JP6531256B2

JP6531256B2 - 臍帯血および末梢血の凍結保存方法および凍結保存用溶液

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Publication number: JP6531256B2
Application number: JP2016559123A
Authority: JP
Inventors: 美乃子高梨; みゆき伊藤; 孝一佐瀬
Original assignee: Japanese Red Cross Society; Zenoaq Resource Co Ltd
Current assignee: Japanese Red Cross Society; Zenogen Pharma Co Ltd
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2019-06-19
Anticipated expiration: 2035-11-13
Also published as: US20170303530A1; EP3219320B1; JPWO2016076428A1; WO2016076428A1; EP3219320A4; CN115777690A; CN106999518A; EP3219320A1; US20230180740A1

Description

本発明は、臍帯血および末梢血の凍結保存方法および凍結保存用溶液に関する。より詳細には、解凍後の臍帯血または末梢血における細胞生存率が良好であり、且つ解凍後に生体に対して安全に適用できる、臍帯血および末梢血の凍結保存方法および凍結保存用溶液に関する。

臍帯血および末梢血は造血幹細胞を含んでおり、骨髄とともに、造血幹細胞源として臨床応用がなされている。臍帯血および末梢血は、必要に応じて造血幹細胞を含む成分を分離回収した後、凍結保存用溶液と混合して、使用されるまで凍結保存される。

造血幹細胞を含む成分を凍結保護するための凍結保存用溶液としては、例えば、ＣＰ−１（商品名）またはＣｒｙｏＳｕｒｅ−ＤＥＸ４０（商品名）が挙げられる（非特許文献１〜２）。ＣＰ−１は、ヒドロキシエチルスターチとジメチルスルホキシドとを主成分として含むものであり、ＣｒｙｏＳｕｒｅ−ＤＥＸ４０は、デキストランとジメチルスルホキシドとを主成分として含むものである。

Takanashi M, Oba A, Ogawa A, et al. Red blood cell depletionof cord blood using an automated system - Evaluation of the AXP system.自動分離装置を用いる臍帯血の赤血球除去調製-AXP systemの評価. 日本輸血細胞治療学会誌56(1):62-67, 2010. Yamaguchi R, Takanashi M, Ito M, et al. Plasticizer concentration in cord blood cryopreserved with DMSO. Bone Marrow Transplant 49(1):157-8, 2014.

凍結保存されている造血幹細胞を含む成分は、解凍後、例えば、造血幹細胞を分離回収して利用する場合もあれば、凍結保存用溶液を含んだ状態で生体に適用する場合もある。従って、臍帯血用または末梢血用の凍結保存用溶液、ならびに、臍帯血または末梢血に由来する造血幹細胞を含む成分用の凍結保存用溶液は、様々な利用態様に適合した特性を備えることが強く求められている。

生体への適用に関して、非特許文献１〜２に記載のヒドロキシエチルスターチおよびデキストランは何れも医療用医薬品として認可されており、血管内に投与した場合でも、生体にとっての安全性に優れた成分である。しかしながら、これら成分はアナフィラキシーショック等の副作用の報告がなされており、より安全性に優れた成分の利用が望まれている。

また、解凍後に、造血幹細胞を分離回収して利用する場合、凍結保護液は、造血幹細胞の回収が容易な組成であることが望まれる。

さらに、ＣＰ−１に関して、標準的な使用法では、血清アルブミンの添加が必須とされているため、特に医療現場での利用に際して、操作性および迅速性に改良の余地がある。

本発明は上記の課題を解決するためになされたものであって、臍帯血、末梢血、およびこれら血液に由来する造血幹細胞を含む成分の凍結保存に利用することができ、かつ様々な利用態様に適合した特性を備える凍結保存用溶液、およびその利用を提供することを一つの目的とする。

本発明に係る凍結保存方法は、臍帯血または末梢血を凍結保存する方法であって、凍害防御剤およびグルコースを含む凍結保存用溶液と、臍帯血または末梢血とを混合する混合工程と、上記混合工程で得られた混合物を凍結する凍結工程と、を含む。

本発明に係る作製方法は、臍帯血または末梢血の凍結物を作製する方法であって、凍害防御剤およびグルコースを含む凍結保存用溶液と、生細胞を含む臍帯血または末梢血とを混合する混合工程と、上記混合工程で得られた混合物を凍結する凍結工程と、を含む。

本発明はまた、上記作製方法を用いて作製された、臍帯血または末梢血の凍結物を提供する。

本発明に係る臍帯血または末梢血の凍結保存用溶液は、凍害防御剤およびグルコースを含む。

本発明に係る凍結保存用キットは、臍帯血または末梢血を凍結保存するためのキットであって、上記臍帯血または末梢血の凍結保存用溶液と、凍結保存用溶液および臍帯血または末梢血を格納可能な耐寒性の容器と、を備える。

本発明の凍結保存方法および凍結保存用溶液を用いれば、解凍後の臍帯血または末梢血における細胞生存率が良好であり、また、解凍した臍帯血または末梢血を生体に対して安全に適用することができる。

本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、臍帯血を、凍害防御剤およびグルコースを含む溶液と混合して凍結を行った場合、解凍後の細胞生存率が良好であることを見出し、本発明を完成させるに至った。以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。

〔臍帯血または末梢血の凍結保存方法〕
本発明に係る臍帯血または末梢血の凍結保存方法は、凍害防御剤およびグルコースを含む凍結保存用溶液と、臍帯血または末梢血とを混合する混合工程と、混合工程で得られた混合物を凍結する凍結工程と、を含んでいる。

