KR20080027295A - 혈장-제거되고, 적혈구-비제거된 제대혈 조성물 및 사용방법 - Google Patents

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KR20080027295A
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Abstract

본 발명의 제대혈(UCB) 조성물은 혈장이 상기 UCB 유닛으로부터 실질적으로 제거되며 적혈구(RBC)는 상기 UCB 유닛으로부터 제거되지 않는다는 독특한 특징을 보유한다. 이러한 UCB 유닛은 혈장 제거가 혈장 제거 동결보존, 선별, 해동, 및/또는 조혈 줄기세포 이식과 조합된 과정에 의해 제조될 수 있는데, 상기 유닛은 가공후 세포 회수 및 해동후 주입 세포 용량을 최대화함으로써 우수한 임상 성과를 제공할 수 있다. 본 발명의 UCB 조성물을 투여함으로써 조혈 체계와 연관된 매우 다양한 양성 질환 및 양성 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
제대혈, 혈장, 적혈구, 생착, 이식, 지중해빈혈

Description

혈장-제거되고, 적혈구-비제거된 제대혈 조성물 및 사용 방법{PLASMA-DEPLETED, NON-RED BLOOD CELL-DEPLETED CORD BLOOD COMPOSITIONS AND METHODS OF USE}
발명의 배경
사람 줄기세포의 동정, 분리 및 생성에 상당한 관심이 주목되고 있다. 사람 줄기세포는 자가 재생가능하고 다양한 계통의 성숙한 사람 세포를 생성시킬 수 있는 다기능성 전구체 세포이다. 이러한 능력은 기관 및 조직 발생을 위해 필수적인 세포 분화 및 특화에 대한 토대를 제공한다. 줄기세포 이식에 있서의 최근의 성공으로부터, 질병, 독성 화학물질에 대한 노출 및/또는 방사선 조사로 인한 골수제거 후 골수의 복원(reconstitution) 및/또는 보충을 위한 새로운 임상적 도구가 제공되었다. 모두는 아니나 대부분의 조직을 복원하고 생리학적 및 해부학적 기능성을 회복시키는 데 줄기세포가 사용될 수 있음을 입증하는 추가적인 증거가 존재한다.
다수의 다양한 유형의 포유동물 줄기세포가 특성결정되었다. 예를 들어, 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 성인 줄기세포 및 다른 수임(committed) 줄기세포 또는 전구세포(progenitor cell)가 알려져 있다. 실제적으로, 특정 줄기세포는 분리되거나 특성결정되었을 뿐 아니라 제한된 분화도를 허용하는 조건하에서 배양되었다. 집단에서 HLA 유형의 가능한 수천만의 조합 때문에, 개별 환자로 HLA 매칭될 수 있는 모든 세포 유형으로 분화될 수 있는, 충분한 양, 집단 및 다양한 HLA 유형의 사람 줄기세포를 얻기가 매우 어렵다는 점에서 기본적인 문제가 남아있다. 다양한 HLA 유형의 줄기세포는 매우 제한적인 공급원을 갖는다. 악성 종양, 선천성 대사 장애, 혈액소병증 및 면역결핍증을 포함하는 다양한 질환의 치료에서 이들의 중요성 때문에, 다양한 HLA 유형의 줄기세포의 충분한 공급원을 개발하는 것은 매우 유리할 것이다.
충분한 수량의 사람 줄기세포를 얻는 것은 여러 이유로 문제되어 왔다. 첫째, 성인 조직에서 정상적으로 생성되는 줄기세포 집단의 분리는 기술적으로 어렵고, 부분적으로는 혈액 또는 조직에서 확인된 극도로 제한된 양으로 인해 비용이 많이 든다는 것이다. 둘째, 낙태된 태아를 포함하는 태아 또는 배아 조직으로부터 이들 세포의 조달은 윤리적 관심을 고조시켰다. 따라서, 배아 또는 태아 조직으로부터 조달된 세포의 사용을 요하지 않는 대안적인 공급원이 줄기세포의 임상적 사용에서의 추가 진행을 위해 필수적이다. 그러나, 줄기세포, 특히 사람 줄기세포의 생육가능한 대안적 공급원이 거의 없어서 공급이 제한되어 있다. 또한, 예를 들어, 제공자(donor) 피검체 또는 환자로부터 세포 또는 조직을 수거하고, 시험관 내에서 세포를 배양 및/또는 증폭시키고 절단하는 등의 과정을 포함하여, 치료 및 연구 목적으로 충분한 양의 대안적 공급원으로부터 줄기세포를 수거하는 것은 일반적으로 노동 집약적이다.
예를 들어, 미국 특허 5,486,359호에는 중간엽 세포 계열의 전구체로서 역할하는 골수로부터 유래한 사람 중간엽 줄기세포(HMSC) 조성물이 기술되어 있다. 균질한 HMSC 조성물은 조혈 세포 또는 분화된 중간엽 세포 중 어느 하나와 관련된 마 커를 함유하지 않는 유착 골수 또는 골막 세포의 포지티브한 선택에 의해 얻어진다. 중간엽 줄기세포와 관련된 특징을 나타내는 분리된 중간엽 세포 집단은 분화없이 배양 중에 재생되는 능력을 지니며, 손상된 조직 위치에서 시험관 내에 도입되거나 생체 내에 위치되는 경우에 특정 중간엽 계보로 분화되는 능력을 갖는다. 그러나, 그러한 방법의 단점은, 이들이 우선적으로, 후속하여 HMSC를 분리시키기 위해 사람 제공자로부터 골수 또는 골막 세포를 수거하는 데 있어 침습적이고 고통스러운 과정을 요한다는 점이다.
PCT 공개공보 WO 00/73421호는, 분리되고 배양되고 미래의 사용을 위해 동결 보존되거나 분화가 유도된 운반 중인 태반으로부터 유래한 사람 양막 상피 세포를 기술하고 있다. 양막 상피 세포는 표준 세포 분리 기법에 따라 양막으로부터 분리된다. 이들 세포는 다기능성이며, 각막 표면 상피 또는 질 상피와 같은 상피 조직으로 분화할 수 있다. 그러나, 이러한 방법의 단점은, 이들이 노동 집약적이며 줄기세포 수율이 매우 낮다는 것이다. 사실상, 전형적인 치료 또는 연구를 목적으로 충분한 수의 줄기세포를 얻기 위해서는, 양막 상피 세포가 먼저 양막으로부터 분리된 후에 시험관 내에서 배양되고 증폭되어야 한다.
제대혈(Umbilical cord blood, UCB)은 조혈 전구 줄기세포의 공지된 대안적 공급원이다. 제대혈로부터의 줄기세포는 조혈 복원, 골수에서 사용된 치료 과정 및 다른 관련된 이식(참조: 예를 들어, 미국 특허 제 5,004,681호 및 5,192,553호)을 위해 일반적으로 동결 보존된다. 제대혈의 회수를 위한 통상적인 기법은, 태반으로부터 제대혈을 배출시키기 위해 중력의 도움을 받아 사용되는 주사 또는 캐뉼 러의 사용에 기초하고 있다(참조: 예를 들어, 미국 특허 5,004,681호, 5,192,553호, 5,372,581호 및 5,415,665호). 주사 또는 캐뉼러를 일반적으로 제대 정맥 내에 위치시키고 태반으로부터 제대혈을 배출시키는 것을 보조하도록 태반을 부드럽게 마사지한다. 그러나, 제대혈로부터 줄기세포의 조달에 있어서 주요한 제한은 수득된 제대혈의 용량이 흔히 불충분했다는 것이며, 이로부터 이식 후에 골수를 효과적으로 재생시키는데 불충분한 수의 세포가 생성된다는 것이다.
줄기세포는 악성 종양, 유전 질환, 혈색소병증 및 면역결핍증을 포함하는 다양한 질환 및 질병의 치료에 사용할 수 있다. 그러나, 제대혈로부터의 줄기세포는 이들을 수거하는데 있어서의 제한으로 인해 공급이 과도하게 부족하며, 특히 성인 환자를 치료하는데 사용되는 경우에 제대혈로부터 일반적으로 수거된 세포의 수가 불충분하며 대규모화하는 경우에 과도한 비용이 소요된다. 그 자체로, 이식 후에 골수를 효과적으로 복원하는데 충분한, 충분한 수의 조혈 줄기세포를 함유하는 제대혈 조성물이 당업계에서는 강력히 요구되고 있다. 또한, 당업계에서는 그러한 제대혈 조성물을 제조하는 방법, 및 치료적 목적으로 상기 조성물을 사용하는 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구사항 및 기타 요구사항을 충족시킨다.
본 발명의 간단한 요약
본 발명의 제대혈(UCB) 조성물은 UCB 유닛으로부터 실질적으로 혈장은 제거되나 적혈구(RBC)는 비제거된 유리한 특징을 보유하는, 즉 혈장은 제거되나 적혈구는 제거되지 않는 조성물이다. 이러한 UCB 유닛은, 혈장 제거와 조혈 줄기세포의 동결 보존, 선별, 동결 및/또는 이식을 결합시켜, 처리 후 세포 회수 및 동결 후 주입 세포 용량을 최대화시킴으로써 전혈(whole blood) 또는 RBC-제거된 UCB 유닛에 대해 우수한 임상적 결과를 제공하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 UCB 조성물을 투여함으로써 조혈 체계와 연관된 광범위한 악성 질환 및 양성 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
일 양태에서, 본 발명은 적어도 부피당 약 50%의 적혈구 및 항응고제를 포함하는, 혈장이 실질적으로 제거되고 적혈구는 제거되지 않는 제대혈(UCB) 조성물을 제공한다. 바람직하게는, UCB 조성물은 부피당 적어도 약 65%의 적혈구를 포함한다. 특정 예에서, UCB 조성물은 부피당 약 0 내지 약 30%의 혈장, 바람직하게는 약 10 내지 약 30%의 혈장을 포함한다.
일 구체예에서, UCB 조성물은, 예를 들어 조혈 줄기세포를 포함하는 줄기세포를 포함한다. 다른 구체예에서, UCB 조성물은 부피당 약 5 내지 약 40%의 항응고제, 바람직하게는 약 5 내지 약 20%의 항응고제를 포함한다. 일반적으로, 항응고제는 시트르산, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 덱스트로스 및/또는 아데노신을 함유한다. 바람직하게는, 항응고제는 이들 성분 모두(즉, CPDA)를 함유한다.
다른 구체예에서, UCB 조성물은 동결방호제(cryoprotectant)를 추가로 포함한다. 바람직하게는, UCB 조성물은 부피당 약 5 내지 약 15%의 동결방호제를 포함한다. 특정 예에서, 동결방호제는 디메틸 설폭사이드(DMSO)이다. 특정의 다른 예에서, 동결 보존제는 DMSO와 젠트란(Gentran) 40 또는 DMSO와 히드록시에틸 전분(HES)의 혼합물이다. 바람직한 일 구체예에서, DMSO의 최종 농도가 약 5 내지 약 10%가 될 때까지 동결방호제가 용액으로서 첨가된다.
본 발명의 다른 구체예에서, UCB 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 보유한다:(1) 적어도 약 0.4 ×106 개 RBC/㎕(예를 들어, 약 0.4 ×106 내지 약 8 ×106 RBC/㎕), 바람직하게는 적어도 약 3.2 ×106 개 RBC/㎕, 더욱 바람직하게는 적어도 약 3.8 ×106 개 RBC/㎕에 달하는 적혈구(RBC) 농도; (2) 약 0.5 ×109 개 내지 약 5 ×109 개 RBC, 바람직하게는 약 1 ×109 개 내지 약 2.5 ×109 개 RBC에 달하는 RBC 수; (3) 약 3 ×103 개 내지 70 ×103 개 WBC/㎕, 바람직하게는 약 15 ×103 개 WBC/㎕에 달하는 백혈구(WBC) 농도; (4) 적어도 약 20 ×107 개 WBC(예를 들어, 약 20 ×107 개 내지 약 500 ×107 개 WBC), 바람직하게는 적어도 약 90 ×107개 WBC에 달하는 WBC 수; (5) 약 1 ×104 개 내지 약 1 ×108개 CD34+ 세포, 바람직하게는 약 1 ×106 개 내지 약 5 ×107 개 CD34+ 세포에 달하는 CD34+ 세포 수; (6) 약 0.018 내지 약 4.3%, 바람직하게는 약 0.15 내지 약 1.8%에 달하는 WBC 분획 중의 CD34+ 세포의 비율; (7) 약 20 ×107 개 내지 약 500 ×107 개의 유핵세포, 바람직하게는 약 90 ×107 개 내지 약 300 ×107 개 유핵세포에 달하는 총 유핵세포 수; 및 (8) 약 0.18 내지 약 1.8%, 바람직하게는 약 0.54%에 달하는 세포 분획 중의 유핵세포의 비율. 통상의 기술자는 CD34+ 세포 수가 이용된 특정 분석법에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 특정 예에서, UCB 조성물은 동결방호제를 첨가하기 전에 상기 기술된 특징 중 하나 이상을 보유한다. 바람직하게는, UCB 조성물이 동결방호제를 첨가시킨 후 상기 기술된 특징들 중 하나 이상을 지닌다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 농도가 적어도 약 3.2 x 106개 적혈구/㎕인, 부피당 약 50% 이상의 적혈구 및 항응고제를 포함하는 제대혈(UCB) 조성물을 제공하고, 여기서 혈장은 실질적으로 제거되나 적혈구는 제거되지 않는다. 바람직하게는, UCB 조성물이 부피당 적어도 약 65%의 적혈구를 포함한다. 특정 예에서, UCB 조성물은 부피당 약 0 내지 약 30%의 혈장을 포함하고, 바람직하게는 부피당 약 10 내지 약 30%의 혈장을 포함한다.
일 구체예에서, UCB 조성물은 예컨대 조혈 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, UCB 조성물은 부피당 약 5 내지 약 40%의 항응고제를 포함하고, 바람직하게는 부피당 약 5 내지 약 20%의 항응고제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, UCB 조성물은 동결방호제를 추가로 포함한다. 바람직하게는, UCB 조성물이 부피당 약 5 내지 약 15%의 본원에 기술된 임의의 동결방호제 또는 이의 혼합물(예컨대, DMSO 및 젠트란(Gentran) 40의 혼합물)을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, UCB 조성물은 동결방호제를 첨가시키지 전에 및/또는 바람직하게는 그 이후에 상기 기술된 특징들(예컨대, 적어도 약 3.8 x 106 개 RBC/㎕ 등) 중 하나 이상을 지닌다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물 피검체(예컨대, 인간)에게 본원에 기술된 유효량의 혈장-제거된 UCB 조성물을 투여함에 의해 악성 질병(예컨대, 혈액 암) 또는 양성 질병 또는 질환(예컨대, 조혈계와 관련된 질병 또는 질환)을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 예에서, 인간은 약 50kg을 초과하는 체중을 지닌다(즉, 성인 환자). 다른 특정 예에서, 인간은 약 50kg 미만의 체중을 지닌다(즉, 소아 환자).
일 구체예에서, 악성 질병은 제한 없이 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 골수형성이상 질환, 소아 만성 골수 백혈병 및 비-호지킨 림프종을 포함하는 혈액암이다. 또 다른 구체예에서, 양성 질환 및 질병은 조혈계와 관련되며, 혈색소병증, 골수 기능상실 증후군, 면역 결핍, 대사병/축적병, 호중구 질병, 혈소판 질환, HIV 감염과 같은 바이러스 감염, 및 자가면역 질환을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 혈색소병증이 지중해빈혈증(예컨대, 수혈-의존성 지중해빈혈증, 대지중해빈혈증 등)이거나 낫적혈구병이다. 본 발명의 혈장-제거된 제대혈 조성물로 예방 또는 치료하기에 적합한 악성 질병 및 조혈계와 관련된 양성 질병의 추가의 예가 하기에 기술된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 조혈 질환의 치료 또는 치료적 이식을 위해 포유동물 피검체에게 투여되는 혈장-제거된 UCB 조성물은 하기 우수한 임상적 성과 중 하나 이상을 제공한다: (1) 전 제대혈 또는 적혈구-제거된 제대혈에 비해 호중구 이식의 누적 빈도 증가; (2) 전 제대혈 또는 적혈구-제거된 제대혈에 비해 혈소판 이식의 누적 빈도 증가; (3) 전 제대혈 또는 적혈구-제거된 제대혈에 비해 호중구 이식 속도의 증가; (4) 전 제대혈 또는 적혈구-제거된 제대혈에 비해 혈소판 이식 속도의 증가; (5) 전 제대혈, 적혈구-제거된 제대혈, 골수 또는 말초혈 줄기 세 포에 비해 무병생존률의 증가; (6) 전 제대혈, 적혈구-제거된 제대혈, 골수 또는 말초혈 줄기 세포에 비해 이식-관련 사망률의 감소; (7) 전체 제대혈, 적혈구-제거된 제대혈, 골수 또는 말초혈 줄기 세포에 비해 전체 생존률의 증가; 및 (8) 골수 또는 말초혈 줄기 세포에 비해 급성 및 만성 이식편 대 숙주 질병의 빈도 감소. 본원에서 사용된 대로, 상기 기술된 임상적 성과 중 하나에서의 증가 또는 감소는 전 제대혈, 적혈구-제거된 제대혈, 골수 및/또는 말초혈 줄기 세포에 비해 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 차이를 의미한다. 바람직하게는, 포유동물 피검체에게 투여되는 혈장-제거된 UCB 조성물이 상기 기술된 임상적 성과들 중 적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그 이상을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 혈장-제거된 UCB 조성물을 다중 용량으로서 포유동물 피검체에게 투여한다. 예를 들어, 복합 용량(multiple dose)은 더블 제대혈 유닛 용량, 삼배 제대혈 유닛 용량 등일 수 있다. 바람직하게는, 복합 용량이 단일 용량에 비해 상기 포유동물 피검체에서의 재발률을 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, 혈장-제거된 제대혈 조성물을 HLA 매칭되거나 미스매칭되거나 일배수동종인 골수, 말초혈 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포와 함께 투여한다.
혈장-제거된 제대혈 조성물은 해동되고 포유동물 피검체에게 투여되는 중간에 세척되거나 세척되지 않을 수 있다. 바람직하게는, 조성물을 세척하지 않는다. 그러나, 당업자는 포유동물 피검체가 손상된 신장 기능을 지니거나 저체중인 경우에 조성물이 세척될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 예에서, 조성물은 해동되고 포유동물 피검체에게 투여되는 중간에 희석된다. 바람직하게는, 조성물이 포유동물 피검체로의 주입에 의해 투여된다.
여전히 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항응고제를 함유하는 UCB 샘플로부터 혈장 부피를 제거함에 의해 혈장-제거된 제대혈(UCB) 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
UCB 샘플은 신생아 및/또는 산모와 같은 제공자로부터 수집되는 것이 통상적이다. 일 구체예에서, 혈장-제거된 제대혈 조성물은 약 5 내지 약 40 부피%의 항응고제를 포함하고, 바람직하게는 약 5 내지 약 20 부피%의 항응고제를 포함한다. 일반적으로, 항응고제는 시트르산, 나트륨 시트레이트, 나트륨 포스페이트, 덱스트로오스, 및/또는 아데노신을 함유한다. 바람직하게는, 항응고제가 이들 성분을 모두 함유한다(즉, CPDA).
또 다른 구체예에서, 이 방법은 동결방호제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 혈장-제거된 제대혈 조성물이 부피당 약 5 내지 약 15%의 동결방호제를 포함한다. 특정 예에서, 동결방호제는 디메틸 설폭사이드(DMSO)이다. 다른 특정 예에서, 동결방호제는 DMSO 및 젠트란 40 또는 DMSO 및 히드록시에틸 전분(HES)의 혼합물이다. 바람직한 구체예에서, 동결방호제를 DMSO의 최종 농도가 약 5 내지 약 10%가 될 때까지 용액으로서 첨가한다.
또 다른 구체예에서, 이 방법은 동결방호제를 함유하는 혈장-제거된 제대혈 조성물을 약 4℃부터 약 -50℃까지 1분에 약 -1℃의 속도로 동결시킨 다음, 약 -50℃부터 약 -90℃까지 1분에 약 -10℃의 속도로 동결시키는 단계를 추가로 포함한 다. 이 방법은 동결된 조성물을 약 -135℃ 미만의 온도, 바람직하게는 약 -150℃ 미만의 온도에서 저장하는 단계를 추가로 포함한다. 이 방법은 동결된 조성물을 해동시키는 단계 및 해동된 조성물을 포유동물 피검체에게 투여하기 전에 이를 세척하거나 세척하지 않는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 예에서, 이 방법은 냉동보존 이전 또는 이후에 줄기 세포의 개체군을 생체외 팽창시키는 것을 추가로 포함한다. 다른 특정 예에서, 이 방법은 혈장-제거된 제대혈 조성물을 포유동물 피검체에게 투여하는 것과 같은 후속적인 단계를 진행하기 전에, 이것이 특정 선별 기준에 부합하는지를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 먼저 제공자로부터 줄기 세포 공급원을 수집함에 의해, 조혈 줄기 세포와 같은 살아 있는 줄기 세포를 수집하는 방법을 제공한다. 줄기 세포 공급원을 항응고제와 혼합시킨 후, 줄기 세포 공급원의 부피를 약 15℃ 내지 약 26℃의 온도에서 원심분리에 의해 감소시킨다. 원심분리 후에 혈장과 같은 액체를 줄기 세포 공급원으로부터 제거하여, 감소된 부피를 지니는 농축된 줄기 세포 공급원을 남긴다. 농축된 줄기 세포 공급원을 동결 용기로 옮기고 약 2℃ 내지 약 8℃로 약 30분 내지 약 60분 동안 냉각시킨다. 약 50% DMSO 및 저분자량 폴리사카라이드의 1:1(부피/부피) 용액의 혼합물을 포함하는 동결방호제 용액을 제조하고 약 2℃ 내지 약 8℃에서 유지시킨다. 동결방호제 용액을 동결 용기에서 농축된 줄기 세포 공급원에 첨가한다. 동결방호제를 첨가하는 동안, 동결 용기의 농축된 줄기 세포 공급원을 이동시켜 동결방호제 용액을 첨가하자마자 혼합을 달성한다. 예를 들어, 진동 플랫폼상에서 농축된 줄기 세포 공급원을 동결 용기에 정 위시킴에 의해 동작이 제공된다. 농축된 줄기 세포 공급원을 함유하는 동결 용기는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 유지된다. 동결방호제는 프로그래밍된 주사기 펌프에 의해 첨가되는 것이 바람직하다. 이렇게 하여 약 5 내지 약 15 부피%, 바람직하게는 약 5 내지 약 10 부피%의 DMSO 농도를 지니는 동결방호제-줄기 세포 혼합물이 형성된다.
