacion TNC, la viabilidad usando 7-AAD, y la positividad de CD34 y CD45. Los datos se comparan con 8 muestras de sangre del cordon umbilical no preservadas seleccionadas aleatoriamente recogidas usando recogida por venopuncion en bolsas de recogida de citrato-fosfato-dextrosa estandares (Baxter) en ausencia de HYPOTHERMOSOL®. La figura 3 muestra la viabilidad media, el TNC viable, 10 CD34+ viable y CD45+ viable de tres unidades de sangre del cordon umbilical recogidas en bolsas pre-rellenadas con HYPOTHERMOSOL® sin anticoagulante y almacenadas a 4 °C durante 24, 48 o 72 horas. Como se muestra en la figura 3, la viabilidad celular se mantiene durante 72 horas. Los recuentos de celulas TNC, CD34+ y CD45+ disminuyeron ligeramente las primeras 24 horas, pero se estabilizaron durante el resto del almacenamiento en frfo de 72 horas. Estos datos demuestran que los tipos celulares relevantes (por ejemplo, celulas madre) son viables y 15 pueden recuperarse despues de extensos periodos de almacenamiento hipotermico de sangre entera en HYPOTHERMOSOL®. Aderrfes, estos datos validan el uso de HYPOTHERMOSOL® para almacenar la sangre entera durante extensos periodos en ausencia de anticoagulantes.

En las figuras 1, 2 y 3, se calcularon los valores de TNC viable, CD34+ viable y CD45+ viable como se indica a 20 continuacidn:

TNC viable = (% de viabilidad x (NC/ml) x (volumen)

CD34+ viable = (% de CD34+ en recuento de NC) x (TNC viable)

CD45+ viable = (% de CD45+ en recuento de NC) x (TNC viable)

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Ejemplo 5: Almacenamiento hipotermico de sangre periferica entera en condiciones hipotermicas.

La sangre periferica se extraera de acuerdo con tecnicas convencionales con y sin anticoagulante de acido-citrato- dextrosa. A partir del a muestra inicial, se dispensaran 40 M de celulas y cada uno de los 5 tubos y se diluiran 1:0,1, 30 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10 con volumenes de HYPOTHERMOSOL® (2-8 °C). Los viales de control negativo seran sangre no diluida a temperatura ambiente y sangre no diluida a 4°C. Las muestras se ensayaran en 18, 36 y 72 horas por citometrla de flujo para un recuento de celulas nucleadas total, viabilidad y positividad CD34 y CD45. Una muestra de la sangre inicial extrafda se ensayara inmediatamente despues de la donacion para servir como control inicial.

35

Se espera que las celulas de sangre periferica entera, al recogerse, aislarse y almacenarse en presencia de HYPOTHERMOSOL® o un equivalente del mismo en condiciones hipotermicas, muestren al menos una viabilidad y capacidad de recuperacion comparables en el tiempo en condiciones hipotermicas en comparacidn con las celulas procesadas convencionalmente. Por lo tanto, este estudio demostrafe que, una vez mas, los beneficios de la 40 presente invencion que se ha ilustrado anteriormente en los Ejemplos 1-4 tambien seran aplicables a la sangre periferica entera y las celulas obtenidas de la misma.

En base a las enserianzas anteriores, ahora es evidente que la sangre entera recogida y almacenada usando los materiales y los metodos desvelados en el presente documento, tiene una mejor integridad y su contenido en BC 45 tiene una mejor viabilidad y capacidad de recuperacion al compararse con los metodos estendares de recogida y almacenamiento actualmente disponibles. Y, ahora es evidente que las celulas madre aisladas de dicha sangre entera muestran alta viabilidad y velocidades de recuperacion en comparacidn con las preparaciones convencionales. Ademas, se espera que la viabilidad y la recuperacion celular se mantengan irfes alia de 72 horas, preferiblemente hasta al menos 7 dias, 14 dlas, 21 dias, o mas, al recogerse, procesarse y/o almacenarse en las 50 condiciones y de acuerdo con las pfecticas descritas en el presente documento.

