MX2007015201A

MX2007015201A - Composiciones y metodos de uso de sangre de cordon umbilical agotada de plasma, no agotada de globulos rojos.

Info

Publication number: MX2007015201A
Application number: MX2007015201A
Authority: MX
Inventors: Robert Chow
Original assignee: Stemcyte Inc
Priority date: 2005-06-02
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2008-03-14
Also published as: WO2006130812A2; WO2006130812A3; AU2006252363A1; ATE551062T1; RU2007148802A; IL187641A0; EP1906729B1; EP1906729A4; KR20080027295A; CA2609266A1; BRPI0610968A2; EP1906729A2; HK1124484A1; JP2008545755A

Abstract

Las composiciones de sangre de cordon umbilical (UCB) de la presente invencion poseen las caracteristicas unicas de tener plasma que se encuentra sustancialmente agotado de la unidad UCB y globulos rojos (RBC) que no se encuentran agotadas de la unidad UCB. Tales unidades de UCB pueden prepararse mediante un proceso que combina el agotamiento del plasma con la criopreservacion, seleccion, descongelacion y/o trasplante de celulas germinales hematopoyeticas para proporcionar resultados clinicos superiores al maximizar la recuperacion celular post-procesamiento y la dosis de celulas de infusion post-descongelacion. Tambien se proporcionan metodo para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades malignas y enfermedades benignas asociadas con el sistema hematopoyetico mediante la administracion de las composiciones de UCB de la presente invencion.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS D? USO DE SANGRE D? CORDÓN UMBILICAL AGOTADA DE PLASMA, NO AGOTADA D? GLÓBULOS ROJOS REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud se refiere a las Solicitudes Provisionales de E.U. Nos. 60/687,127, presentada en Junio 2 de 2005, y 60/733,956, presentada en Noviembre 3 de 2005, cuyas descripciones se incorporan en la presente mediante la referencia en su totalidad para todo propósito. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe un considerable interés en la identificación, aislamiento y generación de células germinales humanas. Las células germinales humanas son células precursoras totipotenciales o pluripotenciales capaces de auto renovarse y de generar una variedad de linajes celulares humanos maduros. Esta capacidad sirve como base para la diferenciación y la especialización celular necesaria para el desarrollo de órganos y tejidos. Recientes éxitos en el transplante de células germinales han proporcionado nuevas herramientas clínicas para reconstituir y/o suplir médula ósea después de la mieloablación debida a enfermedad, exposición a químicos tóxicos y/o radiación. Existe evidencia adicional que demuestra que las células germinales pueden emplearse para repoblar muchos, si no todos, los tejidos y restaurar la funcionalidad fisiológica y anatómica.

Se han caracterizado muchos tipos diferentes de células germinales de mamífero. Por ejemplo, se conocen células germinales embriónicas, células reproductoras embriónicas, células germinales adultas y otras células germinales comprometidas. De hecho, ciertas células germinales no solo se han aislado y caracterizado, sino que también se han cultivado bajo condiciones que permiten un grado limitado de diferenciación. Debido a las decenas de millones de combinaciones posibles de tipos de HLA en la población, permanece el problema básico de que es muy difícil obtener cantidades, poblaciones y variedades suficientes de tipos de HLA de células germinales humanas capaces de diferenciación en todos los tipos que pueden ser HLA compatibles con pacientes individuales. Las células germinales de diferentes tipos de HLA tienen un suministro críticamente corto. Debido a su importancia en el tratamiento de una amplia variedad de trastornos, incluyendo malignidades, errores ingénitos de metabolismo, hemoglobinopatías e inmunodeficiencias, sería altamente ventajoso tener una adecuada fuente de células germinales de varios tipos de HLA. La obtención de números suficientes de células germinales humanas ha sido problemática por diversas razones. Primero, el aislamiento de poblaciones de origen normal de células germinales en tejidos adultos ha sido técnicamente difícil y costoso, debido en parte a las muy limitadas cantidades encontradas en sangre o en tejidos. Segundo, la procuración de estas células a partir de tejidos embriónicos o fetales, incluyendo fetos abortados, ha hecho surgir problemas éticos. En consecuencia, son esenciales fuentes alternativas que no requieren el uso de células proporcionadas a partir de tejido embriónico o fetal para el progreso posterior en el uso clínico de células germinales. Sin embargo, existen pocas fuentes alternativas viables de células germinales, particularmente células germinales humanas, y por tanto, el suministro es limitado. Además, la cosecha de células germinales a partir de fuentes alternativas en cantidades adecuadas para propósitos terapéuticos y de investigación es generalmente laboriosa, implicando, e.g., la cosecha de células o tejidos de un sujeto o paciente donador, el cultivo y/o propagación de células in vitro, disección, etc. Por ejemplo, la Patente de E.U. No. 5,486,359 describe composiciones de células germinales mesenquimal humana (HMSC) derivadas de la médula ósea que sirven como progenitoras para linajes de célula mesenquimal. Las composiciones de HMSC homogéneas se obtienen mediante la selección positiva de células de médula o periosteales adherentes que se encuentran libres de marcadores asociados ya sea con las células hematopoyéticas o con las células mesenquimales diferenciadas. Las poblaciones de célula mesenquimal aisladas presentan características asociadas con las células germinales mesenquimales, tienen la capacidad para regenerarse en cultivo sin diferenciación, y tienen la capacidad de diferenciarse en linajes mesenquimales específicos ya sea cuando se inducen in vitro o cuando se colocan in vivo en el sitio del tejido dañado. Sin embargo, la desventaja de tales métodos es que requieren primero la cosecha invasiva y dolorosa de células de médula o periosteales de un donador humano a fin de aislar subsecuentemente las HMSCs . La Publicación PCT No. WO 00/73421 describe células epiteliales amnióticas humanas derivadas de placenta liberada que se aislan, se cultivan, se criopreservan para uso futuro o se inducen a diferenciación. Las células epiteliales amnióticas se aislan a partir de la membrana amniótica de acuerdo con técnicas estándar de aislamiento celular. Estas células son multipotenciales y pueden diferenciarse en tejidos epiteliales tales como el epitelio de la superficie córnea o el epitelio vaginal. Sin embargo, la desventaja de tales métodos es que son de trabajo intensivo y que el rendimiento de las células germinales es muy bajo. De hecho, para obtener un número suficiente de células germinales para propósitos típicos terapéuticos o de investigación, las células epiteliales amnióticas deben aislarse primero del amnión y después cultivarse y expandirse in vitro. La sangre del cordón umbilical se conoce como una fuente alternativa de células germinales hematopoyéticas. Las células germinales de sangre de cordón umbilical se criopreservan rutinariamente para reconstitución hematopoyética, un procedimiento terapéutico utilizado en médula ósea y otros transplantes relacionados (ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 5,004,681 y 5,192,553). Las técnicas convencionales para la recolección de sangre de cordón umbilical se basan en el uso de una aguja o cánula que se utiliza con la ayuda de la gravedad para drenar la sangre de cordón umbilical de la placenta (ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 5,004,681, 5,192,553, 5,372,581 y 5,415,665). La aguja o cánula se coloca comúnmente en la vena umbilical y se da masaje suavemente a la placenta para ayudar a drenar la sangre de cordón umbilical de la placenta. Sin embargo, una limitación principal de la procuración de células germinales a partir de la sangre de cordón umbilical ha sido el volumen frecuentemente inadecuado de sangre de cordón umbilical obtenido, dando como resultado números de células insuficientes para reconstituir efectivamente la médula ósea después del transplante. Las células germinales tienen el potencial para utilizarse en el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades y trastornos, incluyendo malignidades, enfermedades genéticas, hemoglobinopatías e inmunodeficiencias . Sin embargo, las células germinales de sangre de cordón umbilical tienen un suministro críticamente corto debido a las restricciones en su recolección, a los números inadecuados de células típicamente recolectados de la sangre de cordón umbilical, especialmente si se utilizan para tratar a un paciente adulto, y al costo extraordinario para establecer un gran inventario. Por tanto, existe una fuerte necesidad en la técnica de composiciones de sangre de cordón umbilical que contengan un número adecuado de células germinales hematopoyéticas suficiente para reconstituir efectivamente la médula ósea después del transplante. Existe también la necesidad en la técnica de métodos para la preparación de tales composiciones de sangre de cordón umbilical y para su uso para propósitos terapéuticos. La presente invención satisface éstas y otras necesidades. BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN Las composiciones de sangre de cordón umbilical (UCB) de la presente invención poseen las ventajosas características de que tienen plasma que se encuentra sustancialmente agotada, pero glóbulos rojos (RBC) que no se encuentran agotadas de la unidad UCB, i.e., una composición agotada de plasma, no agotada de glóbulos rojos. Tales unidades de UCB pueden prepararse mediante un proceso que combina el agotamiento del plasma con la criopreservación, selección, descongelación y/o transplante de células germinales hematopoyéticas para proporcionar resultados clínicos superiores con relación a unidades de sangre completa o de UCB de RBC agotada maximizando la recuperación celular post-procesamiento y la dosis de células de infusión post-descongelación. También se proporcionan métodos para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades malignas y de enfermedades benignas asociadas con el sistema hematopoyético mediante la administración de las composiciones de UCB de la presente invención. En un aspecto, la presente invención proporciona una composición de sangre de cordón umbilical (UCB) que comprende al menos aproximadamente 50% de glóbulos rojos por volumen y un anticoagulante, en la cual el plasma se encuentra sustancialmente agotado pero los glóbulos rojos no se encuentran agotados. Preferentemente, la composición de UCB comprende al menos aproximadamente 65% de glóbulos rojos por volumen. En ciertos ejemplos, la composición de UCB comprende desde aproximadamente 0% hasta aproximadamente 30% de plasma por volumen, preferentemente desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 30% de plasma por volumen. En una modalidad, la composición de UCB comprende células germinales, incluyendo, e.g., células germinales hematopoyéticas. En otra modalidad, la composición de UCB comprende desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 40% por volumen de anticoagulante, preferentemente desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 20% por volumen de anticoagulante. Generalmente, el anticoagulante contiene ácido cítrico, citrato de sodio, fosfato de sodio, dextrosa, y/o adenosina. Preferentemente, el anticoagulante contiene todos estos componentes (i.e., CPDA) . Aún en otra modalidad, la composición de UCB comprende además un crioprotector. Preferentemente, la composición de UCB comprende desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 15% por volumen de crioprotector. En ciertos ejemplos, el crioprotector es dimetil sulfóxido (DMSO). En ciertos ejemplos diferentes, el crioprotector es una mezcla de DMSO y Gentran 40 o DMSO y almidón de hidroxietilo (HES) . En una modalidad preferida, el crioprotector se agrega como una solución hasta que la concentración final de DMSO es de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 10%. En otras modalidades de la presente invención, la composición de UCB tiene una o más de las siguientes características: (1) una concentración de glóbulos rojos (RBC) de al menos aproximadamente 0.4 x 106 RBC/µl (e.g., de aproximadamente 0.4 x 106 a aproximadamente 8 x 106 RBC/µl), preferentemente de al menos aproximadamente 3.2 x 106 RBC/µl, más preferentemente de al menos aproximadamente 3.8 x 105 RBC/µl; (2) un número de RBC de desde aproximadamente 0.5 x 109 hasta aproximadamente 5 x 109 RBC, preferentemente de aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 2.5 x 109 RBC; (3) una concentración de glóbulos blancos (WBC) de aproximadamente 3 x 103 a aproximadamente 70 x 103 WBC/µl, preferentemente de aproximadamente 15 x 103 WBC/µl; (4) un número de WBC de al menos aproximadamente 20 x 107 WBC (e.g., de aproximadamente 20 x 107 a aproximadamente 500 x 107 WBC, preferentemente de al menos aproximadamente 90 x 107 WBC; (5) un número de células CD34+ de desde aproximadamente 1 x 104 hasta aproximadamente 1 x 108 células CD34+, preferentemente de desde aproximadamente 1 x 106 hasta aproximadamente 5 x 107 células CD34+; (6) un porcentaje de células CD34+ en la fracción de WBC de desde aproximadamente 0.018% hasta aproximadamente 4.3%, preferentemente de aproximadamente 0.15% a aproximadamente 1.8%; (7) un número total de células nucleadas de aproximadamente 20 x 107 a aproximadamente 500 x 107 células nucleadas, preferentemente de aproximadamente 90 x 107 a aproximadamente 300 x 107 células nucleadas; y (8) un porcentaje de células nucleadas en la fracción celular de desde aproximadamente 0.18% hasta aproximadamente 1.8%, preferentemente de aproximadamente 0.54%. El experto en la técnica apreciará que el número de células CD34+ variará dependiendo del análisis particular utilizado. En ciertos ejemplos, la composición de UCB tiene una o más de las características antes descritas antes de agregar el crioprotector. Preferentemente, la composición de UCB tiene una o más de las características antes descritas después de agregar el crioprotector. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de sangre de cordón umbilical (UCB) que comprende al menos aproximadamente 50% de glóbulos rojos por volumen, una concentración de glóbulos rojos de al menos aproximadamente 3.2 x 106 de glóbulos rojos/µl, y un anticoagulante, en la cual el plasma se encuentra sustancialmente agotado pero los glóbulos rojos no se encuentran agotados. Preferentemente, la composición de UCB comprende al menos aproximadamente 65% de glóbulos rojos por volumen. En ciertos ejemplos, la composición de UCB comprende de aproximadamente 0% a aproximadamente 30% de plasma por volumen, preferentemente de aproximadamente 10% a aproximadamente 30% de plasma por volumen. En una modalidad, la composición de UCB comprende células germinales incluyendo, e.g., células germinales hematopoyéticas. En otra modalidad, la composición de UCB comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% por volumen de anticoagulante, preferentemente de aproximadamente 5% a aproximadamente 20% por volumen de anticoagulante. Aún en otra modalidad, la composición de UCB comprende además un crioprotector. Preferentemente la composición de UCB comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% por volumen de cualquier crioprotector o mezclas del mismo descritas en la presente (e.g., una mezcla de DMSO y Gentran 40) . En otras modalidades de la presente invención, la composición de UCB tiene una o más de las características antes descritas (e.g., al menos aproximadamente 3.8 x 106 de RBC/µl, etc.) antes y/o preferentemente después de agregar el crioprotector. Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad maligna (e.g., malignidad hematológica) o enfermedad o trastorno benigno (e.g., una enfermedad o trastorno asociado con el sistema hematopoyético) administrando a un sujeto mamífero (e.g., un humano) una cantidad efectiva de la composición de UCB de plasma agotada descrita en la presente. En ciertos ejemplos, el humano tiene un peso de menos de aproximadamente 50 kg (i.e., paciente pediátrico). En una modalidad, la enfermedad maligna es una malignidad hematológica incluyendo, sin limitación, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, trastornos mielodisplásicos, leucemia mielógena juvenil crónica, y linfoma no de Hodgkin. En otra modalidad, la enfermedad o trastorno benigno se encuentra asociado con el sistema hematopoyético incluyendo, sin limitación, una hemoglobinopatía, un síndrome de falla de médula ósea, una deficiencia inmune, una enfermedad metabólica/de almacenamiento, un trastorno neutrófilo, una enfermedad de plaquetas, una infección viral tal como una infección VIH, y una enfermedad autoinmune. Preferentemente, la hemoglobinopatía es talasemia (e.g., talasemia dependiente de transfusión, talasemia mayor, etc.) o enfermedad de drepanocito. Se describen abajo ejemplos adicionales de enfermedades malignas y trastornos benignos asociados con el sistema hematopoyético adecuadas para prevención o tratamiento con las composiciones de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención. En otras modalidades de la presente invención, la composición de UCB de plasma agotada que se administra al sujeto mamífero para el tratamiento o transplante curativo de enfermedades hematopoyéticas proporciona uno o más de los resultados clínicos superiores: (1) un incremento en la incidencia acumulativa del injerto de neutrófilos con relación al total de sangre de cordón umbilical o de sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos; (2) un incremento en la incidencia acumulativa del injerto de plaquetas con relación al total de sangre de cordón umbilical o de sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos; (3) un incremento en la velocidad del injerto de neutrófilos con relación al total de sangre de cordón umbilical o de sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos; (4) un incremento en la velocidad del injerto de plaquetas con relación al total de sangre de cordón umbilical o de sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos; (5) un incremento en la tasa de supervivencia libre de enfermedad con relación al total de sangre de cordón umbilical, de sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos, médula ósea o células germinales de sangre periférica; (6) una disminución en el transplante relativo a la tasa de mortalidad con relación al total de sangre de cordón umbilical, de sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos, médula ósea o células germinales de sangre periférica; (7) un incremento en la tasa de supervivencia total relativa al total de sangre de cordón umbilical, de sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos, médula ósea o células germinales de sangre periférica; (8) una disminución en la incidencia de injerto agudo y crónico contra enfermedad huésped con relación a la médula ósea y células germinales de sangre periférica. Como se utiliza en la presente, el incremento o disminución en uno de los resultados clínicos antes descritos se refiere una la diferencia de al menos aproximadamente 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50%, con relación al total de sangre de cordón umbilical, de sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos, médula ósea y/o células germinales de sangre periférica. Preferentemente, la composición de UCB de plasma agotada que se administra al sujeto mamífero proporciona al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de los resultados clínicos anteriormente descritos. En otra modalidad, la composición de UCB de plasma agotada se administra como una dosis múltiple al sujeto mamífero. Por ejemplo, la dosis múltiple puede ser una dosis doble de unidad de sangre de cordón umbilical, una dosis triple de unidad de sangre de cordón umbilical, etc. Preferentemente, la dosis múltiple disminuye la tasa de reincidencia en dicho sujeto mamífero con relación a una dosis única. Aún en otra modalidad, la composición de sangre de cordón umbilical de plasma agotada se administra en combinación con médula ósea, células germinales de sangre periférica o células germinales mesenquimales compatibles con HLA, no compatibles o haploidénticas . La composición de sangre de cordón umbilical de plasma agotada puede lavarse o no lavarse entre la descongelación y la administración al sujeto mamífero. Preferentemente, la composición no se lava. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará que la composición puede lavarse si el sujeto mamífero tiene una función renal deteriorada o un bajo peso corporal. En ciertos ejemplos, la composición se diluye entre la descongelación y la administración al sujeto mamífero. Preferentemente, la composición se administra mediante infusión dentro del sujeto mamífero. Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la preparación de una composición de sangre de cordón umbilical (UCB) de plasma agotada, mediante el retiro de un volumen del plasma de la muestra de UCB conteniendo un anticoagulante. La muestra de UCB se colecta típicamente de un donador tal como un neonato y/o la madre de un neonato. En una modalidad, la composición de sangre de cordón umbilical de plasma agotada comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% por volumen de anticoagulante, preferentemente de aproximadamente 5% a aproximadamente 20% por volumen de anticoagulante. Generalmente, el anticoagulante contiene ácido cítrico, citrato de sodio, fosfato de sodio, dextrosa, y/o adenosina. Preferentemente, el anticoagulante contiene todos estos componentes (i.e., CPDA) . En otra modalidad, el método comprende además la etapa de agregar un crioprotector. Preferentemente, la composición de sangre de cordón umbilical de plasma agotada comprende desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 15% por volumen de crioprotector. En ciertos ejemplos, el crioprotector es dimetil sulfóxido (DMSO) . En ciertos ejemplos diferentes, el crioprotector es una mezcla de DMSO y Gentran 40 o DMSO y almidón de hidroxietilo (HES) . En una modalidad preferida, el crioprotector se agrega como una solución hasta que la concentración final de DMSO es de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 10%. Aún en otra modalidad, el método comprende además la etapa de congelamiento de la composición de sangre de cordón umbilical de plasma agotada conteniendo crioprotector, a una tasa de aproximadamente -1°C por minuto de aproximadamente 4°C a aproximadamente -50°C, y enseguida a una tasa de aproximadamente -10°C por minuto de aproximadamente -50°C a aproximadamente -90°C. El método puede comprender además la etapa de almacenamiento de la composición congelada a una temperatura por debajo de aproximadamente -135°C, preferentemente por debajo de aproximadamente -150°C. El método puede comprender además la etapa de descongelación de la composición congelada y ya sea de lavado o no lavado de la composición descongelada antes de la administración a un sujeto mamífero. En ciertos ejemplos, el método comprende además la expansión ex vivo de la población de células germinales ya sea antes o después de la criopreservación. En ciertos ejemplos diferentes, el método comprende además la determinación de si la composición de sangre de cordón umbilical de plasma agotada cumple ciertos criterios de selección antes de proceder con las etapas subsecuentes, e.g., la administración al sujeto mamífero. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para colectar células germinales viables, e.g., células germinales hematopoyéticas, primero colectando una fuente de células germinales de un donador. Después de mezclar la fuente de células germinales con un anticoagulante, se reduce el volumen de la fuente de células germinales mediante centrifugación a una temperatura de entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 26°C. El líquido, e.g., plasma, se remueve de la fuente de células germinales después de la centrifugación, dejando la fuente concentrada de células germinales con un volumen reducido. La fuente concentrada de células germinales se transfiere a un contenedor de congelamiento y se enfría a entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos. Se produce una solución de crioprotector incluyendo una mezcla de una solución de 1:1 (volumen/volumen) de aproximadamente 50% de DMSO y un polisacárido de bajo peso molecular y se mantiene entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C. La solución de crioprotector se agrega a la fuente concentrada de células germinales en el contenedor de congelamiento. A medida que se agrega el crioprotector, la fuente concentrada de células germinales en el contenedor de congelamiento se mueve para lograr el mezclado tan pronto como se agrega la solución de crioprotector. El movimiento se proporciona colocando la fuente concentrada de células germinales en el contenedor de congelamiento, por ejemplo, sobre una plataforma oscilante. El contenedor de congelamiento conteniendo la fuente concentrada de células germinales se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C. El crioprotector se agrega preferentemente utilizando una bomba de jeringa programable. Se forma así una mezcla de crioprotector-células germinales con una concentración de DMSO de entre aproximadamente 5% y aproximadamente 15% por volumen, preferentemente entre aproximadamente 5% y aproximadamente 10%. En ciertos ejemplos, las células germinales viables colectadas se almacenan. Como ejemplo no limitante, la mezcla de crioprotector-células germinales en el contenedor de congelamiento, preparada de acuerdo con el método antes descrito, puede colocarse en un cásete de almacenamiento de aluminio que se ha enfriado previamente a entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C. El cásete de almacenamiento de aluminio puede colocarse entonces en un congelador de tasa controlada y congelarse a una tasa controlada. Típicamente, esto debe ocurrir dentro de aproximadamente los 10 minutos de recepción del contenedor de congelamiento. Después de congelar, el contenedor de congelamiento congelado con la mezcla congelada de crioprotector-células germinales puede transferirse desde el congelador de tasa controlada a un tanque de nitrógeno líquido para el almacenamiento de las células germinales viables.