특정 예에서, 수집된 살아 있는 줄기 세포를 저장한다. 비-제한적인 예로서, 상기 기술된 방법에 따라 제조된 동결 용기 중의 동결방호제-줄기 세포 혼합물을 약 2℃ 내지 약 8℃로 미리-냉각된 알루미늄 저장 카세트에 정위시킬 수 있다. 알루미늄 저장 카세트를 이후 조절된 속도 동결기에 위치시키고 조절된 속도로 동결시킬 수 있다. 통상적으로, 이것은 동결 용기에 넣은 지 약 10분 이내에 발생하여야 한다. 동결 후, 동결된 동결방호제-줄기 세포 혼합물을 지니는 동결된 동결 용기를 살아 있는 줄기 세포의 저장을 위해 조절된 속도 동결기로부터 액체 질소 탱크로 옮길 수 있다.
적합한 줄기 세포 공급원으로는 성체 줄기 세포 공급원, 태아 줄기 세포 공급원, 배아 줄기 세포 공급원, 태반혈, 제대혈, 말초혈, 골수 및 태아 간이 있으나 이로 제한되지 않는다. 특정 예에서, 줄기 세포 공급원은 태반혈 및/또는 제대혈이다. 일부 구체예에서, 줄기 세포 공급원은 유핵세포를 포함하고, 약 95%를 초과하는 유핵세포가 농축된 줄기 세포 공급원에 존재한다.
다른 구체예에서, 항응고제는 시트레이트, 포스페이트 및 덱스트로오스(CPD)를 포함한다. 추가의 구체예에서, 농축된 줄기 세포 공급원을 함유하는 동결 용기 의 온도는 동결방호제를 첨가하는 동안, 예컨대 백을 아이스 팩으로 감쌈에 의해 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 유지된다. 특정 예에서, 동결방호제-줄기 세포 혼합물을 동결 전에 적어도 2개의 동결 용기에 나눈다.
줄기 세포 공급원-항응고제 혼합물은 통상적으로 약 15℃ 내지 약 26℃의 온도에서 저장된다. 줄기 세포 공급원-항응고제 혼합물은 이의 부피를 감소시키기 전에 이러한 방식으로 약 48시간 이내로 저장될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 동결방호제 용액을 약 2℃ 내지 약 8℃로 냉각시킨다. 특정 예에서, 저분자 폴라사카라이드 용액은 덱스트란을 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 조절된 속도 동결기로부터 액체 질소 탱크로의 운반은 약 10분 이내에 달성된다. 특정 예에서, 조절된 속도 동결기로부터 액체 질소 탱크로의 이동은 약 10초 이내에 달성된다.
추가의 구체예에서, 동결방호제-줄기 세포 혼합물은 유핵세포를 포함하고, 유핵세포의 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95%가 해동 후에 살아 있다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점 및 이의 바람직한 구체예가 이어지는 상세한 설명, 실시예 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 모든 환자에 대한 전체적인 결과를 도시한다. 도 1A는 모든 환자(n=106)에 대한 ANC500 이식 비조정된 누적 빈도를 도시한다; 도 1B는 모든 환자(n=89)에 대한 혈소판 20K 이식 비조정된 누적 빈도를 도시한다; 도 1C는 모든 환자(n=118)에 대한 첫해의 환자 생존률을 도시한다; 도 1D는 모든 악성 환자(n=85)에 대한 첫해의 무재발 생존률을 도시한다.
도 2는 경감(remission) 첫 번째 이식 환자 서브셋에 대한 결과를 도시한다. 도 2A는 경감(remission)/첫 번째 이식 환자(n=87)에 대한 ANC500 이식 비조정된 누적 빈도를 도시한다; 도 2B는 경감/첫 번째 이식 환자(n=72)에 대한 혈소판 20K 이식 비조정된 누적 빈도를 도시한다; 도 2C는 경감/첫 번째 이식 환자(n=98)에 대한 첫해의 환자 생존률을 도시한다; 도 2D는 경감/첫 번째 이식 환자(n=67)에 대한 첫해의 무-재발 생존률을 도시한다.
도 3은 NMDP, 비-NMDP 미국환자, 및 비-NMDP 대만 환자 사이의 비교를 도시한다. 도 3A는 호중구(ANC500) 생착 누적 빈도를 도시한다; 도 3B는 혈소판 20K 생착 누적 빈도를 도시한다; 도 3C는 재발율을 도시한다; 도 3D는 환자 사망율 및 전체 생존율을 도시한다.
도 4는 유아, 성인 및 단일 유닛 이식 환자 사이의 비교를 도시한다. 도 4A는 호중구(ANC500) 생착 누적 빈도를 도시한다; 도 4B는 혈소판 20K 생착 누적 빈도를 도시한다; 도 4C는 재발율을 도시한다; 도 4D는 환자 사망율 및 전체 생존율을 도시한다.
도 5는 양성 또는 악성 질환을 앓고 있는 환자들 사이의 비교를 도시한다. 도 5A는 경감/첫 번째 이식 환자(n=87)에 대한 ANC500 이식 비조정된 누적 빈도를 도시한다; 도 5B는 경감/첫 번째 이식 환자(n=72)에 대한 혈소판 20K 생착 비조정된 누적 빈도를 도시한다; 도 5C는 경감/첫 번째 이식 환자(n=98)에 대한 환자 전체 생존률을 도시한다.
도 6은 세척되거나 비세척된 제대혈 유닛들이 이식되는 환자들 사이의 비교 를 도시하고 있다. 도 6A는 호중구(ANC500) 생착 누적 빈도를 도시한다; 도 6B는 혈소판 20K 생착 누적 빈도를 도시한다; 도 6C는 혈소판 50K 생착 누적 빈도를 도시한다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
본원에서 사용된 하기 용어는 달리 명시하지 않는 한 하기된 의미를 지닌다.
용어 "줄기 세포"는 무한시간 동안 분할하며 특화된 세포로 성장하는 능력을 지니는 어떠한 세포를 나타낸다. 줄기세포는 모든 배엽(즉, 외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로부터 유도된다. 줄기세포의 전형적인 공급원은 배아, 골수, 말초혈, 제대혈, 태반혈 및 지방조직을 포함한다. 줄기세포는 유기체에 대한 대부분의 조직을 생성시킬 수 있음을 의미하는 다능성 세포일 수 있다. 예를 들어, 다능성 줄기세포는 피부, 간, 혈액, 근육, 뼈, 등의 세포로 성장할 수 있다. 반면, 다능성(multipotent) 또는 성체 줄기세포는 전형적으로는 제한된 세포형으로 성장한다. 예를 들어, 조혈 줄기세포는 전형적으로는 림프구, 골수 및 적혈구 계통의 세포로 성장한다. 생세포(viable cell)는 살아있으며 종종 성장 및 분화할 수 있는 세포이다. 본 발명 분야의 전문가에게는, 예를 들어, 트립신 블루 염료를 배제시키는 능력에 의해서 세포의 생존을 측정하는 방법이 알려져 있다. 본원에서 사용된 용어 줄기세포는 달리 명시하지 않는 한 전구세포(progenitor cell)를 포함한다.
"유핵세포"는 핵, 즉, 염색체 DNA를 포함하는 기관을 지니는 세포를 나타낸다. 유핵세포는, 예를 들어, 백혈구 및 줄기세포를 포함한다. "비유핵세포"는 예 를 들어 성체 적혈구를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "혈장이 실질적으로 제거된" 및 "혈장-제거된"은 혈장이 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 초과하여 제거된 본 발명의 제대혈 조성물을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 혈장은 제대혈-항응고제 혼합물을 원심분리하고 혈장 분획으로부터 세포 분획을 분리함으로써 실질적으로 제거된다. 실질적인 제거 후에 남아있는 혈장량은 전형적으로는 부피당 약 0% 내지 약 30%, 바람직하게는 부피당 약 10% 내지 약 30%이다.
본원에서 사용된 용어 "적혈구 비제거된" 및 "적혈구가 제거되지 않은"은 적혈구가 약 30%, 25,%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로 제거된 본 발명의 제대혈 조성물을 나타낸다. 본 발명은 제대혈 유닛으로부터 적혈구를 제거하는 단계를 포함하지 않지만, 당업자라면 혈장 유닛를 제거시키는 단계 및/또는 어떠한 그 밖의 처리 단계가 소량의 적혈구를 제거할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
용어 "호중구 생착 속도"는 새롭게 이식된 골수에 의해서 생성된 새로운 면역체계가 얼마나 신속하게 작동하는지를 나타내며, 전형적으로는 수용 체중의 혈액 부피 당 밴드(band)와 호중구 수의 합으로 나타낸다. 바람직하게는, 환자는 호중구 생착 전에 면역약화된다. 호중구 생착에 대한 속도 또는 시간이 짧으면 짧을수록 환자에게 더욱더 유리하다. 유사하게, 용어 "혈소판 생착 속도"는 새롭게 생착된 골수가 얼마나 신속하게 응고에 중요한 혈소판을 생산하는데 작동하는지를 나타낸다. 혈소판 생착 전에, 환자는 공여자의 혈소판의 수혈에 의존하여 이들은 어떠 한 출혈 문제가 없다. 혈소판 생착에 대한 속도 또는 시간이 짧으면 짧을수록 더욱더 환자에게 유리하다.
용어 "생착 누적 빈도"는 특정의 조혈세포 계통, 예를 들어, 호중구 또는 혈소판의 점진적인 강한 생산을 보이는 이식체의 백분율을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "제대혈 유닛" 및 "UCB 유닛"는 단일의 공여자로부터 수거된 제대혈의 양을 나타낸다. 본 발명의 UCB 조성물은 전형적으로는 하나의 UCB 유닛를 함유하지만, 다중 UCB 유닛, 예를 들어, 세포 용량을 추가로 증가시키기 위해서 환자에게 투여될 수 있는 이중 제대혈 유닛를 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "동결방호제(cryoprotectant)"는 동결동안 세포의 생존성을 증진시키는데 사용되는 작용제를 나타낸다. 동결방호제는 디메틸 설폭시드(DMSO), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 포름아미드, 및 히드록시에틸 전분(HES)을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 바람직하게는 저분자량의 폴리사카라이드, 예컨대, 덱스트란(예, 젠트란 40(Gentran 40))이 동결방호제 혼합물에 첨가될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 동결방호제 용액은 약 10:1 비의 DMSO 대 젠트란 40, 예컨대, 50% DMSO 대 5% 젠트란 40을 포함하며, 이는 제대혈과 항응고제 혼합물에 첨가되어 약 5% 내지 약 10% DMSO의 최종 농도를 제공한다.
본 발명의 혈장-감소된 제대혈 조성물의 "유효량"은 조혈체계와 연관된 악성 질환 또는 양성 질환에 요구된 효과, 예를 들어, 방지 또는 치료를 제공하기에 충분한 양이다.
본원에서 사용된 용어 "투여하는"은 어떠한 경로, 즉, 경구, 비내, 정맥내, 골내, 복강내, 근육내, 관절내, 뇌실내, 두개내(intracranial), 병변내, 기관내, 경막내, 피하, 진피내, 경피 또는 경점막 투여를 포함하지만 이로 제한되지는 않는 어떠한 경로에 의해서 본 발명의 혈장-제거된 제대혈 조성물의 전달을 나타낸다. 바람직하게는 환자는 본 발명의 방법에 따라서 제조된 하나, 둘, 셋, 또는 그 이상의 제대혈 유닛가 주입된다. 이중 제대혈 유닛와 같은 다중 제대혈 유닛은 동시 또는 연속적으로(예를 들어, 몇 분, 몇 시간, 또는 및 일의 과정으로) 환자에게 투여될 수 있다. 특정의 예에서, 본 발명의 혈장-제거된 제대혈 유닛은 병에 걸린 골수를 제거하는 골수제거, 세기 저하 또는 비-골수제거 치료법이나, 방사선 치료, 화학치료, 또는 그 밖의 방사선 노출로 숙주 골수를 제거한 후에 투여된다. 특정의 그 밖의 예에서, 본 발명의 혈장-제거된 제대혈 유닛은 병합 치료로서 골수 및/또는 말초혈 세포와 동시에 또는 연속적으로 동시-투여된다.
II. 일반적인 개요
다른 조혈줄기세포의 공급원과는 달리, 제대혈은 줄기세포의 수거를 위해 존재하는 전체 세포의 수가 제한되는 줄기세포 공급원이다. 반면, 골수 및 말초혈은 조혈줄기세포의 거의 무제한 공급원이다. 이러한 고유의 제한 때문에, 주어진 유닛의 제대혈의 전체 유핵세포 용량은 새로운 골수의 임상 결과, 예를 들어, 호중구 이식, 혈소판 이식, 및 확립에 가장 중요한 결정인자 중 하나이다. 백혈구 이식의 결핍은 작용성 면역체계의 결핍을 의미하기 때문에, 생착에 대한 충격은 그에 의해서 환자의 생존에 영향을 준다. 생착 실패시에, 환자는, 본인의 자가 골수를 회복하거나, 본인의 저장된 골수 또는 말초혈 줄기세포에 의해서 회복되거나, 다른 관 련 또는 비관련 줄기세포 이식이 수행되지 않는 한, 점진적으로 감염에 약화될 것이다.
1988년 내지 1994년 사이의 제대혈 이식 초기에는, 제대혈 유닛가 동결 보존되어 어떠한 부피의 감소 없이 전혈(whole blood) 유닛로 보관되었다. 예를 들어, 2,257 유닛가 1993년 내지 1994년 사이에 뉴욕혈액센터(New York Blood Center(NYBC))에서 전혈 유닛로 보관되었다. 그 결과, 그 당시 수행된 제대혈 이식은 전혈 유닛를 사용하였다. 사실, 2003년 현재로서, NYBC는 460건의 그러한 전혈 유닛를 이식하여 저장되는 상이한 형태의 유닛에 대한 가장 높은 이용율을 나타냈다.
저장 공간에 대한 과도한 비용으로 인해서, NYBC 제대혈 은행은 1994년에 최종 부피을 약 20㎖가 되게 하기 위해서 헤스판(Hespan: 헤타전분 또는 히드록시에틸 전분)을 첨가한 다음 원심분리하여 과량의 적혈구 및 혈장을 제거시킴으로써 전혈 유닛의 동결 부피을 감소시키는 방법을 개발하였다. 또 다른 평판이 좋은 기술은 피콜-침강 구배 원심분리(Ficoll-sedimentation gradient centrifugation)를 이용하여 적혈구 및 호중구를 제거함으로써 단핵세포를 정제함을 포함한다. 그러나, 이들 기술은 현저한 수의 조혈줄기세포가 적혈구 덩어리에 포집되고 적혈구와 함께 제거되기 때문에 그러한 조혈줄기세포를 충분히 회수하지 못한다. 사실, 가공 후의 전형적인 조혈줄기세포 회수는 헤스판 방법의 경우에 70 내지 75%이고, 피콜 방법의 경우에는 단지 25 내지 50%이다.
본 발명은, 부분적으로는, 본원에 기재된 방법에 따라서 제대혈 유닛를 가공 하는 것이 상기된 헤스판 및 피콜과 같은 기술의 적용성을 심각하게 제한하는 유핵세포 손실도를 최소화한다는 놀라운 발견을 기초로 한다. 사실, 본 발명의 방법은 가공, 동결 보존 및 해동 후에 더 많은 수의 생존 줄기세포를 함유하여 환자에게 주입을 위한 더 많은 평균 세포 용량을 유도하는 제대혈 조성물을 제공하며, 적혈구-제거된 또는 전혈 유닛에 비해서 현저하게 개선된 임상 결과가 혈장-제거된 제대혈 유닛로 달성된다는 놀라운 발견을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 해동된 제대혈 조성물을 환자에게 투여하기 전에 세척단계에 가하지 않는 것이 더 높은 생착 누적 빈도 및 호중구 및 혈소판 둘 모두에 대한 보다 신속한 생착 속도를 유도한다는 놀라운 발견을 기초로 한다. 이와 같이, 본원에 기재된 제대혈 유닛를 가공하는 방법 및 생성되는 혈장-제거된, 비-적혈구-제거된 조성물은 다른 공지된 제대혈 은행으로부터 얻은 제대혈 생성물에 비해서 더 우수한 생착율 및 더 높은 생존율을 제공하고 있다.
III. 제대혈의 혈장-제거 처리
본 발명의 제대혈(UCB) 조성물은 UCB 유닛로부터 실질적으로 제거되는 혈장 및 UCB 유닛로부터 제거되지 않는 적혈구(RBC)을 지니는 독특한 특징을 보유한다. 그러한 UCB 유닛은 처리후 세포 회수 및 해동후 주입 세포 용량을 최대로 함으로써 우수한 임상 결과를 제공하도록 혈장 제거을 조혈줄기세포의 동결 보존, 선택, 해동 및/또는 이식과 조합하는 방법에 의해서 제조될 수 있다. 본 발명의 UCB 조성물을 투여함으로써 조혈체계와 연관된 광범위하게 다양한 악성 질환(예, 혈액종양) 및 양성 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
한 측면에서, 혈장-제거된, RBC-비제거된 UCB 유닛은 이하 기재된 과정에 의해서 제조된다.
신생아 UCB가 수거 용기, 예컨대, 항응고제를 함유하는 멀티-백 혈액 수거 백내로 수거된다. 수거 용기는 전형적으로 약 0.1 내지 약 100㎖의 항응고제(예, 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100㎖)를 함유한다. 바람직하게는 수거 용기는 약 23㎖ 내지 약 35㎖의 항응고제를 함유한다. 항응고제의 비-제한적인 예는 시트레이트, 포스페이트, 덱스트로스, 및 아데노신 혼합물(CPDA), 시트레이트, 포스페이트 및 덱스트로스 혼합물(CPD), 및 산, 시트레이트 및 덱스트로스 혼합물(ACD)를 포함한다. 바람직하게는, 항응고제는 0.299%의 무수 시트르산, 0.263%의 데하이드레이트 시트르산나트륨, 0.222%의 일염기성 인산나트륨(일수화물), 3.19% 덱스트로스 및 0.0275%의 아데노신을 포함할 수 있는 CPDA이다. CPDA는 등장성이며 중성의 pH를 지녀서, 항응고제 대 혈액의 비가 중요하지 않다. 그러나, 당업자라면 수거 용기내의 항응고제의 조성 및/또는 부피가 공여자로부터 수거된 제대혈의 양에 좌우될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
수거된 UCB는 출생후 약 48시간까지의 동결 보존을 위해서 바람직하게는 약 43시간 이내에 UCB 처리 실험실로 전달된다. 그러나, 출생 후 약 72시간까지의 동결 보존이 또한 허용되는 결과를 유도할 수 있다.
수거 백을 칭량하고 전체 중량에서 수거백의 중량과 항응고제를 감함으로써 UCB 수거 부피가 측정된다. 백 내의 부피는 UCB의 부피과 항응고제의 부피에 의해 서 결정된다.
전체 제대혈이 이시점에서 검정되어 전체혈구수를 측정한다. 가공전 적혈구용적율(즉, 적혈구 부피 백분율)과 항응고제는 전형적으로 샘플의 95% 이상에서 약 20% 내지 약 60%의 범위를 지닌다. 적혈구 농도는 일반적으로 약 2 내지 약 10 x 106/㎕이며, 백혈구 농도는 일반적으로 약 1 내지 약 30 x 106/㎖이다.
UCB 유닛은, 예를 들어, 3-백 수거 혈액 백으로 원심분리되어 상부 혈장 분획으로부터 세포 분획을 분리한다.
상부 혈장 부분은 제 2백 내로 제거되고, 이어서 밀봉된다. 특정의 예에서, 나머지 대부분의 세포 분획이 60cc를 초과하는 경우, 생성물은 두 분획(예, 최초 백 및 제 3 백으로), 즉, 자체 수거/전달 백에 각각 분할할 수 있다. 혈장 제거 후에, 적혈구용적율(hematocrit(HCT))과 UCB 유닛의 RBC 농도 둘 모두가 전혈(whole blood) 또는 적혈구-제거된 유닛에 비해서 약 1.2 내지 약 3 배(평균 약 1.6 내지 약 1.8배; 중간=약 1.7 내지 약 1.8배) 증가한다(참조, 표 1).
표 1. 항응고제를 함유하지만 동결방호제는 함유하지 않는 혈장-제거된 유닛, 전혈 유닛 및 적혈구-제거된 제대혈 유닛의 비교
Figure 112007095124372-PCT00001
TW = 대만으로부터의 샘플; US = 미국으로부터의 샘플. 처리된 혈장-제거된 샘플은 99%의 적혈구 백혈구, 및 CD34+ 세포의 회수율을 기본으로 하는데, 그 이유는 약 0.1% 미만이 혈장 분획에서 발견되기 때문이다. 처리된 RBC-제거된 샘플은 최초 전혈의 20%의 적혈구 수율 및 적혈구 제거 후의 전혈과 유사한 적혈구 농도를 기본으로 한다. 처리된 RBC-제거된 샘플은 또한 백혈구 및 CD34+ 세포의 75%의 평균 회수율 및 평균 75% 부피 감소를 기본으로 한다.
각각의 수거/전달 백내의 생성물은 이어서 무균의 도킹 장치를 통해서 하나의 동결 백(예, CryoCyte® 백)에 옮긴다. 전형적으로는 UCB 유닛은 혈장 제거 및 미리 냉각된(즉, 약 4℃) 동결방호제의 첨가 후에 약 75cc의 대략적인 최대 부피으 로 하나의 동결 백에서 동결 보존된다. 그러나, 일부 UCB 유닛은 두 개의 백으로, 예를 들어, 약 150cc의 대략적인 합한 최대 부피으로 분할된다.