En base a los descubrimientos descritos e ilustrados en el presente documento, las composiciones y metodos no descritos hasta ahora dan como resultado una viabilidad e integridad inesperadas de la sangre entera recogida en condiciones hipotermicas en comparacion con la sangre entera recogida de forma convencional. Y adicionalmente, 55 los componentes de sangre entera obtenidos de acuerdo con la presente invencion muestran menos dano estructural, qufmico y/o funcional en comparacion con los componentes aislados de forma convencional. Aun mas si cabe, se espera que dichos componentes aislados, al criopreservarse posteriormente de acuerdo con las ensehanzas expuestas en el presente documento, se recuperen en mayor medida y muestren una viabilidad y funcionalidad superiores en comparacion con la sangre entera recogida de manera convencional. Las ensehanzas

de la presente invencidn son particularmente eficaces para la recogida de sangre del corddn umbilical y celulas aisladas de la misma, especialmente celulas madre.

Equivalentes

5

Las presentes realizaciones se consideraran ilustrativas y no restrictivas, estando el alcance de la invencidn indicado por las reivindicaciones adjuntas en lugar de por la descripcion anterior.

Calceina-AM

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El ensayo de Calcelna-AM proporciona un metodo sencillo, rapido y preciso para medir la viabilidad celular y/o la citotoxicidad. La Calceina-AM es un compuesto no fluorescente e hidrdfobo que permea fdcilmente las celulas vivas intactas. La hidrdlisis de Calceina-AM por las esterasas intracelulares produce calceina, un compuesto hidrdfilo, fuertemente fluorescente que se retiene bien en el citoplasma celular. Las celulas cultivadas en placas pueden 15 tenirse y cuantificarse en menos de dos horas.

Una evaluacion inmediatamente posterior a la descongelacidn tiende a dar datos incompletos e imprecisos con respecto a la viabilidad y la funcion de la muestra; por lo tanto, se recomienda que la evaluacidn de la viabilidad se realice de 24 a 48 horas despuds de la descongelacidn. La evaluacion de la viabilidad y el rendimiento 20 inmediatamente despues de la descongelacidn puede ser util para evaluar la extensidn de la muerte celular de aparicidn retardada (es decir, al comparar los valores 1 hora post-descongelacion con los valores 24 horas post- descongelacion); sin embargo, al determinarla eficacia de la preservacion, se garantiza una evaluacion con especial atencion y comparacidn de tanto los rendimiento como la viabilidad entre los valores previos a la congelacion, los valores posteriores a la descongelacidn y 24-48 h post-descongelacion. Esto permits una determinacidn precisa del 25 estado de la muestra y la eficacia de preservacidn.

Eiemplo 1: Recogida de sangre entera hipotermica.

Recogida de sangre del cordon umbilical (sin tejido del corddn). Despuds de la expulsidn del neonato, pinzar y cortar 30 el corddn umbilical, despues seguir uno de dos enfoques:

Metodo de sistema cerrado

Despues de la expulsion de la placenta, los extremos proximal y distal del cordon umbilical se frotan con alcohol, se 35 dejar secar y se frotan de nuevo con tintura de yodo. Una aguja 16G fijada a una bolsa de recogida de sangre que contiene un volumen de HYPOTHERMOSOL® se inserta en el sitio proximal lo mds cerca posible de la pinza. La sangre comenzara a llenar la bolsa a travds de drenaje por gravedad. Despues, el extremo distal se canula inmediatamente con un angiocatdter 16G. Una jeringa de 50 ml pre-rellenada con HYPOTHERMOSOL® se fija a la cdnula a traves de un luer-lock, y la sangre se lava abundantemente del corddn umbilical a la bolsa de recogida. 40 Debe usarse un total de 150 ml de solucion (3jeringas) para lavar por completo la sangre en la bolsa de recogida. Despues de la recogida, la bolsa se cierra hermdticamente atando tres nudos en el tubo de la linea de recogida, dejando al menos 6 pulgadas de tubo expuesto entre los nudos y la bolsa.