Las fuentes adecuadas de células germinales incluyen, pero no se limitan a, fuentes adultas de células germinales, fuentes fetales de células germinales, fuentes embriónicas de células germinales, sangre de placenta, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, médula ósea, e hígado fetal. En ciertos ejemplos, la fuente de células germinales es sangre de placenta y/o sangre de cordón umbilical . En algunas modalidades, la fuente de células germinales comprende células nucleadas y más de aproximadamente el 95% de las células nucleadas se encuentra presente en la fuente concentrada de células germinales. En otras modalidades, el anticoagulante comprende citrato, fosfato y dextrosa (CPD) . En una modalidad adicional, la temperatura del contenedor de congelamiento que contiene la fuente concentrada de células germinales se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C durante la adición del crioprotector, e.g., envolviendo la bolsa en paquetes de hielo. En ciertos ejemplos, la mezcla de crioprotector-células germinales se divide entre al menos dos contenedores de congelación antes de congelarse. La mezcla de fuente de células germinales-anticoagulante se almacena típicamente a una temperatura de entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 26°C. La mezcla de fuente de células germinales-anticoagulante puede almacenarse de esta manera por hasta aproximadamente 48 horas antes de que se reduzca su volumen. En otra modalidad, la solución de crioprotector se enfría a entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C. en ciertos ejemplos, la solución de polisacárido de bajo peso molecular comprende dextrano. Aún en otra modalidad, la transferencia desde el congelador de tasa controlada al tanque de nitrógeno líquido se completa dentro de aproximadamente 10 minutos. En ciertos ejemplos, la transferencia desde el congelador de tasa controlada al tanque de nitrógeno líquido se completa dentro de aproximadamente 10 segundos. En una modalidad adicional, la mezcla de crioprotector-células germinales incluye células nucleadas y al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, o 95% de las células nucleadas son viables post-descongelación . Otras características, objetivos y ventajas de la presente invención y sus modalidades preferidas se harán aparentes a partir de la descripción detallada, ejemplos y reivindicaciones siguientes. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los resultados generales para todos los pacientes. La Figura ÍA muestra la incidencia acumulativa no ajustada del injerto ANC500 para todos los pacientes (n = 106) ; la Figura IB muestra la incidencia acumulativa no ajustada del injerto de plaquetas 20K para todos los pacientes (n = 89) ; la Figura ÍC muestra la tasa de supervivencia del paciente al primer año para todos los pacientes (n = 118); y la Figura ID muestra la tasa de supervivencia libre de reincidencia al primer año para todos los pacientes malignos (n = 85) . La Figura 2 muestra los resultados para el subconjunto de pacientes de remisión de primer transplante. La Figura 2A muestra la incidencia acumulativa no ajustada del injerto de ANC500 para pacientes de remisión/primer transplante (n = 87); la Figura 2B muestra la incidencia acumulativa no ajustada de injerto de plaquetas 20K para pacientes de remisión/primer transplante (n = 72); la Figura 2C muestra la tasa de supervivencia del paciente al primer año para pacientes de remisión/primer transplante (n = 98); y la Figura 2D muestra la tasa de supervivencia libre de reincidencia al primer año para pacientes malignos de remisión/primer transplante (n = 67). La Figura 3 muestra una comparación entre pacientes NMDP, no NMDP de E.U., y no NMDP de Taiwan. La Figura 3A muestra la incidencia acumulativa del injerto neutrófilo (ANC500); la Figura 3B muestra la incidencia acumulativa de injerto de plaquetas 20K; la Figura 3C muestra la tasa de reincidencia; y la Figura 3D muestra la mortalidad del paciente y las tasas generales de supervivencia. La Figura 4 muestra una comparación entre pacientes de transplante pediátricos, adultos y de unidad única. La Figura 4A muestra la incidencia acumulativa de injerto neutrófilo (ANC500); la Figura 4B muestra la incidencia acumulativa de injerto de plaquetas 20K; la Figura 4C muestra la tasa de reincidencia; y la Figura 4D muestra la mortalidad del paciente y las tasas generales de supervivencia. La Figura 5 muestra una comparación entre pacientes con enfermedades benignas o malignas. La Figura 5A muestra la incidencia acumulativa no ajustada del injerto de ANC500 para pacientes de remisión/primer transplante (n = 87); la Figura 5B muestra la incidencia acumulativa de injerto de plaquetas 20K para pacientes de remisión/primer transplante (n = 72); la Figura 5C muestra la supervivencia general del paciente para pacientes de remisión/primer transplante (n = 98). La Figura 6 muestra una comparación entre pacientes que reciben unidades de sangre de cordón umbilical lavadas o no lavadas. La Figura 6A muestra la incidencia acumulativa de injerto de neutrófilo (ANC500) ; la Figura 6B muestra la incidencia acumulativa de injerto de plaquetas 20K; y la Figura 6C muestra la incidencia acumulativa de injerto de plaquetas 50K. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Definiciones Como se utilizan en la presente, los siguientes términos tienen los significados adscritos a los mismos a menos que se especifique de otra manera. El término "células germinales" se refiere a cualquier célula que tiene la capacidad de dividirse por períodos indefinidos de tiempo para dar lugar a células especializadas. Las células germinales emanan de todas las capas germinales (i.e., ectodermo, mesodermo y endodermo). Las fuentes típicas de células germinales incluyen embriones, médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón umbilical, sangre de placenta y tejido adiposo. Las células germinales pueden ser pluripotentes, lo que significa que son capaces de generar la mayoría de los tejidos en un organismo. Por ejemplo, las células germinales pluripotentes pueden dar lugar a las células de la piel, hígado, sangre, músculo, hueso, etc. en contraste, las células germinales multipotentes o adultas típicamente dan lugar a tipos limitados de células. Por ejemplo, las células germinales hematopoyéticas dan lugar a células de linajes linfoide, mieloide y eritroide. Las células viables son células que se encuentran vivas y frecuentemente son capaces de crecimiento y división. Los expertos en la técnica tienen conocimiento de métodos para determinar la viabilidad de las células, e.g., mediante la capacidad para excluir un colorante azul de tripano. El término células germinales como se utiliza en la presente incluye células germinales a menos que se anote de otra manera. "Células nucleadas" se refiere a células que tienen un núcleo, i.e., un organelo que comprende ADN cromosomal.

Las células nucleadas incluyen, e.g., glóbulos blancos y células germinales. "Células no nucleadas" incluyen, e.g., células adultas de sangre roja. Como se utilizan en la presente, los términos "el plasma se encuentra sustancialmente agotado" y "plasma agotada" se refieren a las composiciones de sangre de cordón umbilical de la presente invención en las cuales se ha removido el volumen de plasma mayor que 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. En una modalidad preferida, el plasma se encuentra sustancialmente agotado centrifugando una mezcla de sangre de cordón umbilical-anticoagulante y separando la fracción celular de la fracción de plasma. El volumen de plasma que permanece después de un agotamiento sustancial es típicamente de aproximadamente 0% a aproximadamente 30% por volumen, preferentemente de aproximadamente 10% a aproximadamente 30% por volumen. Los términos "glóbulos rojos no agotadas" y "los glóbulos rojos no se encuentran agotados" como se utilizan en la presente, se refieren a las composiciones de sangre de cordón umbilical de la presente invención en las cuales se ha removido el volumen de glóbulos rojos menor a aproximadamente 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%. Aunque la presente invención no incluye una etapa para remover los glóbulos rojos de la unidad de sangre de cordón umbilical, el experto en la técnica entenderá que la etapa de agotamiento de la unidad del plasma y/o otras etapas de procesamiento, pueden remover un pequeño volumen de glóbulos rojos. El término "velocidad para injerto de neutrófilos" se refiere a una indicación de qué tan rápido funciona el nuevo sistema inmune creado por la médula ósea recién injertada e indica típicamente la suma del número de bandas y neutrófilos por volumen de sangre en el recipiente. Preferentemente, el paciente se encuentra inmunocomprometido previo al injerto de neutrófilos. Entre más corta sea la velocidad o el tiempo del injerto de neutrófilos, es más ventajoso para el paciente. De manera similar, el término "velocidad de injerto de plaquetas" se refiere a una indicación de qué tan rápido funciona la médula ósea recién injertada para desactivar las plaquetas importantes para la coagulación. Antes del injerto de plaquetas, los pacientes dependen de la transfusión de plaquetas donadors de manera que no tienen ningún problema de sangrado. Entre más corta sea la velocidad o el tiempo para el injerto de plaquetas, es más ventajoso para el paciente. El término "incidencia acumulativa de injerto" se refiere al porcentaje de transplantes que eventualmente muestran una robusta producción de ese linaje particular de células hematopoyéticas, e.g., neutrófilos o plaquetas. Los términos "unidad de sangre de cordón umbilical" y "unidad UCB" como se utilizan en la presente, se refieren a un volumen de sangre de cordón umbilical que se colecta de un solo donador. Las composiciones de UCB de la presente invención contienen típicamente una unidad UCB, pero también pueden contener múltiples unidades de UCB, e.g., unidades dobles de sangre de cordón umbilical que pueden administrarse a un paciente a fin de incrementar adicionalmente la dosis de células. Como se utiliza en la presente, el término "crioprotector" se refiere a un agente utilizado para mejorar la viabilidad de las células a medida que se congelan. Los crioprotectores incluyen, pero no se limitan a, dimetil sulfóxido (DMSO), glicerol, etileno glicol, propileno glicol, formamida, y almidón de hidroxietilo (HES) . Preferentemente, se agrega un polisacárido de bajo peso molecular tal como dextrano (e.g., Gentran 40) a la mezcla crioprotectora. En una modalidad preferida, la solución crioprotectora comprende aproximadamente una relación de 10:1 (volumen/volumen) de DMSO a Gentran 40, tal como, por ejemplo, 50% DMSO a 5% Gentran 40, que se agrega a la mezcla de sangre de cordón umbilical y anticoagulante para proporcionar una concentración final de aproximadamente 5% a aproximadamente 10% de DMSO.

Una "cantidad efectiva" de una composición de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención, es una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, e.g., prevención o tratamiento de una enfermedad maligna o de una enfermedad benigna asociada con el sistema hematopoyético . Como se utiliza en la presente, el término "administración" se refiere al suministro de las composiciones de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención, mediante cualquier vía incluyendo, sin limitación, administración oral, intranasal, intravenosa, intraósea, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, intraventricular, intracraneal, intralesional, intratraqueal, intratecal, subcutánea, intradérmica, transdérmica o transmucosa. Preferentemente, se infunde a los pacientes con una, dos, tres o más unidades de sangre de cordón umbilical preparadas de acuerdo con los métodos de la presente invención. Pueden administrarse unidades múltiples tales como unidades dobles de sangre de cordón umbilical simultáneamente o consecutivamente (e.g., durante el curso de varios minutos, horas o días) a un paciente. En ciertos ejemplos, las unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención se administran después de la terapia mieloablativa, de intensidad reducida o no mieloablativa para eliminar la médula ósea enferma o después de la terapia de radiación, quimioterapia, u otra exposición a radiación que haya abladido la médula ósea huésped. En ciertos ejemplos diferentes, las unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención se co-administran ya sea simultáneamente o consecutivamente con médula ósea y/o células de sangre periférica como terapia de combinación. II. Revisión General A diferencia de otras fuentes de células germinales hematopoyéticas, la sangre de cordón umbilical ofrece un suministro de células germinales que se limita al número total de células presente para esa recolección. En contraste, la médula ósea y la sangre periférica Ofrecen un suministro casi ilimitado de células germinales hematopoyéticas. Debido a esta inherente limitación, la dosis total de células nucleadas de una unidad dada de sangre de cordón umbilical es una de las determinantes más importantes para el resultado clínico, e.g., injerto de neutrófilos, injerto de plaquetas y el establecimiento de una nueva médula ósea. Dado que la carencia de injerto de glóbulos blancos significa la carencia de un sistema inmune funcional, el impacto en el injerto, a su vez, afecta la supervivencia del paciente. Al fallar el injerto, el paciente sucumbirá eventualmente a la infección a menos que el paciente recupere su propia médula ósea autóloga, sea rescatado con su propia médula o células germinales de sangre periférica almacenadas, o que experimente otro tran$plante de células germinales relacionada o no relacionada. Al inicio del transplante de sangre de cordón umbilical entre 1988 y 1994, las unidades de sangre de cordón umbilical se criopreservaron y se almacenaron como unidades de sangre completa, sin ninguna reducción en el volumen. Por ejemplo, se almacenaron 2,257 unidades como unidades de sangre completa entre 1993 y 1994 en el New York Blood Center (NYBC) . Como resultado, los transplantes de sangre de cordón umbilical realizados en ese tiempo utilizaron unidades de sangre completa. De hecho, desde el 2003, el NYBC transplantó 460 de tales unidades de sangre completa, representando la tasa de utilización más alta para los diferentes tipos de unidades gue se almacenaron. Debido al extraordinario costo del espacio de almacenamiento, el NYBC Cord Blood Bank desarrolló un método para reducir el volumen congelado de unidades de sangre completa en 1994, agregando Hespan (almidón heta o almidón de hidroxietilo) seguido por centrifugación para remover el exceso de glóbulos rojos y plasma a fin de lograr un volumen final de aproximadamente 20 ml . Otra popular técnica implica la purificación de células mononucleares removiendo los glóbulos rojos y los neutrófilos utilizando centrifugación de gradiente de sedimentación Ficoll. Sin embargo, estas técnicas no proporcionan una recuperación adecuada de las células germinales hematopoyéticas debido a que un número significativo de tales células se encuentra atrapado dentro de la masa de glóbulos rojos y se remueven conjuntamente con las glóbulos rojos. De hecho, la recuperación típica de células germinales hematopoyéticas post-procesamiento es de 70-75% para el método Hespan y solo de 25-50% para el método Ficoll. La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que el procesamiento de las unidades de sangre de cordón umbilical de acuerdo con los métodos descritos en la presente, minimiza el grado de pérdida de células nucleadas que limita severamente la aplicabilidad de técnicas tales como los métodos Hespan y Ficoll descritos anteriormente. De hecho, los métodos de la presente invención proporcionan composiciones de sangre de cordón umbilical que contienen un número mayor de células germinales viables post-procesamiento, criopreservación y congelamiento, dando como resultado una mayor dosis de células promedio para su infusión en un paciente, y el sorprendente descubrimiento de que se logra un resultado clínico significativamente mejorado con unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada al compararse con las unidades de glóbulo rojo agotada o de sangre completa. La presente invención también se basa en el sorprendente descubrimiento de que el no someter a una etapa de lavado las composiciones de sangre de cordón umbilical descongeladas de la presente invención previo a su administración al paciente, da como resultado una mayor incidencia acumulativa de injerto así como una velocidad más rápida para el injerto tanto para neutrófilos como para plaquetas. Por tanto, los métodos para el procesamiento de las unidades de sangre de cordón umbilical descritas en la presente y las composiciones de plasma agotada, no agotada de glóbulos rojos, proporcionan una tasa superior de injerto y una tasa más alta de supervivencia en comparación con los productos de sangre de cordón umbilical obtenidos de otros bancos públicos de sangre de cordón umbilical. III. Procesamiento de Agotamiento de Plasma de Sangre de Cordón umbilical Las composiciones de sangre de cordón umbilical (UCB) de la presente invención poseen la característica única de tener plasma que se encuentra sustancialmente agotada de la unidad UCB y glóbulos rojos (RBC) que no se encuentran agotadas de la unidad UCB. Tales unidades de UCB pueden prepararse mediante un proceso que combina el agotamiento de plasma con la criopreservación, selección, descongelación y/o transplante de células germinales hematopoyéticas para proporcionar un resultado clínico superior, maximizando la recuperación de células posterior al procesamiento y la dosis de células de infusión posterior a la descongelación. También se proporcionan métodos para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades malignas (e.g., malignidades hematológicas) y trastornos benignos asociados con el sistema hematopoyético mediante la administración de las composiciones de UCB de la presente invención. En un aspecto, las unidades de UCB de plasma agotada, de RBC no agotada se preparan mediante el proceso descrito a continuación. Una UCB de neonato se colecta en un envase de recolección tal como una bolsa de recolección de sangre multi-bolsas gue contiene un anticoagulante. El envase de recolección contiene típicamente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 ml de anticoagulante (e.g., aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 95, 90, 95 o 100 ml) . Preferentemente, el envase de recolección contiene de aproximadamente 23 ml a aproximadamente 35 ml de anticoagulante. Los ejemplos no limitantes de anticoagulantes incluyen, una mezcla de citrato, fosfato, dextrosa y adenosina (CPDA) , una mezcla de citrato, fosfato y dextrosa (CPD) , y una mezcla de ácido, citrato y dextrosa (ACD) . Preferentemente, el anticoagulante es CPDA, que puede comprender 0.299% de ácido cítrico anhidroso, 0.263% de citrato de sodio dehidrato, 0.222% de fosfato de sodio monobásico (monohidrato), 3.19% de dextrosa y 0.0275% de adenosina. CPDA es isotónica y tiene un pH neutro, de manera que la relación de anticoagulante a sangre no es crítica. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará que la composición y/o el volumen del anticoagulante en el envase de recolección puede depender del volumen de sangre de cordón umbilical colectado del donador. La UCB colectada se suministra a un laboratorio de procesamiento de UCB, preferentemente dentro de aproximadamente 43 horas para permitir la criopreservación aproximadamente a las 48 horas después del nacimiento. Sin embargo, la criopreservación hasta aproximadamente las 72 horas de nacimiento puede producir también resultados aceptables . La bolsa de recolección se pesa para determinar el volumen de recolección de UCB sustrayendo el peso de la bolsa de recolección con anticoagulante del peso combinado. El volumen en la bolsa se determina por el volumen de la UCB más el volumen del anticoagulante. La sangre de cordón umbilical completa se analiza en este punto para determinar la cuenta de sangre completa. El hematocrito de pre-procesamiento (i.e., el porcentaje de glóbulos rojos por volumen) con anticoagulante tiene típicamente un rango de desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 60% para más del 95% de las muestras. La concentración de glóbulos rojos se encuentra comúnmente entre aproximadamente 2 a aproximadamente 10 x 10s/µl y la concentración de glóbulos blancos se encuentra comúnmente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 x 106/ml. La unidad UCB se centrifuga, e.g., en una bolsa de recolección de sangre de 3 bolsas para separar la fracción celular de la fracción de plasma superior. La porción de plasma superior se retira en la segunda bolsa que después se sella. En ciertos ejemplos, si la porción restante mayormente celular contiene más de 60 cc, el producto puede dividirse en dos porciones (e.g., en la bolsa original y en la tercera bolsa), cada una en su propia bolsa de recolección/transferencia. Después del agotamiento del plasma, tanto el hematocrito (HCT) como la concentración de RBC de la unidad UCB se incrementan aproximadamente de 1.2 a aproximadamente 3 veces (promedio = aproximadamente de 1.6 a aproximadamente 1.8 veces; media = aproximadamente 1.7 a aproximadamente 1.8 veces) con relación a las unidades de sangre completa o de glóbulo rojo agotada (ver Tabla 1) . Tabla 1. Comparación de cuentas de sangre de unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada, sangre completa y glóbulo rojo agotada que contienen anticoagulante pero no crioprotector.