本発明に係る凍結保存方法に適用できる臍帯血の由来は特に限定されず、有胎盤類の哺乳動物全般の臍帯血を保存することができる。有胎盤類の哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜；ヒト；が挙げられる。また、本発明に係る凍結保存方法に適用できる末梢血の由来は特に限定されず、例えば、前述の動物が挙げられる。本発明に係る凍結保存方法によれば、ヒトの臍帯血および末梢血に効果的に適用することが可能である。

臍帯血は、例えば、臍帯静脈を穿刺して自然落下で採取すればよい。末梢血は、例えば、まるまる体外循環の方法で採取すればよい。したがって、本発明に係る凍結保存方法の一実施形態では、臍帯から臍帯血を採取する工程または生体から末梢血を採取する工程をさらに含む。

凍結保存用溶液に含まれる凍害防御剤は、臍帯血または末梢血を十分に保存できる凍結保存用溶液を構成し得るものであれば、特に限定されない。凍害防御剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯとする）、グリセロール、プロピレングリコール、および１−メチル−２−ピロリドン等が挙げられる。凍害防御剤としては、ＤＭＳＯおよびプロピレングリコールが好ましく、ＤＭＳＯが特に好ましい。凍結防御剤は、混合工程で得られた混合物において、３．０〜１０．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、５．０〜８．０ｗ／ｖ％あるいは５．０〜８．０ｖ／ｖ％含まれることがより好ましく、細胞回収率およびＤＭＳＯ量の低減化の観点から５．０ｖ／ｖ％含まれることがさらに好ましい。

グルコースは、混合工程で得られた混合物において、０．２５〜５．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、０．５〜５．０ｗ／ｖ％含まれることがより好ましく、１．０〜２．５ｗ／ｖ％含まれることがさらに好ましく、１．５〜２．０ｗ／ｖ％含まれることが特に好ましい。

凍結保存用溶液は、凍害防御剤とグルコースとの濃度比を、２０：１〜１：１とすることが好ましく、１０：１〜２：１とすることがより好ましく、２０：３〜１０：３とすることがさらに好ましい。この構成により、凍害防御剤の濃度を従来技術と比較して大きく低減し得る。そのため、特に生体に適用する場合において、体内に入る凍害防御剤の量を低減することができるため、より安全である。

凍結保存用溶液は、さらに、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、ｐＨ調製剤、および増粘剤等が挙げられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、およびリン酸緩衝液等が挙げられる。また、Basic Stock Solution（ＢＳＳ）にリン酸緩衝液を添加しない場合には、生理食塩水を添加したものも用いることもできる。このうちリン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。ｐＨ調整剤は凍結保存用溶液中のｐＨをおよそ６．５〜９．０、好ましくは７．０〜８．５に調整するために適宜用いることが好ましい。なお、本発明におけるリン酸緩衝液とは、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、リン酸一カリウム（無水）、リン酸二ナトリウム（無水）、リン酸三ナトリウム（無水）、塩化カリウム、およびリン酸二水素カリウム（無水）などのことをいい、特に塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、塩化カリウム、またはリン酸二水素カリウム（無水）を用いることが好ましい。ｐＨ調整剤は凍結保存用溶液中に０．０１〜１．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、０．０５〜０．５ｗ／ｖ％含まれることがより好ましい。

凍結保存用溶液は、増粘剤を含んでいてもよい。増粘剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース（以下ＣＭＣとする）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（以下ＣＭＣ−Ｎａとする）、有機酸ポリマー、アルギン酸プロピレングリコール、およびアルギン酸ナトリウム等が挙げられる。増粘剤としては、ＣＭＣおよびＣＭＣ−Ｎａが好ましく、ＣＭＣ−Ｎａが特に好ましい。また、有機酸ポリマーのうちではポリアクリル酸ナトリウムが好ましい。しかしながら、本発明では凍結保存用溶液に増粘剤が含まれていなくとも臍帯血または末梢血を良好に保存することができるため、本発明に係る凍結保存方法の好ましい一実施形態では、凍結保存用溶液は増粘剤を含んでいない。ヒトへの静脈内投与を想定した細胞製剤については、増粘剤を含まないことが望ましい。

凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。天然の動物由来成分としては、例えば、アルブミン、血清および基礎培地等が挙げられる。血清としては成牛血清、仔牛血清、新生仔牛血清、および牛胎児血清などが挙げられる。基礎培地としては、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ−１２培地、およびＤＭ−１６０培地等が挙げられる。凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液では、天然の動物由来成分のロット間での品質の違いの問題を生じることがない上、血清に含まれる各種サイトカイン、増殖因子およびホルモン等の本来細胞保存に不必要な成分による臍帯血中の細胞の性質の変化の虞を回避でき、さらに、基礎培地に含まれる由来が不明な成分による影響も回避できる。そのため、天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液は、特に臨床使用において、生体に安全に適用することができるという観点で、非常に有用である。

凍結保存用溶液は、デキストランを含んでいないことが好ましい。デキストランを含んでいない場合、アナフィラキシーショックを引き起こす虞を低減することができ、生体に安全に適用することができる。

凍結保存用溶液は、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）を含んでいないことが好ましい。ヒドロキシエチルスターチを含んでいない場合、アナフィラキシーショックを引き起こす虞を低減することができ、生体に安全に適用することができる。