혈장-제거된 UCB/항응고제 혼합물은 이어서 하나 이상의 동결방호제의 첨가 전에 약 4℃로 냉각된다. 전형적으로는 용액 형태의 동결방호제는 UCB/항응고제 부피의 약 25% 내지 약 50%의 양으로 첨가된다. 예를 들어, 혈장-제거된 샘플중의 UCB/항응고제 부피가 60㎖인 경우, 동결방호제 용액의 부피는 15㎖일 수 있다. 그 결과, UCB 유닛은 일반적으로 부피당 약 5% 내지 약 15%의 동결방호제, 예를 들어, 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 또는 15부피%의 동결방호제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 동결방호제 용액은 약 50% DMSO 및 약 5% 젠트란 40(Gentran 40)(즉, 약 10:1 비의 DMSO 대 젠트란 40)의 혼합물을 포함하여 약 5% 내지 약 10%의 최종 DMSO 농도를 제공한다. DMSO/젠트란 40 동결방호제 용액은 UCB/항응고제 혼합물에 약 5% 내지 약 10%의 최종 DMSO 농도를 달성하도록 회전기상의 아이스 팩 사이에 동결 백을 지니는 주사 펌프에 의해서 분당 약 0.75㎖의 속도로 첨가될 수 있다. 표 2에 도시된 바와 같이, 항응고제 및 동결방호제 둘 모두를 함유하는 혈장-제거된 UCB 유닛은 전혈 또는 적혈구-제거된 유닛에 비해서 더 높은 적혈구용적율(HCT) 및 RBC 농도(즉, 약 1.6배 이상)를 지닌다.
표 2. 항응고제와 동결방호제를 함유하는 혈장-제거된 유닛, 전혈 유닛, 및 적혈구-제거된 제대혈 유닛의 혈구수 비교(25부피% DMSO)
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TW = 대만으로부터의 샘플; US = 미국으로부터의 샘플. 처리된 혈장-제거된 샘플은 99%의 적혈구 백혈구, 및 CD34+ 세포의 회수율을 기본으로 하는데, 그 이유는 약 0.1% 미만이 혈장 분획에서 발견되기 때문이다. 처리된 RBC-제거된 샘플은 최초 전혈의 20%의 적혈구 수율 및 적혈구 제거 후의 전혈과 유사한 적혈구 농도를 기본으로 한다. 처리된 RBC-제거된 샘플은 또한 백혈구 및 CD34+ 세포의 75%의 평균 회수율 및 평균 75% 부피 감소를 기본으로 한다.
동결방호제 부재하의 혈장-제거된 UCB/항응고제 혼합물의 처리후 적혈구용적율은 전형적으로는 약 20 내지 약 100%, 바람직하게는 약 40% 내지 약 100%, 더욱 바람직하게는 약 50% 내지 약 100%의 범위, 예를 들어, 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상이다. 이와 같이, 본 발명의 처리된 UCB 유닛은 전혈 UCB 유닛(즉, 40%) 및 히드록시에틸 전분(HES) 적혈구-제거된 UCB 유닛(즉, 40%) 둘 모두에 대한 적혈구 용적율 보다 더 높은 적혈구 용적율을 지닌다(참조, 표 1).
동결방호제를 함유하는 혈장-제거된 UCB/항응고제의 처리후 적혈구 용적율은 전형적으로 약 16% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 32% 내지 약 80%, 더욱 바람직하게는 약 40% 내지 약 80%, 가장 바람직하게는 약 50% 내지 약 80%의 범위, 예를 들어, 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 및 80%이다. 이와 같이, 바람직한 구체예에서 동결방호제를 함유하는 본 발명의 처리된 UCB 유닛은 전혈 UCB 유닛(즉, 32%) 및 HBS 적혈구-제거된 UCB 유닛(즉, 32%) 둘 모두에 대한 적혈구용적율 보다 더 높은 적혈구용적율을 지닌다(참조, 표 2)
동결방호제 부재하의 혈장-제거된 UCB/항응고제 혼합물에 대한 처리후 적혈구 농도는 전형적으로 약 0.5 내지 약 10 x 106㎕, 바람직하게는 약 3 내지 약 10 x 106㎕, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 10 x 106㎕의 범위, 예를 들어, 약 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10 x 106㎕이다. 이와 같이, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 처리된 UCB 유닛은 전혈 UCB 유닛(즉, 3.5 x 106㎕) 및 HES 적혈구-제거된 UCB 유닛(즉, 3.5 x 106㎕) 둘 모두에 대한 적혈구 농도 보다 더 높은 적혈구 농도를 지닌다(참조, 표 1).
동결방호제를 함유한 혈장-제거된 UCB/항응고체 혼합물에 대한 처리후 적혈구 농도는 전형적으로는 약 0.4 내지 약 8 x 106㎕, 바람직하게는 약 2.4 내지 약 8 x 106㎕, 더욱 바람직하게는 약 3.2 내지 약 8 x 106㎕ 범위, 예를 들어, 약 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 또는 8 x 106㎕이다. 이와 같이, 바람직한 구체예에서, 동결방호제를 함유하는 본 발명의 처리된 UCB 유닛은 전혈 UCB 유닛(즉, 2.8 x 106㎕) 및 HES 적혈구-제거된 UCB 유닛(즉, 2.8 x 106㎕) 둘 모두에 대한 적혈구 농도 보다 더 높은 적혈구 농도를 지닌다(참조, 표 2).
동결방호제 부재하의 혈장-제거된 UCB/항응고제 혼합물에 대한 처리후 백혈구 농도는 전형적으로는 약 3 내지 약 90 x 106㎖범위, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90 x 106㎖이다. 바람직하게는, 처리 및 동결방호제 첨가 후의 백혈구 농도는 하나의 백 UCB 생성물에 대한 약 75cc의 동결 부피에서 약 10 x 106㎖ 초과, 예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 x 106㎖이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 혈장-제거된 UCB 유닛의 세포 농도는 전혈 유닛 보다 약 25%이상, 예를 들어 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상 높다.
UCB 유닛의 상기된 처리는 혈장 제거 및 전혈 또는 적혈구 제거 사이의 차이 에 부분적으로 원인이 된다. 유리하게는, 본 발명의 처리된 UCB 유닛은 낮은 혈장 부피을 지니고 더 높은 세포 농도 및 더 높은 적혈구용적율을 생성한다. 어떠한 특정의 이론으로 한정되는 것은 아니지만, 이들 성질중 하나 이상은 전혈 또는 적혈구-제거된 유닛에 비해서 개선된 임상 결과와 함께 증진된 동결 보존을 제공한다. 비-제한 예로서, 본 발명의 혈장-제거된 UCB 유닛은 뉴욕혈액센터(NYBC)로부터의 전혈 결과에 비해서 개선된 임상 결과를 제공한다.
본원에 기재된 혈장 제거 과정은 또한 UCB 유닛 적혈구 제거의 HES 또는 그 밖의 방법에 비해서 하기 이점을 지닌다: (1) 낮은 유핵세포 손실; (2) 낮은 CD34+ 세포 손실; (3) 낮은 콜로니 형성유닛 손실; (4) 실질적으로 높은 적혈구용적율; 및(5) 높은 세포 농도(즉, 적혈구를 포함). 또한, 더 큰 부피의 존재는 본 발명의 처리된 UCB 유닛가 해동 후 조작 기술을 견딜 수 있게 하는데, 그 이유는 전형적으로 더 적은 부피의 적혈구 제거 생성물(예, 25㎖)에 비해서 전체 생성물을 해동시키는데 소요되는 더 긴 시간 때문이다. 이와 같이, 상기 성질 중 하나 이상이 혈장-제거된 UCB 이식물을 수혈받은 환자에서 관찰된 우수한 임상 결과에 원인이 된다. 그러나, 본 발명의 혈장-제거된 UCB 유닛은 통상의 듀아(dewar) 액체 질소 탱크 또는 써모제니시스 코포레이션(ThermoGenesis Corp.)으로부터 제조된 바이오아치브(BioArchive®) 액체 질소 탱크에 저장되는지에 무관하게 뉴욕혈액센터(NYBC)로부터의 적혈구-제거된 결과에 비해서 개선된 임상 결과를 제공한다.
그런 다음, 항응고제 및 동결방호제 둘 모두를 함유하는 혈장-제거된 UCB 혼 합물은 약 4℃로부터 약 -50℃까지 분당 약 -1℃의 비통상적으로 프로그래밍된 플랫라인(flatline) 동결 곡선을 이용하여 동결된다. 이러한 동결 단계는 액체로부터 얼음으로의 조성물의 상전이로부터 발생하는 열(즉, 융해열)의 방출을 상쇄하기 위한 딥(dip) 부재하에 수행될 수 있다. 최초 동결 단계 후, 처리된 UCB 유닛은 약 -50℃ 로부터 약 -90℃로 분당 약 -10℃의 동결속도로 추가로 동결된다. 그 외 제대혈 은행(예를 들어, 세인트루이스 제대혈 은행)에서의 통상적으로 프로그래밍된 동결 곡선은 생성되는 융해열의 상쇄(compensation)에 대한 이론적 해석과 함께, 융해열에 대해 예상되는 온도 지점에서 딥을 지닌다. 그러나, 이러한 상쇄는 가끔 과상쇄되어, 분당 -5℃를 초과하는 가파른 냉각 속도를 발생시켜 세포를 사멸시킨다. 본원에 기술된 플랫라인 동결 곡선에서, 융해열은 상전이 전에 세포를 사멸시키지 않는 가파른 온도 상승을 야기시킨다. 또한, 분당 약 -1℃의 플랫라인 동결 곡선은 세포를 사멸시키는 가파른 냉각 속도를 발생시키지 않는다. 처리된 UCB 유닛은 액체 질소(예를 들어, 액체 및/또는 증기상)에서 통상적으로 약 -135℃, 바람직하게는 -150℃ 미만에서 보관된다.
본 발명의 혈장-제거된 UCB 유닛 및 전혈 UCB 유닛 둘 모두는 유사한 수의 세포를 함유하고, 이론적으로는 동일한 세포 회수를 달성해야 하지만, 본 발명의 혈장-제거된 UCB 유닛은 예기치 않게 전혈 UCB 유닛 보다 나은 임상 성과를 달성한다. 예를 들어, 혈장-제거된 UCB 유닛은 전혈 UCB 유닛에 대한 NYBC 과거 자료와 비교시 개선된 임상 성과를 제공한다. 임의의 특정 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 혈장-제거된 UCB 유닛은 보다 효능이 있고, 줄기세포 생존력에 대한 보다 나은 보존을 제공하고/하거나, 환자에서의 보다 신속한 면역 복원을 가능케 하도록 처리됨으로써 제거되는 혈장 내의 억제 인자가 결핍되어 있고/거나, 농축된 상태의 적혈구 및 용해된 헤모글로빈은 줄기세포 생존력을 보존하는 것을 돕는다. 사실, 세포 농도 및 효능은 전혈 UCB의 최소 약 1.5배이다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 혈장-제거된 UCB 유닛은 하기 기준을 충족시킨다:(1) 약 2.0 x 107/㎏의 단일 또는 더블 유닛 조합 용량으로 최소 유핵세포 수; (2) 약 1.0 x 105/㎏의 단일 또는 더블 유닛 조합 용량으로서의 표준화된 CD34+ 세포 용량; 및 고해상도의 최소 4/6 HLA A/B/DR 매치(match). CD34+ 용량은 보통 실험실간 변화에 대해 표준화되고, 특정 실험실에서의 100의 제대혈 유닛에 대한 평균 CD34+ 백분율을 취하고, 0.300%의 값으로 나눔으로써 결정되며(벡톤 디킨슨 프로-카운트(Becton Dickinson Pro-Count) 유세포분석 계산법이 사용되는 경우에 미국의 일반적인 인구에서의 CD34+ 세포의 대략적인 평균 백분율), 개별적 용량에 상기 비를 곱하여 표준화된 CD34+ 세포 용량이 산출된다. 통상의 기술자는 상기 선택 기준 중 어느 하나 또는 모두가 사용되는 환경 및 분석 방법에 따라 다양할 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
이식 전에 본 발명의 혈장-제거된 UCB 유닛은 해동된다. 이후, 해동된 유닛은 투여 전에 세척되거나 세척되지 않는다. 바람직하게는, 해동된 유닛은 세척되지 않는다. 특정 예에서, 해동된 비세척된 유닛은 직접 주입에 의해 환자에 투여된다. 그 외 특정 예에서, 해동된 비세척된 유닛은 예를 들어, 인간 혈청 알부민 및 젠트란(젠트란, 덱스트란)을 함유하는 등장액에 희석되고/되거나 복원된 후에 주입에 의해 환자에 투여된다. 실시예 4에 나타난 바와 같이, 해동 후에 비세척된 혈장-제거된 UCB 유닛은 이러한 유닛이 이식된 환자에서의 임상 성과를 개선시켰다. 사실, 누적된 혈소판 생착(engraftment) 발생 및 호중구 및 혈소판의 생착 속도 둘 모두는 세척된 유닛에 비해 증가되었고, 이는 해동후 세척이 실질적으로 조혈모세포의 생착의 누적 발생을 지연시키거나 감소시키는 것을 의미한다. 또한, 해동후 비세척된 혈장-제거된 UCB 유닛은 유핵 세포의 보다 나은 회수를 제공함으로써, 세척된 유닛과 비교하여 투여되는 전체 유핵 세포(TNC) 용량을 증가시킨다.
그러나, 그 외 특정 예, 예를 들어, 어린 유아 또는 저항력 저하 신장 기능을 지니는 환자에서는, 해동된 혈장-제거된 유닛은 이러한 유닛이, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 및 젠트란(덱스트란)을 함유하는 등장액으로 세척된 후에 주입에 의해 환자에 투여된다.
또 다른 구체예에서, 특정 UCB 유닛의 복제 가능성을 입증하고, 유닛이 CFU 분석에서 반복 시험에서 성장을 나타내는 것을 실패하는 것을 억제하기 위해 집락 형성 유닛(CFU) 분석이 밀봉된 관조직 또는 제대혈의 대부분(bulk)을 함유하는 동결보존용 백에 부착되거나 부착되지 않은 구획에 존재하는 해동된 혈장-제거된 제대혈, 또는 동결보존용 백 내의 실제로 해동된 혈장-제거된 UCB 유닛에서 수행될 수 있다. 특정 예에서, CFU 분석은 전체 새포 및 적혈구 제거 유닛에 비해 보다 높은 적혈구 밀도, 보다 높은 유리 헤모글로빈 농도, 및 보다 높은 적혈구 껍질(ghost)을 고려한다. 따라서, CFU 성장을 위한 반고체 배지 상의 세포의 플레이 팅 전에 해동 직후에 인간 혈청 알부민 또는 우태아 혈청 및 덱스트란을 함유하는 용액 중 약 1 내지 약 10 또는 약 1 내지 약 20배의 희석이 이용된다.
본 발명의 혈장-제거된 UCB 유닛의 투여는 생착의 누적 발생, 생착 속도, 생존률, 무병 생존, 재발율, 및 이식편대숙주질환 발병률과 관련하여 비관련된 UCB 이식편에 대해 선례가 없는 임상 성과를 제공한다. 조혈 체계와 연관된 양성 질환에 관하여, 본원에 기술된 UCB 유닛은 유리하게는 개선된 생존의 이익을 위해 위험 비를 뒤엎는 생착에 대한 누적 발생, 생착 속도, 생존률, 무병 생존, 재발율, 및 이식편대숙주질환 발병률과 관련하여 비관련된 UCB 이식편에 대해 선례가 없는 임상 성과를 제공한다. 예를 들어, 양성 질환에 대해 비관련된 HLA-미스매치된 혈장-제거된 UCB 유닛이 이식된 환자에서의 임상 성과는 전혈 또는 적혈구 제거 제대혈 유닛을 이용하여 기존에 보고된 관련된 HLA-매치된 제대혈 이식편 보다 낫다. 사실, 관련되지 않은 HLA-미스매치된 혈장-제거된 UCB를 이용한 임상 성과는 전체 생존 및 무병 생존 뿐만 아니라 양성 적응증에 대한 호중구 생착에 대한 속도와 관련하여 골수를 이용한 관련 HLA-매치된 이식편에 필적한다. 또한, 혈장-제거된 UCB 유닛은 보다 많은 세포 용량 및 보다 젊고 경증인 환자가 인용된 문헌(Kurtzberg et al., N. Engl. J. Med., 352:2069-2081(2005))에 기술된 적혈구 제거 UCB 유닛 보다 빠르게 생착된다. 양성 질환과 관련해서, 본원에 기술된 UCB 유닛은 생착에 대한 누적 발생, 생착 속도, 생존률, 무병 생존, 재발율, 및 이식편대숙주질환 발생률과 관련하여 비관련된 UCB 이식편에 대해 선례가 없는 임상 성과를 제공한다.
요컨대, 본 발명의 UCB 혈장-제거된 처리는 제공된 제대혈 유닛에 대해 하기 이점을 제공한다:(1) 처리후 최대 유핵 세포 회수; (2) 처리후 최대 CD34+ 세포 회수; (3) 처리후 최대 집락 형성 유닛 회수; (4) 처리후 최대 줄기세포 회수(외삽법에 의함); (5) 해동후 최대 유핵 세포 회수; (6) 해동후 최대 CD34+ 세포 회수; (7) 해동후 최대 집락 형성 유닛 회수; (8) 해동후 최대 줄기세포 회수(외삽법에 의함); (9) 유핵 세포의 최대 주입량; (10) CD34+ 세포의 최대 주입량; (11) 집락 형성 유닛의 최대 주입량; (12) 줄기세포의 최대 주입량(외삽법에 의함). 또한, 본원에 기술된 철리, 냉동보존, 해동, 및 선택 기술을 통해 세포 용량을 최대화시킴으로써, 본 발명은 단일 또는 더블 혈장-제거된 UCB 유닛이 이식된 소아 및 성인 환자 둘 모두에서 하기의 임상 성과 파라미터를개선시킨다:(1) 호중구 생착의 누적 발생; (2) 면역 복원의 누적 발생(외삽법에 의함); (3) 혈소판 생착의 누적 발생; (4) 호중구 생착에 대한 속도; (5) 면역 복원에 대한 속도(외삽법에 의함); (6) 혈소판 생착에 대한 속도; (7) 무병 생존; (8) 재발율; (9) 이식 관련 사망률, 특히 이식 실패 및 주입(느린 생착 또는 이식 실패)로 인한 사망; 및(10) 가장 중요하게는, 전체 생존.
제대혈 수거
본 발명은 실질적으로 혈장이 제거되나 적혈구는 제거되지 않도록 처리된 제대혈 조성물을 제공한다. 제대혈은 줄기세포의 풍부한 공급원으로, 제공자에게 외상 없이 용이하게 수득될 수 있다. 대조적으로, 이식을 위한 골수 세포의 수득은 입원 기간 동안의 시간 및 비용 소모와 함께 외상을 겪게 된다. 바람직하게는, 제대혈은 탯줄로부터의 직접 배출로 수득된다. 따라서, 유아의 분만후, 탯줄은 더블 으로 교차 클램핑되고, 클램프의 압착된 부분 바로 위가 절개되고, 제대혈관으로부터의 태아혈의 유출이 수득 용기에 수집될 수 있다. 보통, 탯줄을 짜내지 않고 충분한 수득이 달성되며, 태반 분리가 발생하기 전에 약 2분 동안 수득이 달성된다. 분만시 모체혈액, 뇨 또는 기타 액체에 의한 오염을 피하는 것이 고려되어야 한다. 제대혈은 또한 당 분야에 공지된 임의의 기타 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 목적상 제공자는 공여에 사전 동의한 제공자인 모체 제공자, 및 신생아가 되는 실제 제대혈 제공자와 함께 실제 신생아 제공자의 법적 보호자인 모친을 포함한다. 모체 제공자는 일반적인 건강이 양호하고, 연령이 약 16 내지 약 50세인 개체이다. 공여 적합성 및 수혈 전파 감염성 질병의 결핍, 유전 질병, 및 조혈 체계의 암을 결정하기 위해 제대혈 공여 전 또는 후에 모체 제공자로부터 특정 정보가 수집될 수 있다. 예를 들어, 모체 제공자에 기입되어야 하는 의료 질문서가 제공될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 모체 제공자는 공여 전에 의료 검사를 받을 것이다.
제대혈의 수거는 멸균 조건하에서 이루어져야 한다. 수거후 즉시, 제대혈은 항응고제와 혼합되어야 한다. 일반적으로, 약 23㎖ 내지 약 35㎖의 항응고제가 약 255㎖ 이하의 제대혈(즉, 하나의 제대혈 유닛)과 혼합된다. 적절한 항응고제는 당 분야에 공지된 임의의 것, 예를 들어, CPDA(시트레이트-포스페이트-덱스트로오스-아데노신), CPD(시트레이트-포스페이트-덱스트로오스), ACD(산-시트레이트-덱스트로오스), 알세버 용액(Alsever's solution, Alsever et al., N. Y. St. J. Med., 41:126(1941)), 드 고윈 용액(De Gowin's Solution, De Gowin et al., J. Am. Med. Assoc, 114:850(1940)), 에드글루게이트-Mg(Edglugate-Mg, Smith et al., J. Thome. Cardiovasc. Surg., 38:573(1959)), 라우스-터너 용액(Rous-Turner Solution, Rous et al., J. Exp. Med., 23:219(1916)), 기타 글루코오스 혼합물, 헤파린, 에틸 비스코우마세테이트(biscoumacetate) 등을 포함한다.
제대혈 처리를 돕고 안전성을 개선시키기 위해, 다양한 혈액 성분을 위한 처리 백이 멸균 혈액 백 시스템의 일부가 될 수 있다. 한 구체예에서, 혈장 보관 용액은 처리 백중 하나로 통합될 수 있다. 또한, 수거 백 및 처리 백 둘 모두는 포트 및 브레이크 커넥터가 장비될 수 있다. 포트는 백의 내부로의 또는 백의 내부로부터의 물질의 첨가 또는 배출에 사용될 수 있다. 브레이크 커넥터는 튜브 또는 백의 입구를 일시적으로 폐쇄하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 조혈 체계와 연관된 악성종양과 같은 악성 질환 또는 양성 질환을 치료하기 위해 이식에 적합한 혈장-제거된 혈액 조성물을 생성시키기 위해 제대혈 외에, 태반 혈액 또는 태아혈이 이용될 수 있다. 태반 혈액 또는 태아혈은 당 분야에 공지된 임의의 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 태아혈은 초음파, 플라센토센테시스(placentocentesis), 또는 태아경에 의해 인도되는 바늘을 이용하여 태반 뿌리의 태아 혈액으로부터 수집될 수 있다. 태아혈은, 예를 들어, 근원(roots) 및 확장된 정맥에서 분만된 태반으로부터의 바늘 흡출에 의해 수득될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 출산후 여성에게 제대혈 및 태반혈을 공여하는지를 질문하였다. 병원에 연락하여, 제대혈/태반혈 수거 프로젝트의 참여에 경감 질문하였다. 잠재적인 제공자는 자연 분만 또는 제왕절개에 의해 아기를 분만중인 여성 및 분만하려는 여성이다. 미국 특허 5,993,387호에서, 출산후 여성으로부터 제대혈 및 태반혈을 수득하는 한 방법은, 예를 들어, 아기가 출생하기 전에 은행에 가족을 등록시키고, 출산 후에 수거되는 태반 줄기세포의 수거 및 보관을 위한 요금을 지급하는 것이다.