TW = muestras de Taiwan; US = muestras de los Estados Unidos. Plasma procesado-muestras agotadas se basan en 99% de recuperación de glóbulos rojos, glóbulos blancos y CD34+células, ya que menos de aproximadamente 0.1% se encuentran en la fracción de plasma. RBC procesado-muestras agotadas se basa en 20% de producción de glóbulos rojos de sangre completa original y una concentración similar de glóbulos rojos como en la sangre completa después del agotamiento de los glóbulos rojos. RBC procesado-muestras agotadas también se basan en la recuperación promedio del 75% de glóbulos blancos y CD34+células y sobre el promedio de 75% de reducción de volumen .

El producto en cada bolsa de recolección/transferencia se transfiere entonces a través de un dispositivo de dique estéril a una bolsa de congelación (e.g., bolsa CryoCyte®) . Típicamente, las unidades de UCB se criopreservan en una bolsa de congelación después del agotamiento de plasma y de la adición de crioprotector preenfriado (i.e., aproximadamente 4°C), e.g., con un volumen máximo aproximado de aproximadamente 75 cc. Sin embargo, algunas unidades de UCB se dividen en dos bolsas, e.g., con un volumen máximo combinado aproximado de aproximadamente 150 cc. La mezcla de UCB de plasma agotada/anticoagulante se enfría entonces a aproximadamente 4°C previo a la adición de uno o más crioprotectores. Típicamente, se agrega un crioprotector en forma de una solución en una cantidad igual a aproximadamente 50% del volumen de UCB/anticoagulante. Por ejemplo, en ejemplos en los cuales el volumen de UCB/anticoagulante en la muestra de plasma agotada es de 60 ml, el volumen de la solución de crioprotector puede ser de 15 ml . Como resultado, la unidad UCB comprende generalmente de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% por volumen del crioprotector, e.g., aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% por volumen del crioprotector. En una modalidad preferida, la solución de crioprotector comprende una mezcla de aproximadamente 50% de DMSO y aproximadamente 5% de Gentran 40 (i.e., aproximadamente una relación de 10:1 de DMSO a Gentran 40) para proporcionar una concentración final de DMSO de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%. La solución de crioprotector de DMSO/Gentran 40 puede agregarse a la mezcla de UCB/anticoagulante a una tasa de aproximadamente 0.75 ml por minuto mediante una bomba de jeringa con la bolsa de congelación entre paquetes de hielo en un girador para lograr una concentración final de DMSO de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%. Como se muestra en la Tabla 2, las unidades de UCB de plasma agotada que contienen tanto anticoagulante como crioprotector, tienen un hematocrito (HCT) más alto y una concentración de RBC (i.e., al menos 1.6 veces) relativa a las unidades de sangre completa o de glóbulo rojo agotada. Tabla 2. Comparación de cuentas de sangre de unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada, de sangre completa y de glóbulo rojo agotada que contienen anticoagulante y crioprotector (25% por volumen de DMSO) .

El hematocrito posterior al procesamiento de la mezcla de UCB de plasma agotada/anticoagulante en ausencia del crioprotector se encuentra típicamente en el rango de desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 100%, preferentemente entre aproximadamente 40% y aproximadamente 100% y más preferentemente entre aproximadamente 50% y aproximadamente 100%, e.g., al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95%. Por tanto, en modalidades preferidas, las unidades de UCB procesadas de la presente invención tienen un hematocrito que es más alto que el hematocrito para unidades tanto de UCB de sangre completa (i.e., 40%) como de unidades de UCB de almidón de hidroxietilo (HES) de célula roja agotada (i.e., 40%) (ver Tabla 1) . El hematocrito posterior al procesamiento de la mezcla de UCB de plasma agotada/anticoagulante con crioprotector se encuentra típicamente en el rango de desde aproximadamente 16% hasta aproximadamente 80%, preferentemente entre aproximadamente 32% y aproximadamente 80%, más preferentemente entre aproximadamente 40% y aproximadamente 80%, y más preferentemente entre aproximadamente 50% y aproximadamente 80%, e.g., aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% y 80%. Por tanto, en modalidades preferidas, las unidades de UCB procesadas de la presente invención con crioprotector tienen un hematocrito que es más alto que el hematocrito para unidades tanto de UCB de sangre completa (i.e., 32%) como de unidades de UCB de HES de célula roja agotada (i.e., 32%) (ver Tabla 2) .

La concentración posterior al procesamiento de glóbulos rojos para la mezcla de UCB de plasma agotada/anticoagulante en ausencia de crioprotector, se encuentra típicamente en el rango de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 x 106/µl, preferentemente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10 x 106/µl, y más preferentemente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 10 x 106/µl, e.g., aproximadamente, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, o 106/µl. Por tanto, en modalidades preferidas, las unidades de UCB procesadas de la presente invención tienen una concentración de glóbulos rojos que es más alta que la concentración de glóbulos rojos tanto para unidades de UCB de sangre completa (i.e., 3.5 x 106/µl) como para unidades de UCB de HES de célula roja agotada (i.e., 3.5 x 106/µl) (ver Tabla 1). La concentración posterior al procesamiento de glóbulos rojos para la mezcla de UCB de plasma agotada/anticoagulante con crioprotector, se encuentra típicamente en el rango de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 8 x 106/µl, preferentemente entre aproximadamente 2.4 y aproximadamente 8 x 106/µl, y más preferentemente entre aproximadamente 3.2 y aproximadamente 8 x 106/µl, e.g., aproximadamente, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 u 8 x 106/µl. Por tanto, en modalidades preferidas, las unidades de UCB procesadas de la presente invención con crioprotector tienen una concentración de glóbulos rojos que es más alta que la concentración de glóbulos rojos tanto para unidades de UCB de sangre completa (i.e., 2.8 x 106/µl) como para unidades de UCB de HES de célula roja agotada (i.e., 2.8 x 106/µl) (ver Tabla 2) . La concentración posterior al procesamiento de glóbulos blancos para la mezcla de UCB de plasma agotada/anticoagulante en ausencia de crioprotector, se encuentra típicamente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 90 x 106/ml, e.g., aproximadamente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, o 90, o 106/µl. Preferentemente, la concentración de glóbulos blancos, post-procesamiento y de la adición del crioprotector es mayor que aproximadamente 10 x 10d/ml), aproximadamente 10, 15, 30, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 106/ml, en un volumen de congelación de aproximadamente 75 cc para un producto de una bolsa de UCB. En una modalidad preferida, la concentración celular de las unidades de UCB de plasma agotada de la presente invención es al menos aproximadamente 25% mayor que la de las unidades de sangre completa, e.g., al menos aproximadamente 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más. El procesamiento antes descrito de las unidades de UCB, es responsable, en parte, de las diferencias entre el agotamiento de plasma y el agotamiento de sangre completa o de glóbulos rojos. Ventajosamente, las unidades de UCB procesadas de la presente invención tienen un volumen de plasma menor que produce una mayor concentración celular y un hematocrito más alto. Sin vincularse a ninguna teoría particular, una o más de estas propiedades proporciona una mejor criopreservación con resultados clínicos mejorados en comparación con las unidades de sangre completa o de glóbulos rojos. Como un ejemplo no limitante, las unidades de UCB de plasma agotada de la presente invención proporcionan resultados clínicos mejorados en comparación con los resultados de la sangre completa del New York Blood Center (NYBC) . El proceso de agotamiento de plasma descrito en la presente tiene también las siguientes ventajas sobre HES u otros métodos de agotamiento de células rojas de unidades de UCB: (1) menor pérdida de células nucleadas; (2) menor pérdida de células CD34+; (3) menor pérdida de unidades formadoras de colonia; (4) un hematocrito sustancialmente más alto; y (5) una mayor concentración celular (i.e., incluyendo glóbulos rojos) . Adicionalmente, la presencia de un mayor volumen permite que las unidades de UCB procesadas de la presente invención soporten las técnicas de manipulación posteriores a la descongelación debido a la mayor cantidad de tiempo que toma para descongelar el producto completo contra un producto de agotamiento de célula roja con un volumen típicamente menor (e.g., 25 ml ) . Por tanto, una o más de las propiedades anteriores cuenta para el resultado clínico superior observado en pacientes que reciben un transplante de UCB de plasma agotada. Sin embargo, las unidades de UCB de plasma agotada de la presente invención proporcionan resultados clínicos mejorados en comparación con los resultados de célula roja agotada del New York Blood Center (NYBC) , ya sea almacenadas en tanques convencionales de rociado de nitrógeno líquido o en tanques BioArchive® de nitrógeno líquido hechos por ThermoGenesis Corp. La mezcla de UCB de plasma agotada que contiene tanto anticoagulante como crioprotector se congela entonces utilizando una curva programada de congelación de línea plana de aproximadamente -1°C por minuto desde aproximadamente 4°C hasta aproximadamente -50°C. Esta etapa de congelación puede llevarse a cabo en ausencia de inmersión para compensar la liberación de calor resultante de la transición de fase (i.e., calor de fusión) de la composición de líquido a hielo. Después de la etapa inicial de congelación, las unidades de UCB procesadas se congelan adicionalmente a una tasa de aproximadamente -10°C por minuto desde aproximadamente -50°C hasta aproximadamente -90°C. Las curvas de congelación programada tradicionales en otros bancos (e.g., el St. Louis Cord Blood Bank) tienen una inmersión al punto de temperatura esperado para el calor de fusión, con la racional de compensación para el calor de fusión que se genera. Sin embargo, esta compensación ocasionalmente sobre-compensa y genera una pendiente de tasa de enfriamiento que a más de -5°C por minuto mata las células. Para la curva plana de congelamiento descrita en la presente, el calor de fusión ocasiona una aguda elevación en la temperatura que no mata las células previo al cambio fase. Adicionalmente, la curva plana de congelación de aproximadamente -1°C no produce una pendiente de relación de enfriamiento que mate las células. Las unidades de UCB procesadas se almacenan típicamente por debajo de aproximadamente -135°C y preferentemente por debajo de aproximadamente -150°C en nitrógeno líquido (e.g., fase líquida y/o de vapor) . Las unidades de UCB de plasma agotada de la presente invención logran inesperadamente un mejor resultado clínico que las unidades de UCB de sangre completa, aunque ambas contienen un número similar de células y en teoría deben lograr la misma recuperación de células. Por ejemplo, las unidades de UCB de plasma agotada proporcionan un resultado clínico mejorado al compararse con los datos históricos del NYBC para unidades de UCB de sangre completa. Sin vincularse a alguna teoría particular, las unidades de UCB de plasma agotada son más potentes, proporcionan mejor preservación de la viabilidad de la células germinales, y/o carecen de factores inhibidores en el plasma que se remueven mediante el procesamiento para permitir una más rápida reconstitución inmune en el paciente y/o los glóbulos rojos y la hemoglobina lisada en un estado concentrado ayudan a preservar la viabilidad de las células. De hecho, la concentración celular y la potencia son al menos 1.5 veces las de la UCB de sangre completa. En una modalidad preferida, las unidades de UCB de plasma agotada de la presente invención cumplen con los siguientes criterios de selección: (1) mínimo número de células nucleadas como una dosis combinada de unidad única o doble de aproximadamente 2.0 x 107/kg; (2) dosis normalizada de células CD34+ como una dosis combinada de unidad única o doble de aproximadamente 1.0 x 105/kg; y (3) mínimo de compatibilidades 4/6 HLA A/B/DR a alta resolución. La dosis de CD34+ ser normaliza comúnmente para variación inter-laboratorio y se determina tomando el porcentaje promedio de CD34+ para 100 unidades de sangre de cordón umbilical en un laboratorio particular y dividiendo el valor entre 0.300% (el porcentaje promedio aproximado de células CD34+ en la población general en los E.U. si se utiliza el método de enumeración de citometría de flujo Becton Dickinson Pro-Count) , en el cual la dosis individual se multiplica por la tasa para llegar a una dosis normalizada de células CD34+. El experto en la técnica apreciará fácilmente que cualquiera o todos los criterios de selección anteriores puede variar dependiendo de las circunstancias y métodos de análisis utilizados . Previo al transplante, las unidades de UCB de plasma agotada de la presente invención se descongelan. Las unidades descongeladas se lavan o no se lavan previo a la administración. Preferentemente, las unidades descongeladas no se lavan. En ciertos ejemplos, las unidades descongeladas no lavadas se administran a un paciente mediante infusión directa. En otros ciertos ejemplos, las unidades descongeladas no lavadas se administran a un paciente mediante infusión después de haber diluido y/o reconstituido las unidades con una solución isotónica que contiene, por ejemplo, albúmina de suero humano y Gentran (dextrano) . Como se muestra en el Ejemplo 4, las unidades de UCB no lavadas de plasma agotada después de descongelarse mejoran el resultado clínico en pacientes transplantados con tales unidades. De hecho, la incidencia acumulativa para el injerto de plaquetas y la velocidad de injerto para neutrófilos y plaquetas se incrementan con relación a las unidades lavadas, indicando que el lavado posterior a descongelación realmente retarda o reduce la incidencia acumulativa de injerto de células germinales hematopoyéticas. Adicionalmente, las unidades de UCB no lavadas de plasma agotada después de descongelarse proporcionan una mejor recuperación de células nucleadas, incrementando así la dosis total de células nucleadas (TNC) que se administra con relación a las unidades lavadas. Sin embargo, en ciertos ejemplos, e.g., con niños pequeños o cuando los pacientes tienen una función renal comprometida, las unidades descongeladas de plasma agotada se administran a un paciente mediante infusión después de haber lavado las unidades con una solución isotónica que contiene, por ejemplo albúmina de suero humano y Gentran (dextrano) . En otra modalidad, puede llevarse a cabo un análisis de unidad formadora de colonia (CFU) en la sangre de cordón umbilical descongelada de plasma agotada en una entubación sellada o un segmento unido o no unido a la bolsa de congelación que contiene el grueso de la sangre de cordón umbilical, o en las unidades de UCB descongeladas de plasma agotada reales en la bolsa de congelación, para demostrar el potencial de replicación de la unidad UCB particular y para sostener la unidad si falla el análisis de CFU, para mostrar el crecimiento en pruebas repetidas. En ciertos ejemplos, el análisis de CFU toma en cuenta la más alta densidad de glóbulos rojos, la más alta concentración de hemoglobina, y la más alta concentración fantasma de glóbulos rojos contra las unidades de sangre completa y de glóbulo rojo agotada. Por tanto, se utiliza una dilución de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 o desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 en una solución que contiene albúmina de suero humano o suero fetal de ternera y dextrano, inmediatamente después de descongelar previo a la colocación en placas de las células en el medio semisólido para el crecimiento de CFU. La administración de las unidades de UCB de plasma agotada de la presente invención proporciona un resultado clínico sin precedente para transplantes de UCB no relacionados en términos de la incidencia acumulativa de injerto, la velocidad de injerto, tasa de supervivencia, supervivencia libre de enfermedad, tasa de reincidencia, y tasa de enfermedad de injerto contra huésped. Con respecto a las enfermedades benignas asociadas con el sistema hematopoyético, las unidades de UCB descritas en la presente proporcionan un resultado clínico sin precedente, para transplantes de UCB no relacionados en términos de la incidencia acumulativa de injerto, la velocidad de injerto, tasa de supervivencia, supervivencia libre de enfermedad, tasa de reincidencia, y tasa de enfermedad de injerto contra huésped que conduce ventajosamente la tasa de riesgo a favor del beneficio con supervivencia mejorada. Por ejemplo, el resultado clínico en pacientes transplantados con unidades de UCB no relacionadas sin compatibilidad con HLA de plasma agotada para enfermedades benignas es mejor que los transplantes de sangre de cordón umbilical compatible con HLA previamente reportados utilizando unidades de sangre completa o de sangre de cordón umbilical de célula roja agotada. De hecho, el resultado clínico utilizando UCB no relacionada sin compatibilidad con HLA de plasma agotada es comparable con los transplantes relacionados compatibles con HLA utilizando médula ósea en términos de la supervivencia general y la supervivencia libre de enfermedad, así como la velocidad para el injerto de neutrófilos para indicaciones benignas. Adicionalmente las unidades de UCB de plasma agotada se injertan más rápido que las unidades de UCB de glóbulo rojo agotada descritas en Kurtzberg et al., N, Engl. J. Med., 352-2069-2081 (2005), a pesar de la dosis de célula más alta y de los pacientes más jóvenes y menos pesados utilizados en ese estudio. con respecto a enfermedades malignas, las unidades de UCB descritas en la presente proporcionan un resultado clínico sin precedente para transplantes de UCB no relacionada en términos de la incidencia acumulativa de injerto, la velocidad de injerto, tasa de supervivencia, supervivencia libre de enfermedad, tasa de reincidencia, y tasa de enfermedad de injerto contra huésped. En suma, el procesamiento de agotamiento de plasma de UCB de la presente invención proporciona los siguientes beneficios para una unidad de sangre de cordón umbilical dada: (1) máxima recuperación de células nucleadas posterior al procesamiento; (2) máxima recuperación de células CD34+ posterior al procesamiento; (3) máxima recuperación de unidad formadora de colonia posterior al procesamiento; (4) máxima recuperación de células germinales posterior al procesamiento (mediante extrapolación); (5) máxima recuperación de células nucleadas posterior a la descongelación; (6) máxima recuperación de células CD34+ posterior a la descongelación; (7) máxima recuperación de unidad formadora de colonia posterior a la descongelación; (8) máxima recuperación de células germinales posterior a la descongelación (mediante extrapolación); (9) máxima dosis de células nucleadas infundidas; (10) máxima dosis de células CD34+ infundidas; (11) máxima dosis de unidades formadoras de colonia infundidas; y (12) máxima dosis de células germinales infundidas (mediante extrapolación) . Adicionalmente, al maximizar la dosis de células a través de las técnicas de procesamiento, criopreservación, descongelación y selección descritas en la presente, la invención mejora los siguientes parámetros de resultados clínicos en pacientes tanto pediátricos como adultos transplantados con unidades de UCB únicas o dobles de plasma agotada: (1) incidencia acumulativa de injerto de neutrófilo; (2) incidencia acumulativa de reconstitución inmune (mediante extrapolación); (3) incidencia acumulativa de injerto de plaquetas; (4) velocidad para el injerto de neutrófilos; (5) velocidad para la reconstitución inmune (mediante extrapolación); (6) velocidad para el injerto de plaquetas; (7) supervivencia libre de enfermedad; (8) tasa de reincidencia, (9) mortalidad relacionada con el transplante, especialmente muerte debida a falla de injerto e infección (injerto lento o falla de injerto), y (10) más importantemente, la supervivencia general. Recolección de Sangre de Cordón umbilical La presente invención proporciona composiciones de sangre de cordón umbilical que se han procesado para remover sustancialmente el plasma pero no las glóbulos rojos. La sangre de cordón umbilical es un rica fuente de células germinales y puede obtenerse fácilmente y sin trauma al donador. En contraste, la recolección de células de médula ósea para transplante es una experiencia traumática que es costosa en términos de tiempo y gasto de dinero para hospitalización. Preferentemente, la sangre de cordón umbilical se colecta mediante drenaje directo desde el cordón umbilical. Por tanto, después del nacimiento del infante, el cordón umbilical puede prensarse doblemente y transectarse justo por arriba de la porción oprimida en la pinza, y el flujo de sangre fetal resultante de los vasos umbilicales puede retenerse en un envase de recolección. Una recolección adecuada puede lograrse comúnmente sin ordeñar el cordón umbilical y se completa aproximadamente en dos minutos, antes de que se presente la separación de la placenta. Debe tenerse cuidado de evitar la contaminación por sangre, orina, u otros fluidos maternos en el campo de parto. La sangre de cordón umbilical también puede obtenerse mediante cualquier otro método conocido en la técnica. Un donador, para los propósitos de la presente invención, puede incluir donadors maternos que son donadors para el propósito de consentimiento informado para la donación, y son madres con derechos de custodia de los donadors neonatos reales, siendo los bebés neonatos los donadors reales de sangre de cordón umbilical. Los donadors maternos son individuos que se encuentran con buena salud general y entre las edades de aproximadamente 16 y aproximadamente 50. Puede colectarse cierta información del donador materno antes o después de la donación de sangre de cordón umbilical a fin de determinar la adecuabilidad y la carencia de enfermedades infecciosas transmitidas por transfusión, enfermedades genéticas y cánceres del sistema hematopoyético. Por ejemplo, puede proporcionarse al donador materno un cuestionario médico para llenar. En una modalidad de la presente invención, el donador materno experimentará un examen médico antes de la donación. La recolección de sangre de cordón umbilical debe efectuarse bajo condiciones estériles. Inmediatamente al recolectarse, la sangre de cordón umbilical debe mezclarse con un anticoagulante. Generalmente, se mezclan de aproximadamente 23 ml a aproximadamente 35 ml del anticoagulante con hasta 255 ml de sangre de cordón umbilical (i.e., una unidad de sangre de cordón umbilical). Los anticoagulantes adecuados incluyen cualquiera conocido en la técnica, tal como, e.g., CPDA (citrato-fosfato-dextrosa-adenosina), CPD (citrato-fosfato-dextrosa) , ACD (ácido-citrato-dextrosa) , solución de Alsever (Alsever et al., N.Y.St. J. Med. 41:126 (1941)), solución de De Gowin (De Gowin et al., J. Am. Med. Assoc., 114:850 (1940)), edglugato-Mg (Smith et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 38-573 (1959)), solución Rous-Turner (Rous et al., J. Exp. Med. 23:219 (1916)), otras mezclas de glucosa, heparina, etil biscoumacetato, etc. Preferentemente, el anticoagulante es CPDA. Para ayudar al procesamiento de la sangre de cordón umbilical y mejorar la seguridad, las bolsas de procesamiento para los diversos componentes de la sangre pueden ser parte de un sistema estéril de bolsa para sangre. En una modalidad, la solución de almacenamiento de plasma puede incorporarse en una de las bolsas de procesamiento. Adicionalmente tanto la bolsa de recolección como las bolsas de procesamiento pueden equiparse con puertos y conectores de obstrucción. Los puertos pueden utilizarse para agregar o extraer materiales a o desde el interior de la bolsa. Un conector de obstrucción puede utilizarse para cerrar temporalmente un tubo o la entrada de una bolsa.