凍結保存用溶液は、水溶液であることが好ましい。凍結保存用溶液の浸透圧は、保存液としての性能を保持するために、１０００ｍＯｓｍ以上であることが好ましく、１０００〜２７００ｍＯｓｍであることがより好ましい。

なお、凍結保存用溶液の組成は、細胞を十分に保存できる組成であれば上記で列挙した各成分の具体例のうちいずれの成分の組み合わせも用いることができる。また、濃度についてもそれぞれ選択して組み合わせることができる。

凍結保存用溶液は、好ましい一例において、凍害防御剤およびグルコースを含み、かつ天然の動物由来成分、増粘剤、デキストランおよびＨＥＳを含まない水溶液である。凍結保存用溶液は、より好ましい一例において、ＤＭＳＯおよびグルコースを含み、かつ天然の動物由来成分、増粘剤およびデキストランを含まない水溶液である。凍結保存用溶液は、さらに好ましい一例において、ＤＭＳＯを６．０〜２０．０ｗ／ｖ％含み、グルコースを１．０〜１０．０ｗ／ｖ％含み、かつ天然の動物由来成分、増粘剤、デキストランおよびＨＥＳを含まない水溶液である。凍結保存用溶液は、よりさらに好ましい一例において、ＤＭＳＯを１０．０ｖ／ｖ％含み、グルコースを３．０ｗ／ｖ％含み、かつ天然の動物由来成分、増粘剤、デキストランおよびＨＥＳを含まない水溶液である。凍結保存用溶液は、特に好ましい一例において、ＤＭＳＯとグルコースとｐＨ調整剤とのみを含む水溶液である。凍結保存用溶液は、最も好ましい一例において、ＤＭＳＯとグルコースとｐＨ調整剤とのみを含む水溶液であって、ＤＭＳＯを６．０〜２０．０ｗ／ｖ％含み、グルコースを１．０〜１０．０ｗ／ｖ％含む水溶液である。凍結保存用溶液は、最も好ましいさらなる一例において、ＤＭＳＯとグルコースとｐＨ調整剤とのみを含む水溶液であって、ＤＭＳＯを１０．０ｖ／ｖ％含み、グルコースを３．０ｗ／ｖ％含む水溶液である。

医療用途で用いる臍帯血または末梢血を凍結保存する場合、凍結保存用溶液は滅菌されていることが好ましい。細菌感染のリスクが低減されるため、より安全に生体へ適用することができるからである。

凍結保存する臍帯血または末梢血は、赤血球の少なくとも一部、好ましくは赤血球全てが除去されていてもよい。赤血球を除去することによって、凍結容量が小さくなるため、多数検体の保存が容易になる。赤血球の除去は、例えば、公知の方法で行うことができる。

また、凍結保存する臍帯血または末梢血は、血漿の少なくとも一部が除去されていてもよい。血漿の少なくとも一部を除去することによって、凍結保存用溶液と混合物する臍帯血または末梢血の体積を調整することができる。また、凍結容量が小さくなるため、多数検体の保存が容易になる。血漿の除去は、例えば、公知の方法で行うことができる。

凍結保存用溶液と臍帯血または末梢血とは、１：１〜３：１の体積比で混合することが好ましく、１：１〜２：１の体積比で混合することがより好ましく、一例において１：１の体積比で混合することがさらに好ましい。これらの範囲で混合することによって、より良好な解凍後の細胞生存率を達成することができる。凍結保存用溶液における各成分の濃度は、上記混合比に応じて調整される。例えば、１：１の体積比で混合する場合には、凍結保存用溶液における各成分の濃度は、混合物における濃度の２倍の濃度とすればよい。

凍結保存用溶液および臍帯血または末梢血の総量は特に限定されないが、例えば、１０〜１００ｍＬとすることができる。

混合する方法は特に限定されない。混合は、より均一に混合することができるという観点から、撹拌しながら行うことが好ましい。また、混合時の温度は特に限定されないが、１０℃以下であることが好ましく、氷冷しながら行うことがより好ましい。また、凍結保存用溶液を予め上記の温度にしておくことが好ましい。このような温度で混合することによって、混合物の温度上昇の影響を抑え、細胞生存率をより維持することができる。

混合工程で得られた混合物を次いで凍結する。凍結する前に、検査用のサンプルを採取したり、重量を測定したりしてもよい。また、耐寒性の容器（例えば、凍結用バッグ）に混合物を移し替えてもよい。これらの操作の間、細胞生存率保持の観点から、混合物は１０℃以下に冷却しておくことが好ましい。

凍結工程は、混合工程から可能な限り時間を置かず（例えば３０分以内、好ましくは１０分以内）に行うことが好ましい。冷却速度は特に限定されないが、緩速で冷却することが好ましく、例えば１℃／分〜３℃／分の冷却速度とすることができる。緩速で冷却する場合、例えば、プログラムフリーザー等を用いればよい。最終的な凍結する温度は特に限定されないが、好ましくは−８０℃以下、より好ましくは−１５０℃以下、さらに好ましくは−１９５．８℃以下である。保存する温度が低いほど、より長期間、良好な状態で保存することができる。また、−８０℃付近で凍結させた混合物を−１８０℃〜−２００℃（例えば、液体窒素中）に移して保存してもよい。耐寒性の容器に入れて凍結することが好ましい。