Metodo de recogida alternative 45 “

El extremo proximal del corddn umbilical puede sumergirse en un recipiente de recogida de 250 ml que contiene 50 ml de HYPOTHERMOSOL® y anticoagulante y despues se quita la pinza, o puede usarse una aguja 16G fijada a una bolsa de recogida de sangre de 250 ml como se describe en el metodo de sistema cerrado. Despuds, la sangre se "exprime" aplicando presion al corddn entre el pulgar y el indice en gancho y tirando suavemente en una direccidn 50 distal-proximal. Este proceso puede repetirse hasta que se recoja el volumen de sangre deseable.

Eiemplo 2: Las cdlulas sanaulneas almacenadas en condiciones hipotermicas conservan la viabilidad post- sedimentacidn.

55 Se recogio sangre del cordon umbilical en sitios donantes por venopuncidn en bolsas de sangre que contenfan citrato-fosfato-dextrosa (Baxter US Healthcare). Despues de determinar que la unidad es de "calidad de investigation" (TNC s 9 x 10s), la unidad se dividid uniformemente en dos bolsas de transferencia. Se afiadid HYPOTHERMOSOL® frio (2-8 °C) a una bolsa en una relacion 1:1 con el volumen de sangre y se almaceno a 4 °C. La otra mitad de la unidad sirvid como control y se mantuvo a temperatura ambiente. Las muestras se procesaron

despubs de 24 horas y las recuperaciones del recuento total de cblulas nucleadas viables se determinaron a traves de citometrfa de flujo despues de la sedimentacibn y de nuevo, despues de la reduccibn plasmbtica. Los controles se mantuvieron a temperatura ambiente la misma duracion. Los resultados se expresaron como porcentaje de recuperacion en comparacion con las recuperaciones de recuento de cblulas nucleadas total de la sangre inicial 5 extraida en el momento de la recogida.

Para determinar si HTS-FRS + Hetastarch puede actuar como una solucion de sedimentacibn por gravedad para racionalizar el procesamiento de la sangre del cordon umbilical y mejorar la recuperacion y la viabilidad de los TNC, tres unidades de sangre del cordon umbilical se dividieron cada una por la mitad y se procesaron con las siguientes 10 soluciones: 1) Solucion de sedimentacibn estbndar: Hetastarch (40 %), NaCI al 0,9 % (48%), ACD-A al 6 % (12 %); 2) HTS-FRS (60 %), Hetastarch (40 %). Despues de 1 hora, la sangre que contenfa solucibn de sedimentacion estandar sedimento por completo; sin embargo, la sangre que contenla solucibn de sedimentacibn HTS-FRS necesito 90 minutos para sedimentar. La sangre diluida 1:1 con HTS-FRS y almacenada a 4 °C demostro recuperaciones del 74,52 % post-sedimentacibn y un 72,12 % de reduccion post-plasmatica en comparacion con las 15 recuperaciones del 90,98 % post-sedimentacibn y un 93,98% de reduccibn post-plasmatica a partir de muestras no diluidas almacenadas a temperatura ambiente, probando que las cblulas sangufneas almacenadas en HYPOTHERMOSOL® conservan su viabilidad despues de la sedimentacibn y un procesamiento adicional.

Eiemplo 3: Las celulas sanauineas almacenadas en condiciones hiootermicas durante extensos periodos conservan 20 la viabilidad.

Se recogio sangre del cordon umbilical en el momento de la cirugla en los sitios donantes de 3 secciones C programadas por venopuncibn en bolsas de recogida (Pall Medical) que se habfan rellenado previamente con 35 ml de HYPOTHERMOSOL® frfo (4 °C). No se ahadio anticoagulante. Los volumenes de recogida fueron 87,3, 72 y 25 85 ml. Las unidades se almacenaron hasta 72 horas a 4 °C y se controlaron cada 24 horas para comprobar la coagulacibn por determinacion visual de la formacion de cobgulos. La viabilidad TNC se determinb en cada punto temporal usando 7-AAD y citometrla de flujo. No se observo coagulacibn en ningun punto temporal y, como se muestra en la figura 1, la viabilidad celular se mantuvo durante 72 horas de almacenamiento en frio en comparacion con el valor inicial (extraccion de sangre inicial en el momento de la recogida). En la figura 1, las barras de error son 30 error estandar +/- 1 de la media. Estos datos demuestran que la viabilidad celular se conserva durante extensos periodos de almacenamiento hipotbrmico de sangre entera en HYPOTHERMOSOL®. Ademas, estos datos validan el uso de HYPOTHERMOSOL® para almacenar la sangre entera durante extensos periodos en ausencia de anticoagulantes.