Adicionalmente a la sangre de cordón umbilical, puede utilizarse sangre de placenta o fetal para producir las composiciones de sangre de plasma agotada que son adecuadas para transplante, e.g., para tratar enfermedades malignas tales como malignidades hematológicas o enfermedades benignas asociadas con el sistema hematopoyético. La sangre de placenta o fetal puede obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica. por ejemplo, la sangre fetal puede tomarse de la circulación fetal en la raíz de la placenta con el uso de una aguja guiada mediante ultrasonido, placentocentesis o fetoscopía. La sangre de placenta puede obtenerse, e. g., mediante aspiración por aguja de la placenta extraída en la raíz y en las venas distendidas. En algunas modalidades, se pide a las mujeres postnatales que donen sangre de cordón umbilical y sangre de placenta. Se hace contacto con los hospitales y se les pide participar en un proyecto de recolección de sangre de cordón umbilical/de placenta. Los donadors potenciales son mujeres que se encuentran en labor y están a punto de dar a luz a un bebé ya sea mediante nacimiento natural o sección cesárea. En la Patente de E.U. No. 5,993,387, se describe un método para obtener sangre de cordón umbilical y sangre de placenta de una mujer postnatal, e.g., registrando a una familia con un banco antes de que nazca el bebé y colectando un pago por la recolección y almacenamiento de las células germinales de cordón umbilical que van a recolectarse después del nacimiento . En una modalidad, después del parto, se colecta la sangre de cordón umbilical y/o de placenta y se examina. En algunas modalidades, el examen asegura que la sangre de cordón umbilical o la sangre de placenta sea adecuada para procesamiento posterior. El examen puede incluir examinar la placenta para asegurarse de que se encuentra intacta y libre de meconio pesado o descarga purulenta. El cordón umbilical puede examinarse para determinar que se encuentra intacto con 2 arterias y 1 vena y desprovisto de nudos u otras anormalidades. Como se describió anteriormente, la recolección puede realizarse en una bolsa que preferentemente contiene un anticoagulante tal como una solución de citrato-fosfato-dextrosa-adenosina (CPDA) . En modalidades preferidas, post-procesamiento, las unidades de UCB de plasma agotada contienen una cantidad suficiente de células germinales para el transplante exitoso de un paciente infante o adulto. Dado que las células germinales hematopoyéticas reales no tienen marcadores convenientes de superficie celular y solo pueden definirse funcionalmente, tienen que utilizarse sustitutos. Por ejemplo, el número total de células nucleadas puede frecuentemente predecir el número de células germinales en una unidad de sangre de cordón umbilical y ha mostrado su correlación clínica con el injerto y la supervivencia. En otro ejemplo, el número de células germinales con marcadores de superficie celular tales como CD34 o las capacidades funcionales para formar varias unidades formadoras de colonia se utilizan algunas veces, y también se correlacionan clínicamente con el injerto y la supervivencia. Después de agregar un anticoagulante y mezclarlo con la sangre de cordón umbilical, la mezcla resultante puede almacenarse a temperaturas, e.g., entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 42°C o de entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 26°C, por hasta aproximadamente 48 horas. Procesamiento de Agotamiento de Plasma El volumen de la sangre de cordón umbilical recolectada conteniendo anticoagulante se reduce, e.g., centrifugando primero la mezcla a temperaturas entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 42°C, preferentemente, entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 26°C. La centrifugación se efectúa para remover un volumen sustancial de líquido, e.g., plasma, de la mezcla. La centrifugación se lleva a cabo preferentemente a aproximadamente 1,000 x g a aproximadamente 2,500 x g durante entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 minutos, con la fuerza centrífuga y el tiempo de centrifugación suficientes para ocasionar la sedimentación de la mayor parte de las células sin ocasionar daños. Después de la centrifugación, se remueve un volumen sustancial de plasma para reducir el volumen de la mezcla de sangre de cordón umbilical para producir una unidad de sangre de cordón umbilical de plasma agotada que no se ha agotada de glóbulos rojos. En ciertos ejemplos, al menos aproximadamente 10 ml de plasma se dejan en la unidad de sangre de cordón umbilical de plasma agotada. La unidad de plasma agotada se transfiere entonces a un contenedor de congelación, e.g., una bolsa CryoCyte® y se enfría a entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos. En modalidades preferidas, se pierde menos de aproximadamente el 5% de las células nucleadas (e.g., menos de aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2% o 1%) cuando se remueve el sobrenadante, como se evidencia por la enumeración de células en el plasma sobrenadante. El volumen aceptable se determina por medio del volumen de soporte de la bolsa CryoCyte® particular utilizada, por el número de células que van a criopreservarse, y la concentración de la solución criopreservada . Si el volumen de la unidad de sangre de cordón umbilical de plasma agotada es demasiado grande como para ocasionar gue el volumen exceda aproximadamente 60 a aproximadamente 75 ml, entonces puede utilizarse una bolsa CryoCyte® más grande o puede dividirse la mezcla entre dos o más bolsas CryoCyte®.

Expansión ex vivo de Células germinales Opcionalmente, las células germinales hematopoyéticas presentes en la unidad de sangre de cordón umbilical de plasma agotada pueden multiplicarse utilizando una técnica de cultivo in vitro ya sea antes o después de la criopreservación, expandiendo así el número de células germinales disponible para la terapia. Debe tenerse cuidado en asegurar que la expansión ex vivo de las células germinales hematopoyéticas no de cómo resultado la producción de células de progenie diferenciada a expensas de las células germinales multipotentes que son terapéuticamente necesarias para el transplante. Se han descrito varios protocolos para el crecimiento de células germinales de sangre de cordón umbilical en cultivo (ver, e.g., Smith et al., Br. J. Haematol. 63:29-34 (1986); Dexter et al., J. Cell. Physiol., 91:335 (1977); Witlock et al., Proc. Natl. Acad. Sci., E.U.A., 79:3608-3612 (1982)). El experto en la técnica conocerá otros procedimientos para la expansión de la población de las células germinales en cultivo. También pueden utilizarse diversos factores para estimular la proliferación de células germinales in vitro. Como ejemplos no limitantes, puede utilizarse una variedad de citosinas y factores de crecimiento tales como interleucina-1 (IL-1), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-6 (IL-6), factor de estimulación de colonia (CSF) de granulocito-macrófago (GM) , solos o en combinación, para estimular la expansión ex vivo de las células germinales hematopoyéticas presentes en las unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención. Criopreservación y Almacenamiento La congelación de células es ordinariamente destructiva. Al enfriarse, el agua dentro de la célula se congela. Entonces se presenta un daño por los efectos osmóticos en la membrana celular, deshidratación celular, concentración de solutos, y formación de cristal de hielo. A medida que se forma el hielo fuera de la célula el agua disponible se remueve de la solución y se extrae de la célula, ocasionando deshidratación osmótica y elevando la concentración de solutos que eventualmente destruyen la célula. Estos efectos dañinos pueden evitarse mediante: (a) el uso de un crioprotector; (b) el control de la tasa de congelación; y/o (c) el almacenamiento a una temperatura suficientemente baja para minimizar la muerte celular. En modalidades preferidas de la presente invención, las unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada se mezclan con una solución crioprotectora. Muchos crioprotectores son conocidos por los expertos en la técnica, ejemplos no limitantes de crioprotectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, dimetil sulfóxido (DMSO) , glicerol, etileno glicol, propileno glicol, formamida, almidón de hidroxietilo (HES), polivinilpirrolidona (PVP), albúmina, colina cloruro, aminoácidos, metanol, acetamida, glicerol monoacetato, sales inorgánicas, y polisacáridos de bajo peso molecular tales como dextrano (e.g., Gentran 40), sucrosa, i-eritritol, D-ribitol, D-manitol, D-sorbitol, i-inositol o D-lactosa. Preferentemente, la solución de crioprotector comprende aproximadamente una relación de 10:1 (volumen/volumen) de DMSO a Gentran 40 tal como, e.g., 50% de DMSO a 5% de Gentran 40, que se agrega para proporcionar una concentración final de desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 10% de DMSO y se pre-enfría a aproximadamente 4°C. En ciertas circunstancias, la solución crioprotectora se mezcla, cargada en una jeringa se enfría a entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos. Después de enfriarse, la solución de crioprotector pre-enfriada se agrega a la sangre de cordón umbilical de plasma agotada para formar una mezcla de sangre de cordón umbilical que contiene tanto anticoagulante como crioprotector. La solución de crioprotector puede agregarse a la sangre de cordón umbilical de plasma agotada en el contenedor de congelación mientras que el contenedor de congelación se encuentra en movimiento. Por ejemplo, el contenedor de congelación puede colocarse en una plataforma oscilante y mantenerse a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C, e.g., envolviendo el contenedor de congelación en paquetes de hielo. En algunas modalidades, la solución de crioprotector se agrega a la sangre de cordón umbilical de plasma agotada en el contenedor de congelación utilizando una bomba de jeringa programable. Las bombas de jeringa se encuentran comercialmente disponibles, e.g., de J-KEM Scientific, Inc., New Era Pump Systems, Inc., y Kent Scientific. En una modalidad preferida, el crioprotector se agrega a una tasa de aproximadamente 0.75 ml por minuto. Por tanto, la tasa de dilución es aproximadamente una dilución de 1:100 de la unidad de sangre de cordón umbilical de plasma agotada por minuto con la solución crioprotectora. La tasa aceptable de adición del crioprotector a la sangre de cordón umbilical de plasma agotada puede determinarse por medio de la tasa de dilución de la solución crioprotectora, que es un factor de la tasa de adición del crioprotector, del volumen de la unidad de sangre de cordón umbilical de plasma agotada y de la concentración de la solución crioprotectora. La mezcla de sangre de plasma agotada de la presente invención que contiene tanto anticoagulante como crioprotector, se almacena típicamente en nitrógeno líquido (e.g., en la fase líguida y/o de vapor) a por debajo -135°C, preferentemente por debajo de aproximadamente -150°C. Las condiciones para congelar la mezcla se controlan cuidadosamente para mejorar la viabilidad de las células post-descongelación . En algunas modalidades, el Contenedor de congelación con la mezcla de crioprotector-células germinales se coloca en un cásete de almacenamiento de aluminio que se ha pre-enfriado a entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C. El cásete de almacenamiento de aluminio, en algunas modalidades, se encuentra especialmente diseñado para tener una ventana que muestra el número de código de barras de la unidad de sangre de cordón umbilical almacenada y permite una abertura parcial para permitir la recuperación de muestras de segmento unidas de la unidad sin perturbar el volumen de la unidad en la bolsa de congelación. El cásete de almacenamiento de aluminio se transfiere entonces a un congelador de tasa controlada, preferentemente dentro de aproximadamente 10 minutos de la recepción del contenedor de congelación con la mezcla de sangre de cordón umbilical que contiene anticoagulante y crioprotector. La mezcla se congela entonces a una tasa controlada. La tasa programada de congelación es preferentemente de aproximadamente -1°C por minuto de aproximadamente 4°C a aproximadamente -50°C. Esta etapa de congelación puede llevarse a cabo en ausencia de una inmersión para compensar la liberación de calor resultante de la transición de fase (i.e., el calor de fusión) de la composición, de líquido a hielo. Después de la etapa inicial de congelación, las unidades de sangre de cordón umbilical procesadas se congelan adicionalmente a una tasa de aproximadamente -10°C por minuto de aproximadamente -50°C a aproximadamente -90°C, midiendo la temperatura utilizando una sonda dentro de un contenedor falso en el mismo congelador de tasa controlada para imitar las condiciones de las unidades de sangre de cordón umbilical que se preservan. Los congeladores de tasa controlada se encuentran comercialmente disponibles, e.g., FTS Systems y Thermo Forma. La mezcla de sangre de cordón umbilical congelada en el contenedor de congelación se transfiere entonces a un tanque de nitrógeno líquido para almacenamiento de las células germinales viables. La transferencia se efectúa preferentemente en aproximadamente 10 minutos o menos, e.g., menos de aproximadamente 8 minutos, menos de aproximadamente 5 minutos, menos que aproximadamente 4 minutos, menos de aproximadamente 3 minutos, menos de aproximadamente 2 minutos, menos de aproximadamente 1 minuto, menos de aproximadamente 45 segundos, menos de aproximadamente 30 segundos, menos de aproximadamente 20 segundos o en aproximadamente 10 segundos o menos. Más preferentemente, la transferencia toma aproximadamente 1 minuto o menos. Las unidades de sangre de cordón umbilical congeladas preferentemente se descongelan rápidamente (e.g., en un baño de agua mantenido a entre aproximadamente 37 °C y aproximadamente 41°C) y se enfría inmediatamente al descongelarse. En ciertos ejemplos, la bolsa de congelación que contiene la unidad de sangre de cordón umbilical congelada puede sumergirse en un baño de agua tibia con rotación suave opcional para asegurar el mezclado de la unidad mientras se descongela e incrementa su transferencia térmica desde el agua hasta la masa de hielo interna. En ciertos otros ejemplos, puede ser deseable para tratar la unidad de sangre de cordón umbilical a fin de prevenir la aglomeración celular al descongelarse mediante la adición antes y/o después de la congelación de DNasa, dextrano de bajo peso molecular y citrato, o almidón de hidroxietilo (HES) . Tan pronto como la unidad se encuentra en un estado ligeramente "derretido", la bolsa de congelación puede colocarse en hielo en preparación para la administración. Los protocolos ejemplares para descongelar las unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención se proporcionan en los ejemplos 7 y 8 abajo. En una modalidad preferida de la presente invención, la unidad de sangre de cordón umbilical descongelada puede infundirse directamente en un paciente sin una etapa de lavado. Por consiguiente, se contempla que la sangre de cordón umbilical de plasma agotada, criopreservada y descongelada, pero no lavada, puede administrarse mediante infusión directa para propósitos terapéuticos. Sin embargo, en ejemplos en los cuales el crioprotector en una concentración efectiva para criopreservación sería considerablemente tóxico para un paciente, puede removerse o diluirse previo a la administración. Una técnica para diluir la concentración tóxica de crioprotector es por dilución y/o reconstitución a una concentración insignificante que es menos tóxica para las células. Preferentemente, esto se logra simplemente agregando la solución de dilución/reconstitución, sin incluir una etapa de lavado. En este caso, la cantidad absoluta de crioprotector, glóbulos rojos, glóbulos blancos, hemoglobina libre y fantasmas de célula roja lisada infundida en un receptor, es similar a aquella para infusión directa. En ciertos otros ejemplos, la dilución de la concentración tóxica de crioprotector se logra agregando una solución de lavado seguida por uno o más ciclos de centrifugación para formar pildoras de las células, retirar el sobrenadante, y la resuspensión de las células. Post-descongelación y del retiro opcional del crioprotector, puede llevarse a cabo la cuenta celular (e.g., mediante el uso de un hemocitómetro) y la prueba de viabilidad celular (e.g., mediante exclusión de azul tripano; ver, abajo) para confirmar la supervivencia celular. Otros procedimientos que pueden utilizarse para procesar adicionalmente las unidades de sangre de cordón umbilical descongeladas de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, el enriquecimiento de las células germinales y la expansión ex vivo de las células germinales. Sin embargo, estas etapas pueden omitirse a fin de minimizar la pérdida de células. Determinación de la viabilidad celular La viabilidad celular puede determinarse en cualquier punto a lo largo del proceso antes descrito. Adicionalmente a la viabilidad de la células germinales, el número de células también puede caracterizarse, e. g., para células nucleadas y/o o no nucleadas. Los expertos en la técnica reconocerán que muchos métodos se encuentran disponibles para determinar la viabilidad celular. En algunas modalidades, la viabilidad celular se determina utilizando análisis de exclusión de colorante, e.g., exclusión de colorante azul tripano. En algunas modalidades, la sangre de cordón umbilical congelada se descongela y se analiza por viabilidad utilizando análisis de exclusión de colorante. Utilizando los métodos presentes, al menos 80%, o preferentemente al menos 85% de las células nucleadas son viables después de descongelarse, o más preferentemente al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las células nucleadas son viables después de descongelarse . Usos Terapéuticos Las composiciones de sangre de cordón umbilical (UCB) de plasma agotada, de glóbulo rojo (RBC) no agotada de la presente invención son terapéuticamente valiosas para un gran número de enfermedades y trastornos tales como, e.g., aquellas enfermedades y trastornos asociados con el sistema hematopoyético. Las composiciones de UCB descritas en la presente también son valiosas en el área de la medicina regeneradora, e.g., utilizando células germinales para accionar el proceso de cicatrización o el re-crecimiento de tejido perdido o dañado en pacientes. Las clases no limitantes de enfermedades y trastornos que pueden tratarse administrando las composiciones de UCB de la presente invención incluyen enfermedades malignas tales como malignidades hematológicas y enfermedades asociadas con el sistema hematopoyético. Las malignidades hematológicas son un grupo de neoplasmas que surgen a través de la transformación maligna de células derivadas de la médula ósea. Ejemplos de malignidades hematológicas y otros tipos de enfermedades malignas incluyen, pero no se limitan a, leucemias y linfomas (e.g., leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena juvenil crónica, linfoma no de Hodgkin, leucemia mielomonocítica juvenil, leucemia bifenotípica, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, leucemia aguda no diferenciada, mieloesclerosis maligna aguda, policitemia vera, mielometaplasia agnogénica, macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia bilinaje aguda, leucemia de célula mástil aguda, leucemia mielomonocítica crónica, leucemia de célula cabelluda, leucemia de célula de plasma, leucemia prolinfocítica, etc.), trastornos mielodisplásicos (e.g., anemia refractaria con o sin sideroblastos anillados, anemia refractaria con exceso de blastos, citopenia refractaria, síndrome 5q, etc.), trastornos linfoproliferativos, mielofibrosis, tumores malignos /e.g., cáncer de mama, neuroblastoma, melanoma maligno, carcinoma del estómago, carcinoma ovárico, carcinoma pulmonar de célula pequeña, retinoblastoma, carcinoma testicular, glioblastoma, rabdomiosarcoma, tumores del sistema nervioso central, sarcoma de Ewing, etc.), e histiocitosis (e.g., histiocitis de célula Langerhans, linfohistiocitosis eritrofagocítica familiar, lifohistiocitosis hemofagocítica, enfermedad linfoproliferativa X-enlazada, etc.). Ejemplos de enfermedades benignas asociadas con el sistema hematopoyético incluyen, pero no se limitan a, hemoglobinopatías (e.g., talasemia, anemia de drepanocito, etc.), síndromes de falla de médula ósea (e.g., trombocitopenia, trombocitopenia amegacariocítica, síndrome Blackfan-Diamond, disqueratosis congénita, anemia Fanconi, osteoporosis, disgénesis reticular, anemia sideroblastica, síndrome Schwachman-Diamond, anemia aplásica severa, pancitopenia, agranulocitosis, aplasia de célula roja, anemia aplásica idiopática, anemia sideroblástica idiopática adquirida etc.), deficiencias inmunes (e.g., síndrome DiGeorge, enfermedad de adhesión de linfocito, síndrome de Nezelof, síndrome Omenn, deficiencia inmune severa combinada, síndrome Wiskott-Aldrich, síndrome X-enlazado hiper-IgM, deficiencia de alfa 1-antitripsina etc.), enfermedades metabólicas/de almacenamiento (e.g., aspartilglucosaminuria, adrenoleucodistrofia, alfa-manosidosis, fucosidosis, enfermedad de Gaucher, gangliosidosis, síndrome Hurler, síndrome Hurler-Scheie, síndrome Scheie, enfermedad de I-célula, lipofucoscinosis ceroide infantil, enfermedad Krabbe, síndrome Lesch-Nyhan, leucodistrofia metacromática, síndrone Maroteaux-Lamy, sialidosis, enfermedad Tay Sach, enfermedad Wolman, mucopolisacaridosis, mucolipidosis, etc.), trastornos de neutrófilos (e.g., enfermedad granulomatosa crónica, síndrome Chediak-Higashi, neutropenia congénita, síndrome de Kostmann, etc.), enfermedades de plaquetas (e.g., trombobastenia de Glanzmann, etc.), porfiria (e.g., porfiria eritropoyética congénita, etc.), infecciones virales (e.g., infección VIH), y trastornos autoinmunes (e.g., lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, síndrome de Sjorgen, diabetes tipo I, esclerosis múltiple, hepatitis crónica, osteopatías inflamatorias, etc.).