本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯血または末梢血は、解凍後に良好な細胞生存率を示す（後述の実施例を参照）。本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯血または末梢血は、例えば、２〜３ヶ月経過後において、凍結前を１００％とした場合の細胞生存率が８０％以上、好ましくは８５％以上で細胞を回収し得る。また、本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯血または末梢血は、１ヶ月経過後、３ヶ月経過後、６ヶ月経過後、１年経過後、３年経過後、５年経過後、もしくは１０年経過後において、またはそれ以上経過後において（半永久的に）、凍結前を１００％とした場合の細胞生存率が８０％以上、好ましくは８５％以上で細胞を回収し得る。ＣＤ３４陽性細胞の生存率は特に良好であり、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上であり得る。

したがって、本発明に係る凍結保存方法を用いて臍帯血または末梢血を凍結保存しておけば、将来自他の医療の際に、解凍して用いることができる。また、現在の技術では分取されていない可能性のある未知の細胞が将来的に単離可能になった際に、有効に用いることができる。例えば、現在治療法がない疾患であっても、将来的に治療法が開発された際に、凍結保存しておいた臍帯血または末梢血を利用することが可能となる。また、先天性遺伝子疾患等においては、遺伝子治療用の自家細胞ソースとして利用することもできる。

また、本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯血または末梢血は、解凍後に良好なＴＮＣ（総有核細胞）回収率、ＣＤ３４陽性細胞回収率、および総ＣＦＵ回収率を示す（後述の実施例を参照）。本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯血または末梢血は、例えば、２〜３ヶ月経過後において、凍結前を１００％とした場合のＴＮＣ（総有核細胞）回収率が９２．５％以上で細胞を回収し得る。本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯血または末梢血は、例えば、２〜３ヶ月経過後において、凍結前を１００％とした場合のＣＤ３４陽性細胞回収率が６７．１％以上で細胞を回収し得る。本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯血または末梢血は、例えば、２〜３ヶ月経過後において、凍結前を１００％とした場合の総ＣＦＵ回収率が７１．９％以上で細胞を回収し得る。

本発明では、デキストランを用いずとも、臍帯血または末梢血を良好に凍結保存することができる。そのため、解凍後に生体に対して安全に適用することができる。また、凍結保存用溶液と臍帯血または末梢血とを混合するだけであり、別途の添加の操作が不要で、採取後の臍帯血または末梢血を迅速に凍結保存することができる。

なお、混合工程で得られた臍帯血または末梢血と凍結保存用溶液との混合物（組成物）も本発明の範囲である。

〔凍結保存されている臍帯血または末梢血の解凍方法〕
本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯血または末梢血を解凍する方法は特に限定されない。解凍する温度は特に限定されないが、３０〜４０℃の範囲内であることが好ましく、３７〜４０℃の範囲内であることがより好ましい。解凍は急速に行うことが好ましく、例えば、３７〜３８℃の恒温水槽を用いて解凍すればよい。

解凍した臍帯血または末梢血は、医療または研究等に用いることができる。一例において、解凍した臍帯血または末梢血は、そのまま凍結保存用溶液と共に生体に注入されてもよいし、凍結保存用溶液を除去してから生体に注入されてもよい。あるいは、解凍した臍帯血または末梢血から生細胞が回収されてもよい。解凍した臍帯血もしくは末梢血または回収した生細胞は、例えば、血管内投与等の方法によって生体に注入される。上述のように、解凍した臍帯血または末梢血は、良好な細胞生存率および回収率を示す。

したがって、本発明は、解凍した臍帯血または末梢血を生体に投与する投与工程を含む、臍帯血または末梢血の投与方法を提供する。また、本発明は、解凍した臍帯血または末梢血から生細胞を回収する細胞回収工程を含む、臍帯血または末梢血からの生細胞の回収方法を提供する。また、本発明は、解凍した臍帯血または末梢血から回収された生細胞を生体に投与する投与工程を含む、臍帯血または末梢血の投与方法を提供する。

細胞回収工程において、生細胞を回収する方法は特に限定されず、例えば、臍帯血または末梢血から生細胞を回収するための公知の方法を用いることができる。回収される生細胞は特に限定されず、例えば、造血幹細胞等が挙げられる。回収される生細胞は、好ましくは幹細胞または前駆細胞であり、より好ましくは造血幹細胞である。あるいは、現在では分離できていない未知の細胞であり得る。なお、回収される生細胞は、臍帯血または末梢血に含まれるオリジナルの細胞に限らず、培養技術によって増殖した細胞（すなわち、オリジナルの細胞のコピー）であってもよい。回収された生細胞は、医療または研究等に用いることができる。医療に用いる場合、回収された生細胞は、自己または他者に移植され得る。

また、解凍した臍帯血または末梢血と凍結保存用溶液との混合物（組成物）も本発明の範囲である。

〔臍帯血または末梢血の凍結物およびその作製方法〕
本発明に係る臍帯血または末梢血の凍結物の作製方法は、凍害防御剤およびグルコースを含む凍結保存用溶液と、生細胞を含む臍帯血または末梢血とを混合する混合工程と、上記混合工程で得られた混合物を凍結する凍結工程と、を含んでいる。