한 구체예에서, 분만후, 제대혈 및/또는 태반혈이 수거되고, 검사된다. 몇몇 구체예에서, 검사는 제대혈 또는 태반혈이 추가의 처리에 적합한지를 보장한다. 검사는 태반이 온전하고, 다량의 태변 또는 화농성 분비물이 없는지 검사하는 것을 포함한다. 탯줄은 2개의 동맥 및 1개의 정맥이 온전하고, 진결절 또는 기타 비정상이 없는지 결정하는 것이 검사될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 수거는 바람직하게는 항응고제, 예를 들어, 시트레이트-포스페이트-덱스트로오스-아데노신(CDPA) 용액을 함유하는 백으로 수거될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 처리후, 혈장-제거된 UCB 유닛은 아동 또는 성인 환자의 성공적인 이식을 위해 충분한 양의 줄기세포를 함유한다. 진짜 조혈모세포는 사용하기 좋은 세포 표면 마커를 지니지 않고, 기능적으로만 규정될 수 있으므로, 대용 마커가 사용되어야 한다. 예를 들어, 유핵 세포의 전체 수에서 종종 제대혈 내의 줄기세포의 수를 예측할 수 있고, 생착 및 생존과 임상적으로 관련이 있는 것으로 나타난다. 또 다른 예에서, 세포 표면 마커, 예를 들어, CD34를 지니거나 다양한 집락 형성 유닛를 형성하는 기능적 능력을 지니는 전구세포의 수가 때때로 사용되고, 이 역시 생착 및 생존과 임상적으로 관련된다.
항응고제가 첨가되고 제대혈과 혼합된 후, 생성된 혼합물은 약 48시간 이하 동안 예를 들어, 약 0℃ 내지 약 42℃ 또는 약 15℃ 내지 약 26℃의 온도에 보관될 수 있다.
혈장-제거 처리
항응고제를 함유하는 수거된 제대혈의 부피는, 예를 들어, 우선 약 0℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 15℃ 내지 약 26℃의 온도에서 혼합물을 원심분리시킴으로써 감소된다. 원심분리는 혼합물로부터 충분한 부피의 액체, 예를 들어, 혈장을 제거하기 위해 수행된다. 원심분리는 바람직하게는 세포가 손상을 입지 않으면서 세포의 대부분을 침강시키기에 충분한 원심분리력 및 원심분리 시간으로, 약 5분 내지 약 20분 동안 약 1,000 x g 내지 약 2,500 x g로 수행된다. 원심분리후, 충분한 부피의 혈장이 제거되어 제대혈 혼합물의 부피가 감소하고, 적혈구가 제거되지 않은 혈장-제거된 제대혈 유닛이 생성된다. 특정 예에서, 최소한 약 10㎖의 혈장이 혈장-제거된 제대혈 유닛에 잔류한다. 이후, 혈장-제거된 유닛은 동결 용기, 예를 들어, 크리오사이트(Cryocyte®) 백으로 옮겨져, 약 30 내지 약 60분 동안 약 2℃ 내지 약 8℃로 냉각된다. 바람직한 구체예에서, 상층액 혈장 내의 세포의 계수에 의해 확인되는 바와 같이, 상층액이 제거되는 경우 유핵 세포의 약 5% 미만(예를 들어, 약 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)이 손실된다.
허용되는 부피는 사용되는 특정 크리오사이트® 백의 부피, 냉동보존되는 세포의 수, 및 냉동보존액의 농도를 고정시킴으로써 결정된다. 혈장-제거된 제대혈 유닛의 부피가 너무 커서 약 60 또는 약 75㎖를 초과하는 부피를 야기시키는 경우, 보다 큰 크리오사이트® 백이 사용될 수 있거나, 샘플이 두개 이상의 크리오사이트® 백으로 나누어질 수 있다.
줄기세포의 생체외 증량
선택적으로, 혈장-제거된 제대혈 유닛에 존재하는 조혈모세포는 냉동보존 전 또는 후에 시험관내 배양 기술을 이용하여 증시시킴으로써, 치료가능한 줄기세포의 수를 증가시킬 수 있다. 조혈모세포의 생체외 증식은 이식을 위해 치료적으로 요구되는 다능성 줄기세포의 소요에서 분화된 전구세포가 생성되지 않도록 하는 데 주의해야 한다. 배양에서 제대혈 줄기세포를 성장시키기 위한 다양한 프로토콜이 기술되어 있다(참조: Smith et al., Br. J. Haematol, 63:29-34(1986); Dexter et al., J. Cell. Physiol, 91:335(1977); Witlock et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 79:3608-3612(1982)). 통상의 기술자는 배양에서 줄기세포의 수를 확장시키는 기타 방법을 인지할 것이다. 시험관 내에서 줄기세포의 증식을 자극시키기 위한 다양한 인자가 이용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 혈장-제거된 제대혈 유닛에 존재하는 조혈모세포의 생체외 확장을 자극하기 위해 다양한 사이토카인 및 성장 인자, 예를 들어, 인터루킨-1(IL-I), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-6(IL-6), 과립구-대식구(GM)-집락자극인자(CSF)가 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
동결보존 및 보관
세포의 동결은 보통 유해하다. 냉각시, 세포 내의 물이 동결된다. 이후, 세포막에 대한 삼투 효과, 세포 탈수, 용질 농도, 및 얼음 결정 형성에 의해 손상 이 발생한다. 세포 외부에 얼음이 형성됨에 따라, 이용가능한 물이 용액으로부터 제거되고 세포로부터 회수되어, 삼투압적 탈수가 야기되고 용질 농도가 상승되어, 결국에는 세포가 파괴된다. 이러한 유해한 영향은,(a) 동결방호제의 이용; (b) 동결 속도의 조절; 및/또는(c) 세포 사멸을 최소화시키기에 충분한 온도에서의 보관에 의해 회피될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 혈장-제거된 제대혈 유닛은 동결방호액과 혼합된다. 다수의 동결방호제가 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 적절한 동결방호제의 비제한적 예는 디메틸 설폭시드(DMSO), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 포름아미드, 히드록시에틸 전분(HES), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 알부민, 콜린 클로라이드, 아미노산, 메탄올, 아세트아미드, 글리세롤 모노아세테이트, 무기염, 및 저분자량 다당류, 예를 들어, 덱스트란(예: 젠트란(젠트란) 40), 수크로오스, i-에리트리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-소르비톨, i-이노지톨, 또는 D-락토오스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 동결방호액은 약 10:1의 비(부피/부피)의 DMSO:젠트란 40, 예를 들어, 50% DMSO:5% 젠트란 40을 포함하고, 이는 약 5% 내지 약 10%의 DMSO의 최종 농도를 생성시키도록 첨가되고, 약 4℃로 예비 냉각된다. 특정 예에서, 동결방호액은 혼합되고, 주사기로 로딩되고, 로딩된 주사기는 약 30 내지 약 60분 동안 약 2℃ 내지 약 8℃에서 냉각된다.
냉각후, 예비 냉각된 동결방호액이 혈장-제거된 제대혈에 첨가되어 항응고제 및 동결방호제 둘 모두를 함유하는 제대혈 혼합물이 형성된다. 동결방호액은 동결 용기를 작동시키면서 동결 용기 내의 혈장-제거된 제대혈에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 동결 용기는 로킹 플랫폼에 배치되어, 예를 들어, 아이스 팩 내에 동결 용기를 포장함으로써 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 유지될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 동결방호액이 프로그래밍가능한 주사기 펌프를 이용하여 동결 용기 내의 혈장-제거된 제대혈에 첨가된다. 주사기 펌프는 예를 들어, J-KEM 사이언티픽, 인크사(J-KEM Scientitfic, Inc.), 뉴 에라 펌프 시스템스, 인크사(New Era Pump Systems, Inc.), 및 켄트 사이언티픽사(Kent Scientific)에서 시판된다. 한 바람직한 구체예에서, 동결방호제는 분당 약 0.75㎖의 속도로 첨가된다. 따라서, 희석률은 동결방호액을 이용하여 분당 혈장-제거된 제대혈 유닛의 약 1:100 희석이다. 혈장-제거된 제대혈에 대한 동결방호제의 허용가능한 속도는 동결방호제의 첨가 속도의 인자인 동결방호액의 희석률, 혈장-제거된 제대혈 유닛의 부피, 및 동결방호액의 농도에 의해 결정될 수 있다.
항응고제 및 동결방호제 둘 모두를 함유하는 본 발명의 혈장-제거된 제대혈 혼합물은 통상적으로 약 -135℃ 미만, 바람직하게는 -150℃ 미만으로 액체 질소(예를 들어, 액체 및/또는 증기상)에 보관된다. 혼합물을 동결시키기 위한 조건은 해동 후의 세포의 생존력을 향상시키기 위해 조심스럽게 조절된다. 몇몇 구체예에서, 동결방호제-줄기세포 혼합물을 지닌 동결 용기는 약 2℃ 내지 약 8℃로 예비 냉각된 알루미늄 보관 카세트에 배치된다. 몇몇 구체예에서, 알루미늄 보관 카세트는 보관되는 제대혈 유닛의 바코드 유닛수를 보여주고, 동결보존용 백 내의 벌크한 유닛을 어지럽히지 않고 유닛의 부착된 구획 샘플의 회수를 가능케 하는 부분적인개방을 가능케 하는 창을 지니도록 특별히 고안된다. 이후, 알루미늄 보관 카세 트는 바람직하게는 항응고제 및 동결방호제를 함유하는 제대혈 혼합물을 지닌 동결 용기가 약 10분 이내에 수령되는 속도 조절 동결기로 옮겨진다. 이후, 혼합물은 속도 조절되어 동결된다. 프로그래밍되는 동결 속도는 약 4℃로부터 약 -50℃까지 바람직하게는 분당 약 -1℃의 속도이다. 이러한 동결 단계는 액체로부터 얼음으로의 조성물의 상전이로부터 발생하는 열(즉, 융해열)의 방출을 상쇄하는 딥의 부재하에서 수행될 수 있다. 최초 동결 단계후, 처리된 제대혈 유닛은 동결보존되는 제대혈 유닛의 조건을 모방하는 동일한 동결 속도 조절로 더미 용기 내에서 프로프를 이용하여 측정된 온도인, 약 -50℃로부터 약 -90℃로 분당 약 -10℃의 속도로 추가로 동결된다. 동결 속도 조절기는, 예를 들어, FTS 시스템스사(FTS Systems) 및 써모 포르마사(Thermo Forma)에서 시판된다.
이후, 동결 용기 내의 동결된 제대혈 혼합물은 살아 있는 줄기세포의 보관을 위한 액체 질소 탱크로 옮겨진다. 이동 시간은 바람직하게는 약 10분 미만, 예를 들어, 약 8분 미만, 약 5분 미만, 약 4분 미만, 약 3분 미만, 약 2분 미만, 약 1분 미만, 약 45초 미만, 약 30초 미만, 약 20초 미만, 약 10초 미만이다. 가장 바람직하게는 이동은 약 1분 미만이 걸린다.
동결된 제대혈 유닛은 바람직하게는 신속하게 해동(예를 들어, 약 37℃ 내지 약 41℃로 유지되는 수조 내에서)되고, 해동 즉시 냉각된다. 특정 예에서, 동결된 제대혈 유닛을 함유하는 동결보존용 백은, 임의로 유닛의 혼합물의 해동 및 따듯한 물로부터 얼음 덩어리 내부로의 열 전달의 증가를 보장하기 위해 약한 회전과 함께 따뜻한 물에 침지될 수 있다. 그 외 특정 예에서, 해동 후에 세포 응집을 예방하 기 위해 동결 전 및/또는 후에 DNA분해효소(DNase), 저분자량 덱스트란 및 시트레이트, 또는 히드록시에틸 전분(HES)을 첨가하여 제대혈 유닛을 처리하는 것이 요망될 수 있다. 유닛이 약간 "녹은(slushy)" 상태가 되자마자, 동결보존용 백은 투여를 위한 제조물 내의 얼음에 배치될 수 있다. 본 발명의 혈장-제거된 제대혈 유닛을 해동시키기 위한 예시적 프로토콜은 하기 실시예 7 및 8에 제공된다.
본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 해동된 제대혈 유닛은 세척 단계 없이 환자에게 직접 주입될 수 있다. 따라서, 동결보존되고 해동되지만 세척되지 않은 혈장-제거된 제대혈이 치료 목적을 위해 직접 주입에 의해 투여될 수 있는 것이 구상된다. 그러나, 동결보존에 효과적인 농도의 동결방호제가 환자에게 매우 유독할 수 있는 경우에, 이는 투여전에 제거되거나 희석될 수 있다. 동결방호제의 독성 농도를 희석시키는 한 방법은 세포에 덜 독성인 약한 농도로의 희석 및/또는 복원에 의해 이루어진다. 바람직하게는, 이는 세척 단계 없이 단지 희석액/복원액을 첨가함으로써 달성된다. 이 경우, 수혜자에 주입된 동결방호제, 적혈구, 백혈구, 유리 헤모글로빈, 및 용해된 적혈구 껍질의 절대량은 직접 주입을 위한 절대량과 유사하다. 그 외 특정 예에서, 동결방호제의 독성 농도를 희석시키는 것은 세척액을 첨가한 후, 1회 이상의 주기의 원심분리에 의한 세포의 펠레트화, 상층액의 제거, 및 세포의 재현탁에 의해 달성된다. 해동 및 동결방호제의 임의의 제거 후에, 세포 계수(예를 들어, 혈구계를 이용함) 및 세포 생존력 시험(예를 들어, 트리판 블루 배제법을 이용; 하기 참조)이 세포 생존을 확인하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명의 해동된 제대혈 유닛을 추가로 처리하기 위해 사용될 수 있는 기타 방법은 줄기세포의 농축 및 줄기세포의 생체외 확장을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나, 이러한 단계는 세포 손실을 최소화시키기 위해 생략될 수 있다.
세포 생존력의 결정
상기 기술된 처리 과정에 걸쳐 임의의 시점에서 세포 생존력이 결정될 수 있다. 줄기세포 생존력 외에, 세포수, 예를 들어, 유핵 세포 및/또는 무핵 세포의 수가 또한 규명될 수 있다. 통상의 기술자는 세포 생존력을 결정하기 위해 다수의 방법이 이용가능한 것을 인지할 것이다. 몇몇 구체예에서, 세포 생존력은 염료 배제 분석, 예를 들어, 트리판 블루 염료 배제법을 이용하여 결정된다. 몇몇 구체예에서, 동결된 제대혈의 샘플이 해동되고, 염료 배제 분석을 이용하여 생존력이 분석된다. 본원의 방법을 이용하여, 약 80%, 또는 바람직하게는 약 85%의 유핵 세포가 해동 후에 생존하고, 더욱 바람직하게는 최소한 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% 또는 99%의 유핵 세포가 해동 후에 생존한다.
치료 용도
본 발명의 혈장 제거되고 적혈구(RBC) 비제거된 제대혈(UCB)은 광범위한 질병 및 장애, 예를 들어, 조혈 체계와 연관된 질병 및 장애에 대해 치료적으로 가치가 있다. 본원에 기술된 UCB 조성물은 또한 예를 들어, 환자의 손실되거나 손상된 조직의 치유 과정 또는 재성장을 트리거링하는 줄기세포를 이용하는 재생 의학의 분야에서 가치가 있다.
본 발명의 UCB 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있는 질병 및 장애의 비제한적인 부류는 악성 질환, 예를 들어, 혈액암 및 조혈 체계와 연관된 악성 질환을 포함한다. 혈액암은 골수 유래 세포의 악성 세포전환을 통해 발생하는 신생물 집단이다.
혈액암 및 기타 유형의 악성 질환의 예는 백혈병 및 림프종(예를 들어, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 유년기 만성 골수성 백혈병, 비호지킨림프종, 유년기 골수 단구성 백혈병, 이중표현형 백혈병, 버키트 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병, 급성 미분화형 백혈병, 급성 악성 척수 경화증, 진성다혈구증, 원인불명 미엘로메타플라시아(myelometaplasia), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 급성 바이일직선 백혈병, 급성 비만 세포 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 모발상세포백혈병, 형질구성 백혈병, 전림프구성 백혈병 등), 골수형성이상 질환(예를 들어, 환상철모구를 지니거나 지니지 않는 불응성 빈혈, 과잉 모세포를 지니는 불응성 빈혈, 치료저항성 세포 감소증, 5q 증후군 등), 림프구증식성 질환, 골수섬유증, 악성 종양(예를 들어, 신경모세포종, 악성 흑색종, 가슴 소세포폐암종, 망막모세포종, 고환 암종, 교모세포종, 횡문근 육종, 중추신경계의 종양, 유잉 육종 등), 및 조직구증(예를 들어, 랑게르한스 세포 조직구증, 가족성 혈액탐식성 림프조직구증, 식혈세포성 림프조직구증, X 염색체 관련 반성 림프증식성 질환 등)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
조혈 체계와 연관된 양성 질환의 예는 혈색소병증(예를 들어, 탈라세미아, 겸상적혈구빈혈 등), 골수부전 기인 빈혈(예를 들어, 혈소판감소증, 무거핵구성 혈소판감소증, 블랙판-다이아몬드증후군, 선천성 각화 이상증, 판코니 빈혈, 골화석 증, 망상 이발생, 철적아구성 빈혈, 슈와크만-다이아몬드 증후군, 중증 재생불량성 빈혈, 범혈구감소증, 과립구 감소증, 적혈구 형성부전증, 특발성 무형성 빈혈, 후천적 특발성 무형성 빈혈 등), 면역 결핍(예를 들어, 디조지 증후군, 림프구 접착 질환, 네젤로프 증후군, 오멘 증후군, 중증 복합성 면역 결핍, 위스코트-올드리치 증후군, X 염색체 관련 하이퍼-IgM 증후군, 알파 1-항트립신 결핍증 등), 대사병/축적병(예를 들어, 아스파르틸글루코스아민뇨증, 부신 백질 이영양증, 알파-만노시도시스, 푸코사이드 축적증, 고셔병, 강글리오사이드증, 헐러 증후군, 헐러-샤이에 증후군, 샤이에 증후군, I-세포 질환, 유아 지방갈색소증, 크라베병, 레쉬-니한 증후군, 이염성의 백질 이영양증, 마로토-라미 증후군, 테이-삭스병, 월만병, 뮤코다당 침착증, 뮤코리피드증 등), 호중구 질환(예를 들어, 만성 육아종성 질환, 세디아크-히가시 증후군, 선천성 호중구감소증, 코스트만 증후군 등), 혈소판 질환(예를 들어, 글란즈만 혈소판무력증 등), 포르피린증(예를 들어, 선천성 적혈구형성성 포르피린증 등), 바이러스 감염(예를 들어, HIV 감염), 및 자가 면역 장애(예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌증후군, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 만성 간염, 염증성 골증 등)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 혈장-제거된 제대혈 조성물은 또한 조혈 계통의 다양한 유전 질병 및 장애를 지닌 세포의 치료에서 매우 큰 가치를 지닐 수 있다. 상기 질병의 예는 지중해빈혈(예를 들어, 알파, 베타, 감마), 가족성 재생불량성 빈혈, 판코니 증후군, 블루움 증후군, 순수 적혈구형성부전증, 가족성 혈액탐식성 림프조직구 증식, 선천성각화부전증, 블랙판-다이아몬드 증후군, 선천성 이적혈구생성 증후군 I-IV, 슈와크만-다이아몬드 증후군, 디히드로폴레이트 환원효소 결핍, 포름아미노 전이효소 결핍, 아스파르틸 글루코사미니다아제 결핍, 베타-글루쿠로니다아제 결핍, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 결핍, 레쉬-니한 증후군, 선천성 구상 적혈구증, 선천성 타원적혈구증, 선천성 유구적혈구증, 선천성 Rh 영 질환, 발작성 야간혈색소뇨증, 글루코오스-6-포스페이트 탈수효소 결핍, 피루베이트 키나아제 결핍, 선천성 에리트로포이에틴 감수성, 겸상적혈구병, 겸상적혈구 소질, 메테모글로빈혈증, 중증복합 면역결핍병, T 및 B 세포를 지니지 않는 중증복합 면역결핍병, T 세포를 지니지 않는 중증복합 면역결핍병, 중증복합 면역결핍병 아데노신 디아미나제 결핍증, 무표지 림프구 증후군, 복합 면역결핍증, 이온 운반체 반응성 복합 면역결핍증, 캡 형성 이상을 지닌 복합 면역결핍증, 공통 가변형 면역결핍증, 뉴클레오시드 포스포릴라아제 결핍증, 과립구 액틴 결핍증, 호중구 액틴 결핍증, 유아 과립구 감소증, 고셔병, 아데노신 디아미나제 결핍증, 코스트만 증후군, 망상 이발생, 및 선천성 백혈구 기능부전 증후군을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "지중해빈혈"은 유전성 혈액 장애군을 의미한다. 지중해빈혈을 지닌개체는 알파 또는 베타 헤모글로빈의 불균형한 합성으로 인해 정상적인 헤모글로빈을 충분히 생성할 수 없어서 중증 빈혈증을 야기시킨다. 헤모글로빈은 적혈구에서 발견되고, 신체의 모든 부분으로 산소를 운반한다. 이는 두개의 상이한 단백질인 알파 및 베타 사슬로 구성된다. 신체가 이들 두 단백질중 어느 것을 충분히 생성하지 못하거나 생성 불균형성을 지니는 경우, 적혈구는 적절하게 형성되지 않고, 산소를 충분히 운반할 수 없다. 결과는 유년기 초기 및 삶의 말년에 발병하여, 일생동안의 빈번한 수혈 및 빈번한 수혈로부터 철 과부하를 면하게 하기 위한 킬레이트 요법을 필요로 한다. 철 킬레이트 요법에도 불구하고, 기관은 궁극적으로는 과량의 철로 과부하되고, 적절하게 기능하지 못하게 된다.