Las composiciones de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención también pueden ser de gran valor en el tratamiento de varias enfermedades y trastornos genéticos que afectan las células del linaje hematopoyético. Ejemplos de tales enfermedades incluyen, sin limitación, talasemia (e.g., alfa, beta, gamma), anemia aplásica familiar, síndrome de Fanconi, síndrome de Bloom, aplasia de célula roja pura, linfohistiocitosis eritrofagocítica familiar, disqueratosis congénita, síndrome Blackfan-Diamond, síndromes I-IV diseritropoyéticos congénitos, síndrome Schwachmann-Diamond, deficiencia de dihidrofolato reductasa, deficiencia de formamino transferasa, deficiencia de aspartil glucosaminasa, deficiencia de beta-glucuronidasa, deficiencia de hiopxantina-guanina fosforibosiltransferasa, síndrome Lesch-Nyhan, esferocitosis congénita, eliptocitosis congénita, estomatocitosis congénita, enfermedad de Rh nulo congénita, hemoglobinuria nocturna paroxismal, hemoglobinuria nocturna, deficiencia de glucosa-6-fosfato dehidrogenasa, deficiencia de piruvato quinasa, sensibilidad a eritropoyetina congénita, enfermedad y rasgo de drepanocito, met-hemoglobinemia, enfermedad severa de inmunodeficiencia combinada, enfermedad severa de inmunodeficiencia combinada con ausencia de células T y B, enfermedad severa de inmunodeficiencia combinada con ausencia de células T, enfermedad severa de inmunodeficiencia combinada con deficiencia de adenosina deaminasa, síndrome de linfocito vacío, inmunodeficiencia combinada, inmunodeficiencia combinada de respuesta a ionóforo, inmunodeficiencia combinada con una anormalidad de tapado, inmunodeficiencia variable común, deficiencia de nucleósido fosforilasa, deficiencia de granulocito actina, deficiencia de neutrófilo actina, agranulocitosis infantil, enfermedad de Gaucher, deficiencia de adenosina deaminasa, síndrome de Kostmann, disgénesis reticular y síndromes de disfunción de leucocitos congénita. Como se utiliza en la presente, el término "talasemia" se refiere a un grupo de trastornos de sangre genéticos. Los individuos con talasemia no son capaces de producir suficiente hemoglobina normal debido a la síntesis no balanceada de la hemoglobina alfa o beta, lo cual ocasiona anemia severa. La hemoglobina se encuentra en los glóbulos rojos y transporta oxígeno a todas las partes del cuerpo. Consiste de dos diferentes proteínas una cadena alfa y una beta. Si el cuerpo no produce suficiente o tiene un mal balance de cualquiera de estas dos proteínas, los glóbulos rojos no se forma apropiadamente y no pueden transportar suficiente oxígeno. El resultado es anemia que comienza en la niñez temprana y permanece durante toda la vida, requiriendo transfusiones de sangre frecuentes de por vida y terapia de quelación de hierro para deshacerse de la sobrecarga de hierro de las frecuentes transfusiones. A pesar de la terapia de quelación de hierro, los órganos se sobrecargan eventualmente con un exceso de hierro y son incapaces de funcionar apropiadamente. Los individuos cuyas glóbulos rojos no producen suficiente proteína alfa en comparación con la proteína beta, tienen talasemia alfa. Existen diversos tipos de talasemia alfa que fluctúan de suave a severo en su efecto en el cuerpo. El estado de transporte silencioso generalmente no ocasiona problemas de salud debido a que la falta de proteína alfa es tan pequeña que la hemoglobina funciona normalmente. La condición constante de resorte de la hemoglobina es una forma inusual del estado de transporte silencioso ocasionado por una mutación del gen alfa globulina. Como en el estado de transporte silencioso, un individuo con esta condición no experimenta comúnmente problemas de salud relacionados. El rasgo de talasemia alfa o condición de talasemia alfa suave se caracteriza por la carencia algo mayor de proteína alfa. Los pacientes con esta condición tienen glóbulos rojos más pequeñas y una anemia suave, aunque muchos pacientes no experimentan síntomas. La enfermedad de hemoglobina H se caracteriza por una falta de proteína alfa que es suficientemente grande para ocasionar una anemia severa y serios problemas de salud tales como un bazo agrandado, deformidades óseas y fatiga. La enfermedad de hemoglobina H-de resorte constante es una condición más severa que la enfermedad de hemoglobina H. los individuos con esta condición tienden a tener una anemia más severa y sufren más frecuentemente del agrandamiento del bazo y de infecciones virales. La enfermedad homózigua de resorte constante es una variación de la de hemoglobina H-resorte constante que se presenta cuando dos portadores de resorte constante pasan sus genes a su niño. Esta condición es generalmente menos severa que el resorte constante de hemoglobina H y más similar a la enfermedad de hemoglobina H. La hydrops fetalis o talasemia alfa mayor se caracteriza por la ausencia de genes alfa, lo que ocasiona que las globulinas gamma producidas por el feto formen una hemoglobina anormal llamada hemoglobina Barts. La mayoría de los individuos con esta condición mueren antes de o poco después del nacimiento. En algunos casos extremadamente raros en los cuales la condición se descubre antes del nacimiento, las transfusiones de sangre in útero han permitido el nacimiento de niños con hydrops fetales que después requieren transfusiones sanguíneas y cuidados médicos de por vida. También pueden efectuarse transplantes de células germinales hematopoyéticas in útero, incluyendo transplantes de sangre de cordón umbilical para curar esta condición . Los individuos cuyas glóbulos rojos no producen suficiente proteína beta tienen talasemia beta. Existen diversos tipos de talasemia beta que fluctúan de suave a severo en su efecto en el cuerpo. La talasemia menor o rasgo de talasemia se caracteriza por una falta de proteína beta que no es suficientemente grande para ocasionar problemas en el funcionamiento normal de la hemoglobina. Un individuo con esta condición simplemente transporta el rasgo genético para talasemia y comúnmente no experimentará ningún problema de salud diferentes a una posible anemia suave. La talasemia intermedia es una condición en la cual la falta de proteína beta en la hemoglobina es suficientemente grande para ocasionar una anemia moderadamente severa y problemas de salud significativos, incluyendo deformidades óseas y agrandamiento del bazo. La talasemia mayor o anemia de Cooley es la forma más severa de talasemia beta, en la cual la falta total de proteína beta en la hemoglobina ocasiona una anemia que amenaza la vida que requiere transfusiones regulares de sangre y un extenso cuidado médico constante. Estas extensas transfusiones sanguíneas de por vida conducen a una sobrecarga de hierro que deben tratarse con terapia de quelación para evitar una muerte temprana por falla de órganos . Adicionalmente a los diferentes tipos de talasemias alfa y beta antes descritos, existen otros trastornos relacionados tales como talasemia E beta y talasemia beta débil. Tales condiciones también son adecuadas para tratamiento mediante la administración de las composiciones de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención. En ciertos ejemplos, las composiciones de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención contienen células germinales hematopoyéticas que no transportan el defecto genético encontrado en el paciente o no transportan el defecto genético en un estado homozigoto o en un estado heterozigoto doble y por tanto son capaces de dar lugar a un sistema hematopoyético de funcionamiento normal. en otros ciertos ejemplos, las células germinales hematopoyéticas en las composiciones de sangre de cordón umbilical de la presente invención, tienen incorporado un gen heterólogo capaz de expresión mediante sus células progenie y tales células germinales recombinantes pueden utilizarse en el tratamiento de trastornos genéticos del sistema hematopoyético. Por ejemplo, los pacientes que tienen células hematopoyéticas que carecen de un gen o que tienen un gen mutante, pueden infundirse con las células germinales hematopoyéticas que han incorporado una contraparte funcional del gen deficiente. Tales genes que pueden someterse a terapia de gen incluyen, pero no se limitan a, hemoglobina o enzimas que median su trayectoria sintética, e.g., para el tratamiento de anemias tales como beta-talasemia, enfermedad de drepanocito, etc.

En la técnica se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes externos en las células y pueden utilizarse para construir las células germinales hematopoyéticas recombinantes para propósitos de terapia de gen. la técnica utilizada debe proporcionar la transferencia estable de la secuencia de gen heterólogo a la células germinales, de manera que la secuencia de gen heterólogo pueda heredarse y expresarse por la progenie de la células germinales, y a fin de que no se interrumpan las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células receptoras. Las técnicas que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, fusión celular, transferencia de gen mediada por cromosomas, transferencia de gen mediada por células, transfección, transformación, transducción, electroporación, infección (e.g., virus de ADN recombinante, virus de ARN recombinantes) , fusión de esferoplasto, microinyección, dextrano DEAE, precipitación de calcio fosfato, liposomas, fusión de lisosoma, lípidos catiónicos sintéticos, el uso de un arma genética o un transportador de vector de ADN, etc. para diversas técnicas para transformación o transfección de células de mamífero, ver, e.g., Keown et al., Methods Enzymol, 185:527-37 (1990); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (2001).

Otras enfermedades y trastornos que pueden tratarse con las composiciones de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención, incluyen, sin limitación, mieloesclerosis, anemias hemolíticas adquiridas, inmunodeficiencias adquiridas, trastornos infecciosos que ocasionan inmunodeficiencias primarias o secundarias, infecciones bacteriales (e.g., Brucelosis, Listerosis, tuberculosis, lepra), infecciones parasitarias (e.g., malaria, Leishmaniasis) , infecciones por hongos, trastornos que implican desproporciones en conjuntos de células linfoide y funciones inmunes deterioradas debido al envejecimiento, trastornos de fagocitos (e.g., deficiencia de neutrófilo de actina, deficiencia de neutrófilos de membrana GP-180), anormalidades de eritrocitos heredadas, trastornos hereditarios del sistema inmune, trastornos hereditarios de línea linfa y heme, trastornos metabólicos hereditarios, trastornos de plaquetas hereditarios, trastornos de célula de plasma, otras malignidades, otras enfermedades no malignas, trombosis congénita, ataxia-telangiectasia, hipoplasia de cartílago-cabello, enfermedad de almacenamiento de glucosa, infección de VIH, hemofagocitosis, síndrome de Hunter, deficiencia inmune y neutropenia, deficiencia de adhesión de leucocitos, enfermedad de almacenamiento lisosomal, mielofibrosis con metaplasia mieloide, síndrome Morquio, enfermedad Niemann-Pick, lipofuscinosis neuronal ceroide y síndromes Sanfilipo tipos A, B, C y D. Las composiciones de sangre de cordón umbilical de plasma agotada descritas en la presente también son valiosas en el área de la medicina regenerativa, e.g., utilizando células germinales para activar el proceso de curación o el re-crecimiento de tejido perdido o dañado en pacientes. Por ejemplo, puede administrarse una o más unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada a un paciente para terapias regenerativas para curar huesos rotos o para tratar quemaduras graves, ceguera, sordera, daño cardiaco (e.g., debido a ataque al corazón, etc.), daño nervioso (e.g., daño a la médula espinal) , choque, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, diabetes (tipo I o II) y otras condiciones . Las composiciones de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención maximizan la dosis total de células nucleadas a través de los procedimientos de procesamiento, criopreservación, selección y/o descongelación descritos en la presente, para proporcionar la máxima cantidad de células germinales hematopoyéticas en una unidad de sangre de cordón umbilical dada. Como resultado, los pacientes que tienen cualquiera de las enfermedades o trastornos descritos anteriormente experimentan un resultado clínico superior a los logrados con unidades de sangre completa o de sangre de cordón umbilical de RBC agotada. En particular, los pacientes despliegan una mejora significativa en parámetros tales como la incidencia acumulativa y la velocidad para injerto de neutrófilos y plaquetas, la extensión de la supervivencia libre de enfermedad, la tasa de reincidencia, la mortalidad relacionada al transplante y la supervivencia general. IV. Ejemplos La presente invención se describirá en mayor detalle mediante los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos, y no pretenden limitar la presente invención en modo alguno. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que pueden cambiarse o modificarse para producir esencialmente los mismos resultados. Ejemplo 1. Unidad de Sangre de Cordón umbilical de Plasma Agotada Ejemplar Este ejemplo proporciona una composición ejemplar de sangre de cordón umbilical (UCB) que se ha agotada sustancialmente de plasma, pero no se ha agotada de glóbulos rojos. Volumen estándar de crioprotector: aproximadamente 15 ml de crioprotector por aproximadamente 60 ml de unidad de plasma agotada. Si CV = volumen de sangre de cordón umbilical colectado, AV = volumen de anticoagulante (e.g., entre aproximadamente 23 a aproximadamente 35 ml) , PV = volumen de sangre de cordón umbilical de plasma agotada, PAV = volumen de anticoagulante posterior al procesamiento; y APV = volumen de sangre de cordón umbilical de plasma agotada anticoagulada, entonces una composición ejemplar de UCB de la presente invención comprendería: PV = 60 ml x (CV/(CV + AV) ) ; PAV = 60 ml x (AV/(CV + AV) ) ; PV + PAV = APV = 60 ml; y Volumen previo a congelación = APV + volumen de crioprotector = 60 ml + 15 ml = 75 ml . Ejemplo 2. El Agotamiento de Plasma de las Unidades de Sangre de Cordón umbilical Incrementa el Hematocrito y la Concentración de Glóbulos rojos. Este ejemplo ilustra que la sangre de cordón umbilical colectada procesada (UCB) de acuerdo con los métodos de la presente invención incrementa el hematocrito (i.e., porcentaje de glóbulos rojos en el volumen final) y la concentración de glóbulos rojos (RBC) de las unidades de UCB. La UCB colectada de 488 neonatos se analizó para determinar el hematocrito ("PRE-HCT%") y la concentración de RBC ("PRE-RBC (106/ul") de las muestras previo al procesamiento de agotamiento del plasma descrito en la presente. Post-procesamiento, se determinó el hematocrito ("POST-HCT%") , la concentración de RBC ("POST-RBC (106/ul") y la concentración de glóbulos blancos ("POST-WBC (103/ul") . Como se muestra en la Tabla 3, el procesamiento de las unidades de UCB mediante agotamiento del plasma de acuerdo con los métodos de la presente invención proporciona un incremento sustancial en el hematocrito y la concentración de RBC. Tabla 3. Números Previos y Posteriores al Procesamiento para 488 Unidades de Sangre de Cordón umbilical.

Sin vincularse a ninguna teoría particular, el mayor hematocrito y/o la mayor concentración de RBC de las unidades de UCB post-procesadas proporciona ventajosamente mejores propiedades de criopreservación y/o mejor resultado clínico . Ejemplo 3. Comparación de Unidades de Sangre de Cordón umbilical de Plasma Agotada, de Glóbulos rojos Agotadas y de Sangre Completa . Este ejemplo ilustra una comparación de las composiciones de sangre de cordón umbilical de plasma agotada de la presente invención con unidades de sangre completa y HES de glóbulo rojo agotadas.

Hematocrit: Las unidades de sangre de cordón umbilical (UCB) de plasma agotada (PD) tienen un promedio de aproximadamente 1.8 veces el hematocrito de las unidades de sangre completa o de las unidades de glóbulo rojo agotadas (RD) . El hematocrito corresponde al porcentaje de glóbulos rojos (RBC) por volumen, para una unidad dada. Sin vincularse a ninguna teoría particular, el mayor hematocrito de las unidades de RD UCB de la presente invención proporciona ventajosamente mejores propiedades de criopreservación y/o mejor resultado clínico.

Concentración de Glóbulos rojos: Las unidades de PD tienen un promedio de aproximadamente 1.8 veces la concentración de RBC de las unidades de sangre completa y de RD. Sin vincularse a ninguna teoría particular, la mayor concentración de RBC de las unidades de PD de UCB de la presente invención proporcionan ventajosamente mejores propiedades de criopreservación y/o mejor resultado clínico.

Volumen de Plasma: Las unidades de PD y de RD de UCB tienen un menor porcentaje de plasma por volumen que las unidades de sangre completa Húmero de Glóbulos blancos : Las unidades de PD de UCB tienen números similares de glóbulos blancos (WBC) a las unidades de sangre completa y de RD.

Concentración de Glóbulos blancos : Las unidades de PD tienen una concentración de WBC entre las unidades de sangre completa y las unidades de RD, con aproximadamente 1.8 veces la concentración de 'WBC de las unidades de sangre completa, mientras que las unidades de RD tienen aproximadamente 3 veces la concentración de WBC de sangre completa .

Número de Glóbulos rojos: Las unidades de PD y de sangre completa tienen números similares de RBC, que son aproximadamente 5 veces mayores que las unidades de RD.

Número de Células CD3 + Las unidades de PD tienen números similares de células CD34+ a las unidades de sangre completa y de RD. Número de Sangre Sangre de PD Sangre de RD células CD34+ Completa 1 x 106 a 5 X 1 x 106 a 5 x 1 x 106 a 5 x 107 107 107 % de Células CD34+ en Fracción de WBC: Las unidades de PD tienen un porcentaje de células CD34+ en la fracción de WBC que se encuentra entre las unidades de sangre completa y las unidades de RD.

Número de Células Nucleadas : Las unidades de PD tienen números totales de células nucleadas (TNC) que son similares a las unidades de sangre completa y de RD. % de Células Nucleadas en la Fracción Celula : Las unidades de PD tienen un porcentaje de células nucleadas en la fracción celular que se encuentra entre las unidades de sangre completa y de RD.