混合工程および凍結工程の説明は、上述の〔臍帯血または末梢血の凍結保存方法〕におけるものと同じである。

本発明に係る作製方法によって作製された臍帯血または末梢血の凍結物は、解凍後に良好な細胞生存率を示す（後述の実施例を参照）。本発明に係る臍帯血または末梢血の凍結物は、例えば、２〜３ヶ月経過後において、凍結前を１００％とした場合の細胞生存率が８０％以上で細胞を回収することができる。また、本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯血または末梢血は、１ヶ月経過後、３ヶ月経過後、６ヶ月経過後、１年経過後、３年経過後、５年経過後、もしくは１０年経過後において、またはそれ以上経過後において（半永久的に）、凍結前を１００％とした場合の細胞生存率が８０％以上で細胞を回収し得る。

本発明に係る臍帯血または末梢血の凍結物は、上述の回収方法を用いて生細胞が回収されてもよい。回収された生細胞は、医療または研究等に用いることができる。生細胞は、例えば、造血幹細胞等であり得る。また、本発明に係る臍帯血または末梢血の凍結物は、解凍した後、そのまま生体に注入されてもよし、凍結保存用溶液を除去してから生体に注入されてもよい。

〔臍帯血または末梢血の凍結保存用溶液〕
本発明に係る臍帯血または末梢血の凍結保存用溶液は、凍害防御剤およびグルコースを含んでいる。凍結保存用溶液の説明は、上述の〔臍帯血または末梢血の凍結保存方法〕におけるものと基本的に同じである。

凍結保存用溶液において、凍害防御剤は、一例において、６．０〜２０．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、１０．０〜１６．０ｗ／ｖ％あるいは１０．０〜１６．０ｖ／ｖ％含まれることがより好ましく、細胞回収率およびＤＭＳＯ量の低減化の観点から１０．０ｖ／ｖ％含まれることがより好ましい。

凍結保存用溶液において、グルコースは、一例において、０．５〜１０．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、１．０〜１０．０ｗ／ｖ％含まれることがより好ましく、２．０〜５．０ｗ／ｖ％含まれることがさらに好ましく、３．０〜４．０ｗ／ｖ％含まれることが特に好ましい。

〔凍結保存用キット〕
本発明に係る臍帯血または末梢血を凍結保存するためのキットは、上述の臍帯血または末梢血の凍結保存用溶液と、凍結保存用溶液および臍帯血または末梢血を格納可能な耐寒性の容器と、を備える。

本発明に係るキットは、上述の〔臍帯血または末梢血の凍結保存方法〕および〔臍帯血または末梢血の凍結物およびその作製方法〕に好適に用いられる。

容器は、凍結保存用溶液および臍帯血または末梢血を格納可能であり、かつ耐寒性であれば、特に限定されない。容器の大きさは、特に限定されず、格納する臍帯血または末梢血の量に応じて適宜選択すればよい。容器の大きさは、例えば、容量が１０ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは２０ｍＬ〜３０ｍＬとすることができる。耐寒性の程度は、臍帯血または末梢血を保存する温度に耐え得るものであれば特に限定されないが、例えば、−８０℃に耐え得る材料であることが好ましく、−２００℃に耐え得る材料であることが好ましい。そのような容器としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネイト、およびフッ化エチレンプロピレン等の合成樹脂製の容器が挙げられる。容器は、密封できるものが好ましく、また内部が滅菌されていることが好ましい。

本発明に係るキットは、さらに、キットの使用説明書を備えていてもよい。キットの使用説明書には、上記〔臍帯血または末梢血の凍結保存方法〕の欄で説明した、本発明に係る凍結保存方法の内容、および／または上記〔臍帯血または末梢血の凍結物およびその作製方法〕の欄で説明した、本発明に係る作製方法の内容が記録されている。また、キットの使用説明書には、所定の終濃度になるように凍結保存用溶液を用いる旨の指示が記載されていてもよい。

〔まとめ〕
以上のように、本発明に係る凍結保存方法は、臍帯血または末梢血を凍結保存する方法であって、凍害防御剤およびグルコースを含む凍結保存用溶液と、臍帯血または末梢血とを混合する混合工程と、上記混合工程で得られた混合物を凍結する凍結工程と、を含む。

本発明に係る凍結保存方法において、上記凍結保存用溶液は、増粘剤を含まないことが好ましい。

本発明に係る凍結保存方法において、上記凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。

本発明に係る凍結保存方法において、上記凍害防御剤は、ジメチルスルホキシドであることが好ましい。

本発明に係る凍結保存方法において、上記混合物において、凍害防御剤は３．０〜１０．０ｗ／ｖ％含まれ、グルコースは０．２５〜５．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましい。

本発明に係る凍結保存方法において、上記混合工程では、上記凍結保存用溶液と上記臍帯血または末梢血とを１：１〜３：１で混合することが好ましい。

本発明に係る凍結保存方法において、上記臍帯血または末梢血は、赤血球の少なくとも一部が除去されていることが好ましい。

本発明に係る凍結保存方法において、上記臍帯血または末梢血は、ヒト由来であることが好ましい。

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。

＜実施例１＞
〔凍結保存用溶液の用意〕
凍結保存用溶液Ａ（実施例）：
ＤＭＳＯを１０．０ｖ／ｖ％（１１．０ｗ／ｖ％）、グルコースを３．０ｗ／ｖ％、ｐＨ調整剤を適量含む、滅菌した水溶液を凍結保存用溶液Ａとして用意した。

凍結保存用溶液Ｂ（比較例）：
ＤＭＳＯを５０．０％ｖ／ｖ（５５ｗ／ｖ％）、デキストラン（Dex40）を５．０ｗ／ｖ％含む滅菌した水溶液を凍結保存用溶液Ｂとして用意した。