35 Eiemplo 4: Los tipos celulares sianificativos se preservaron v podlan recuperarse al recoaerse v almacenarse en condiciones hipotermicas.

Se recogio sangre del cordon umbilical de tres donantes como se ha descrito en el Ejemplo 3. No se ahadio anticoagulante. Despubs de 24, 48 y 72 h de almacenamiento a 4 °C en HYPOTHERMOSOL®, se retiraron 25 ml de 40 muestra de la sangre del cordon umbilical para su procesamiento; se tomb 1 ml de alfcuota para el ensayo de pre- procesamiento y los 24 ml restantes se procesaron usando metodos de procesamiento de sangre del cordbn umbilical convencionales. Se utilizo citometria de flujo para determinar el rendimiento pre-procesamiento, la recuperacion TNC, la viabilidad usando 7-AAD, y la positividad de CD34 y CD45. Como se muestra en la figura 2, en comparacion con el valor inicial (extraccion de sangre inicial en el momento de la recogida), los recuentos de celulas 45 TNC, CD34+ y CD45* disminuyeron ligeramente las primeras 24 horas, pero se estabilizaron durante el resto del almacenamiento en frio de 72 horas. En la figura 2, las barras de error son error estandar +/-1 de la media.

Despues del agotamiento de los globulos rojos y el plasma, la poblacion de celulas nucleadas total se suspendio de nuevo en 10 ml de IMDM para un ensayo post-procesamiento. Se utilizo citometrfa de flujo para determinar el 50 rendimiento post-procesamiento, la recuperacion TNC, la viabilidad usando 7-AAD, y la positividad de CD34 y CD45. Los datos se comparan con 8 muestras de sangre del cordbn umbilical no preservadas seleccionadas aleatoriamente recogidas usando recogida por venopuncibn en bolsas de recogida de citrato-fosfato-dextrosa estandares (Baxter) en ausencia de HYPOTHERMOSOL®. La figura 3 muestra la viabilidad media, el TNC viable, CD34+ viable y CD45+ viable de tres unidades de sangre del cordbn umbilical recogidas en bolsas pre-rellenadas 55 con HYPOTHERMOSOL® sin anticoagulante y almacenadas a 4 °C durante 24, 48 o 72 horas. Como se muestra en la figura 3, la viabilidad celular se mantiene durante 72 horas. Los recuentos de cblulas TNC, CD34+ y CD45+ disminuyeron ligeramente las primeras 24 horas, pero se estabilizaron durante el resto del almacenamiento en frio de 72 horas. Estos datos demuestran que los tipos celulares relevantes (por ejemplo, cblulas madre) son viables y pueden recuperarse despubs de extensos periodos de almacenamiento hipotbrmico de sangre entera en

HYPOTHERMOSOL®. Ademas, estos datos validan el uso de HYPOTHERMOSOL® para almacenar la sangre entera durante extensos periodos en ausencia de anticoagulantes.

En las figuras 1, 2 y 3, se calcularon los valores de TNC viable, CD34+ viable y CD45+ viable como se indica a 5 continuation:

TNC viable = (% de viabilidad x (NC/ml) x (volumen)

CD34+ viable = (% de CD34+ en recuento de NC) x (TNC viable)

CD45+ viable = (% de CD45+ en recuento de NC) x (TNC viable)

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Eiemplo 5: Almacenamiento hipofermico de sangre periferica entera en condiciones hipotermicas.

La sangre periferica se extraera de acuerdo con tecnicas convencionales con y sin anticoagulante de acido-citrato- dextrosa. A partir del a muestra inicial, se dispensaran 40 M de cblulas y cada uno de los 5tubos y se diluirin 1:0,1, 15 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10 con volumenes de HYPOTHERMOSOL® (2-8 °C). Los viales de control negativo serbn sangre no diluida a temperatura ambiente y sangre no diluida a 4 °C. Las muestras se ensayaran en 18, 36 y 72 horas por citometrfa de flujo para un recuento de celulas nucleadas total, viabilidad y positividad CD34 y CD45. Una muestra de la sangre inicial extrafda se ensayara inmediatamente despues de la donacibn para servir como control inicial.