Ejemplo 4. Transplante de Células germinales Hematopoyéticas (HSCT) Utilizando Unidades de Sangre de Cordón umbilical (UCB) Agotadas de Plasma pero no de Glóbulos rojos. Este ejemplo ilustra que las unidades de sangre de cordón umbilical (UCB) que se han agotada sustancialmente de plasma, pero no se han agotada de glóbulos rojos, son una fuente segura y efectiva de células germinales hematopoyéticas con un resultado clínico que, en la mayoría de los ejemplos, es superior a los controles históricos, y que no lavar las unidades de UCB de plasma agotada después de descongelar, mejora la incidencia para el injerto de plaquetas y el tiempo para injerto de neutrófilos y plaquetas . La UCB es una atractiva fuente de transplante de células germinales hematopoyéticas (HSCT) debido a los menos estrictos requerimientos de compatibilidad de HLA y a la menor incidencia y severidad de la enfermedad de injerto contra huésped. sin embargo, a diferencia de las fuentes de médula ósea y de sangre periférica, la dosis de célula limitante asociada con las unidades de UCB ha impedido su amplio uso en adultos. Las técnicas de agotamiento de células rojas que se utilizan ampliamente en el campo, son los métodos de almidón de hidroxietilo (HES) y Ficoll, de los cuales, ambos incurren en pérdida significativa de células nucleadas post-procesamiento lo que exacerba adicionalmente la limitación en la dosis de células. De las muchas estrategias para incrementar la dosis de células de unidades de UCB incluyendo transplantes de unidad doble, transplantes combinados de UCB/haploidéntica, y expansión ex vivo, el proceso descrito en este ejemplo incrementa ventajosamente la recuperación de células nucleadas durante el procesamiento y descongelación mediante el agotamiento del plasma pero no de las glóbulos rojos. Como resultado, se evita el atrapamiento de células nucleadas y de células germinales con algún grado de reducción de volumen asociado con el retiro del plasma. El uso de este método da como resultado la pérdida de menos del 0.1% de las células nucleadas en la fracción de plasma descartada post-procesamiento (n = 27). El procedimiento descrito en este ejemplo también incrementa la recuperación de células nucleadas removiendo la etapa de lavado después de descongelar o congelar la UCB. El lavado post-descongelación de las unidades de sangre de cordón umbilical congeladas se practica ampliamente con el propósito de remover el DMSO crioprotector y liberar la hemoglobina de las células rojas lisadas (Kurtzberg et al., NEJM, 335:157-166 (1996)). Por ejemplo, se ha reportado una mejor viabilidad posterior a la descongelación con lavado (Rubinstein et al., PNAS, 92:10119-10122 (1995)). Adicionalmente, se ha reportado que el retiro del crioprotector antes de la infusión facilita un injerto más rápido (Kurtzberg et al., supra). Recientemente, sin embargo, varios reportes cuestionan el papel del lavado posterior a la descongelación de unidades de sangre de cordón umbilical previo a su infusión en pacientes (Nagamura-Inoue et al., Transfusión, 43:1295-1294 (2003); Hahn et al., Bone Marrow Transplantation, 32:145-150 (2003); Antoneanas et al., Bone Marrow Transplantation, 34:739 (2004); Creer et al., Proceedings of the 3rd Annual International Cord Blood Transplantation Symposium) . En estos estudios, se observan resultados clínicos similares y viabilidad posterior a la descongelación con las unidades estándar de sangre de cordón umbilical de célula roja agotada ya sea que se emplee lavado o no post-descongelación. No existen tales datos acerca de la utilidad del lavado posterior a la descongelación para las unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada, pero no agotadas de glóbulos rojos. Se estableció un gran y racialmente diverso inventario de PD de UCB con más de 162 HSCTs de UCB realizado utilizando tales productos en todo el mundo para Abril de 2005. El diseño del estudio se muestra abajo: Diseño del Estudio 1. Criterio de inclusión - todos los transplantes entre Nov. De 2001 y Abril de 2005: n = 162. 2. # de datos del transplante aún no disponible: n = 44. 3. Datos suministrados y auditados por NMDP y centros de transplantes. 4. "Todos los Pacientes" - datos de injerto o supervivencia disponibles para 118 de 162 transplantados, 73%. 5. 44 de 162 datos aún no disponibles - 27%. 6. Datos disponibles para 58 de 64 transplantes de NMDP - 91% 7. Datos disponibles para 89 de 117 transplantes en E.U. - 76%. 8. Datos disponibles para 29 de 45 transplantes en Taiwan - 64% . 9. Transplantes de "reincidencia/re-transplante" (previo al transplante y/o transplantados durante la reincidencia) = 20. 10. Pacientes de "remisión/primer transplante" = 98 (los pacientes de remisión sin transplantes previos). 11. Transplantes de UCB único = 99; transplantes de UCB doble = 19; no mieloablativos = 7; PSCT de UCB/haploidéntico = 1. Como se indicó en el diseño del estudio, los datos de injerto y/o supervivencia se encontraron disponibles para 118 pacientes, que representan una tasa total de recolección de datos de 73%. Las características de estos 118 pacientes se muestran abajo: Características del Paciente: 1. Sexo: M = 72 (61%); F = 56 (39%). 2. Edad: Promedio = 14; Medio = 8; Rango = 0.3-55. 31 transplantes en pacientes mayores de 16 (26%). 3. Peso: Promedio = 35 kg; Medio = 26 kg; Rango = 4.5-103 kg . 36 transplantes en pacientes de más de 50 kg (31%) . Las indicaciones benignas contaron para 29 casos (25%), con 14 hemoglobinapatías, 6 anemias aplásicas, 5 síndromes Wiscott-Aldrich (WAS) , 2 síndromes de inmunodeficiencia combinada severa (SCID)), y 2 otros. Hubo 89 transplantes por indicaciones malignas (75%), con 37 leucemias linfoblásticas agudas (ALL) , 22 leucemias mielógenas agudas (AML) , 9 leucemias mielógenas crónicas (CML), y 21 otros. Hubo 20 transplantes (22% de malignos) en los cuales los pacientes se encontraron a 1CR/1CP, 20 transplantes (22% de malignos) en los cuales los pacientes fueron pacientes de reincidencia/re-transplante, 7 transplantes en los cuales los pacientes tuvieron transplantes previos y 16 transplantes en los cuales los pacientes se transplantaron durante la reincidencia, la falla por inducción, tumor resistente, o crisis de ráfaga. 58/118 (49%) de los datos del paciente se auditaron y se suministraron por el NMDP y se re-auditaron por centros de transplantes; el resto se auditó y se suministró por centros de transplante. La incidencia acumulativa no ajustada de injerto para la cuenta absoluta de neutrófilos de 500 (ANC 500), la cuenta de plaquetas de 20,000 (Plt20K) , y la cuenta de plaquetas de 50,000 (Plt50K) se calcularon. Todas las tasas de incidencia acumulativa se calcularon sin ajuste, es decir, todas las muertes previo al injerto se contaron como fallas de injerto. Se utilizaron las estimaciones Kaplan Meier para analizar la supervivencia y la supervivencia libre de enfermedad.

Las unidades de UCB de PD de todos los 118 pacientes se caracterizaron por medio de una dosis media total de células nucleadas (TNC) previo a la congelación de 5.6 x 107/kg con un promedio de dosis de TNC previo a la congelación de 7.6 x 107/kg. La dosis media de TNC posterior a la descongelación (n = 68) fue de 5.2 x 107/kg (93% de recuperación) y la dosis promedio de TNC posterior a la descongelación fue de 7.9 x 107/kg (100% de recuperación). La dosis media de CD34 previo a la congelación (n *= 117) fue de 1.8 x 105/kg con una dosis promedio de CD34 previo al congelamiento de 2.6 x 105/kg. El número medio de compatibilidades de HLA ABDR fue de 4.0, con la clase I a una resolución de baja a intermedia y la clase II a alta resolución. La viabilidad media posterior a la descongelación por centro de transplantes fue de 75%. 41 de los transplantes (35%) se efectuaron fuera de los Estados Unidos. 89 (75%, con 58 de NMDP y 31 no NMDP) de los transplantes utilizaron sangre de cordón umbilical de StemCyte U.S. como fuente; 29 (25%) de los transplantes utilizaron sangre de cordón umbilical de StemCyte Taiwan. El resultado clínico en los 118 pacientes con datos de resultados de injerto o de supervivencia disponibles, que fueron transplantados con unidades de UCB de PD indicó que la incidencia acumulativa no ajustada de injerto para ANC 500, Plt20K y Plt50K fue de 90 + 3% (Figura ÍA) , 77 + 5% (Figura IB) y 75 + 5% respectivamente. Dado que la incidencia acumulativa se encontró sin ajuste, todas las muertes previas al tiempo esperado para injerto se trataron como fallas de injerto. El tiempo medio para injerto para ANC 500 (n = 87), Plt20K (n = 72) y Plt50K (n = 68) fue de 22.0 (rango 7-64), 49.5 (rango 13-95), y 58.5 días (rango 21-132), respectivamente. Como se muestra en la Tabla 4, la incidencia acumulativa de injerto y el tiempo medio para injerto para pacientes de transplante de UCB de PD fueron sustancialmente mayores en comparación con pacientes transplantados con unidades de UCB de RD del New York Blood Center (NYBC) o del National Marrow Donor Program (NMDP) . Tabla 4. Las unidades de UCB de PD proporcionan un resultado clínico superior en comparación con las unidades de UCB de RD. resultado un mayor injerto aparente Con un seguimiento medio de 526 días (rango 106-1,284 días) para los pacientes sobrevivientes, las estimaciones Kaplan-Meier de 1 año de supervivencia para todos los casos y de supervivencia libre de enfermedad (DFS) para casos malignos a 1 año, fueron 65 + 5% (Figura ÍC) y 50 + 6% (Figura ID), respectivamente. La Tabla 4 también muestra que la tasa de un año e supervivencia para pacientes transplantados con UCB de PD fue sustancialmente mayor en comparación con los pacientes transplantados con unidades de UCB de RD del NYBC, NMDP o del St. Louis Cord Blood Bank. La incidencia de enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) aguda de grado III-IV y de GvHD crónica fue de 15% a 100 días y de 13% a 1 año, respectivamente, que es menor que los valores previamente reportados. La tasa de reincidencia para casos malignos y la tasa de mortalidad relacionada con transplante (TRM) para todos los casos fue de 25 + 6% a 1 año y de 26 + 4% a 1 año, respectivamente. Estos resultados indican que los pacientes que recibieron las unidades de UCB de PD de la presente invención lograron resultados clínicos superiores (e.g., mejor incidencia acumulativa del injerto ANC 500, Plt20K y Plt50K, tiempo medio más rápido para injerto ANC 500, Plt20K y Plt50K, y tasa a un año incrementada) con relación a los pacientes transplantados con unidades de RD o de UCB de sangre completa. Adicionalmente, la tasa de supervivencia de 1 año de GvHD y la tasa de supervivencia libre de enfermedad del transplante con unidades de UCB de PD con superiores en comparación con los transplantes de médula ósea y de células germinales de sangre periférica . Cuando los pacientes de transplante de primera reincidencia (i.e., pacientes sin transplantes previos y pacientes que se transplantaron durante la reincidencia; n = 98) se analizaron por separado, la incidencia acumulativa no ajustada de injerto para ANC 500, Plt20K y Plt50K fue de 94 + 3% (Figura 2A) , 81 + 5% (Figura 2B) y 80 + 5%, respectivamente. El tiempo medio para injerto para ANC 500, Plt20K y Plt50K fue de 22.0, 49.5 y 58.0 días, respectivamente. Las estimaciones Kaplan-Meier de 1 año de supervivencia para todos los casos y de supervivencia libre de enfermedad (DFS) para casos malignos a 1 año, fueron 73 + 5% (Figura 2C) y 59 + 7% (Figura 2D) , respectivamente. La tasa de reincidencia para casos malignos y la tasa TRM para pacientes de reincidencia fueron de 20 + 6% a 1 año y 20 + 4% a 1 año respectivamente. La Tabla 4 muestra que los pacientes de transplante de UCB de PD de primera reincidencia han incrementado dramáticamente la incidencia acumulativa de injerto ANC 500, Plt20K y Plt50K, un tiempo medio más rápido para el injerto ANC 500, Plt20K y Plt50K y una tasa de supervivencia de un año incrementada con relación a pacientes transplantados con unidades de UCB de RD. Estos resultados demuestran que el HSCT utilizando UCB de PD puede llevarse a cabo de manera segura y efectiva. También se efectuó una comparación entre pacientes de NMDP contra no NMDP de E.U. y no NMDP de Taiwan. En particular, la Figura 3 muestra una comparación de la incidencia acumulativa del injerto de ANC 500 (Figura 3A) , la incidencia acumulativa de injerto de plaquetas 20 K (Figura 3B) , la tasa de reincidencia (Figura 3C) y de la mortalidad del paciente y las tasas de supervivencia a 1 año (Figura 3D) para estos tres subconjuntos de pacientes. Debido a que la tasa de recolección de datos del resultado del NMDP es de más del 91% de los pacientes, se elimina esencialmente una inclinación a reporte favorable para los centros de transplantes. Al comparar los subconjuntos no NMDP con los resultados de NMDP y al encontrar resultados esencialmente similares, mediante extrapolación, se excluye una inclinación significativa a un reporte favorable también en esos grupos. También se efectuó una comparación entre subconjuntos de pacientes en el grupo de peso pediátrico (< 50 kg) , el grupo de peso adulto (> 50 kg) y los transplantes de unidad única. En particular, la Figura 4 muestra una comparación de la incidencia acumulativa de injerto ANC 500 (Figura 4A) , la incidencia acumulativa de injerto de plaquetas 20K (Figura 4B) , la tasa de reincidencia (Figura 4C) y las tasas de mortalidad del paciente y de la supervivencia a 1 año (Figura 4D) para estos tres subconjuntos de pacientes. Esta comparación muestra que los pacientes de peso adulto lograron resultados sobresalientes y superiores con relación a, e.g., Laughiin et al., NEJM 351:2265 (2004) y Rocha et al., NEJM 351:2276-85 (2004). Los resultados pediátricos son sobresalientes al compararse con los resultados estratificados por edades del NYBC. Los resultados de unidad única muestran que la contribución por una segunda unidad de otro centro no es responsable del sobresaliente resultado clínico. También se realizó una comparación entre pacientes con enfermedades benignas o malignas en el subconjunto de remisión. En particular, la Figura 5 muestra una comparación de la incidencia acumulativa de injerto ANC 500 (Figura 5A) , la incidencia acumulativa de injerto de plaquetas 20K (Figura 5B) , y la tasa de supervivencia a 1 año (Figura 5C) para estos dos subconjuntos de pacientes. Con respecto al transplante de células germinales hematopoyéticas para indicaciones benignas, la dosis media de TNC previo a la congelación fue de 7.7 x 107/kg, la dosis media de TNC posterior a la descongelación fue de 7.7 x 107/kg, y la dosis media de CD34 previo a la congelación fue de 3.1 x 105/kg. El tiempo medio para injerto para ANC 500 (n=21), Plt20K (n = 20), y Plt50K (n = 18) fue de 14.5 días (rango 11-41), 47.0 días (rango 13-82) y 56.5 días (rango 21-96), respectivamente. La incidencia acumulativa no ajustada de injerto para ANC 500, Plt20K y Plt50K fue de 89 + 7%, 89 + 71 y 87 + 8%, respectivamente. La incidencia de GvHD aguda grado II reportada fue de 33% y ninguno de los pacientes tuvo GvHD aguda de grado III-IV. 50% desarrolló GvHD crónica limitada (7/14) y hasta ahora solo se reportó un paciente que tuvo GvHD crónica extensiva. Con un seguimiento medio de 356 días (rango 93-1,100 días), la estimación Kaplan-Meier de TRM a 1 año, supervivencia total y supervivencia libre de enfermedad fue de 11 + 6%, 89 + 6% y 89 + 6%, respectivamente . Con respecto al transplante de células germinales hematopoyéticas para indicaciones malignas, la dosis media de TNC previo a la congelación fue de 6.4 x 107/kg, la dosis media de TNC posterior a la descongelación fue de 5.3 x 107/kg, y la dosis media de CD34 previo a la congelación fue de 2.5 x 105/kg. El tiempo medio para injerto para ANC 500 (n= 66), Plt20K (n = 52), y Plt50K (n = 50) fue de 24 días (rango 7-49 días), 53 días (rango 15-94 días) y 63 días (rango 37-132 días), respectivamente. La incidencia acumulativa no ajustada de injerto para ANC 500, Plt20K y Plt50K fue de 93 + 3%, 76 + 6% y 75 + 6%, respectivamente. La incidencia de GvHD aguda grado II-IV y III-IV reportada fue de 37% y 20%, respectivamente. 12 pacientes desarrollaron GvHD crónica limitada y 15% desarrolló GvHD crónica extensiva. Con un seguimiento medio de 282 días (rango 50-1,263 días), la estimación Kaplan-Meier de TRM a 1 año, supervivencia total y supervivencia libre de enfermedad fue de 20 + 6%, 67 + 6% y 59 + 7%, respectivamente. Ningún evento adverso importante se asoció con la infusión de transplantes de UCB de PD ya sea que las unidades se lavaran o no post-descongelación. Los efectos secundarios comunes reportados incluyeron hemoglobinuria, hipertensión, urticaria, náusea y vómito y dispnea. La hemoglobinuria se presentó más frecuentemente en pacientes que recibieron sangre de cordón umbilical no lavada. Un paciente desarrolló ataques transitorios y la encefalopatía pareció relacionarse temporalmente a la infusión de sangre de cordón umbilical no lavada, lo cual se resolvió con tratamiento y sin secuelas. En términos de lavado contra no lavado postdescongelación para transplantes de UCB de PD, se encontraron disponibles los datos para los 84 pacientes en remisión sin historia de transplantes previos que recibieron unidades de UCB de PD ya sea lavadas (n = 43) o no lavadas (n = 40) para HSCT. Todas las unidades de sangre de cordón umbilical de PD que experimentaron algún tipo de lavado (e.g., separación por dilución o centrifugación) , sin importar el protocolo, se agruparon bajo el grupo de lavado. Todas las unidades de sangre de cordón umbilical de PD que se descongelaron y se infundieron sin una etapa de centrifugación, ya sea diluidas o no (e.g., reconstituidas) previo a la infusión se clasificaron en el grupo de no lavado. Los eventos adversos de cualquier grado que se presentaron más de una vez durante la infusión incluyeron hemoglobinuria (9 de no lavado, 1 de lavado), hipertensión (6 de no lavado, 4 de lavado), urticaria (1 de no lavado, 1 de lavado), náusea/vómito (2 de no lavado), y dispnea (1 de no lavado, 1 de lavado). Un paciente de no lavado desarrolló ataques y encefalopatía que se resolvieron sin ninguna secuela, aunque la relación con la infusión fue incierta. La recuperación total de célula nucleada (TNC) post-descongelación fue más alta para el grupo de no lavado (media 95%) que para el grupo de lavado (media 75%) . La incidencia acumulativa no ajustada de injerto de neutrófilo fue similar para ambos grupos: 91 + 5% para no lavado, (n = 36) contra 93 + 4% para lavado (n = 41) . Sin embargo, el tiempo medio para injerto de neutrófilo (20 vs . 26 días) y de injerto de plaquetas (plaquetas 20K: 47 vs . 55 días; plaquetas 50K: 55 vs . 63 días) se presentó más tempranamente para el grupo de no lavado. Esta diferencia fue altamente significativa para la velocidad de injerto de plaquetas en análisis tanto de una variación como de variaciones múltiples. La diferencia también fue significativa para la velocidad de injerto de neutrófilos en análisis de una variación. Adicionalmente, la incidencia acumulativa para el injerto de plaquetas 20K fue significativamente alta para no lavado (n = 28; 92 + 6%) que para lavado (n = 39; 75 + 7%) tanto para análisis de una variación como de variaciones múltiples. La GvDH aguda de grado III-IV fue de 10% (no lavado) y 19% (lavado) , y la GvDH crónica extensiva fue de 0% (no lavado) y 22% (lavado) . La TRM fue de 18 + 6% para el de no lavado y de 20 + 7% para el de lavado, con la tasa de reincidencia para casos malignos a 11 + 7% para el de no lavado y de 25 + 8% para el de lavado. La supervivencia total a un año fue de 75 + 7% (n = 40) contra 72 + 8% (n = 43), y la DFS a un año fue de 69 + 10% (n = 23) contra 54 + 9% (n = 34) para no lavado y lavado, respectivamente. Con respecto al transplante de células germinales hematopoyética para indicaciones benignas, el tiempo medio para injerto para ANC 500, plaquetas 20K, y plaquetas 50K para el grupo de lavado contra el grupo de no lavado fueron de 27 vs . 12 días, 58 vs . 44 días, y 73 vs . 53 días, respectivamente. Con respecto al transplante de células germinales hematopoyéticas para indicaciones malignas, el tiempo medio para injerto para ANC 500 y plaquetas 20K para el grupo de lavado contra el grupo de no lavado fueron de 28 vs . 23 días, y de 55 vs . 49 días, respectivamente. La Figura 6 muestra que, en un análisis de variación múltiple, el no lavado mejoró significativamente el injerto de plaquetas cuando un total de 95 pacientes en remisión sin historia de transplantes previos recibió unidades de UCB de PD ya sea lavadas (n = 52) o no lavadas (m 42) para HSCT. En total, los análisis ajustados confirmaron resultados no variables mostrando que los transplantes no lavados se injertaron (P20K y P50K) más rápido que las unidades lavadas. Características de Casos de Lavado versus Sin Lavado (n = 94) Sin Lavado Lavado P* (n=42, 45%) (n=52, 55%) Factores del Receptor Hembra 19 (45%) • 19 (36%) 0.41 Edad (años) 0-2 6 (14%) 14 (27%) 0.27 3-11 21 (50%) 19 (36%) 12-18 5 (12%) 10 (19%) 19-55 10 (24%) 9 (17%) Cordones 8 (19%) 9 (17%) 0.99 dobles Malignidad 26 (62%) 45 (86%) 0.008 Factores de trasplante Alto riesgo 6 (14%) 20 (38%) 0.01 (si) Dosis TNC Pre-Congelada X107/kg <3 6 (14%) 9 (17%) 0.13 3-5 20 (48%) 16 (31%) 6-9 4 (9%) 14 (27%) >9 12 (28%) 13 (25%) igualación prom. HLA 6 7 <17%> 8 (15%> °-99 * Los valores P se computaron utilizando Pruebas Exactas de Fisher Se realizó un estudio de seguimiento de 237 pacientes que incluyó los 118 pacientes pediátricos descritos anteriormente. La media de edad fue de 9 años (rango 0.3- 59) , con 33% de > 165 años; el peso medio fue de 30 kg (rango 4.5-112), con 35% de > 50 kg; 60% fueron hombres; el # medio de compatibilidades de ABDR de HLA fue de 4.0; la dosis de TNC media fue de 5.6 x 10 7/kg; la dosis media de CD34 fue de 1.8 x 105/kg; el centro de transplantes reportó que la dosis media de TNC posterior a la descongelación fue de 5.2 x 10 /kg; hubo 70% de indicaciones malignas; 39% de los transplantes se realizaron fuera de los E.U.; hubo 27% de transplantes dobles; y 16% de los transplantes se realizaron después de la terapia no mieloablativa. La incidencia de aGvDH de grado III-IV y de cGvDH extensiva fue de 13% y 14% respectivamente. La tasa de injerto no ajustado de injertos ANC 500, plaquetas 20K y plaquetas 50K fue de 88 + 3%, 82 + 4% y 76 + 4%, respectivamente. El tiempo medio para injerto para ANC 500, plaquetas 20K y plaquetas 50K fue de 22, 28 y 63 días, respectivamente. La tasa de reincidencia fue de 23 + 4% y la TRM fue de 29 + 3%. Con un seguimiento medio de 325 días, la supervivencia total a 1 año y la supervivencia libre de enfermedad fueron de 59 + 4% y 54 + 4%, respectivamente. El análisis de estratificación mostró un mal resultado de injerto y supervivencia a la dosis de CD34+ por debajo de 0.7 x 107/kg. Hubo 113 transplantes lavados (W) y 95 (no lavados (NW) de sangre de cordón umbilical de PD. No se presentaron eventos adversos significativos cuando no se excedió el umbral recomendado de DMSO de 1 g por kg del peso del receptor. La recuperación de TNC post-descongelación reportada por los centros de transplantes fue mayor para NW (media 89% vs . 75%) . Las tasa de injerto no ajustadas fueron más altas y los tiempos medios para injerto fueron más tempranamente para CB de PD NW que para W: 91 + 4% y 20 días para NW vs . 88 + 4% y 24 días para W para ANC 500 (p = 0.03); 86 + 6% y 44 días para NW vs . 78 + 5% y 58 días para W para plaquetas 20K (p = 0.004); 85 + 6% y 57 días para NW vs . 72 + 6% y 75 días para W para plaquetas 50K (p = 0.01). Las incidencias de GvDH de grado III-IV fueron de 12% (NW) y 13% (W) , y de GvDH crónica extensiva fueron de 4% (NW) y 19% (W) , respectivamente. Las tasas de reincidencia fueron de 16 + 5% para NW y de 28 + 5% para W (p = 0.15), con la TRM a 25 + 5% para NW y 34 + 5% para W (p = 0.52) . La supervivencia total a 1 año fue de 63 + 6% vs. 49 + 5% (p = 0.40), y la DFS a 1 año fue de 62 + 6% vs . 36 + 7% para NW y W (p = 0.21=, respectivamente. El resultado de los transplantes de sangre de cordón umbilical de PD se compararon favorablemente con los datos publicados utilizando transplantes de sangre de cordón umbilical de RBC agotada y se dirigieron mejor con respecto al injerto, TRM y supervivencia. No hubo ningún beneficio en el lavado posterior a la descongelación de la sangre de cordón umbilical de PD, y el no lavado fue significativamente mejor que el lavado posterior a la descongelación de la sangre de cordón umbilical de PD con respecto a la tasa de injerto de neutrófilos y plaquetas y a la velocidad de injerto, TRM, tasa de reincidencia, supervivencia total a 1 año y DFS. Este ejemplo demuestra lo siguiente: (1) los transplantes de UCB de PD tienen un promedio y dosis celular media mayor; (2) la incidencia acumulativa no ajustada de injerto de neutrófilo y plaquetas parece ser significativamente mejor que las unidades de células sangre roja agotadas (RD) tanto para niños como para adultos; (3) velocidad sobresaliente de injerto de neutrófilo y plaquetas que alcanza la de los transplantes de médula ósea para indicaciones benignas; (4) la tasa de supervivencia a 1 año y la tasa de mortalidad relacionada con transplante se mejoran significativamente contra las unidades de RD tanto para adultos como para niños, especialmente en indicaciones benignas para niños; (5) la tasa de reincidencia es tan buena como los transplantes de UCB de RD; y (6) el no lavado de las unidades de UCB e PD mejora el injerto significativamente contra el lavado. Como resultado, este ejemplo ilustra que el transplante de UCB de PD puede efectuarse de manera segura en pacientes con resultados comparables o superiores a los controles históricos. Este ejemplo muestra además que el no lavado de las unidades de UCB de PD post-descongelación mejora la incidencia al injerto de plaquetas y el tiempo para injerto para neutrófilos y plaquetas, indicando que el lavado posterior a la descongelación retrasa el injerto de las células germinales hematopoyéticas. Ejemplo 5. Injerto Rápido y Durable después del Transplante de Sangre de Cordón umbilical no Relacionado para Minos con Talasemia Dependiente de Transfusión . Este ejemplo ilustra las composiciones de sangre de cordón umbilical de la presente invención, que proporcionan una óptima dosis total de células nucleadas, y producen un rápido y durable injerto en pacientes con talasemia dependiente de transfusión. La sangre de cordón umbilical (UCB) es una atractiva fuente no relacionada para el transplante de células germinales hematopoyéticas de talasemia. Sin embargo, la dosis de células es un factor crítico para el transplante de sangre de cordón umbilical. De hecho, el transplante de sangre de cordón umbilical ha sido frecuentemente no exitoso en el tratamiento de talasemia debido a que es necesario administrar grandes números de células transplantadas para sostener la hematopoyesis y prevenir el rechazo (Rund et al., N. Engl. J. Med. 353:1135- 1146 (2005) ) . Este ejemplo demuestra que pueden lograrse resultados promisorios con el transplante de sangre de cordón umbilical no relacionada en pacientes seleccionados maximizando la dosis celular de acuerdo con los métodos de la presente invención. Entre Octubre de 2003 y Septiembre de 2005, se utilizó el transplante de sangre de cordón umbilical no relacionada para la reconstitución hematopoyética después de la terapia mieloablativa en 10 pacientes pediátricos con talasemia dependiente de transfusión (ver, Tabla 5) . Tabla 5. Resumen de Casos ? Los pacientes en Cheng Gung no experimentaron rutinariamente biopsia hepática. Los pacientes se clasificaron en base a la presencia de 0, 1 o 2 de las dos características restantes (hepatomegalia y quelación deficiente) de la clasificación Lucarelli Con 2 transplantes de unidad doble y 12 unidades de sangre de cordón umbilical para 10 pacientes, hubo tres 6/6, tres 6/6, cuatro 4/6, y dos 3/6 compatibilidades de HLA A/B/DR de alta resolución. Todas las unidades de sangre de cordón umbilical se proporcionaron por StemCyte Taiwan National Cord Blood Center y se agotaron de plasma pero no experimentaron agotamiento de glóbulos rojos (RBC) a fin de lograr una máxima retención de células nucleadas postprocesamiento de reducción de volumen. Para mejorar adicionalmente la dosis celular infundida, todas las unidades se descongelaron y se infundieron inmediatamente sin lavado. No se observaron eventos adversos significativos después de la infusión a pesar de la importante incompatibilidad de ABO en la mayoría de los casos. El número medio del total de células nucleadas (TNC) previamente congeladas posterior al procesamiento fue de 8.7 x 107/kg (rango, 4.8-15.0 x lO'/kg) y el número medio de células CD34 previamente congeladas posterior al procesamiento fue de 4.1 x 105/kg (rango 2.1-8.0 x 105/kg) del peso corporal del receptor. No se asociaron eventos adversos serios con la infusión. Un paciente murió de sepsis S. mitis resistente a la penicilina en el día +8 previo al tiempo "esperado" para el injerto de neutrófilos. Los otros 9 pacientes se encuentran vivos y bien con un tiempo medio de seguimiento de 378 días desde Octubre 8 de 2005. Ocho pacientes con injerto de neutrófilos mostraron quimerismo total de donador al día +21 y los pacientes restantes lograron un quimerismo mixto estable (85.6% células de donador) al día 162, y se encuentran actualmente a 311 días posterior al transplante. La recuperación autóloga no se observó en ninguno de los pacientes. Los tiempos medios para injerto de neutrófilos (cuenta absoluta de neutrófilos > 500 durante tres días consecutivos), independencia de transfusión de RBC, e injerto de plaquetas (> cuenta de plaquetas de 20,000 durante 7 días consecutivos sin transfusión de plaquetas) fueron de 14 (rango 12-24 días), 35 (rango 20.50 días) y 51 días (rango 45-60 días) después del transplante, respectivamente. El número de pacientes con enfermedad de injerto contra huésped aguda de grado I, II y III (GvDH) que se resolvió con el tratamiento, fueron tres, cuatro y tres, respectivamente. No se había desarrollado ninguna GvDH crónica extensiva en el último contacto.