베타 단백질에 비해 알파 단백질을 충분히 생성하지 못하는 적혈구를 지니는개체는 알파 지중해빈혈을 지닌다. 신체에 대한 영향에 있어서 경증 내지 중증의 범위로 다양한 유형의 알파 지중해빈혈이 존재한다. 침묵 보인자 상태는 일반적으로 건강 문제를 야기시키지 않는데, 이는 알파 단백질의 결핍이 매우 적어 헤모글로빈이 정상적으로 기능하기 때문이다. 헤모글로빈 콘스탄트 스프링 상태(constant spring condition)는 알파 글로빈 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 침묵 보인자 상태의 비정상적 형태이다. 침묵 보인자 상태에서, 이러한 상태를 지닌개체는 보통 관련된 건강 문제를 겪지 않는다. 알파 지중해빈혈 소질 또는 경증 알파 지중해빈혈 상태는 알파 단백질의 다소 많은 결핍을 특징으로 한다. 이러한 상태를 지닌 환자는 다소 작은 적혈구 및 경증 빈혈을 지니지만, 다수의 환자는 증상을 겪지 않는다. 헤모글로빈 H 질병은 중증 빈혈, 및 비장 확장, 골 변형 및 피로와 같은 심각한 건강 문제를 야기시키기에 매우 충분한 알파 단백질의 결핍을 특징으로 한다. 헤모글로빈 H-컨스탄트 스프링 질병은 헤모글로빈 H 질병보다 더욱 중증인 질환이다. 이러한 상태를 지니는개체는 보다 중증인 빈혈을 지니는 경향이 있고, 비장 확장 및 바이러스 감염으로부터 보다 빈번하게 고통받는 경향이 있다. 동형 콘스탄트 스프링 질병은 두명의 컨스탄트 스프링 보인자가 이들의 유전자를 이들의 아이에게 전달하는 경우 발생하는 헤모글로빈 H-컨스탄트 스프링의 변형이 다. 이러한 상태는 일반적으로 헤모글로빈 H 컨스탄트 스프링보다 덜 중증으로, 헤모글로빈 H 질병과 보다 유사하다. 태아수증 또는 중증성 알파 지중해빈혈은 바르트 혈색소로 언급되는 비정상 헤모글로빈을 형성하는 태아에 의해 생성된 감마 글로빈을 야기시키는 알파 유전자의 결핍을 특징으로 한다. 이러한 상태를 지니는 대부분의개체는 출생전 또는 출생 직후에 사망한다. 상기 상태가 출생 전에 발견되는 몇몇 극단적으로 희귀한 경우에서, 자궁내 수혈이 이후 일생동안 수혈 및 의학적 치료를 필요로 하는 태아수증을 지닌 유아의 출생을 가능케 한다. 제대혈 이식을 포함하는 자궁내 조혈모세포 이식이 또한 상기 상태를 치료하기 위해 수행될 수 있다.
적혈구가 충분한 베터 단백질을 생성하지 못하는개체는 베타 지중해빈혈을 지닌다. 신체에 대한 영향에 있어서 경증 내지 중증의 범위로 다양한 유형의 베타 지중해빈혈이 존재한다. 경증성 지중해빈혈 또는 지중해빈혈 소질은 정상적으로 기능하는 헤모글로빈에서 문제를 야기시키기에 충분하지 않은 베타 단백질의 결핍을 특징으로 한다. 이러한 상태를 지닌개체는 단지 지중해빈혈에 대한 유전적 소질을 지니고, 가능한 경증의 빈혈증 외의 건강 문제를 겪지는 않을 것이다. 중간성 지중해빈혈은 헤모글로빈 내의 베타 단백질의 결핍이 중등적으로 중증인 빈혈 및 골 변형 및 비장의 확장을 포함하는 유의한 건강 문제를 야기시키기에 보다 충분한 상태이다. 중증성 지중해빈혈 또는 쿨리 빈혈은 헤모글로빈 내의 베타 단백질의 완전한 결핍이 주기적인 수혈 및 다방면으로 진행되는 의학 치료를 필요로 하는 생명을 위협하는 빈혈을 야기시키는 베타 지중해빈혈의 가장 중증 형태이다. 이러한 다방면의 일생동안의 수혈은 기관 기능상실로 인한 조기 사망을 예방하기 위한 킬레이트 치료로 치료되어야 하는 철 과부하를 발생시킨다.
상기 기술된 다양한 유형의 알파 및 베타 지중해빈혈 이외에, E 베타 지중해빈혈 및 겸상 베타 지중해빈혈과 같은 기타 관련 장애가 존재한다. 이러한 상태는 또한 본 발명의 혈장-제거된 제대혈 조성물을 투여함으로써 치료하기에 적합하다.
특정 예에서, 본 발명의 혈장-제거된 제대혈 조성물은 환자에게서 발견되는 유전적 결합을 지니지 않거나, 동형접합 상태 또는 더블 이형접합 상태의 유전적 결합을 지니지 않는 조혈모세포를 함유함으로써, 조혈 체계을 정상적으로 기능화할 수 있게 한다. 그 외 특정 예에서, 본 발명의 제대혈 조성물 내의 조혈모세포는 이들의 자손 세포에 의해 발현될 수 있는 이종유래 유전자가 통합되어 있어, 이러한 재조합 줄기세포는 조혈 체계의 유전적 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자가 결핍되거나 돌연변이 유전자를 지니는 조혈 세포를 지니는 환자는 결핍 유전자의 기능적 대응부가 통합된 조혈모세포가 주입될 수 있다. 유전자 요법에 적용될 수 있는 이러한 유전자는, 예를 들어, 빈혈, 예를 들어, 베타-지중해빈혈, 겸상세포 질병 등의 치료를 위해 합성 경로를 매개하는 헤모글로빈 또는 효소를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
외래 유전자를 세포에 도입시키기 위한 다양한 기술이 당 분야에 공지되어 있고, 유전자 요법의 목적을 위해 재조합 조혈모세포를 제작하기 위해 이용될 수 있다. 사용되는 기술은 줄기세포로의 이종유래 유전자 서열의 안정적인 이동을 제공해야 하고, 이종유래 유전자 서열은 줄기세포 후손에 의해 유전되고 발현되고, 수혜자 세포의 필수 발달 및 생리학적 기능을 붕괴시키지 않아야 된다. 이용될 수 있는 기술은 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 미세 세포 매기 유전자 전달, 트랜스펙션, 형질전환, 형질도입, 전기천공, 감염(예를 들어, 재조합 DNA 바이러스, 재조합 RNA 바이러스), 스페로플라스트(spheroplast) 융합, 미세주입, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 리포솜, 리포솜 융합, 합성 양이온 지질, 유전자총의 이용 또는 DNA 벡터 수송 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 포유동물 세포의 혈질전환 또는 트랜스펙션을 위한 다양한 기술은 문헌[Keown et al., Methods Enzymol. 185:527-37(1990); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(2001)]을 참조하라.
본 발명의 혈장-제거된 제대혈 조성물을 이용하여 치료될 수 있는 기타 질병 및 장애는 골구경화증, 후천성 용혈 빈혈, 후천성 면역결핍증, 원발성 또는 속발성 면역결핍증을 야기시키는 감염성 질환, 세균 감염(예를 들어, 브루셀라증, 리스테리아증, 결핵, 나병), 기생충 감염(예를 들어, 말라리아, 리슈만편모충증), 진균 감염, 노화로 인한 림프세포계의 불균형 및 손상된 면역기능을 수반하는 장애, 식세포 장애(예를 들어, 호중구 액틴 결핍증, 호중구막 GP-180 결핍증), 유전성 적혈구 이상, 유전성 면역계 장애, 유전성 림프 및 헴계 장애, 유전성 대사 장애, 유전성 혈소판 장애, 혈장 세포 장애, 기타 악성종양, 기타 비-양성 질환, 선천성 혈전증, 모세혈관 확장성 운동 실조증, 연골 모발 형성 부전, 당저장병, HIV 감염, 식혈, 헌터 증후군, 면역 결핍증 및 호중구감소증, 백혈구 부착 결핍증, 리소좀 저장 병, 골수화생을 지니는 골수섬유증, 모르키오 증후군, 니이만-픽병, 신경 세로이드 리포푸스신증, 및 A, B, C 및 D형 산필립포 증후군을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기술된 혈장-제거된 제대혈 조성물은 또한 예를 들어, 환자의 손실되거나 손상된 조직의 치유 과정 또는 재성장을 트리거링하는 줄기세포를 이용하는 재생 의학의 분야에서 가치가 있다. 예를 들어, 하나 이상의 혈장-제거된 제대혈 유닛이 골절된 뼈를 치유하거나 악성 화상, 실명, 난청, 심장 손상(예를 들어, 심장 마비 등에 기인함), 신경 손상(예를 들어, 척수 손상), 뇌졸중, 파킨슨 병, 알츠하이머병, 당뇨병(I형 또는 II형), 및 기타 질환을 치료하기 위한 재생 요법을 위해 환자에 투여될 수 있다.
본 발명의 혈장-제거된 제대혈 조성물은 본원에 기술된 처리, 동결보존, 선택, 및/또는 해동 처리에 걸쳐 전체 유핵 세포 용량을 최대화시켜, 제공된 제대혈 유닛에서의 조혈모세포의 최대량을 제공한다. 결과로서, 상기 기술된 질병 또는 장애중 임의의 것을 지닌 환자는 전체 세포 또는 RBC 제거 제대혈 유닛으로 달성된 임상 성과보다 우수한 임상 성과를 경험하게 된다. 특히, 환자는 누적 발생 및 호중구 및 혈소판 확장에 대한 속도, 무병 생존 기간, 재발율, 이식 관련 사망, 및 전체 생존과 같은 파라미터에서 유의한개선을 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 기술될 것이다. 하기 실시예는 예시 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하고자 하는 바는 아 니다. 통상의 기술자는 본질적으로 동일한 결과를 발생시키기 위해 변경되거나 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 용이하게 인지할 것이다.
실시예 1. 예시적 혈장-제거된 제대혈 유닛.
본 실시예는 실질적으로 혈장이 제거되었으나 적혈구는 제거되지 않은 예시적 제대혈(UCB) 조성물을 제공한다.
표준 동결방지 부피: 약 660㎖의 혈장-제거된 유닛에 대한 약 15㎖의 동결방호제.
CV가 수거된 제대혈 부피가고, AV가 항응고제 부피(예를 들어, 약 23 내지 약 35㎖)이고, PV가 혈장-제거된 제대혈 부피가고, PAV가 처리후 항응고제 부피가고, APV가 항응고된 혈장-제거된 제대혈 부피인 경우, 본 발명의 예시적 UCB 조성물은 하기를 포함할 것이다:
PV = 60㎖ x(CV/(CV+AV));
PAV = 60㎖ x(AV/(CV+AV));
PV + PAV = APV = 60㎖; 및
동결전 부피 = APV + 동결방호제 부피 = 60㎖ + 15㎖ = 75㎖.
실시예 2. 제대혈 유닛의 혈장-제거된는 적혈구부피률 및 적혈구 농도를 증가시킨다.
본 실시예는 본 발명의 방법에 따라 수거된 제대혈(UCB)의 처리가 UCB 유닛의 적혈구부피률(즉, 최종 부피 내의 적혈구의 백분율) 및 적혈구(RBC) 농도를 증가시키는 것을 나타낸다.
본원에 기술된 혈장-제거된 처리 전의 샘플의 적혈구부피률("PRE-HCT %") 및 RBC 농도("PRE-RBC(106/㎕)")를 결정하기 위해 488명의 신생아로부터 수득된 UCB를 분석하였다. 처리후, 적혈구부피률("POST-HCT %"), RBC 농도("POST-RBC(106/㎕)"), 및 백혈구 농도("POST-WBC(103/㎕)")를 결정하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 따른 혈장-제거된에 의한 UCB 유닛의 처리는 적혈구부피률 및 RBC 농도를 실질적으로 증가시켰다.
표 3. 488명의 제대혈 유닛의 처리전 및 처리후 수.
PRE-HCT % PRE-RBC (106/㎕) POST-HCT % POST-RBC (106/㎕) POST-WBC (103/㎕)
평균 39.7 3.5 65.1 5.7 22.3
정중값 39.8 3.4 66.5 5.9 17.7
임의의 특정 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 처리후 UCB 유닛의 보다 높은 적혈구부피률 및/또는 보다 높은 RBC 농도는 유리하게는 보다 나은 동결방지 특성 및/또는개선된 임상 성과를 제공한다.
실시예 3. 혈장-제거된 제대혈 유닛, 적혈구 제거된 제대혈 유닛, 및 전체 세포 제대혈 유닛의 비교.
본 실시예는 본 발명의 혈장-제거된 제대혈 조성물과 전체 세포 및 HES 적혈구 제거 유닛의 비교를 나타낸다.
적혈구 부피률:
혈장-제거된(PD) 제대혈(UCB) 유닛은 전혈 유닛 또는 적혈구 제거(RD) 유닛의 평균 약 1.8배를 지닌다. 적혈구 부피률은 부피에 의한 제공된 유닛의 부피에 서의 적혈구(RBC)의 백분율에 해당한다. 임의의 특정한 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 본 발명의 PD UCB 유닛의 보다 높은 적혈구 부피률은 유리하게는 보다 나은 동결보존 특성 및/또는 개선된 임상 성과를 제공한다.
적혈구 부피률 전혈 PD 혈액 RD 혈액
≤ 40% ≥ 50% ≤ 50%
적혈구 농도:
PD 유닛은 전혈 및 RD 유닛의 RBC 농도의 평균 약 1.8배를 지닌다. 임의의 특정 이론으로 한정하고자 하는 바는 아니지만, 본 발명의 PD UCB 유닛의 보다 높은 RBC 농도는 유리하게는 보다 나은 동결보존 특성 및/또는 개선된 임상 성과를 제공한다.
RCB 농도 전혈 PD 혈액 RD 혈액
< 3.2 x 106/㎕ ≥ 3.2 x 106/㎕ < 3.2 x 106/㎕
혈장 부피:
PD 및 RD UCB 유닛은 부피에 의해 전혈 유닛 보다 낮은 농도의 혈장을 지닌다.
혈장 부피 전혈 PD 혈액 RD 혈액
50-60% 0-30% 0-30%
백혈구수 :
PD UCB 유닛은 전혈 및 RD 유닛과 유사한 백혈구(WBC)수를 지닌다.
WBC 수 전혈 PD 혈액 RD 혈액
≥ 90 x 107 ≥ 90 x 107 ≥ 90 x 107
백혈구 농도:
PD 유닛은 전혈 및 RD 유닛 사이의 WBC 농도를 지니고, 이는 전혈의 WBC 농도의 약 1.8배인 반면, RD 유닛은 전혈의 WBC 농도의 약 3배를 지닌다.
WBC 농도 전혈 PD 혈액 RD 혈액
8 x 103/㎕ 15 x 103/㎕ 24 x 103/㎕
적혈구수:
PD 및 전혈 유닛은 유사한 RBC 수를 지니고, 이는 RD 유닛보다 약 5배 더 크다.
RBC 수 전혈 PD 혈액 RD 혈액
1 내지 2.5 x 109 1 내지 2.5 x 109 0.2 내지 0.5 x 109
CD34+ 세포수:
PD 유닛은 전혈 및 RD 유닛과 유사한 CD34+ 세포수를 지닌다.
CD34+ 세포수 전혈 PD 혈액 RD 혈액
1 x 106 내지 5 x 107 1 x 106 내지 5 x 107 1 x 106 내지 5 x 107
WBC 분획에서의 CD34 + 세포의 %:
PD 유닛은 전혈과 RD 유닛 사이의 WBC 분획내 CD34+ 세포 백분율을 지닌다.
WBC 분획내 CD34+ 세포의 % 전혈 PD 혈액 RD 혈액
0.08% - 1.0% 0.15% - 1.8% 0.24% - 3.0%
유핵 세포수 :
PD 유닛은 전혈 및 RD 유닛과 유사한 전체 유핵 세포(TNC)수를 지닌다.
유핵 세포수 전혈 PD 혈액 RD 혈액
90-300 x 107 90-300 x 107 90-300 x 107
세포 분획내 유핵 세포 %:
PD 유닛은 전혈과 RD 유닛 사이의 세포 분획내 유핵 세포 %를 지닌다.
세포 분획내 유핵 세포 % 전혈 PD 혈액 RD 혈액
0.3% 0.54% 1%
실시예 4. 혈장이 제거되었으나 적혈구는 비제거된 , 제대혈( UCB )을 이용한 조혈모세포 이식( HSCT ).
본 실시예는 실질적으로 혈장이 제거되었으나 적혈구는 비제거된, 제대혈(UCB) 유닛이 대부분의 경우에서 과거 대조군보다 우수한 임상 성과를 지니는 조혈모세포의 안전하고 유효한 공급원이며, 해동 후의 세척되지 않은 혈장-제거된(PD) UCB 유닛이 혈소판 확장에 대한 발생률 및 호중구 및 혈소판 확장에 대한 시간을개선시키는 것을 나타낸다.
UCB는 조혈모세포 이식(HSCT)을 위한 매력적인 공급원인데, 이는 덜 엄격한 HLA 매칭 요구조건 및 낮은 이식편대숙주질환 발병률 및 엄격함 때문이다. 그러나, 골수 또는 말초혈 공급원과는 달리, UCB 유닛과 관련된 제한된 세포 용량은 성인에서의 이의 광범위한 용도를 방해한다. 당 분야에서 널리 이용되는 적혈구 제거 기술은 히드록시에틸 전분(HES) 및 피콜 방법으로, 둘 모두는 세포 용량 제한을 더욱 악화시키는 처리 후의 유의한 유핵 세포 손실을 초래한다. 더블 유닛 이식, 조합 UCB/일배수동종 이식, 및 생체외 확장을 포함하는 UCB 유닛의 세포 용량을 증 가시키는 다수의 방법 중, 본 실시예에 기술된 방법은 유리하게는 혈장을 제거하였으나, 적혈구는 제거하지 않음으로써 처리 및 해동 동안 유핵 세포의 회수를 증가시킨다. 결과로서, 유핵 세포 및 전구세포 및 줄기세포의 포착이 회피되고, 혈장의 제거와 관련되어 약간의 부피 감소가 발생한다. 본 방법의 사용은 처리 후에 폐기된 혈장 분획에서 0.1% 미만의 유핵 세포 손실(n=27)을 발생시킨다.
본 실시예에 기술된 방법은 또한 동결된 UCB의 해동 후 세척 단계를 제거함으로써 유핵 세포의 회수를 증가시킨다. 동결된 제대혈 유닛의 해동 후의 세척은 용해된 적혈구로부터 동결방호제인 DMSO 및 유리 헤모글로빈을 제거하기 위해 광범위하게 실시된다(Kurtzberg et al., NEJM, 335:157-166(1996)). 예를 들어, 세척을 이용하여 보다 나은 해동후 생존력이 보고되어 있다(Rubinstein et al., PNAS, 92:10119-10122(1995)). 또한, 주입 전의 동결방호제의 제거는 보다 신속한 확장을 촉진하는 것으로 보고되어 있다(Kurtzberg et al., 전게서). 그러나, 최근의 여러 보고는 환자로의 주입 전에 제대혈의 해동후 세척의 역할에 의문을 제기하고 있다(Nagamura-Inoue et al., 수혈, 43:1285-1294(2003); Hahn et al., Bone Marrow Transplantation, 32:145-150(2003); Antoneanas et al., Bone Marrow Transplantation, 34:739(2004); Creer et al., Proceedings of the 3rd Annual International Cord 혈액 Transplantation Symposium). 이들 연구에서, 임상 성과 및 해동후 생존력이 해동 후에 세척이 수행되거나 수행되지 않았건 간에 표준 적혈구 제거 제대혈 유닛과 유사하게 관찰된다. 혈장이 제거되나, 적혈구는 제거되지 않은 제대혈 유닛에 대한 해동후 세척의 유용성에 대해서는 데이터가 존재하지 않 는다.
대규모의 인종적으로 다양한 PD UCB 목록을 형성하고, 162개의 UCB에 대해 2005년 4월 현재 전세계에서 이 생성물을 사용하여 HSCT를 수행하였다. 연구 설계에 대해서는 하기되어 있다:
연구 설계:
1. 포함 기준 - 2001년 11월에서 2005년 4월 사이의 모든 이식편: n = 162.
2. 아직 입수되지 않은 이식편 데이터 수: n = 44.
3. NMPD 및 이식편 센터로부터 공급되고 검사된 데이터.
4. "모든 환자" - 이식된 162명 중 118명에 대해 입수가능한 생착 또는 생존율 데이터 - 73%.
5. 아직까지 입수되지 않은 162명 중 44명의 데이터 - 27%
6. 64개의 NMPD 이식편 중 58개에 대해 입수가능한 데이터 - 91%.
7. 117개의 U.S. 이식편 중 89개에 대해 입수가능한 데이터 - 76%.
8. 45개의 대만 이식편 중 29개에 대해 입수가능한 데이터 - 64%.
9. "재발/재-이식" 이식편(사전 이식 및/또는 재발 동안 이식된) = 20개.
10. "완화/제 1 이식편" 환자 = 98명(사전 이식 없이 완화된 환자).
11. 단일 UCB 이식편 = 99개; 더블 UCB 이식편 = 19개; 비-골수제거 = 7개; UCB/일배수동종 PSCT = 1개.
본 연구 설계에서 보여지듯이, 생착 및/또는 생존율 데이터는 118명의 환자에 대해 입수될 수 있었는데, 이는 73%의 전반적인 데이터 수거율을 나타내는 것이 다. 이들 118명 환자의 특징이 하기되어 있다:
환자 특징
1. 성별: 남성 = 72명(61%); 여성 = 56명(39%).
2. 연령: 평균 = 14세; 중위 연령 = 8세; 범위 = 0.3 내지 55세.
16세 이상의 환자에서 31개 이식편(26%).
3. 체중: 평균 = 35 kg; 중위 체중 = 26 kg; 범위 = 4.5 내지 103 kg.
50 kg이 넘는 환자에서 36개 이식편(31%).