〔臍帯血の処理〕
（１．ＨＥＳ添加）
原料臍帯血液量の１／５容量のヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）を計算した。次いで、安全キャビネット内で原料臍帯血バッグに操作アダプターを挿入した。シリンジを使用して、ＨＥＳを必要量添加した。原料臍帯血とＨＥＳとを十分に混和した。

（２．細胞分離）
原料臍帯血バッグのチューブを鉗子で止めた後、無菌接合装置（ＴＳＣＤ）を用いて細胞用分離バッグと接続した。原料臍帯血バッグを分離スタンドにセットし、赤血球と血漿との境界面が明瞭となるまで静置した（約６０〜９０分間）。境界面が明瞭となった後、クレンメを開放し、血漿および白血球層（バフィコート）を細胞用分離バッグに移した。その際、赤血球層の混入は３ｇまでとした。チューブをクレンメで止めた後、原料臍帯血バッグと細胞用分離バッグとを、チューブシーラーを用いてシールして切り離した。

（３．血漿除去）
血漿除去用分離バッグのチューブ先端部分を包装の上から鉗子で止めた後に包装を開封し、チューブの鉗子よりもバッグ側の位置でシールした（ＴＳＣＤ接合までバッグの無菌状態を維持した）。細胞用分離バッグを確認して血漿除去用分離バッグに臍帯血管理番号を記入またはラベルを貼付し、相互の番号の整合性を確認した。細胞用分離バッグのチューブを鉗子で止めた後、無菌接合装置（ＴＳＣＤ）を用いて血漿除去用分離バッグと接続した。接続した細胞用分離バッグと血漿除去用分離バッグとを大容量遠心機のバケットに立てた状態で挿入した。遠心分離条件を４００×Ｇ、１０分に設定して、遠心分離した。遠心分離終了後、細胞用分離バッグを分離スタンドにセットした。クレンメを外し、血漿除去用分離バッグに血漿を移した。この際、細胞用分離バッグ中の濃縮臍帯血容量を、凍結保存用溶液Ａと混合する場合には約１３．０ｍＬとなるように血漿量を調整した。また、凍結保存用溶液Ｂと混合する場合には２３．４ｍＬとなるように血漿量を調整した。細胞用分離バッグと血漿除去用分離バッグとを、チューブシーラーを用いてチューブをシールし切り離した。細胞用分離バッグの重量を測定し記録した。

（４．凍結保存用溶液の添加）
細胞用分離バッグを保冷剤で冷却できるように撹拌器にセットした。凍結保存用溶液Ａについてはシリンジポンプの注入速度（流量）を１２０ｍＬ／ｈｒに設定し確認した（レベル４）。また、凍結保存用溶液Ｂについてはシリンジポンプの注入速度（流量）を２０ｍＬ／ｈｒに設定し確認した。予冷した凍結保存用溶液Ａまたは凍結保存用溶液Ｂをシリンジに必要量分取した。分取したシリンジに翼付静注針を取り付けシリンジポンプにセットした。翼付静注針を操作アダプターに挿入し、冷却撹拌しながら、凍結保存用溶液を注入した。この際、凍結保存用溶液Ａは１３．０ｍＬ、凍結保存用溶液Ｂは４．４ｍＬとした。そのため、凍結時の最終濃度は、凍結保存用溶液Ａについては、ＤＭＳＯが５．０ｖ／ｖ％、グルコースが１．５ｗ／ｖ％となっており、凍結保存用溶液Ｂについては、ＤＭＳＯが８．０ｖ／ｖ％、デキストラン（Dex40）が０．８ｗ／ｖ％となっている。

（５．細胞数測定用検体分取）
細胞用分離バッグの臍帯血管理番号を確認して検体用チューブにラベルを貼付した。細胞用分離バッグに操作アダプターを挿入し、細胞用分離バッグ中の細胞を均一に浮遊し、凍結前臍帯血０．５ｍＬを検査用チューブに分取した。さらに０．５ｍＬの無菌試験用検体を分取した。

（６．凍結バッグへの移し替え）
凍結バッグのプラスチック針を細胞用分離バッグのポートに刺し、凍結前臍帯血を凍結バッグにすべて移し替えた。凍結バッグのチューブに凍結前臍帯血を満たし、セグメントを作製した。凍結バッグの最終重量を測定し、使用した電子天秤番号および最終重量を記録した。凍結処理開始まで、凍結前臍帯血は保冷剤で冷やした。なお、凍結保存用溶液Ａの添加終了から３０分以内に凍結を開始した。

（７．凍結）
凍結バッグ、キャニスター、セグメントおよび作業記録用紙の臍帯血管理番号が一致していることを確認し、凍結バッグをキャニスターに収納した。プログラムフリーザーを用い、冷却速度１〜３℃／分の条件で凍結処理を行った。凍結工程ごとに凍結時の温度変化を測定し、記録した。凍結処理終了後、速やかに液体窒素タンク気相に移し替えた。

〔凍結保存した臍帯血の解凍〕
２〜３ヶ月間凍結保存した臍帯血を凍結バッグごと３５〜３７℃の恒温水槽に入れて解凍した。解凍後、各試験の開始まで氷冷した。

〔造血細胞関連検査〕
（１．有核細胞検査）
凍結前の臍帯血および解凍後の臍帯血について、ＷＢＣ（白血球）およびＮＲＢＣ（有核赤血球）を検査した。検査機器として、自動血球計数装置：Sysmex XE-2100を用いた。これは、半導体レーザーを用いたフローサイトメトリー法に基づくものである。用いた試薬（シスメックス株式会社）は、表１のとおりである。