Treinta y dos por ciento de los pacientes con talasemia dependiente de transfusión no viven después de la edad de 35 (Cao, Haematologica 89:1157-1158 (2004)). Varios estudios han demostrado una mejor supervivencia después del transplante de sangre de cordón umbilical utilizando dosis celulares más altas en diferentes enfermedades (Wagner et al., Blood 100:1611-1618 (2002); Barker et al., Blood 105:1343-1347 (2005); Locatelli et al., Blood 93:3662-3671 (1999)). La UCB no relacionada es una alternativa razonable para la médula ósea no relacionada, presumiendo que la unidad contiene una dosis de células suficiente. Este estudio demuestra que al ajustar una dosis de células adecuada, que puede maximizarse por medio de la selección de transplantes de unidad doble y/o técnicas de procesamiento y descongelación, el transplante de sangre de cordón umbilical no relacionada puede producir un injerto rápido y durable en pacientes seleccionados con talasemia dependiente de la transfusión. La estadía media en hospital para este estudio es de 77 días después del transplante (rango 46 a 98 días), y es claramente efectivo en costo con una mejorar calidad de vida al compararse con el tratamiento convencional de por vida con transfusiones de sangre y terapia de quelación de hierro. En un estudio de seguimiento de 15 pacientes con talasemia dependiente de transfusión que incluyó los 10 pacientes pediátricos antes descritos, el transplante de sangre de cordón umbilical no relacionada utilizando las composiciones de sangre de cordón umbilical de la presente invención, produjo un injerto rápido y durable (ver Tabla 6) . Tabla 6. Resumen de casos alXCBT = transplante de sangre de cordón umbilical de unidad única; 2XCBT = transplante de sangre de cordón umbilical de unidad doble. bLos pacientes se clasificaron en base a la presencia de 0, 1 o 2 de las dos características (hepatomegalia y quelación deficiente) de la clasificación de Lucarelli. cLas igualaciones HLA son a alta resolución, representando (1) y (2) el número de igualaciones HLA para la primera y segunda unidad de sangre de cordón umbilical. dTNC = células totales nucleadas eCD34 = células CD34+ £# de días en el injerto de neutrólfilos es el primero de tres días consecutivos que alcanza una cuenta absoluta de neutrófilos >500 - 14 de 16 transplantes (88%) lograron el injerto y exhibieron quimerismo donador durable dando como resultado una tasa de injerto Kaplan-Meier de 93 ±6%. 9#.días para el injerto de plaquetas es el primero de 7 días consecutivos que alcanzan la cuenta de plaquetas de > 20,000 o 50, 000 durante 7 días consecutivos sin transfusión de plaquetas - estimado de Kaplan-Meier de tasa de injerto de plaquetas 20K y 50K es de 91 ±9% y 82+8%, respectivamente. haGvHD = injerto agudo-versus-enfermedad de huésped con grados de I-IV; cGvHD = injerto crónico-vesus-enfermedad de huésped, graduado ya sea como 'limitado Ltd) o como extenso (Ext) . 1 Sigue en Mayo 8, 2006. dDatos de quimerismo del donador más último con la unidad de injerto en corchetes. kDosis celular combinada de ambas unidades de sangre de cordón umbilical en los transplantes de doble unidad de sangre de cordón umbilical. XE1 paciente 7 expiró en el día +8 de sepsis de S . mitis resistente a la penicilina raEl paciente 12 falló en un transplante inicial 3/6 de sangre de cordón umbilical igualado de HLA, pero se injertó con un transplante de 'unidad doble de sangre de cordón umbilical subsecuente . nEl paciente 12 expiró en el día +60 después de lograr el injerto de una hemorragia intracraneal causada por accidente traumático . °E1 tiempo de seguimiento promedio y medio, excluye los pacientes que expiraron.

Las unidades de sangre de cordón umbilical congeladas que se encuentran sustancialmente agotadas de plasma pero no de glóbulos rojos se descongelaron y se infundieron sin lavado para maximizar la dosis de células. No se observaron eventos adversos significativos a pesar de la incompatibilidad de ABO. Después • de la mieloablación, se transplantaron 21 unidades de sangre de cordón umbilical en 15 pacientes Asiáticos con talasemia mayor, con 5 transplantes dobles de sangre de cordón umbilical no relacionada y uno de re-transplante. A pesar de • un 86% de pares de receptores de unidad de sangre de cordón umbilical con no compatibilidad de HLA, pocos tuvieron GvDH seria; todos se resolvieron con tratamiento. La incidencia acumulativa no ajustada de injerto de neutrófilos con quimerismo del donador fue de 93 + 6%. Los tiempos medios para lograr el injerto de nucleófilos, la independencia de transfusión de RBC y el injerto de plaquetas fueron de 16, 35 y 45 días, respectivamente. La supervivencia libre de talasemia fue de 87 + 9%, la supervivencia total a 1 año fue de 86 + 9%, la mortalidad relacionada con transplante a 1 año fue de 13 + 9%, y la tasa de reincidencia fue de 0%. Dado que el 68% de pacientes de talasemia mayor viven después de la edad de 35 y la mayoría no tienen parientes HLA compatibles, el transplante de sangre de cordón umbilical no relacionada produce una supervivencia satisfactoria y proporciona una alternativa efectiva en costo con una mejor calidad de vida en comparación con la transfusión y quelación de por vida . Ejemplo 6. Un Análisis Audi ado de Par Compatible de Transplantes Utilizando Unidades de Sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos contra las de Plasma Agotada. Este ejemplo ilustra un procedimiento para efectuar un análisis de par compatible entre transplantes de PD y de UCB de sangre roja agotada (RD) para determinar las significativas diferencias en los resultados clínicos entre el transplante de células germinales hematopoyéticas con UCB de PD contra UCB de RD. Un análisis retrospectivo de par compatible es probablemente el método retrospectivo más definitivo para determinar las significativas diferencias en los resultados clínicos entre HSCT conducido con UCB de PD contra UCB de RD.

Para efectuar el análisis de par compatible entre transplantes de UCB de PD y de RD, los pacientes transplantados con unidades de UCB de RD o de PD pueden compatibilizarse y formar pares de acuerdo con las siguientes prioridades: (1) edad del receptor (+ 2 años para pacientes menores de 16 y + 5 años para pacientes mayores de 16); (2) peso (+ 5 kg para pacientes de menos de 50 kg y de + 10 kg para pacientes de más de 50 kg) ; (3) diagnóstico; (4) grado de compatibilidad de HLA; (5) previo al transplante o transplantados durante la reincidencia, falla por inducción, o enfermedad resistente; (6) estado de riesgo para malignidades y ciertas enfermedades (e.g., para leucemia: CR# o CP# y el grado de riesgo evidenciado por un diagnóstico previo conocido de mielodisplasia (MDS), alto riesgo de citogenéticas tales como aquellos con t(9:22), t(l:19), t(4:ll), u otros reordenamientos de MLL, o cariotipos complejos asociados con MDS; para linfomas: el grado de linfoma debe compatibilizarse; para talasemias: la clase Pesaro debe compatibilizarse); (7) opcionalmente unidades de sangre de cordón umbilical únicas contra dobles (en el caso de transplantes de unidad doble, ambas unidades deben procesarse de la misma manera); y (8) opcionalmente mieloablación contra intensidad reducida. Si se compatibilizan múltiples receptores de transplantes de UCB de RD con un receptor de transplante de UCB de PD, entonces se da preferencia al receptor de UCB de RD con el peso más cercano seguido por el año más cercano de transplante. Si un paciente de transplante de UCB de RD no puede compatibilizarse con respecto a todos los criterios anteriores, con un receptor de UCB de PD, entonces se da preferencia al paciente de UCB de RD que puede compatibilizarse de acuerdo con las prioridades anteriores, comenzando desde la primera prioridad. No se da preferencia al número de prioridades compatibilizadas . Por ejemplo, al paciente de UCB de RD que se compatibilizó con las primeras cinco prioridades puede darse preferencia sobre el paciente de UCB de RD compatible con las primeras cuatro prioridades más las prioridades 6, 7 y 8. También puede analizarse a los pacientes como sigue: (1) Debido a que los dos tipos de procesamiento difieren teóricamente en el grado de recuperación de células nucleadas posterior al procesamiento, lo cual puede afectar finalmente la dosis de células promedio y media de tales transplantes, y finalmente el resultado clínico, la dosis de células nucleadas y CD34 no se compatibilizará inicialmente. Si se observan diferencias significativas entre las unidades de PD y de RD, entonces los pares compatibles con dosis similares de células (a) nucleadas (+ 0.5 x 107/kg entre sí), o (b) CD34+ (+ 0.25 x 105/kg entre sí) pueden compararse con los pares sin dosis similar de células. Se razona que, si se observa una diferencia estadísticamente significativa entre los dos tipos de sangre de cordón umbilical, y la dosis de células es la razón principal, entonces los pares compatibilizados en la dosis de células deben tener menos diferencias en los resultados clínicos entre unidades de Pd y de RD que los pares que no son compatibles en la dosis de células. Alternativamente, si existen diferencias en los resultados entre las unidades de PD y de RD para ambos pares de dosis compatibilizados y los pares de dosis no compatibilizados, entonces la dosis de células puede no ser el único mecanismo que cuenta para la diferencia en el resultado clínico. La estratificación de la dosis de células de los grupos tanto de PD como de RD, puede utilizarse para observación de alguna diferencia al compatibilizar las dosis de células. (2) Para malignidades los pares de transplantes sin transplantes previos y efectuados durante la remisión, pueden contrastarse con los pares con transplante previo y/o efectuados durante la reincidencia, falla por inducción, o con enfermedad resistente. Si es posible, los dos cohortes de pacientes podrían compararse por (1) género, (2) sero-positividad de CMV, (3) congelación previa del injerto o criopreservación y dosis de células nucleadas y CD34 posterior a la descongelación, (4) año de transplante, (5) media de seguimiento, (6) tiempo desde el diagnóstico hasta los transplantes; (7) región de transplante (E.U., Europa Occidental, Australia, Centro o Sudamérica, Asia) , y, si se encuentra disponible (8) régimen de acondicionamiento. Para el análisis de par compatibilizado entre unidades de UCB de PD y de RD, pueden utilizarse los puntos del siguiente estudio: I. Resultado primario: 1. Supervivencia total a los 12 meses posteriores al transplante. 2. Incidencia acumulativa no ajustada del injerto de neutrófilos sostenido (no ajustada para muertes previas al período de injerto esperado) . 3. Velocidad de injerto de neutrófilos sostenido. II. Resultado secundario: 1. Supervivencia libre de enfermedad a los 12 meses posteriores al transplante. 2. TRM a los 12 meses posteriores al transplante. 3. Incidencia acumulativa no ajustada del injerto de plaquetas sostenido (no ajustada para muertes previas al período de injerto esperado) . 4. Velocidad de injerto de plaquetas sostenido. 5. La incidencia y severidad de la enfermedad de injerto contra huésped (GvDH) aguda y crónica. 6. La incidencia de reincidencia maligna. 7. La incidencia y severidad de eventos adversos posteriores a la infusión. Ejemplo 7. Procedimiento para Descongelación e Infusión Directa de Unidades de Sangre de Cordón umbilical Congeladas . Este ejemplo describe un protocolo para descongelación e infusión directa de las unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada, criopreservadas de la presente invención sin efectuar ninguna etapa de lavado. En ejemplos en los cuales los pacientes no son neonatos y no tienen función renal comprometida, puede preferirse el siguiente protocolo debido a que minimiza la pérdida de células nucleadas viables, inevitable con el lavado y la prolongada manipulación post-descohgelación. Este procedimiento produce una tolerancia favorable en pacientes con efectos secundarios solo ocasionales que pueden tratarse fácilmente con medidas estándar. Como resultado, puede infundirse la dosis más alta de células germinales viables de manera segura y efectiva en pacientes que lo necesitan . Notas antes de la descongelación: Descongelación de la Unidad de Sangre de Cordón umbilical : Infusión: Reacciones Adversas Potenciales Asociadas con la Administración de Células germinales Hematopoyéticas : Suaves a Moderadas: Frecuentes: náusea, vómito, hipertensión, hipotensión, bradicardia, hemoglobinuria, temblores, gusto a maíz dulce cremoso o ajo (de la expiración del DMSO) . Menos frecuentes: dolor de cabeza, dolores abdominales, diarrea, escurrimientos, escalofríos, fiebre, escurrimientos, opresión en el pecho, vértigo, encefalopatía, ataques, bradicardia, hiperbilirrubinemia, incremento en los niveles de transaminasa en suero.. Amenaza severa a la vida: Muy raramente (-0.4% en el más grande estudio publicado de 1,410 pacientes) y comúnmente auto limitada.