29개(25%)에서 양성 징후가 평가되었는데, 즉 14개 혈색소 병증, 6개 재생불량성 빈혈, 5개 위스콧-알드리치 증후군(WAS), 2개 중증 합병성 면역결핍(SCID) 증후군, 및 2개 기타 질환이었다. 89개의 이식편이 악성 징후(malignant indications)(75%)를 나타내었는데, 즉 37개 급성 림프모구 백혈병(ALL), 22개 급성 골수성 백혈병(A㎖), 9개 만성 골수성 백혈병(C㎖) 및 21개 기타 질환이었다. 환자가 1 CR/1 CP인 20개의 이식편(악성 징후의 22%), 환자가 재발/재이식 환자인 20개의 이식편(악성 징후의 22%), 환자에게 사전이식되는 7개의 이식편, 및 재발, 도입 실패, 종양 내성 또는 급성 발증기 동안에 환자에게 이식되는 16개의 이식편이 존재하였다.
환자 데이터의 58/118(49%)가 NMDP에 의해 검사되고 공급되며 이식편 센터에 의해 재검사되며; 나머지는 이식편 센터에 의해 검사되고 공급된다. 500의 전체 호중구 수치(ANC), 20,000의 혈소판 수치(Plt20K) 및 50,000 혈소판 수치(Plt50K)에 대한 생착의 미조정 누적 빈도을 계산하였다. 조정없이 모든 누적 빈도을 계산 하였는데, 즉 생착 전의 모든 사망을 이식 실패로 계수하였다. 생존 및 재발없는 생존을 분석하는데 카플란 메이어 추정법을 사용하였다.
모든 118명의 환자의 PD UCB 유닛은, 5.6 × 107/kg의 중위 동결-전 총 유핵세포(TNC) 용량; 7.6 × 107/kg의 평균 동결-전 TNC 용량으로 특징 되었다. 중위 동결-후 TNC 용량(n = 68)은 5.2 × 107/kg(93% 회수율)이었고, 평균 동결-후 TNC 용량은 7.9 × 107/kg(100% 회수율)이었다. 중위 동결-전 CD34 용량(n = 117)은 1.8 × 105/kg이었고, 평균 동결-전 CD34 용량은 2.6 × 105/kg이었다. HLA ABDR 매치의 정중 수는 4.0이며, 부류 I은 낮거나 중간 정도의 해상력을 나타냈으며 부류 II는 높은 해상력을 나타냈다. 이식편 센터 당 중위 동결-후 생존력은 75%이었다. 이식편 중 41개(35%)를 미국 이외에서 수행하였다. 89개(58개 NMPD 및 31개 비-NMPD, 75%)의 이식편을, 스템사이트 유.에스.(StemCyte U.S.)로부터 공급되는 제대혈을 사용하였고; 29개의 이식편(25%)을 스템사이트 대만으로부터의 제대혈을 사용하였다.
PD UCB 유닛을 사용하여 이식된 입수가능한 생착 또는 생존율 결과 데이터를 사용한 118명의 환자에 대한 임상적 성과로부터, ANC500, Plt20K 및 Plt50K에 대한 생착의 미조정된 누적 빈도이 각각 90 ± 3%(도 1A), 77 ± 5%(도 1B), 및 75 ± 5%임을 알 수 있다. 누적 빈도이 미조정되었기 때문에, 생착까지의 예상 시간 전의 모든 사망이 이식 실패로 처리되었다. ANC500(n = 87), Plt20K(n = 72), 및 Plt50K(n = 68)에 대한 생착까지의 정중 시간은 각각 22.0 일(범위 7 내지 64), 49.5 일(범위 13 내지 95), 및 58.5 일(범위 21 내지 132)이었다. 표 4에서 보여지듯이, PD UCB 이식편 환자에 대한 생착의 누적 빈도 및 생착까지의 정중 시간은, 뉴욕 혈액 센터(NYBC) 또는 미국립 골수 공여 프로그램(NMPD)으로부터의 RD UCB 유닛을 사용하여 이식된 환자와 비교하여 실질적으로 더 높았다.
표 4. PD UCB 유닛은 RD UCB 유닛과 비교하여 우수한 임상적 성과를 제공한다.
ANC500 생착 누적 빈도 ANC500 생착까지의 정중 시간 (범위) Plt20K 생착의 누적 빈도 Plt20K 생착까지의 정중 시간 (범위) Plt50K 생착의 누적 빈도 Plt50K 생착까지의 정중 시간 (범위) 1년 생존율
PD UCB 유닛 (모든 환자) 90 ±3% (미조정됨) 22일 (7 내지 64) 77 ±5% (미조정됨) 49.5일 (13 내지 95) 75 ±5% (미조정됨) 58.5일 (21 내지 132) 65 ±5%
PD UCB 유닛 (제 1 완화 환자) 94 ±3% (미조정됨) 22일 81 ±5% (미조정됨) 49.5일 80 ±5% (미조정됨) 58일 73 ±5%
NYBC RD UCB 유닛 72% (미조정됨) 28일 (10 내지 120) 50 ±7% (미조정됨) 58% (조정됨)* 90일 (60 내지 250) 40-45%
NMDP RD UCB 유닛 87 ±4% (조정됨)* 21일 (8 내지 62) 61 ±7% (조정됨)* 64일 (12 내지 473) 45 ±8%
세인트 루이스 RD UCB 유닛 54%
*: 조정은 21일전까지의 죽음은 배제하므로, 이로부터 더욱 높은 겉보기 생착이 얻어진다.
생존하는 환자에 대해 526일의 정중기간 추적조사(median follow-up)를 사용하는 경우, 모든 경우에 대한 1년째의 생존율 및 1년째에 악성 경우에 대한 재발없는 생존율(DES)의 카플란-메이어 추정치는 각각 65 ± 5%(도 1C) 및 50 ± 6%(도 1D)이었다. 표 4는 또한, PD UCB 이식편 환자에 대한 1년 생존율이 NYBC, NMDP 또는 세인트 루이스 혈액 은행으로부터의 RD UCB 유닛으로 이식한 환자와 비교하여 실질적으로 더 높음을 보여준다. 등급 III 내지 IV의 급성 이식-대-숙주 질환(GvHD) 및 만성 GvHD의 발생률은 각각 100일째에 15%이고 1년째에는 13%이었는데, 이것은 이전에 보고된 수치보다 낮은 것이다. 악성 경우에 대한 재발율 및 모든 경우에 대한 이식편 관련된 사망율(TRM)은 1년째에 각각 25 ± 6%이고 26± 4%이었다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 PD UCB 유닛을 투여받은 환자들은 RD 또는 전혈 UCB 유닛을 이식받은 환자들에 비해 우수한 임상적 성과(예를 들어, ANC500, Plt20K 및 Plt50K 생착의개선된 누적 빈도, ANC500, Plt20K 및 Plt50K에 대한 보다 신속한 정중 시간, 및 증가된 1년 생존율)를 달성함을 알 수 있다. 또한, PD UCB 유닛을 사용한 이식에서의 GvHD, 1년 생존율, 및 재발 없는 생존율은 골수 및 말초 혈액 줄기세포 이식편와 비교하여 우수하다.
제 1 완화 이식편 환자(즉, 사전 이식되지 않은 환자 및 완화 동안에 이식된 환자; n = 98)를개별적으로 분석하는 경우에, ANC500, Plt20K 및 Plt50K에 대한 생착의 미조정 누적 빈도는 각각 94 ± 3%(도 2A), 81 ± 5%(도 2B) 및 80 ± 5%이었다. ANC500, Plt20K 및 Plt50K에 대한 생착까지의 정중 시간은 각각 22.0일, 49.5일 및 58.0일이었다. 모든 경우에 대한 1년 생존율 및 악성 경우에 대한 1년째의 재발없는 생존율(DFS)에 대한 카플란-메이어 추정치는 각각 73 ± 5%(도 2C) 및 59 ± 7%(도 2D)이었다. 악성 경우에 대한 재발율 및 완화 환자에 대한 TRM 율은 1년째에 각각 20 ± 6% 및 20 ± 4%이었다. 표 4는, 제 1 완화 PD UCB 이식편 환자 가, RD UCB 유닛이 이식된 환자에 비해, 급격하게개선된 ANC500, Plt20K 및 Plt50K 생착에 대한 누적 빈도, ANC500, Plt20K 및 Plt50K에 대한 보다 신속한 정중 시간, 및 증가된 1년 생존율을 나타냄을 보여준다. 이 결과는, PD UCB를 사용한 HSCT가 안전하고 효과적으로 수행될 수 있음을 입증한다.
NMDP 대 비-NMDP U.S.와 비-NMDP 대만 환자 사이에서의 비교가 또한 실시되었다. 구체적으로, 도 3은, 이들 세 하위집단의 환자에 대한 ANC500 생착의 누적 빈도(도 3A), 혈소판 20K 생착의 누적 빈도(도 3B), 재발율(도 3C), 및 환자 사망율 및 1년 생존율(도 3D)의 비교를 도시한다. NMDP 결과 데이터 수거율은 환자의 91% 이상이기 때문에, 이식 센터에 의한 바람직한 보고 바이어스(reporting bias)가 본질적으로 제거된다. 외삽에 의해 비-NMPD 하위집단을 NMPD 결과와 비교하고 실질적으로 유사한 결과를 확인함으로써, 유의적인 바람직한 보고 바이어스가 또한 이들 그룹에서 배제된다.
소아 체중 그룹(50 kg 미만), 성인 체중 그룹(50 kg 이상) 및 단일 유닛 이식편에서의 환자 하위집단 사이에서의 비교를 또한 수행하였다. 구체적으로, 도 4는 이러한 환자의 3개 하위집단에 대한 ANC500 생착의 누적 빈도(도 4A), 혈소판 20K 생착의 누적 빈도(도 4B), 재발율(도 4C), 및 환자 사망율 및 1년 생존율(도 4D)의 비교를 도시한다. 상기 비교는, 성인 체중의 환자가, 예를 들어 문헌에 기재된 것(참조: Laughlin et al., NEJM 351:2265(2004) and Rocha et al., NEJM 351: 2276-85(2004))과 비교하여 탁월하고 우수한 결과를 달성함을 보여준다. 소아 체중 그룹 환자로부터의 결과는, NYBC로부터의 연령 층화된 결과와 비교한 경우 에 탁월하다. 단일 유닛으로부터의 결과는, 다른 센터로부터의 제 2 유닛에 의한 기여가 우수한 임상적 성과를 보장하지 않음을 보여준다.
완화 하위집단에서의 양성 또는 악성 질환을 앓는 환자 사이에서의 비교가 또한 수행되었다. 구체적으로, 도 5는 이러한 환자의 2개 하위집단에 대한 ANC500 생착의 누적 빈도(도 5A), 혈소판 20K 생착의 누적 빈도(도 5B) 및 1년 생존율(도 5C)의 비교를 도시한다.
양성 징후에 대한 조혈 줄기세포 이식에 관하여, 중위 동결-전 TNC 용량은 7.7 × 107/kg이었고, 중위 동결-후 TNC 용량은 7.7 × 107/kg이었으며, 중위 동결-전 CD34 용량은 3.1 × 105/kg이었다. ANC500(n = 21), Plt20K(n = 20) 및 Plt50K(n = 18)에 대한 생착까지의 중위 시간은 각각 14.5일(범위 11 내지 41), 47.0일(범위 13 내지 82), 및 56.5일(범위 21 내지 96)이었다. ANC500, Plt20K 및 Plt50K에 대한 생착의 미조정된 누적 빈도는 각각 89 ± 7%, 89 ± 7% 및 87 ± 8%이었다. 보고된 등급 II의 급성 GvHD 발생률은 33%이고, 어느 환자도 등급 III 내지 IV의 급성 GvHD를 나타내지 않았다. 50%(7/14)가 제한된 만성 GvHD로 진행되었고, 단 1명의 환자가 광범위한 만성 GvHD를 나타내는 것으로 보고되었다. 356일의 정중기간 추적조사(범위 93 내지 1,100일)를 이용하는 경우, 1년 TRM, 전반적인 생존율 및 재발없는 생존율의 카플란-메이어 추정치는 각각 11 ± 6%, 89 ± 6% 및 89 ± 6%이었다.
악성 징후에 관한 조혈모세포 이식와 관련하여, 사전-동결(pre-freeze) TNC 중위 용량은 6.4 x 107/kg이었고, 해동후(post-thaw) TNC 중위 용량은 5.3 x 107/kg이었으며, 사전-동결 CD34 중위 용량은 2.5 x 105/kg이었다. ANC500(n=66), Plt20K(n=52), 및 Plt50K(n=50) 각각의 경우에 있어서, 생착 중위 시간은 각각 24일(범위: 7-49일), 53일(범위: 15-94일), 및 63일(범위: 37-132일)이었다. ANC500, Plt20K, 및 Plt20K 각각의 경우에 있어서, 비조정된 생착 누적 빈도는 각각 93 ± 3%, 76 ± 6%, 및 75 ± 6%이었다. 보고된 등급 II-IV 및 III-IV 급성 GvHD의 발생률은 각각 37%와 20%이었다. 환자의 12%가 제한된 만성 GvHD를 발달시켰으며 15%는 심한 만성 GvHD를 발달시켰다. 평균 282일(범위: 50-1,263일)의 사후연구와 함께, 1년 TRJVI의 무병생존율곡선(Kaplan-Meier) 평가, 전체 생존율, 및 무재발 생존율은 각각 20 ± 6%, 67 ± 6% 및 59 ± 7%이었다.
유닛을 해동후 세척했든지 세척하지 않았든지 간에 PD UCB 이식물의 주입과 연관된 주요한 부작용은 없었다. 보고된 일반적인 부작용은 혈색뇨증, 고혈압, 두드러기, 메스꺼움과 구역질, 및 호흡곤란을 포함하였다. 혈색뇨증은 비세척된 제대혈을 이식받은 환자에게서 더 빈번하게 발생하였다. 어떤 환자는 비세척된 제대혈의 주입과 일시적으로 관련되어 있는 것으로 생각된 일시적 발작과 뇌질환(encephalopathy)을 일으켰는데, 이는 처치로 해결되었으며 임의의 예후는 없었다.
해동 후 세척된 PD UCB 이식 대 비세척된 PD UCB 이식과 관련하여, 이전에 이식에 대한 이력이 없는 양해를 구한 환자 84명으로부터 데이터를 얻을 수 있었는 데, 상기 환자들에게 HSCT를 위한 세척(n=43) 또는 비세척(n=40) PD UCB 유닛을 이식하였다. 프로토콜에 관계없이, 임의의 세척(예를 들어, 희석 및 원심분리 분류)을 겪은 모든 PD 제대혈 유닛은 세척된 그룹으로 분류되었다. 주입 전에 희석했든지 희석하지 않았든지(예를 들어, 복원) 간에, 해동 및 원심분리없이 주입된 모든 PD 제대혈 유닛은 비세척된 그룹으로 분류되었다. 주입 도중에 한번 이상 발생한 임의의 등급의 부작용은 혈색뇨증(비세척 : 9, 세척: 1), 고혈압(비세척: 6, 세척: 4), 두드러기(비세척: 1, 세척: 1), 메스꺼움/구역질(비세척: 2, 및 호흡곤란(비세척: 1, 세척: l)을 포함하였다. 비세척된 이식물을 주입받은 한 환자는 발작과 뇌질환을 일으켰는데, 주입과의 연관성이 불확실하였으나, 임의의 예후 없이 회복되었다.
해동 후 총 유핵세포(Total nucleated cell, TNC)의 재생율(recovery)은 세척된 그룹(평균: 75%)에서 보다 비세척된 그룹(평균: 95%)에서 더 높게 나타났다. 호중구 생착에 대한 비조정된 누적 빈도는 양 그룹에서 유사하였다: 비세척된 그룹(n=36)에서 91 ± 5% 대 세척된 그룹(n=41)에서 93 ± 4%. 그러나, 호중구 생착(20일 대 26일) 및 혈소판 생착(혈소판 2OK: 47일 대 55일; 혈소판 5OK: 55일 대 63일)에 걸리는 평균 시간은 비세척된 그룹에서 더 빠른 것으로 나타났다. 이러한 차이는 단변수(univariate) 및 다변수(multivariate) 분석 모두에서 혈소판 생착 속도에 있어서 매우 중요하였다. 이러한 차이는 또한 단변수 분석에서 호중구 생착 속도에 있어서도 중요하였다. 또한, 혈소판 2OK 생착과 관련한 누적 빈도는 단변수 및 다변수 분석 모두의 경우에서 세척된 그룹(n=39; 75 ± 7%) 보다 비세척된 그룹(n=28; 92 ± 6%)에서 상당히 더 높은 것으로 나타났다. 등급 III-IV 급성 GvHD는 10%(비세척된 그룹)와 19%(세척된 그룹)로 나타났고, 전신성(extensive) 만성 GvHD는 0%(비세척된 그룹)와 22%(세척된 그룹)으로 나타났다. TRM은 비세척된 그룹의 경우 18 ± 6%이었으며, 세척된 그룹의 경우 20 ± 7%이었는데, 악성종양 환자에서의 재발율은 비세척된 그룹에서 11 ± 7%이었고 세척된 그룹에서 25 ± 8%이었다. 비세척된 그룹과 세척된 그룹의 비교시, 1년간 전반적인 생존율은 75 ± 7%(n=40) 대 72 ± 8%(n=43)이었고, 1년간 DFS는 69 ± 10%(n=23) 대 54 ± 9%(n=34)이었다.
양성 징후에 대한 조혈모세포 이식과 관련하여, 세척된 그룹과 비세척된 그룹에서, ANC500, 혈소판 2OK, 및 혈소판 50K 각각의 평균 생착 시간은, 각각 27일 대 12일, 58일 대 44일, 및 73일 대 53일이었다. 악성 징후에 대한 조혈모세포 이식과 관련하여, 세척된 그룹과 비세척된 그룹에서, ANC500 및 혈소판 2OK 각각의 평균 생착 시간은 각각 28일 대 23일 및 55일 및 49일이었다.
도 6은, 다변수 분석시, 이전에 이식의 이력이 없는 양해를 구한 총 94 환자에게 HSCT를 위한 세척된(n=52) PD UCB 유닛 또는 비세척된(n=42) PD UCB 유닛을 주입하였을 때, 세척이 혈소판 생착을 상당히 증진시키지 아니하였음을 보여준다. 전체적으로, 확정된 단변수를 이용한 조정된 분석은 결과적으로 비세척된 이식물이 세척된 유닛보다 더 빨리 생착되었음을(P20K와 P50K)을 제시한다.
세척 대 비세척 케이스의 특징(n = 94)
Figure 112007095124372-PCT00003
*P-값은 피셔의 정확 검정(Fisher's Exact Tests)를 이용하여 계산되었음
상기 설명한 118명의 소아 환자를 포함한 237 환자에 대한 추적 연구(follow-up study)를 수행하였다. 중위 연령은 9살(범위: 0.3-59)(16살을 넘는 환자가 33%)이었고; 중위 체중은 30kg(범위: 4.5-112)(50kg을 넘는 환자가 35%)이었고; 60%가 남자였으며; HLA ABDR 매칭의 중위 수치는 4.0이었고; TNC 중위 용량은 5.6 x 107/kg이었으며; CD34 중위 용량은 1.8 x 105/kg이었으며; 이식 기관에 기 록된 해동후 TNC 중위 용량은 5.2 x 107/kg이었으며; 70% 악성 징후를 지닌 환자가 70%이었으며; 이식물의 39%가 미국 이외의 나라로부터 입수되었으며; 중복(double) 이식은 27%이었고; 비골수모세포 치료(non-myeloablative therapy) 후에 이식의 16%가 실행되었다. 등급 III 내지 IV의 aGVHD 및 전신성 cGVHD의 발생률은 각각 13%와 14%이었다. ANC500, 혈소판 2OK 및 혈소판 5OK 각각의 비조정된 생착율은 각각 88 ± 3%, 82 ± 4% 및 76 ± 4%이었다. ANC 500, 혈소판 2OK, 및 혈소판 50K 각각의 평균 생착 시간은 각각 22일, 48일, 및 63일이었다. 재발율은 23 ± 4%이었으며, TRM은 29 ± 3%이었다. 평균 325일의 추적 연구로, 1년간 전반적인 생존율 및 무질병 생존율은 각각 59 ± 4% 및 54 ± 4%이었다. 계층분석(Stratification analysis)은 0.7 x 107/kg 이하의 CD34+ 세포 용량에서 열악한 생착 및 생존 성과를 보여주었다.
113 케이스의 세척(W) 및 95 케이스의 비세척(NW) PD 제대혈 이식이 있었다. 수혜자 체중 kg 당 1g의 권장된 DMSO 역치(threshold)를 초과하지 아니하였을 경우, 심각한 부작용은 초래되지 아니하였다. 이식 기관에 보고된 바와 같이 해동후 TNC 재생은 NW에서 더 높게 나타났다(평균 재생율 89% 대 75%).
W PD CB에서 보다 NW에서 비조정된 생착율이 더 높았으며 평균 생착 시간이 더 빨랐다: ANC500의 경우, NW에서, 91 ± 4% 및 20일 대 W에서, 88 ± 4% 및 24일(p=0.03); 혈소판 2OK의 경우, NW에서, 86 ± 6% 및 44일 대 W에서, 78 ± 5% 및 58일(p=0.004); 혈소판 5OK의 경우, NW에서, 85 ± 6% 및 57일 대 W에서, 72 ± 6% 및 75일(p=0.01). III-IV 등급 급성 GvHD 발생률은 각각 12%(NW)와 13%(W)이었고, 전신성 만성 GvHD 발생률은 각각 4%(NW)와 19%(W)이었다. 재발율은 NW의 경우 16 ± 5%이었고 W의 경우 28 ± 5%이었으며(ρ=0.15), TRM은 NW의 경우 25 ± 5% 이었고 W의 경우 34 ± 5%이었다. 1년간 전반적인 생존율은, NW 및 W의 경우, 각각 63 ± 6% 대 49 ± 5%이었고(ρ=0.40), 1년간 DFS는 NW 및 W의 경우, 각각 62 ± 6% 대 36 ± 7%이었다(p=0.21).
PD 제대혈 이식의 성과를 RBC가 제거된 제대혈을 이용한 이식의 성과와 관련하여 공개된 데이터와 우선적으로 비교하였으며, 생착, TRM, 및 생존에 관하여 더 치중하여 비교하였다. 해동후 세척된 PD 제대혈의 이점은 없었으며, 호중구 및 혈소판의 생착율 및 생착 속도, TRM, 재발율, 1년간 전반적인 생존율, 및 DFS와 관련하여 세척된 PD 제대혈이 해동후 세척된 PD 제대혈 보다 뛰어나게 좋지는 아니하였다.