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Se espera que las celulas de sangre periferica entera, al recogerse, aislarse y almacenarse en presencia de HYPOTHERMOSOL® o un equivalente del mismo en condiciones hipotermicas, muestren al menos una viabilidad y capacidad de recuperacibn comparables en el tiempo en condiciones hipotermicas en comparacibn con las celulas procesadas convencionalmente. Por lo tanto, este estudio demostrara que, una vez mbs, los beneficios de la 25 presente invencibn que se ha ilustrado anteriormente en los Ejemplos 1-4 tambfen serbn aplicables a la sangre periferica entera y las celulas obtenidas de la misma.

En base a las ensefianzas anteriores, ahora es evidente que la sangre entera recogida y almacenada usando los materiales y los rrfetodos desvelados en el presente documento, tiene una mejor integridad y su contenido en BC 30 tiene una mejor viabilidad y capacidad de recuperacibn al compararse con los rrfetodos esfendares de recogida y almacenamiento actualmente disponibles. Y, ahora es evidente que las celulas madre aisladas de dicha sangre entera muestran alta viabilidad y velocidades de recuperacibn en comparacibn con las preparaciones convencionales. Adetrfes, se espera que la viabilidad y la recuperacibn celular se mantengan irfes alia de 72 horas, preferiblemente hasta al menos 7 dfas, 14 dfas, 21 dias, o mas, al recogerse, procesarse y/o almacenarse en las 35 condiciones y de acuerdo con las prbcticas descritas en el presente documento.

En base a los descubrimientos descritos e ilustrados en el presente documento, las composiciones y rrfetodos no descritos hasta ahora dan como resultado una viabilidad e integridad inesperadas de la sangre entera recogida en condiciones hipotermicas en comparacion con la sangre entera recogida de forma convencional. Y adicionalmente, 40 los componentes de sangre entera obtenidos de acuerdo con la presente invencibn muestran menos dafio estructural, qufmico y/o funcional en comparacion con los componentes aislados de forma convencional. Aun mas si cabe, se espera que dichos componentes aislados, al criopreservarse posteriormente de acuerdo con las ensefianzas expuestas en el presente documento, se recuperen en mayor medida y muestren una viabilidad y funcionalidad superiores en comparacibn con la sangre entera recogida de manera convencional. Las ensefianzas 45 de la presente invencibn son particularmente eficaces para la recogida de sangre del cordon umbilical y celulas aisladas de la misma, especialmente celulas madre.

Equivalentes

50 La invencibn puede realizarse en otras formas especfficas sin apartarse del espiritu o caracterlsticas esenciales de la misma. Por lo tanto, las presentes realizaciones se considerarbn ilustrativas y no restrictivas, estando el alcance de la invencibn indicado por las reivindicaciones adjuntas en lugar de por la anterior descripcibn y, por lo tanto, todos los cambios que estan dentro del significado y rango de equivalencia de las reivindicaciones pretenden incluirse en las mismas.

Claims (6)

1. Un metodo para el almacenamiento hipotermico de sangre entera, comprendiendo el metodo:

5 (a) diluir un volumen de una muestra de sangre entera en un volumen de solucion de preservacidn

adaptada al equilibrio osmotico celular a temperaturas hipotermicas, de tal forma que la relacion de sangre entera con respecto a la solucion de preservacion es de al menos aproximadamente 1:0,1 en volumen; y (b) mantener la mezcla de sangre entera/solucion de preservacion de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 18 °C; en el que

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la mezcla de sangre entera/solucion de preservacion esta exenta de un reactivo anticoagulante introducldo de manera exogena, y

la solucion de preservacidn comprende: una solucion acuosa de electrolitos que contiene iones de potasio a un intervalo de concentracidn de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mM, iones de sodio a un intervalo de 15 concentracion de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 mM, iones de magnesio a un intervalo de concentracion de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mM, iones de cloro a un intervalo de concentracion de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mM, e iones de calcio a un intervalo de concentracidn de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 mM; un anion impermeante; manitol; un agente oncotico macromolecular; al menos un azucar simple; un sustrato para la regeneracion de ATP, y un tampon de pH bioldgico 20 eficaz en condiciones hipotermicas fisiologicas.