Cardiaca: bradicardia, bloqueo cardiaco, arritmia, choque, arresto cardiaco. Neurológica: encefalopatía (posiblemente relacionada a un peso mayor que 2 kg de DMSO/kg del receptor y tratable mediante plasmaféresis) , ataques. Pulmonar: depresión respiratoria Inmunológica: reacción anafiláctica Renal: falla renal aguda debida a alta concentración de hemoglobina libre (mitigada por medio de medicación previa con antihistamina y corticoesteroides, hidratación adecuada, alcalización urinaria, diuresis de manitol) . Causas de Reacciones Adversas Potenciales : Toxicidad a DMSO: Aunque la dosis tóxica aguda de DMSO para humanos no se ha determinado, el valor LD50 (i.e., la cantidad de DMSO requerida para matar el 50% de los animales de prueba) reportado para la administración IV de DMSO se encuentra entre 3.1-9.2 g/kg para ratones, 2.5 g/kg para perros, y más de 11 g/kg para monos. La mayoría de los reportes publicados han mantenido la dosis de DMSO por debajo de 1 g/kg. En una unidad típica de sangre de cordón umbilical de la presente invención, la dosis máxima de DMSO se encuentra entre aproximadamente 7.5 (1 bolsa) y aproximadamente 15 g (2 bolsas). En consecuencia, en pacientes con funciones renales comprometidas y en pacientes pequeños (e.g., aquellos por debajo de 7 kg para 1 bolsa y por debajo de 15 kg si se van a administrar dos bolsas al mismo tiempo) , en los cuales no es un problema lograr una dosis de células adecuada, se recomienda el lavado del producto. La tasa de infusión preferida de un producto de células germinales criopreservadas con 10% DMSO debe encontrarse entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 ml por minuto. Sobrecarga de volumen: El volumen máximo para transfundir debe encontrarse en el rango de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 ml/kg/dosis. Incompatibilidad Mayor del Grupo Sanguíneo ABO: Aunque la incompatibilidad del grupo sanguíneo ABO entre el paciente y el donador no ha sido un problema en el transplante de sangre de cordón umbilical, se suministra la siguiente información adicional en casos de incompatibilidad mayor del grupo sanguíneo, e.g., el paciente es del grupo sanguíneo O y la unidad de sangre de cordón umbilical no es del grupo O. Aunque se sabe que la transfusión de grandes volúmenes de glóbulos rojos de incompatibilidad mayor con ABO ocasiona reacciones a la transfusión en pacientes que tienen una titulación significativa de anti-A o anti-B, Bensinger et al., Transplantation 33:427-429 (1982), notaron que cuando la titulación de hemaglutinina de receptores anti-A y anti-B son de 1:16 o menos, pueden transfundirse con seguridad glóbulos rojos incompatibles como ABO. Sauer-Heilborn et al., 44:907-916 (2004), describen la experiencia con transfusión de células germinales de sangre periférica incompatible con ABO (PBSC) y unidades de médula, y notaron que el riesgo es menor con unidades de PBSC (volumen de glóbulos rojos = 75-100 ml) en comparación con los componentes de médula ósea (volumen de glóbulo rojo = 300-400 ml) . El volumen de glóbulos rojos en unidades de sangre de cordón umbilical de la presente invención es de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 ml . No se sabe que este volumen de glóbulos rojos ocasione serios efectos adversos, pero pueden presentarse síntomas tales como temperatura elevada, incremento en el pulso, y dolor muscular. Se espera orina oscura o roja y plasma debido a la hemolisis en la muestra de sangre de cordón umbilical. La tasa de infusión debe ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 ml/minuto, con cercano monitoreo del paciente. En ciertos ejemplos, puede medicarse previamente al paciente con antipiréticos, antihistaminas y/o corticoesteroides y deben encontrarse bien hidratados. Las reacciones adversas se presentan comúnmente durante la infusión y se resuelven después de detener la infusión. Sin embargo, algunas reacciones pueden presentarse aproximadamente de 6 a 7 horas después de completar la infusión, de manera que debe monitorearse a los pacientes durante todo el período de tiempo.

Los regímenes comunes de medicación previa incluyen, pero no se limitan a, hidratación adecuada (e.g., en incompatibilidad mayor a ABO), antihistaminas (e.g., en incompatibilidad mayor a ABO) corticoesteroides, manitol, antieméticos y antipiréticos (e.g., en incompatibilidad mayor a ABO) . Los ejemplos no limitantes de intervenciones terapéuticas comunes para efectos adversos incluyen diuréticos (e.g., sobrecarga de volumen), anticonvulsivos (e.g., ataques), atropina (e.g., bradicardia), plasmaferesis (e.g., encefalopatía), 02 (e.g., depresión pulmonar) y narcóticos . Ejemplo 8. Procedimiento para Descongelación, Reconstitución e Infusión de Unidades de Sangre de Cordón umbilical Congeladas . Este ejemplo describe un protocolo para congelación, reconstitución e infusión de las unidades de sangre de cordón umbilical de plasma agotada, criopreservadas de la presente invención. En ciertas situaciones en las cuales la sobrecarga de volumen no es una seria consideración, para reducir la viscosidad de las unidades de sangre de cordón umbilical de la presente invención y facilitar la infusión IV mediada por la gravedad, las unidades pueden diluirse o reconstituirse, por ejemplo, con aproximadamente dos veces el volumen de una solución de albúmina de suero humana/Gentran de acuerdo con el siguiente protocolo. Esto reduce la concentración de DMSO de la unidad posterior a la dilución y toda toxicidad potencial inducida por DMSO a las células germinales, y también permite más tiempo entre la descongelación y la infusión. Sus ventajas incluyen la facilidad de administración y el tiempo prolongado para la administración. Notas Antes de la Descongelación : Preparación de Solución de Reconstitución Albúmina de Suero Humano/Gentran: Descongelación de la Unidad de Sangre de Cordón umbilical : Dilución o Reconstitución del Producto de Sangre de Cordón umbilical : Etapa Acción Inmediatamente y tan rápido como sea posible extraer el producto en una jeringa estéril de 60 cc a través de uno de los puertos desinfectados de la bolsa de Infusión : Etapa Acción 1 Inmediatamente y tan rápido como sea posible traer la unidad al cuarto del paciente e infundir el producto a través de una línea central colgando la Bolsa de Reconstitución . El producto descongelado y reconstituido debe infundirse dentro de aproximadamente 30 minutos. Si el producto es demasiado viscoso y no fuirá bien, impulsar el Reacciones Adversas Potenciales Asociadas coa la Administración de Células germinales Hematopoyéticas : Suaves a Moderadas: Frecuentes: náusea, " vómito, hipertensión, hipotensión, bradicardia, hemoglobinuria, temblores, gusto a maíz dulce cremoso o ajo (de la expiración del DMSO) . Menos frecuentes: dolor de cabeza, dolores abdominales, diarrea, escurrimientos, escalofríos, fiebre, escurrimientos, opresión en el pecho, vértigo, encefalopatía, ataques, bradicardia, hiperbilirrubinemia, incremento en los niveles de transaminasa en suero. Amenaza severa a la vida: Muy raramente (-0.4% en el más grande estudio publicado de 1,410 pacientes) y comúnmente auto limitada. Cardiaca: bradicardia, bloqueo cardiaco, arritmia, choque, arresto cardiaco. Neurológica: encefalopatía (posiblemente relacionada a un peso mayor que 2 kg de DMSO/kg del receptor y tratable mediante plasmaféresis) , ataques.

Pulmonar: depresión respiratoria Inmunológica: reacción anafiláctica Renal: falla renal aguda debida a alta concentración de hemoglobina libre (mitigada por medio de medicación previa con antihistamina y corticoesteroides, hidratación adecuada, alcalización urinaria, diuresis de manitol) . Causas de Reacciones Adversas Potenciales : Toxicidad a DMSO: Aunque la dosis tóxica aguda de DMSO para humanos no se ha determinado, el valor LD50 (i.e., la cantidad de DMSO requerida para matar el 50% de los animales de prueba) reportado para la administración IV de DMSO se encuentra entre 3.1-9.2 g/kg para ratones, 2.5 g/kg para perros, y más de 11 g/kg para monos. La mayoría de los reportes publicados han mantenido la dosis de DMSO por debajo de 1 g/kg. En una unidad típica de sangre de cordón umbilical de la presente invención, la dosis máxima de DMSO se encuentra entre aproximadamente 7.5 (1 bolsa) y aproximadamente 15 g (2 bolsas). En consecuencia, en pacientes con funciones renales comprometidas y en pacientes pequeños (e.g., aquellos por debajo de 7 kg para 1 bolsa y por debajo de 15 kg si se van a administrar dos bolsas al mismo tiempo) , en los cuales no es un problema lograr una dosis de células adecuada, se recomienda el lavado del producto. La tasa de infusión preferida de un producto de células germinales criopreservadas con 10% DMSO debe encontrarse entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 ml por minuto. Sobrecarga de volumen: El volumen máximo para transfundir debe encontrarse en el rango de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 ml/kg/dosis. Incompatibilidad Mayor del Grupo Sanguíneo ABO: Aunque la incompatibilidad del grupo sanguíneo ABO entre el paciente y el donador no ha sido un problema en el transplante de sangre de cordón umbilical, se suministra la siguiente información adicional en casos de incompatibilidad mayor del grupo sanguíneo, e.g., el paciente es del grupo sanguíneo O y la unidad de sangre de cordón umbilical no es del grupo O. Aunque se sabe que la transfusión de grandes volúmenes de glóbulos rojos de incompatibilidad mayor con ABO ocasiona reacciones a la transfusión en pacientes que tienen una titulación significativa de anti-A o anti-B, Bensinger et al., Transplantation 33:427-429 (1982), notaron que cuando la titulación de hemaglutinina de receptores anti-A y anti-B son de 1:16 o menos, pueden transfundirse con seguridad glóbulos rojos incompatibles como ABO. Sauer-Heilborn et al., 44:907-916 (2004), describen la experiencia con transfusión de células germinales de sangre periférica incompatible con ABO (PBSC) y unidades de médula, y notaron que el riesgo es menor con unidades de PBSC (volumen de glóbulos rojos = 75-100 ml) en comparación con los componentes de médula ósea (volumen de glóbulo rojo = 300-400 ml) . El volumen de glóbulos rojos en unidades de sangre de cordón umbilical de la presente invención es de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 ml . No se sabe que este volumen de glóbulos rojos ocasione serios efectos adversos, pero pueden presentarse síntomas tales como temperatura elevada, incremento en el pulso, y dolor muscular. Se espera orina oscura o roja y plasma debido a la hemolisis en la muestra de sangre de cordón umbilical. La tasa de infusión debe ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 ml/minuto, con cercano monitoreo del paciente. En ciertos ejemplos, puede medicarse previamente al paciente con antipiréticos, antihistaminas y/o corticoesteroides y deben encontrarse bien hidratados. Las reacciones adversas se presentan comúnmente durante la infusión y se resuelven después de detener la infusión. Sin embargo, algunas reacciones pueden presentarse aproximadamente de 6 a 7 horas después de completar la infusión, de manera que debe monitorearse a los pacientes durante todo el período de tiempo. Los regímenes comunes de medicación previa incluyen, pero no se limitan a, hidratación adecuada (e.g., en incompatibilidad mayor a ABO), antihistaminas (e.g., en incompatibilidad mayor a ABO) corticoesteroides, manitol, antieméticos y antipiréticos (e.g., en incompatibilidad mayor a ABO) . Los ejemplos no limitantes de intervenciones terapéuticas comunes para efectos adversos incluyen diuréticos (e.g., sobrecarga de volumen), anticonvulsivos (e.g., ataques), atropina (e.g., bradicardia), plasmaferesis (e.g., encefalopatía), 02 (e.g., depresión pulmonar) y narcóticos . Se entenderá que la descripción anterior pretende ser ilustrativa y no restrictiva. Muchas modalidades se harán aparentes para los expertos en la técnica a la lectura de la descripción anterior. El alcance de la invención, en consecuencia, deberá determinarse no con referencia a la descripción anterior, sino por el contrario se determina con referencia a las reivindicaciones anexas conjuntamente con el alcance total de los equivalentes a los cuales se refieren tales reivindicaciones. Las descripciones de todos los artículos y referencias, incluyendo solicitudes de patente, patentes y publicaciones PCT, se incorporan en la presente mediante la referencia para todo propósito.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una composición de sangre de cordón umbilical (UCB) que comprende al menos aproximadamente 50% de glóbulos rojos por volumen y un anticoagulante, en donde el plasma se encuentra sustancialmente agotado pero los glóbulos rojos no se encuentran agotados.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde dicha composición de UCB comprende al menos aproximadamente 65% de glóbulos rojos por volumen.
3. La composición de la reivindicación 1, en donde dicha composición de UCB comprende de aproximadamente 0% a aproximadamente 30% de plasma por volumen.
4. La composición de la reivindicación 1, en donde dicha composición de UCB comprende células germinales.
5. La composición de la reivindicación 4, en donde dichas células germinales son células germinales hematopoyéticas .
6. La composición de la reivindicación 1, en donde dicha composición de UCB comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% por volumen de dicho anticoagulante.
7. La composición de la reivindicación 6, en donde dicha composición de UCB comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 20% por volumen de dicho anticoagulante.
8. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho anticoagulante es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ácido cítrico, citrato de sodio, fosfato de sodio, dextrosa, adenosina y mezclas de los mismos .
9. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un crioprotector.
10. La composición de la reivindicación 9, en donde dicha composición de UCB comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% por volumen de dicho crioprotector.
11. La composición de la reivindicación 9, en donde dicho crioprotector es dimetil sulfóxido (DMSO) .
12. La composición de la reivindicación 9, en donde dicho crioprotector es una mezcla de DMSO y Gentran 40.
13. La composición de la reivindicación 9, en donde dicho crioprotector es una mezcla de DMSO y almidón de hidroxietilo (HES) .
14. La composición de la reivindicación 9, en donde dicha composición de UCB comprende una concentración de glóbulos rojos de al menos aproximadamente 3.2 x 106 glóbulos rojos/µl .
15. La composición de la reivindicación 9, en donde dicha composición de UCB comprende una concentración de glóbulos rojos de al menos aproximadamente 3.8 x 106 glóbulos rojos/µl .
16. La composición de la reivindicación 9, en donde dicha composición de UCB comprende un número de glóbulos rojos de desde aproximadamente 1 x 109 hasta aproximadamente 2.5 x 109 glóbulos rojos.
17. La composición de la reivindicación 9, en donde dicha composición de UCB comprende una concentración de glóbulos blancos de aproximadamente 15 x 103 glóbulos blancos/µl .
18. La composición de la reivindicación 9, en donde dicha composición de UCB comprende un número de glóbulos blancos de al menos aproximadamente 90 x 107 glóbulos blancos.
19. La composición de la reivindicación 9, en donde dicha composición de UCB comprende un número de células CD34+ de desde aproximadamente 1 x 106 hasta aproximadamente 5 x 107 células CD34+.
20. La composición de la reivindicación 9, en donde dicha composición de UCB comprende un número total de células nucleadas de desde aproximadamente 90 x 107 hasta aproximadamente 300 x 107 células nucleadas.
21. Una composición de sangre de cordón umbilical (UCB) que comprende al menos aproximadamente 50% de glóbulos rojos por volumen, una concentración de glóbulos rojos de al menos aproximadamente 3.2 x 106 glóbulos rojos/µl y un anticoagulante, en donde el plasma se encuentra sustancialmente agotado pero los glóbulos rojos no se encuentran agotados.
22. La composición de la reivindicación 21, en donde dicha composición de UCB comprende al menos aproximadamente 65% de glóbulos rojos por volumen.
23. La composición de la reivindicación 21, en donde dicha composición de UCB comprende de aproximadamente 0% a aproximadamente 30% de plasma por volumen.
24. La composición de la reivindicación 21, que comprende además un crioprotector.
25. La composición de la reivindicación 24, en donde dicha composición de UCB comprende una concentración de glóbulos rojos de al menos aproximadamente 3.8 x 106 glóbulos rojos/µl .
26. La composición de la reivindicación 24, en donde dicha composición de UCB comprende un número de glóbulos rojos de desde aproximadamente 1 x 109 hasta aproximadamente 2.5 x 109 glóbulos rojos.
27. La composición de la reivindicación 24, en donde dicha composición de UCB comprende una concentración de glóbulos blancos de aproximadamente 15 x 103 glóbulos blancos/µl.
28. La composición de la reivindicación 24, en donde dicha composición de UCB comprende un número de glóbulos blancos de al menos aproximadamente 90 x 107 glóbulos blancos.
29. La composición de la reivindicación 24, en donde dicha composición de UCB comprende un número de células CD34+ de desde aproximadamente 1 x 106 hasta aproximadamente 5 x 107 células CD34+.
30. La composición de la reivindicación 24, en donde dicha composición de UCB comprende un número total de células nucleadas de desde aproximadamente 90 x 107 hasta aproximadamente 300 x 107 células nucleadas.
31. Un método para tratar una enfermedad maligna o trastorno benigno asociado con el sistema hematopoyético, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto mamífero de una cantidad efectiva de una composición de la reivindicación 9 o 24.
32. El método de la reivindicación 31, en donde dicha enfermedad maligna es una malignidad hematológica.
33. El método de la reivindicación 32, en donde dicha malignidad hematológica se selecciona del grupo que consiste de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, trastornos mielodisplásicos, leucemia mielógena juvenil crónica, y linfoma no de Hodgkin.
34. El método de la reivindicación 31, en donde dicho trastorno benigno asociado con el sistema hematopoyético se selecciona del grupo que consiste de una hemoglobinopatía, un síndrome de falla de médula ósea, una deficiencia inmune, una enfermedad metabólica/de almacenamiento, un trastorno neutrófilo, una enfermedad de plaquetas y un trastorno autoinmune.
35. El método de la reivindicación 34, en donde dicha hemoglobinopatía es talasemia.
36. El método de la reivindicación 34, en donde dicha hemoglobinopatía es enfermedad de drepanocito.
37. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición incrementa la incidencia acumulativa del injerto de neutrófilos en dicho sujeto mamífero con relación a la sangre de cordón umbilical completa o a la sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos.
38. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición incrementa la incidencia acumulativa de injerto de plaquetas en dicho sujeto mamífero con relación a la sangre de cordón umbilical completa o a la sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos.
39. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición incrementa la velocidad para el injerto de neutrófilos en dicho sujeto mamífero con relación a la sangre de cordón umbilical completa o a la sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos.
40. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición incrementa la velocidad para el injerto de plaquetas en dicho sujeto mamífero con relación a la sangre de cordón umbilical completa o a la sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos.
41. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición incrementa la tasa de supervivencia libre de enfermedad en dicho sujeto mamífero con relación a la sangre de cordón umbilical completa, la sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos, médula ósea o células germinales de sangre periférica.
42. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición disminuye la tasa de mortalidad relacionada con el transplante en dicho sujeto mamífero con relación a la sangre de cordón umbilical completa, la sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos, médula ósea o células germinales de sangre periférica.
43. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición incrementa la tasa total de supervivencia en dicho sujeto mamífero con relación a la sangre de cordón umbilical completa, la sangre de cordón umbilical agotada de glóbulos rojos, médula ósea o células germinales de sangre periférica .
44. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición disminuye la incidencia de la enfermedad de injerto contra huésped aguda y crónica en dicho sujeto mamífero con relación a la médula ósea o células germinales de sangre periférica.
45. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición se administra como una dosis múltiple a dicho sujeto mamífero.
46. El método de la reivindicación 45, en donde dicha dosis múltiple disminuye la tasa de reincidencia en dicho sujeto mamífero con relación a una dosis única.
47. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición se administra en combinación con médula ósea o células germinales de sangre periférica.
48. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición no se lava entre la descongelación y la administración a dicho sujeto mamífero.
49. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición se lava entre la descongelación y la administración a dicho sujeto mamífero.
50. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición se diluye entre la descongelación y la administración a dicho sujeto mamífero.
51. El método de la reivindicación 31, en donde dicha composición se administra mediante infusión.
52. El método de la reivindicación 31, en donde dicho sujeto mamífero es un humano.
53. El método de la reivindicación 52, en donde dicho humano tiene un peso mayor que aproximadamente 50 kg .
54. El método de la reivindicación 52, en donde dicho humano tiene un peso menor que aproximadamente 50 kg .
55. Un método para la preparación de una composición de sangre de cordón umbilical (UCB) de la reivindicación 1 o 21, comprendiendo dicho método remover un volumen de plasma de una muestra de UCB que contiene un anticoagulante.
56. El método de la reivindicación 55, en donde dicha muestra de UCB se colecta de un donador.
57. El método de la reivindicación 56, en donde dicho donador es un neonato.
58. El método de la reivindicación 55, en donde dicho anticoagulante es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ácido cítrico, citrato de sodio, fosfato de sodio, dextrosa, adenosina y mezclas de los mismos.
59. El método de la reivindicación 55, que comprende además la etapa de agregar un crioprotector.
60. La composición de la reivindicación 59, en donde dicho crioprotector es dimetil sulfóxido (DMSO) .
61. El método de la reivindicación 59, en donde dicho crioprotector es una mezcla de DMSO y Gentran 40.
62. La composición de la reivindicación 59, en donde dicho crioprotector es una mezcla de DMSO y almidón de hidroxietilo (HES) .
63. El método de la reivindicación 59, que comprende además la etapa de congelación de dicha composición de UCB a una tasa de aproximadamente -1°C por minuto de aproximadamente 4°C a aproximadamente -50°C.
64. El método de la reivindicación 63, que comprende además la etapa de congelación de dicha composición de UCB a una tasa de aproximadamente -10°C por minuto desde aproximadamente -50°C hasta aproximadamente -90°C.
65. El método de la reivindicación 64, que comprende además la etapa de almacenamiento de dicha composición de UCB por debajo de aproximadamente -135°C.
66. El método de la reivindicación 65, que comprende además la etapa de descongelación de dicha composición de UCB.