본 발명의 예는 다음과 같은 사실을 증명한다:(1) PD UCB 이식물은 더 높은 평균(average) 및 중간치(median) 세포 용량을 갖는다; (2) 호중구와 혈소판의 비조정된 누적 생착 빈도는 어린이 및 성인 둘 모두에서 적혈구가 제거된(적혈구 제거된, RD) 유닛보다 상당히 더 나은 것으로 나타난다; (3) 호중구와 혈소판의 두드러진 생착 속도, 양성 징후를 위한 골수 이식의 상기 것의 접근; (4) 1년간 생존율 및 이식-관련 사망률이 어린이 및 성인 둘 모두에서(특히 양성 징후가 있는 어린이에서) RD 유닛 대비 상당히개선된다; (5) 재발율은 RD UCB 이식물 만큼 우수하다; (6) 해동후 세척되지 않은 PD UCB 유닛은 세척된 유닛 대비 생착을 상당히개선시킨 다. 그 결과로, 본 발명의 예는 PD UCB 이식이 역사적인 대조군과 필적할 정도이거나 이 보다 우수한 결과를 나타내면서 환자에게 안전하게 이루어질 수 있다는 것을 입증한다. 본 발명의 예는 추가로 해동후 세척되지 않은 PD UCB 유닛이 혈소판 생착 빈도와 호중구와 혈소판의 생착 시간을개선시킨다는 것을 보여주는데, 이것은 해동후 세척이 조혈모세포의 생착을 지연시켰다는 것을 시사한다.
실시예 5. 수혈-의존성 지중해빈혈을 지닌 어린이 대상 비혈연관계 제대혈 이식후 급속하고 영속적인 생착
본 실시예는, 최적의 총 유핵세포 투여용량을 제공하는, 본 발명의 제대혈 조성물이, 수혈-의존성 지중해빈혈을 지닌 환자에서 급속하고 영속적인 생착을 가져온다는 것을 증명한다.
제대혈(UCB)은 지중해빈혈에 대한 조혈모세포 이식을 위한 매력적인 비혈연관계 원천이다. 그러나, 세포 투여용량이 제대혈 이식의 중요한 요소이다. 사실상, 지중해빈혈의 치료에 있어서제대혈 이식은 흔히 성공적이지 못하였는데, 이는 아주 많은 수의 이식 세포가 조혈작용을 지속시키기 위해서 그리고 거부반응을 막기 위해서 투여되어 질 필요가 있기 때문이다(Rund et al., N. Engl. J. Med. 353:1135-1146(2005)). 본 실시예는 본 발명의 방법에 따라 세포 투여용량을 최대화함으로써 선택된 환자에서 비혈연관계 제대혈 이식이 이루어질 수 있다는 가능성있는 결과들을 제시한다.
2003년 10월과 2005년 9월 사이에, 수혈-의존성 지중해빈혈을 지닌 10명의 소아 환자를 대상으로 골수모세포 치료후 조혈 재건을 위하여 비혈연관계 제대혈 이식을 실행하였다(참조: 표 5).
표 5. 케이스 요약.
Figure 112007095124372-PCT00004
Figure 112007095124372-PCT00005
10명의 환자를 대상으로 2회 더블 유닛 이식 및 12회 제대혈 유닛 이식과 함께, 고해상력 HLA AJBfDR 매치검사 결과, 3명(6/6), 3명(5/6), 4명(4/6), 및 2명(3/6)으로 분석되었다. 모든 제대혈 유닛은 스템사이트 타이완 국가 제대혈 센터(StemCyte Taiwan National Cord 혈액 Center)에 의해 제공되었으며 혈장은 제거되었으나 부피 감소 가공후 유핵세포의 최대 보유를 달성하기 위하여 적혈구(RBC)를 제거하지는 않았다. 주입된 세포 용량을 더 강화하기 위하여, 모든 유닛은 해동되었으며 세척없이 즉시 주입되었다. 모든 게이스에서 주요한 ABO 부적합성에도 불구하고 주입후 심각한 부작용은 관찰되지 아니하였다. 수혜자의 체중을 기준으로 사전-동결 가공 후(Post-processing pre-freeze) 평균 총 유핵세포(TNC)의 수는 8.7 x 107/kg(범위: 4.8-15.0 x 107/kg)이었으며, 사전-동결 가공후 평균 CD34 세포 의 수는 4.1 x 105/kg(범위: 2.1-8.0 x 105/kg)이었다. 주입과 연관된 심각한 부작용은 없었다. 한 환자는 예상된" 호중구 생착 시점보다 +8일 앞서 페니실린-내성 연쇄구군(S. mitis)패혈증으로 인하여 사망하였다. 다른 9명의 환자는 생존하고 있으며 2005년 9월 8일 시점까지 378일의 중위 추적연구 기간을 가졌다. 호중구 생착이 이루어진 8 환자들은 +21일까지 완전한 조혈제공자 키메라현상을 나타내었으며, 나머지 환자들은 162일까지 안정적인 혼합 키메라현상(85.6% 제공자의 세포)을 보여주었으며, 현재 이식후 311일이 경과하고 있다. 상기 환자들 중 어느 환자에서도 자가재생(Autologous recovery)은 관찰되지 않았다.
호중구 생착(절대 호중구 수 ≥ 500(연속 3일)), RBC 수혈 비의존, 및 혈소판 생착(> 혈소판수 20,000(혈소판 수혈없이 연속 7일))에 걸리는 평균시간은 이식후 각각 14일(범위: 12-24일), 35일(범위: 20-50일), 및 51일(범위: 45-60일)이었다. 처치로 회복된 I, II, 및 III 등급 급성 이식편 대 숙주 반응(GvHD )을 지닌 환자의 수는 각각 3명, 4명, 및 3명이었다. 전신성 만성 GvHD는 가장 최근의 관찰(contact)에서 일어나지 아니하였다.
수혈 의존성 지중해빈혈병 환자의 32%는 35세 이후에 생존하지 못한다(Cao, Haematologica 89:1157-1158(2004)). 몇몇 연구는 상이한 질병에서 높은 세포 ㅌ용량을 이용한 제대혈 이식 후 생존이개선됨을 증명하였다(Wagner et al., 혈액 100:1611-1618(2002); Barker et al., 혈액 105:1343-1347(2005); Locatelli et al., 혈액 93:3662-3671(1999)). 상기 유닛이 충분한 세포 용량을 함유한다고 가 정할 때, 비혈연관계 UCB는 비혈연관계 제공자 골수의 합리적인 대안이 된다. 본 연구는 더블 유닛 이식물 및/또는 가공 및 해동 기술의 선택에 의해 최대화될 수 있는, 적절한 세포 투여용량의 세팅에서, 비혈연관계 제대혈 이식이 수혈-의존성 지중해빈혈을 지닌 선별된 환자에서 급속하고 영속적인 생착을 가져올 수 있다는 것을 증명한다. 본 연구기간 동안 평균 병원 입원기간은 이식 후 77일이며(범위: 46일 내지 98일), 수혈 및 철 킬레이션화 요법을 동반하는 일반적인 장기 치료와 비교하였을 때, 명백히 삶의 질이개선되며 저렴하다.
상기 언급한 10명의 소아 환자를 포함한 수혈-의존성 지중해빈혈을 지닌 15 환자에 대한 추적연구에서, 본 발명의 제대혈 조성물을 이용한 비혈연관계 제대혈 이식은 급속하며 영속적인 생착을 가져왔다(참조: 표 6).
표 6. 케이스 요약.
Figure 112007095124372-PCT00006
Figure 112007095124372-PCT00007
a 1XCBT = 단일 유닛 제대혈 이식; 2XCBT = 더블 유닛 제대혈 이식.
b 환자들은 루카렐리 분류법의 2가지 특징들(간종대 및 빈약한 킬레이션)의 존재에 근거하여 0, 1, 또는 2로 분류된다.
c HLA 매치는 첫번째 및 두번째 제대혈 유닛에 대한 HLA 매치의 수를 나타내는(1) 및(2)와 함께 고 해상력이다.
d TNC = 총 유핵세포.
e CD34 = CD34+ 세포.
f 호중구 생착까지의 경과일수는 절대 호중구 수가 500개를 초과하는(> 500) 첫번째 연속 3일이다 - 16개 이식물 중 14개의 이식물(88%)이 생착을 이루었으며, 카플란-마이어 생착율이 93 ± 6%에 달하는 영속적인 제공자 키메라현상을 나타내었다.
g 혈소판 생착까지의 경과일수는 혈소판 수혈없이 연속 7일간 혈소판 수가 20,000개 또는 50,000개를 초과하는(> 20,000 또는 50,000) 첫번째 연속 7일이다 - 혈소판 2OK와 50K 생착율에 대한 카플란-마이어 평가는 각각 91 ± 9%와 82 ± 8%이다.
h aGvHD = I 내지 Ⅳ 등급의 이식편대숙주질환; cGvHD = 만성 이식편대숙주질환(국소성(limited, Ltd) 또는 전신성(extensive, Ext)으로 등급이 매겨짐).
l 2006년 5월 8일까지의 추적연구
j 괄호안의 생착(engrafting)중인 유닛과 함께 가장 최근의 제공자 키메라현상 데이터.
k 더블 유닛 제대혈 이식물에서 두 제대혈 유닛의 복합 세포 용량.
l 환자 7명은 페니실린-내성 연쇄구균(S. mitts) 패혈증에 기인하여 +8일째에 사망하였다.
m 환자 12명은 초기 3/6 HLA 매칭된 제대혈 이식은 실패하였으나, 연이은 더블 유닛 제대혈 이식으로 생착되었다.
n 환자 12명은 두개내출혈을 일으키는 트라우마성 사고로 인해 생착이 달성된 후 +60일째에 사망하였다.
o 추적연구의 평균 시간 및 중앙값 시간(사망한 환자 제외).
실질적으로 혈장이 제거되었으나, 적혈구는 제거되지 아니한, 동결된 제대혈 유닛을 해동시키고 세포 용량을 최대화하기 위해 세척없이 주입하였다. ABO 부적합에도 불구하고 심각한 부작용은 관찰되지 아니하였다. 골수제거(myeloablation)후, 21개 제대혈 유닛을 15명의 주요한 아시아출신 지중해빈혈 환자들에게 이식하였다(5명은 더블 비혈연관계 제대혈 이식 및 1명은 재이식). 제대혈 유닛-수혜자 쌍의 86%가 HLA 부적합를 지님에도 불구하고, 심각한 GvHD는 거의 없었으며; 모두 처치로 해결되었다. 제공자 키메리즘을 수반한 비조정된 호중구 생착 누적 빈도는 93 ± 6%이었다. 호중구 생착, RBC 수혈 비의존, 및 혈소판 생착이 이루어지는데 걸리는 시간의 중앙값 시간은 각각 16일, 35일, 및 46일이었다. 무지중해빈혈 생존율은 87 ± 9%이었고, 1년간 전반적인 생존율은 86 ± 9%이었으며, 1년간 이식 관련 사망률은 13 ± 9%이었으며, 재발율은 0%이었다. 주요 지중해빈혈 환자의 68%가 35세 이후에도 생존하며 대부분 HLA-매칭 형제가 없기 때문에, 비혈연관계 제대혈 이식은 만족할만한 생존을 가져오며 장기간의 수혈 및 킬레이션화와 비교할 때,개선된 삶의 질과 함께 저렴한 대안을 제공한다.
실시예 6. 적혈구-제거 제대혈 유닛과 혈장-제거 제대혈 유닛을 이용한 이식에 관한 오디트된 매칭쌍 분석의 비교.
본 실시예는 PD UCB 이식 대 적혈구-제거(RD) UCB 이식의 매칭쌍 분석을 실행하기 위한 절차를 설명하는데, 이는 PD UCB와 RD UCB로 수행된 조혈모세포 이식 사이의 임상적 성과에 있어서의 중대한 차이를 확인하기 위한 것이다.
매칭쌍 소급분석(Matched pair retrospective analysis)은 PD UCB와 RD UCB로 수행된 HSCT 간의 임상적 성과에서 중대한 차이를 확인하기 위한 가장 명확한 소급분석방법일 것이다. PD 및 RD UCB 이식 간의 매칭쌍 분석을 실행하기 위하여, RD 또는 PD UCB 유닛을 이식받은 환자들은 다음 우선순위에 따라 매칭 및 짝지워질 수 있다:(1) 수혜자 연령(16세 미만의 환자의 경우, ± 2 년 및 16세 이상의 환자의 경우, ± 5 년); (2) 체중(50kg 미만의 환자의 경우, ± 5kg 및 50kg 이상의 환자의 경우, ±10kg); (3) 진단; (4) HLA 매치도; (5) 이식 전 또는 이식 진행 도중의 재발, 유도 실패, 또는 내성 질환; (6) 악성종양 및 특정 질병에 대한 위험등급(예를 들어, 백혈병의 경우: 골수형성이상증(MDS)에 대한 종래 진단법에 의해 입증된 CR# 또는 CP# 및 위험도, t(9:22), t(l:19), t(4:l1), 또는 그 외㎖L 재배열을 수반하는 세포유전과 같은 고위험 세포유전(cytogenetics), 또는 MDS와 연관된 복잡한 핵형; 림프종의 경우: 림프종의 등급이 매칭되어야만 한다; 지중해빈혈의 경우: 페자로(Pesaro) 분류가 매칭되어야 한다); (7) 선택적으로 단일 대 더블 제대혈 유닛(더블 유닛 이식의 경우, 양 유닛들은 동일한 방식으로 가공되어야 한다); 및(8) 선택적으로 골수제거 대 감소된 강도. 다수의 RD UCB 이식 수혜자가 PD UCB 이식 수혜자와 매칭되는 경우, 이때에는 체중이 가장 비슷하며 그 다음에 이식이 행해진 해가 가장 가까운 RD UCB 수혜자에게 우선순위가 부여된다. RD UCB 이 식 환자가 PD UCB 수혜자에 대한 상기 모든 기준과 관련하여 매칭될 수 없는 경우, 이때에는 첫번째 우선순위로 부터 시작하여, 상위 우선순우에 따라 매칭될 수 있는 RD UCB 환자에게 우선순위가 부여된다. 매칭된 우선순위의 수에 기하여 우선순위가 부여된다. 예를 들어, 상위 5개의 우선순위와 매칭되는 RD UCB 환자는 상위 4개의 우선순위에 더하여 우선순위 6, 7, 및 8과 매칭되는 RD UCB 환자 보다 우선순위를 부여받을 수 있다.
환자들은 또한 다음과 같이 분석될 수 있다:
(1) 궁극적으로 이러한 이식의 평균 세포 용량 및 세포 용량 중앙값에 궁극적으로 영향을 미칠 수 있으며 궁극적으로 임상적 결과에도 영향을 미칠 수 있는, 2가지 유형의 가공이 가공후 유핵세포 재생도에 있어서 이론적으로 다르기 때문에, 유핵세포 및 CD34 세포 용량은 초기에 매칭되지 아니할 것이다. PD 및 RD 유닛 사이에서 중대한 차이가 나타나는 경우, 이때에는(a) 유핵세포 용량(서로에 대하여 ± 0.5 x 107/kg) 또는(b) CD34+ 세포 용량(서로에 대하여 ± 0.25 x 105/kg)과 유사한 매칭쌍이 세포 용량이 유사하지 않은 쌍과 비교될 수 있다. 통계적으로 중대한 차이가 2가지 유형의 제대혈 사이에서 관찰되고, 세포 용량이 주요한 원인이라면, 이때에는 세포 용량에서 매칭된 쌍들이 세포 용량에서 매칭되지 않는 쌍들보다 PD와 RD 유닛 간의 임상적 성과에서 보다 적은 차이를 나타내야 한다는 것이 추론된다. 대안으로, 용량 매칭쌍 및 용량 비매칭쌍 둘 모두에 있어서 성과상의 차이가 PD와 RD 유닛 사이에 존재한다면, 이때에는 세포 용량은 임상적 성과에서 차이 를 설명하는 유일한 메카니즘이 되지 못할 수 있다. PD와 RD 그룹 모두에 대한 세포 용량 계층분석이 세포 용량이 매칭될 때 임의의 차이가 존재하는지 여부를 알아보기 위하여 이용될 수 있다.
(2) 악성종양의 경우, 이전에 이식받은 적이 없고 경감이 진행 중에 이식이 실행된 이식쌍들이 이전에 이식을 받은 적이 있는 쌍 및/또는 이식이 재발(유도 실패) 진행 도중에 실행된 쌍, 또는 내성질환을 지닌 쌍과 대비될 수 있다. 가능하다면, 환자들 중 2명의 코호트를(1) 성별,(2) CMV 혈청양성반응성(sero-positivity),(3) 이식 사전-동결 또는 동결보존 및 해동후 유핵세포 및 CD34+ 세포 용량,(4) 이식의 해(year),(5) 평균(median) 추적연구기간,(6) 진단에서 이식까지의 소요시간; (7) 이식 지역(미국, 서유럽, 오스트레일리아, 중앙 아메리카 또는 남아메리카, 아시아), 및, 가용한 경우,(8) 전처치요법(conditioning regimen)에 관하여 비교할 수 있다.
PD와 RD UCB 유닛 사이의 매칭쌍 분석을 위하여, 하기 연구 종점이 이용될 수 있다:
I. 일차 결과:
1. 이식후 12개월째의 전반적인 생존율.
2. 지속된 호중구 생착의 비조정된 누적 빈도(예상된 생착 기간 이전의 사망 때문에 비조정됨).
3. 지속된 호중구 생착 속도.
II. 2차 결과:
1. 이식후 12개월째의 무질병 생존율.
2. 이식후 12개월째의 TRM.
3. 지속된 호중구 생착의 비조정된 누적 빈도(예상된 생착 기간 이전의 사망 때문에 비조정됨).
4. 지속된 혈소판 생착 속도.
5. 급성 및 만성 이식편대숙주질환(GVHD)의 발병률 및 극심도.
6. 악성종양의 재발 빈도.
7. 주입후 부작용의 발생빈도 및 극심도.
실시예 7. 동결된 제대혈 유닛의 해동 및 직접 주입 절차.
본 실시예는 임의의 세척 단계를 실행하지 아니한 본 발명의 혈장-제거된, 동결보존된 제대혈 유닛의 해동 및 직접 주입을 위한 프로토콜에 대하여 설명한다.
환자가 신생아가 아니고 손상된(compromized) 신장 기능을 지니지 않는 경우에, 하기 프로토콜이 바람직할 수 있는데, 이는 세척 및 해동 후 지연된 조작에 따라 생존력있는 유핵세포의 불가피하게 소실되는 것이 최소화되기 때문이다. 이러한 접근법은 표준적인 처치로 용이하게 치료될 수 있는 특발성 부작용 만을 지니는 환자에서 바람직한 내성을 생성시킨다. 그 결과로서, 가장 높은 용량의 생존력있는 줄기세포가 안전하고 효과적으로 이러한 투여가 요구되는 환자에게 주입될 수 있다.
해동전 주의사항:
단계 행동
1 가능하면, 환자의 침대 옆에서 제대혈을 해동시켜라. 환자는, 유닛 내의 유리 헤모글로빈의 양 뿐만 아니라, 유닛내의 ABO/Rh 부적합 적혈구의 존재가능성을 고려하여, 이식 센터의 평소 관행에 따라 사전-투약(pre-medication) 받아야 한다.
2 동결된 제대혈 유닛을 -135℃미만의 온도로 상기 유닛을 유지할 허가된 액체 질소 저장 용기에 담아 환자의 침상 곁으로 옮긴다.
3 제대혈 산물을 해동하기 전에, 환자 및 제대혈 유닛에 대한 식별항목(identity)을 확인한다.
4 경우에 따라, 제대혈 유닛은 2개의 냉동보존용 백 또는 더블 유닛 이식에 이용되는 제대혈 2 유닛에 들어 있을 수 있다. 1개의 백만 1시간에 해동되어야 하며, 첫 번째 백이 다른 백의 해동 전에 안전한 상태에서 환자에게 주입이 완료되어야 한다. 유사하게, 첫 번째 제대혈 유닛이 들어 있는 백(들)은 두 번째 제대혈 유닛이 들어 있는 백(들)의 해동 전에 안전한 상태에서 환자에게 주입이 완료되어야 한다.
5 상기 유닛의 주입이 완료된 후 상기 백내에 남아 있는 부착된 조각 또는 잔여물을 이용하여 상기 제대혈 유닛에 대한 검사를 실행한다.
6 일단 해동되면, 제대혈 유닛은 즉시 주입되어야만 한다. 일단 제대혈 유닛이 해동되거나 부분적으로 해동된 경우에는, 이를 재동결시켜서는 안된다.
제대혈 유닛 해동:
단계 행동
1 제대혈 유닛이 완전히 잠길 수 있을 정도의 충분한 양의 멸균수를 수조에 채운다.
2 수온이 37℃±2℃가 되게 한다. 수조의 물은 해동 과정 내내 상기 온도로 유지되어야 한다.
3 수조의 옆에서 플라스틱 백(바람직하게는 멸균된 백)을 테이핑한다. 상기 백이 밀봉될 수 있으면, 아직까지 수조에 넣지 아니한다. 상기 백은 제대혈 유닛을 담은 상기 냉동보관용 백이 손상되어, 그 결과 누수가 일어나는 경우에 상기 제대혈 유닛을 구하는데 사용된다.
4 금속 카세트로부터 동결된 유닛을 주의하여 꺼내고, 유닛에 대한 식별항목(identity)를 확인하고, 상기 백의 파손 여부를 검사한다.
5 상기 제대혈 유닛이 물과 직접 접촉하게 되는 것을 방지하기 위하여 동결된 제대혈 유닛을 플라스틱 백에 넣는다. 밀봉되지 않은 백의 경우, 상기 플라스틱 백의 바깥쪽에서 제대혈을 부드럽게 주무르고, 이때 상기 플라스틱 백에 물이 묻지 않게 주의한다.
6 밀봉된 백의 경우, 공기의 대부분이 빠져나간 후에 백을 밀봉하고, 상기 백을 물속에 담그고, 상기 플라스틱 백을 거쳐서 제대혈 유닛을 부드럽게 주무름으로써 제대혈 유닛을 해동시킨다.
7 해동 과정이 진행되는 동안의 어느 시점에도 상기 제대혈을 사람이 없는 상태에서 방치해서는 안된다.