セルパックで検体を適宜希釈し、十分に撹拌した。測定はマニュアルモードで行った。検査データを用いて、有核細胞数濃度［（ＷＢＣ＋ＮＲＢＣ）×希釈倍率］を求めた。この有核細胞数濃度を用いて、ＴＮＣ（総有核細胞）回収率を求めた。

（２．ＣＤ３４陽性細胞数・細胞生存率検査）
凍結前の臍帯血および解凍後の臍帯血について、ＣＤ３４陽性細胞数および細胞生存率を検査した。検査機器として、フローサイトメーター（以下ＦＣＭという）：Cytomics FC500（ベックマンコールター社製）を用いた。これは、半導体レーザーを用いたフローサイトメトリー法に基づくものである。また、解析用ソフトとして、stemCXP software（ベックマンコールター社製）を用いた。ＣＤ３４陽性胞数測定キット（StemKit，ベックマンコールター社 A15573）を用いて測定し、その他試薬類は表２のとおりである。

検体量および検体番号を確認し、２％ＦＢＳＰＢＳ（−）で検体を適宜希釈した。検体用チューブ（ベックマンコールター社製，A26428）を３本準備し、検体番号およびＳＥＱ番号（１〜３）を記入した。チューブ１、２に７−ＡＡＤとＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＤ３４−ＰＥを各２０μＬずつ添加した。チューブ３に７−ＡＡＤとＣＤ４５−ＦＩＴＣを各２０μＬずつ添加した。全てのチューブに検体を１００μＬ添加し、十分に混和した。室温・暗所で２０分間反応させた。溶血剤（ＮＨ_４ＣｌＬｙｓｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ）を精製水で１０倍に希釈し、各チューブに２ｍＬ添加した（溶血剤は用時調製した）し、十分に混和した。室温・暗所で１０分間反応させた。

ＣＸＰプログラムを起動し、測定パネルを設定した。検体番号等を入力し、測定を開始した。測定終了後、データを確認し、Gate修正の必要がある場合には、Listmode playbackを実行し、Gateを修正した。

解析データに基づきＣＤ３４陽性細胞濃度およびＣＤ３４陽性細胞数を求めた。解凍後の臍帯血については細胞生存率も求めた。

（３．コロニー形成細胞（ＣＦＵ）数検査）
凍結前の臍帯血および解凍後の臍帯血について、ＣＦＵ−ＧＭ数および総ＣＦＵ数を検査した。用いた試薬（STEMCELL Technologies社）は、表３のとおりである。

凍結保存（−１５〜−２５℃）したMethoCult H4034 Optimum (st04044V)（約４ｍＬ）をフリーザーから取り出し、室温以下で解凍した。検体の有核細胞濃度が約４００個／μＬになるよう２％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ培地で希釈し、十分に撹拌した。解凍したMethoCult H4034 Optimum (st04044V)４ｍＬに有核細胞濃度を調整した検体４００μＬを加え、ミキサーで激しく攪拌した。大きな気泡が浮き上がるまで約５分間静置した。

メチルセルロース用シリンジおよび針を用いて、培地と混合した検体を３５ｍｍシャーレ３枚それぞれに１．１ｍＬ分注した。約３ｍＬの滅菌蒸留水を注いだ蒸留水用３５ｍｍシャーレとともに９０ｍｍシャーレに収納した。ＣＯ_２インキュベータに入れ、３７℃、５％ＣＯ_２、湿度１００％の条件で１２〜１５日間培養した。

培養後、倒立顕微鏡（ニコン製ＴＳ１００またはオリンパス製ＩＸ７１−ＰＨ）下でＣＦＵ数を計数した。計数値に基づき、ＣＦＵ−ＧＭ数および総ＣＦＵ数を求めた。これらの値を用いて、ＣＦＵ−ＧＭ回収率および総ＣＦＵ回収率を求めた。

（４．結果）
各造血細胞関連検査の結果を表４にまとめた（数値の単位は％）。

＜実施例２＞
〔凍結保存用溶液の用意〕
凍結保存用溶液Ｃ（実施例）：
ＤＭＳＯを１６．０ｖ／ｖ％（１７．６ｗ／ｖ％）、グルコースを３．０ｗ／ｖ％、ｐＨ調整剤を適量含む、滅菌した水溶液を凍結保存用溶液Ｃとして用意した。

〔臍帯血の処理〕
実施例１と同様の手順で行った。なお、凍結時の最終濃度は、凍結保存用溶液Ｃについては、ＤＭＳＯが８．０ｖ／ｖ％、グルコースが１．５ｗ／ｖ％となっており、凍結保存用溶液Ｂについては、ＤＭＳＯが８．０ｖ／ｖ％、デキストラン（Dex40）が０．８ｗ／ｖ％となっている。

〔凍結保存した臍帯血の解凍〕
２ヶ月間凍結保存した臍帯血を凍結バッグごと３５〜３７℃の恒温水槽に入れて解凍した。解凍後、各試験の開始まで氷冷した。

〔造血細胞関連検査〕
実施例１と同様に行った。

（結果）
各造血細胞関連検査の結果を表５にまとめた（数値の単位は％）。また、実施例１の表４において、凍結保存用溶液Ａと凍結保存用溶液Ｂとで臍帯血採取のタイミングが異なるため、その点を考慮して計算し直したものについても表５に記載した。なお、表５の凍結保存用溶液Ｃについては、臍帯血採取のタイミングを考慮して計算したものである。また、凍結保存用溶液Ｂについては、実施例１と実施例２とで評価手法が同じであるため、表５では足し合わせている。