2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente aislar uno o mas componentes de la sangre entera.

25 3. El metodo de la reivindicacidn 1 o la reivindicacion 2, en el que la sangre entera es sangre del cordon

umbilical.

4. Un metodo para el aislamiento de un componente de una muestra de sangre del cordon umbilical, comprendiendo el metodo:

30

(a) mezclar una muestra de sangre del corddn umbilical proporcionada de un donante con un volumen de solucion de preservacion adaptada al equilibrio osmotico celular a temperaturas hipotermicas de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 18 °C, de tal forma que la relacion de sangre del cordon umbilical con respecto a la solucidn de preservacion es de al menos aproximadamente 1:0,1 en volumen; y, 35 (b) aislar uno o mas componentes de la mezcla de sangre del cordon umbilical y la solucion de

preservacidn; en el que

la mezcla de sangre del corddn umbilical/solucion de preservacion esta exenta de un reactivo anticoagulante introducido de manera exogena, y

40 la solucion de preservacion comprende: una solucidn acuosa de electrolitos que contiene iones de potasio a un intervalo de concentracion de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mM, iones de sodio a un intervalo de concentracion de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 mM, iones de magnesio a un intervalo de concentracion de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mM, iones de cloro a un intervalo de concentracidn de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mM, e iones de calcio a un intervalo de concentracion de 45 aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 mM; un anion impermeante; manitol; un agente oncdtico macromolecular; al menos un azucar simple; un sustrato para la regeneracidn de ATP, y un tampon de pH biologico eficaz en condiciones hipotermicas fisiologicas.

5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relacion de sangre con 50 respecto a la solucidn de preservacion es de al menos aproximadamente 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:5, o 1:10.

6. El ntetodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solucion de preservacion comprende adicionalmente glutation, un derivado de vitamina E, un antioxidante, y combinaciones de los mismos.

55 7. El metodo de la reivindicacion 2 o la reivindicacion 4, en el que el componente o componentes de la

sangre comprenden celulas madre.

8. Una composicidn que comprende una mezcla de una muestra de sangre entera y una solucion de

preservacion adaptada al equilibrio osmdtico celular a temperaturas hipotermicas de aproximadamente 2 °C a

aproximadamente 18 °C, de tal forma que la relacion de sangre entera con respecto a la solucidn de preservacidn es de al menos aproximadamente 1:0,1 en volumen; en la que

la composition esta exenta de un reactivo anticoagulante introducido de manera exogena, y la solucion de preservation comprende: una solucion acuosa de electrolitos que contiene iones de potasio a un 5 intervalo de concentracion de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mM, iones de sodio a un intervalo de concentracion de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 mM, iones de magnesio a un intervalo de concentracion de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mM, iones de cloro a un intervalo de concentracidn de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mM, e iones de calcio a un intervalo de concentracidn de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 mM; un anion impermeante; manitol; un agente oncotico 10 macromolecular; al menos un azucar simple; un sustrato para la regeneration de ATP, y un tampon de pH bioldgico eficaz en condiciones hipotermicas fisioldgicas.

Q

<

Q

OQ

<

>

LU

O

LU

~3

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LU

O

oc

O

Cl

imagen1

FIG. 1

RECUPERACI6N segun el porcentaje de valor inicial

imagen2

24 HORAS

48 HORAS

72 HORAS

TIEMPO DE ALMACENAMIENTO EN FRIO

M TNC VIABLE

E3 CD34 VIABLE

FIG. 2

13 CD45 VIABLE

co

LU

_l

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—3

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cd

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CL

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100%

80%

60%

40%

20%

0%

imagen4

24 HORAS 48 HORAS 72 HORAS

TIEMPO DE ALMACENAMIENTO EN FRIO EN HypoThermosol®

FIG. 3

□ VIABILIDAD H TNC VIABLE 0 CD34 VIABLE M CD45 VIABLE