＜実施例３＞
同一検体を用いて臍帯血の凍結保存の比較実験を行った。

〔凍結保存用溶液の用意〕
凍結保存用溶液Ａ（実施例）：
ＤＭＳＯを１０．０ｖ／ｖ％（１１．０ｗ／ｖ％）、グルコースを３．０ｗ／ｖ％、ｐＨ調整剤を適量含む、滅菌した水溶液を凍結保存用溶液Ａとして用意した。

凍結保存用溶液Ｃ（実施例）：
ＤＭＳＯを１６．０ｖ／ｖ％（１７．６ｗ／ｖ％）、グルコースを３．０ｗ／ｖ％、ｐＨ調整剤を適量含む、滅菌した水溶液を凍結保存用溶液Ｃとして用意した。

〔臍帯血の処理〕
実施例１と同様の手順で赤血球を除去し、２６．５ｍＬまで遠心濃縮した。ここから０．５ｍＬを凍結前の臍帯血試料として採取した後、残りを２つに分けた（１３．０ｍＬ）。これを、実施例１と同様の手順で、１３．０ｍＬの凍結保存用溶液Ａまたは凍結保存用溶液Ｃと混合した。そして、実施例１と同様の手順で、これらを凍結保存した。なお、凍結時の最終濃度は、凍結保存用溶液Ａについては、ＤＭＳＯが５．０ｖ／ｖ％、グルコースが１．５ｗ／ｖ％となっており、凍結保存用溶液Ｃについては、ＤＭＳＯが８．０ｖ／ｖ％、グルコースが１．５ｗ／ｖ％となっている。

〔造血細胞関連検査〕
実施例１と同様に行った。

（結果）
各造血細胞関連検査の結果を表６にまとめた（数値の単位は％）。

凍結保存用溶液Ａは、凍結保存用溶液Ｃと比較して、細胞回収率が高く、また輸注されるＤＭＳＯ量の低減化の観点からも、より好ましいと考えられる。

本発明は、医療および研究等における臍帯血および末梢血の凍結保存に利用することができる。

Claims

臍帯血を凍結保存する方法であって、
凍害防御剤およびグルコースを含み、増粘剤、デキストランおよび天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液と、臍帯血とを混合する混合工程と、
上記混合工程で得られた混合物を凍結する凍結工程と、を含む凍結保存方法。
臍帯血または末梢血を凍結保存する方法であって、
凍害防御剤およびグルコースを含み、増粘剤、デキストランおよび天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液と、臍帯血または末梢血とを混合する混合工程と、
上記混合工程で得られた混合物を凍結する凍結工程と、を含み、
上記混合物において、凍害防御剤は３．０〜１０．０ｗ／ｖ％含まれ、グルコースは０．２５〜５．０ｗ／ｖ％含まれる、凍結保存方法。
上記凍害防御剤は、ジメチルスルホキシドである、請求項１または２に記載の凍結保存方法。
上記混合工程では、上記凍結保存用溶液と上記臍帯血または末梢血とを１：１〜３：１の体積比で混合する、請求項１〜３の何れか１項に記載の凍結保存方法。
上記臍帯血または末梢血は、赤血球の少なくとも一部が除去されている、請求項１〜４の何れか１項に記載の凍結保存方法。
上記臍帯血または末梢血は、ヒト由来である、請求項１〜５の何れか１項に記載の凍結保存方法。
臍帯血の凍結物を作製する方法であって、
凍害防御剤およびグルコースを含み、増粘剤、デキストランおよび天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液と、生細胞を含む臍帯血とを混合する混合工程と、
上記混合工程で得られた混合物を凍結する凍結工程と、を含む作製方法。
臍帯血または末梢血の凍結物を作製する方法であって、
凍害防御剤およびグルコースを含み、増粘剤、デキストランおよび天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液と、生細胞を含む臍帯血または末梢血とを混合する混合工程と、
上記混合工程で得られた混合物を凍結する凍結工程と、を含み、
上記混合物において、凍害防御剤は３．０〜１０．０ｗ／ｖ％含まれ、グルコースは０．２５〜５．０ｗ／ｖ％含まれる、作製方法。
凍害防御剤およびグルコースを含み、増粘剤、デキストランおよび天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液と、生細胞を含む臍帯血との混合物の凍結物。
凍害防御剤およびグルコースを含み、増粘剤、デキストランおよび天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液と、生細胞を含む臍帯血または末梢血との混合物の凍結物であって、
上記混合物において、凍害防御剤は３．０〜１０．０ｗ／ｖ％含まれ、グルコースは０．２５〜５．０ｗ／ｖ％含まれる、凍結物。
凍害防御剤およびグルコースを含み、増粘剤、デキストランおよび天然の動物由来成分を含まない、臍帯血の凍結保存用溶液。
臍帯血を凍結保存するためのキットであって、
請求項１１に記載の臍帯血の凍結保存用溶液と、
凍結保存用溶液および臍帯血を格納可能な耐寒性の容器と、を備える、凍結保存用キット。
上記臍帯血または末梢血は、血漿の少なくとも一部が除去されたものである、請求項１〜６の何れか一項に記載の凍結保存方法。