8 해동을 진행하면서 상기 제대혈 백을 확인한다. 누수가 있다면, 파손 또는 누수가 있는 생성물의 주입 및 잠재적 오염 가능성이 있는 생성물을 주입받은 환자에 대한 모니터링 및 예방 항미생물 처치에 관한 내부 프로토콜을 준수한다.
9 조금 "녹은" 상태가 되자마자(완전히 해동된 상태는 아님) 물에서 제대혈 유닛을 꺼낸다. 외부 플라스틱 백에서 동결보존용 백을 꺼내고, 알코올 와이프로 주입부를 소독한다.
주입:
단계 행동
1 세포 절단을 가능한 최소화시키기 위해 가장 넓은 구멍의 바늘을 이용하여 동결보존용 백의 살균된 포트 중 하나를 통해 생성물을 멸균 60cc 주사기 내로 즉시 그리고 가능한한 신속하게 끌어올린다. 외부 플라스틱 백으로의 누출이 있는 경우, 외부 백으로부터 동결보존용 백을 조심스럽게 분리시키고, 멸균된 주입 포트를 통해 동결보존용 백 내의 임의의 잔류 생성물을 끌어올린 후, 외부 플라스틱 백으로부터 누출된 생성물을 조심스럽게 끌어올린다.
2 그런 다음 가능한 빨리(예를 들어, 5-10㎖/min) 주사기 안의 생성물이 중심관(central line)을 통해 정맥 내(IV)로 들어가게 한다.
3 동결보존용 백은 8% 덱스트란/5% 인간 혈청 알부민 10 내지 20cc으로 헹구어 질 수 있다.
4 두 번째 제대혈 백을 해동시키되, 가능하면, 첫 번째 백이 완전히 주입된 후에 해동시킨다.
조혈모세포 투여와 연관된 잠재적인 역반응:
유순 내지 적당:
빈번한 반응: 메스꺼움, 구역질, 고혈압, 저혈압, 서맥(bradycardia), 혈색뇨증, 몸의 떨림, 달콤한 크림 옥수수(sweet cream corn) 또는 마늘 맛(DMSO 날숨(expiration)에 기인함)
덜 빈번한 반응: 두통, 복통(abdominal cramps), 설사, 플러싱(flushing), 오한, 발열, 플러싱, 가슴 답답함, 현기증, 뇌질환, 발작, 서맥, 고빌리루빈혈증, 혈청 트랜스아미나제 수준의 증가.
극심 내지 생명 위협:
극히 드물고(1,410명의 환자를 대상으로 한 가장 광범위하게 공개된 연구에서 ~0.4%), 일반적으로 자기 한정적임.
심장: 서맥, 심장 블록, 부정맥, 쇼크, 심정지.
신경: 뇌질환(수혜자 체중(kg) 당 2g을 초과한 DMSO와 관련되어 있을 가능성이 있으며 혈장사혈(plasmapheresis)로 치료될 수 있음), 발작.
폐: 호흡부전(respiratory depression)
면역: 과민성 반응(anaphylactic reacton)
신장: 고농도의 유리 헤모글로빈으로 인한 급성 신장부전(항히스타민제 및 코르티코이드를 이용한 사전-투약, 적당한 수화, 소변의 알칼리화, 만니톨 이뇨에 의해 완화됨).
잠재적 역반응의 원인:
DMSO 독성: 사람에 대한 DMSO의 급성 독성 용량이 결정되지는 아니하였을 지라도, DMSO의 정맥내(IV) 투여에 대한 LD50 값(즉, 시험 동물의 50%를 죽이는 데 필요한 DMSO의 양)은 생쥐의 경우 3.1-9.2g/kg, 개의 경우 2.5/kg, 및 원숭이의 경우 11g/kg 초과이다. 대부분의 공개된 보고에서 DMSO 용량은 1g/kg 이하로 유지되었다. 본 발명의 전형적인 제대혈 유닛에서, 최대 DMSO 용량은 약 7.5(1백) 내지 약 15g(2백) 사이이다. 따라서, 저하된(comprimized) 신장 기능을 지닌 환자 및 작은 환자의 경우(예를 들어, 이러한 환자들은 1백에 7kg 이하 및 2개 백이 동시에 투여되는 경우, 15kg이하로 투여받게 됨), 적당한 세포 용량을 달성하는 것이 문제가 되지 않는 경우, 생성물의 세척이 권장된다. 10% DMSO 동결보존된 줄기세포 생성물의 바람직한 주입속도는 분당 약 5 내지 약 10㎖ 사이이다.
부피 과부하( Volumn Overload ): 이식되어야 할 최대 부피의 범위는 약 5 내지 약 15㎖/kg/용량 이내이어야만 한다.
주요 ABO 혈액형 부적합: 환자와 제공자 사이의 ABO 혈액형 부적합이 제대혈 이식에서 논쟁거리가 되지는 않았으나, 하기 추가 정보가 주요 혈액형이 부적합한 경우(예를 들어, 환자의 혈액형은 O형이고 제대혈 유닛의 혈액형은 O형이 아닌 경우)에 제공된다. 주요 ABO 부적합 적혈구의 대규모 부피의 수혈이 상당한 역가의 항-A 및/또는 항-B를 보유한 환자에서 수혈 반응을 일으키는 것으로 알려져 있으나, 벤싱거 등의 논문은(Bensinger et al., Transplantation 33:427-429(1982)), 수혜자의 항-A 및 항-B 헤마글루니틴 역가가 1:16 또는 그 미만일 때, 전 유닛의 ABO 부적합 적혈구가 안전하게 수혈될 수 있다는 것을 강조하였다. 사우어-헤일본 등의 논문은(Sauer-Heilborn et al., Transfusion 44:907-916(2004)), ABO 부적합 말초혈액 줄기세포(PBSC) 및 골수 유닛의 수혈에서 얻을 경험에 대하여 기술하고 있으며, 골수 성분 수혈(적혈구 부피 = 300-400㎖)에 비하여 PBSC 유닛 수혈(적혈구 부피 = 75-100㎖)에서 위험도가 더 낮다는 것을 강조하고 있다. 본 발명의 제대혈 유닛에서 적혈구의 부피는 약 40 내지 약 100㎖이다. 이러한 적혈구의 부피는 심각한 역효과를 일으키지 아니하는 것으로 알려져 있으나, 체온 상승, 혈압 증가, 및 근육 통증과 같은 증상이 발생할 수는 있다. 갈색(Dark) 또는 적색을 띤 소변과 혈장이 제대혈 샘플 내의 용혈 때문에 예상된다. 주입 속도는, 근접 환자 모니터링과 함께, 약 5 내지 약 10㎖/분이어야 한다. 특정 경우에, 환자는 해열제, 항히스타민제, 및/또는 코르티코스테로이드를 사전-투약받을 수 있고 충분히 수분을 섭취하고 있어야 한다. 역반응은 대개 주입이 진행되는 동안 발생하고 주입이 정지된 후 해소된다. 그러나, 일부 반등들은 주입의 완료 후에도 약 6 내지 7시간 지속될 수 있으므로, 환자는 이러한 시간 내내 모니터링되어야 한다.
일반적인 사전-투약 섭생은 적당한 수화(예를 들어, 주요 ABO 미스매치), 항 히스타민제(예를 들어, 주요 ABO 미스매치), 코르티코스테로이드, 만니톨, 구토방지제, 및 해열제(예를 들어, 주요 ABO 미스매치)를 포함하나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 부작용에 대한 일반적인 치료적 조정의 비제한적인 예는 이뇨제 {예를 들어, 부피 과부하), 경련억제제(예를 들어, 발작), 아트로핀(예를 들어, 서맥), 혈장사멸(예를 들어, 뇌질환), O2(예를 들어, 폐기능 저하),및 마약(narcotics)을 포함한다.
실시예 8. 해동, 복원, 및 동결 제대혈 유닛의 해동, 복원, 및 주입 절차.
본 실시예는 본 발명의 혈장-제거된, 동결보존된 제대혈 유닛의 해동, 복원, 및 주입에 관한 프로토콜을 설명한다.
부피 과부하가 심각하게 고려되지 않는 특정 상황에서, 본 발명의 제대혈 유닛의 점도를 감소시키고 중력 매개 정맥내(IV) 주입을 용이하게 하기 위하여, 상기 유닛은 하기 프로토콜에 따라 사람 혈청 알부민/젠트란(Gentran) 용액 부피의 약 2배로 희석 또는 복원될 수 있다. 이것은 희석된 후의 유닛 중의 DMSO 농도 및 줄기세포에 대한 임의의 잠재적인 DMSO-유발 독성을 감소시키고, 또한 해동과 주입 사이에 보다 많은 시간을 허여한다. 이의 이점은 투여의 용이 및 투여에 대한 지연된 시간을 포함한다.
해동 전 주의사항:
단계 행동
1 생물학 실험용 안전 캐비닛에서 동결된 제대혈 유닛을 해동시킨다.
2 환자는, 유닛 내의 DMSO(7.5 내지 15g) 및 유리 헤모글로빈의 양 뿐만 아니라, 유닛내의 ABO/Rh 부적합 적혈구의 존재가능성을 고려하여, 이식 센터의 평소 관행에 따라 사전-투약(pre-medication) 받아야 한다.
3 제대혈 산물을 해동하기 전에, 환자 및 제대혈 유닛에 대한 점검사항을 확인한다.
4 경우에 따라, 제대혈 유닛은 2개의 냉동보존용 백 또는 더블 유닛 이식에 이용되는 제대혈 2 유닛에 들어 있을 수 있다. 1개의 백만 1시간에 해동되어야 하며, 첫 번째 백이 다른 백의 해동 전에 안전한 상태에서 환자에게 주입이 완료되어야 한다. 유사하게, 첫 번째 제대혈 유닛이 들어 있는 백(들)은 두 번째 제대혈 유닛이 들어 있는 백(들)의 해동 전에 안전한 상태에서 환자에게 주입이 완료되어야 한다.
5 상기 유닛의 주입이 완료된 후, 상기 백 내에 남아 있는 부착된 조각 또는 잔여물을 이용하여 상기 제대혈 유닛에 대한 검사를 실행한다.
6 일단 해동되면, 제대혈 유닛은 즉시 희석되거나 복원되어야만 한다. 일단 제대혈 유닛이 해동되거나 부분적으로 해동된 경우에는, 이를 재동결시켜서는 안된다.
7 복원 백의 중량을 측정하여야 한다.
사람 혈청 알부민/제트란 복원 용액의 제조:
단계 행동
1 해동 백 세트 및 양 혈장 운반 세트 상의 롤러 클램프를 닫는다.
2 혈장 운반 세트의 한쪽 말단과 함께 해동 백 세트 중 #1 백의 주입 포트에 스파이크를 박는다.
2 알코올솜(Alcohol prep.)과 함께 사람 혈청 알부민(HSA)을 담은 50㎖ 바이얼의 뚜껑을 제거하고 고무 격막(diaphragm)을 깨끗이 한다.
3 혈장 운반 세트의 다른쪽 말단과 함께 HLA 격막에 스파이크를 박는다.
4 바이얼에 구멍을 뚫기 위해 혈장 스파이크 바로 옆의 HSA 격막에 피하주사침을 삽입한다.
5 부피가 100㎖ 또는 그 미만인 제대혈의 경우: ·상기 HSA 바이얼 백 #1을 들어 올리고, 롤러 클램프를 열고, 상기 바이얼의 내용물 전체(50㎖)를 백 #1으로 흘려 넣는다. 부피가 100㎖를 초과하는 제대혈의 경우: ·HSA 바이얼 2개(총계 100㎖)을 이용하고 상기 두 바이얼의 모든 내용물을 백 #1에 흘려 넣는다.
6 백 #1이 주입부 근처의 HSA 바이얼과 백 #1 사이의 튜빙을 가열하여 밀봉시킨다.
7 두 번째 혈장 운반 세트와 함께 백 #1의 나머지 주입 포트에 스파이크를 박는다.
8 상기 혈장 운반 세트의 다른 쪽 말단과 함께 젠트란 40 백의 주입 포트에 스파이크를 박는다.
9 전자저울 위에 상기 백 #1을 올려놓고 0에서 중량을 측정한다.
10 부피가 100㎖ 또는 그 미만인 제대혈의 경우: ·롤러클램프를 열고 200 그램의 젠트란 40을 백 #1에 흘려 넣는다. 부피가 100㎖를 초과하는 제대혈의 경우: ·롤러클램프를 열고 400 그램의 젠트란 40을 백 #1에 흘려 넣는다.
11 백 #1 근처의 혈장 운반 튜빙을 가열하여 밀봉하고 상기 튜빙을 폐기한다.
12 백 #1의 최종 부피는 250㎖ 또는 500㎖이 되어야 한다(HSA의 경우 최종 농도의 5%이고 젠트란의 경우 8%임).
13 세척 용액을 제조하였던 날짜와 시간 및 세척용액을 제조한 기술자의 이니셜을 백 #1에 표기한다.
14 해동 백 세트의 3개의 백 각각에 동결된 제대혈 유닛의 유닛 번호를 기록하거나, 유닛 식별 라벨을 붙인다.
15 세척 용액과 함께 해동 백 세트를 2℃내지 8℃ 냉장고에 넣고 30분 이상 서늘하게 보관한다. 일단 제조된 세척 용액은, 24시간 이내에 사용하여야 한다.
제대혈 유닛 해동:
단계 행동
1 제대혈 유닛을 완전히 담그기 위하여 충분한 양의 멸균수를 수조에 채운다.
2 수조 안의 물의 온도가 37℃±2℃가 되게 한다. 수조 안의 물은 해동 과정 내내 상기 온도로 유지되어야 한다.
3 수조의 옆에서 플라스틱 백(바람직하게는 멸균된 백)을 테이핑한다. 상기 백이 밀봉될 수 있으면, 아직까지 수조에 넣지 아니한다. 상기 백은 제대혈 유닛을 담은 상기 냉동보관용 백이 손상되어, 그 결과 누수가 일어나는 경우에 상기 제대혈 유닛을 구하는데 사용된다.
4 금속 카세트로부터 동결된 유닛을 주의하여 꺼내고, 유닛에 대한 점검사항을 확인하고, 상기 백의 파손여부를 검사한다.
5 상기 제대혈 유닛이 물과 직접 접촉하게 되는 것을 방지하기 위하여 동결된 제대혈 유닛을 플라스틱 백에 넣는다. 이 단계는 상기 유닛이 액체 질소에서 꺼내어 지고, 식별항목에 대한 확인 및 유닛에 대한 검사를 완료하자마자 실행되어야 한다. 밀봉되지 않은 백의 경우, 상기 플라스틱 백의 바깥쪽에서 제대혈을 부드럽게 주무르고, 이때 상기 플라스틱 백에 물이 묻지 않게 주의한다. 동결보존용 백의 파손이 발견된 경우, 백의 내용물은 플라스틱 백의 외부로 누출될 가능성이 있기 때문에 오염을 최소화하는 것이 중요하다.
6 밀봉된 백의 경우, 공기의 대부분이 빠져나간 후에 백을 밀봉하고, 상기 백을 물속에 담그고, 상기 플라스틱 백을 거쳐서 제대혈 유닛을 부드럽게 주무름으로써 제대혈 유닛을 해동시킨다.
7 해동 과정이 진행되는 동안의 어느 시점에도 상기 제대혈을 사람이 없는 상태에서 방치해서는 안된다.
8 해동을 진행하면서 상기 제대혈 백의 누수 여부를 확인한다. 누수가 있다면, 파손 또는 누수가 있는 생성물의 주입 및 잠재적 오염 가능성이 있는 생성물을 주입받은 환자에 대한 모니터링 및 예방 항미생물 처치에 관한 내부 프로토콜을 준수한다. 제대혈을 버려서는 안된다.
9 "녹은 얼음(icy slushy)" 상태가 되자마자, 물에서 제대혈 유닛을 꺼낸다. 외부 플라스틱 백으로부터 동결보존용 백을 꺼내고, 알코올 와이프로 주입 포트를 소독한다. 이러한 해동 단계는 5분 이상이 걸려서는 안된다.
제대혈 생성물 희석 또는 복원:
단계 행동
1 세포 절단을 가능한 최소화시키기 위해 가장 넓은 구멍의 바늘을 이용하여 동결보존용 백의 살균된 포트 중 하나를 통해 생성물을 멸균 60cc 주사기 내로 즉시 그리고 가능한한 신속하게 끌어올려 수용시킨다. 외부 플라스틱 백으로의 누출이 있는 경우, 외부 백으로부터 동결보존용 백을 조심스럽게 분리시키고, 멸균된 주입 포트를 통해 동결보존용 백 내의 임의의 잔류 생성물을 끌어올린 후, 외부 플라스틱 백으로부터 누출된 생성물을 조심스럽게 끌어올린다.
2 이후, 주사기 내의 제대혈 생성물을 가능한 신속하게 복원 백으로 즉시 밀어 넣는다. 제대혈 생성물의 점성으로 인해, 상당한 저항력이 예상된다.
3 이제 제대혈 생성물이 담겨 있는 복원 백의 중량을 재고, 생성물의 중량과 빈 복원 백의 중량 사이의 차이로부터 해동된 제대혈 생성물의 중량 및 부피를 결정한다.
4 5% 인간 혈청 알부민/8% 덱스트란(HSA/젠트란) 복원 용액의 2배 부피를 복원 백에 첨가한다. 희석을 5분 이상 하지 않는다. 예를 들어, 제대혈 유닛이 75cc의 해동된 부피 또는 75g의 해동된 중량을 지니는 경우, 150cc의 HSA/젠트란 복원 용액을 첨가한다.
5 복원 단계는 5분을 초과하여서는 안된다.
주입:
단계 행동
1 즉시 그리고 가능한 한 신속하게 상기 유닛을 환자의 병실로 가져가고, 복원 백을 걸음으로써 중심관을 통해 생성물이 주입되게 한다. 해동되고 복원된 생성물은 약 30분 이내에 주입되어야 한다. 생성물의 점성이 너무 크고 잘 흐르지 않는 경우, 생성물을 가볍고 천천히 눌러 주어 주입을 돕는다.
2 적절한 경우, 첫 번째 백이 완전히 주입되고, 환자의 안정성 및 내성이 확인된 후에만 두 번째 제대혈 백을 해동시킨다.
3 해동으로부터 이동, 이동으로부터 주입까지, 전체 과정은 60분을 초과해서는 안된다.
조혈모세포 투여와 관련된 잠재적 부작용:
유순 내지 적당:
빈번한 반응: 메스꺼움, 구토, 고혈압, 저혈압, 서맥, 혈색소뇨증, 오한, 단 크림 옥수수 또는 마늘 맛(DMSO 호기에 의함).
덜 빈번한 반응: 두통, 복통, 설사, 홍조, 오한, 열, 홍조, 흉부 압박, 현기증, 뇌병증, 발작, 서맥, 고빌리루빈혈증, 증가된 혈청 트랜스아미나아제 수준.
극심 내지 생명 위협:
매우 드물고(1,410명의 환자를 대상으로 한 가장 광범위하게 공개된 연구에 서 ~0.4%)하고, 일반적으로 자기 한정적임.
심장: 서맥, 심차단, 부정맥, 쇼크, 심장 정지.
신경: 뇌병증(수혜자 체중 kg당 2 g을 초과하는 DMSO와 관련되어 발생 가능하고, 혈장분리반출술에 의해 치료가능), 발작.
폐: 폐 기능 저하
면역: 과민성 반응
신장: 고 농도의 유리 헤모글로빈에 기인한 급성 신부전(항히스타민제 및 코르티코이드를 이용한 사전-투약, 적당한 수화, 소변의 알칼리화, 만니톨 이뇨에 의해 완화됨).
잠재적 부작용의 원인:
DMSO 독성:
인간에 대한 DMSO의 급성 독성은 확인되지 않았으나, DMSO의 IV 투여에 대해 보고된 LD50 값(즉, 시험 동물의 50%를 사멸시키는데 필요한 DMSO의 양)은 마우스의 경우 3.1 내지 9.2 g/kg이고, 개의 경우 2.5/kg이고, 원숭이의 경우에는 11g/kg을 초과한다. 대부분 공개된 보고는 DMSO 용량을 1g/kg 미만으로 제한한다. 본 발명의 전형적인 제대혈 유닛에서, 최대 DMSO 용량은 약 7.5(1개의 백) 내지 약 15 g(2개의 백)이다. 따라서, 저항력 저하 신장 기능을 지닌 환자 및 작은 환자의 경우(예를 들어, 이러한 환자들은 1백에 7kg 이하 및 2개 백이 동시에 투여되는 경우, 15kg이하로 투여받게 됨), 적당한 세포 용량을 달성하는 것이 문제가 되지 않는 경우, 생성물의 세척이 권장된다. 10% DMSO 동결보존된 줄기세포 생성물의 바 람직한 주입 속도는 분당 약 5 내지 약 10㎖ 사이가 되어야 한다.
부피 과부하: 주입되는 최대 부피의 범위는 약 5 내지 약 15㎖/kg/용량 이내이어야 한다.
주요 ABO 혈액형 부적합: 환자와 제공자 사이의 ABO 혈액형 부적합은 제대혈 이식에 있어서는 문제가 되지 않지만, 주요 혈액형 부적합의 경우, 예를 들어, 환자의 혈액형이 O형이고 제대혈이 O형이 아닌 경우 하기의 추가 정보가 제공된다.
주요 ABO 부적합 적혈구의 다량의 주입은 유의한 역가의 항-A 및/또는 항-B를 지닌 환자에서 수혈 부작용을 일으키는 것으로 공지되어 있으나, 벤싱어 등의 논문은(Bensinger et al., Transplantation 33:427-429(1982)), 수혜자의 항-A 및 항-B 헤마글루티닌 역가가 1:16 이하인 경우, ABO 부적합 적혈구의 전체 유닛이 안전하게 주입될 수 있다는 것을 강조하고 있다. 사우어-헤일본 등의 논문은(Sauer-Heilborn et al., 수혈 44:907-916(2004)) ABO 부적합 말초 혈액 줄기세포(PBSC) 및 골수 유닛의 수혈 경험에 대해 기술하고 있고, 골수 성분(적혈구 부피 = 300-400㎖)에 비해 PBSC 유닛(적혈구 부피 = 75-100㎖) 수혈의 위험이 낮다는 것을 강조하고 있다. 본 발명의 제대혈 유닛의 부피는 약 40 내지 약 100㎖이다. 적혈구의 이러한 부피는 심각한 부작용을 야기시키는 것으로 공지되어 있지 않지만, 체온 상승, 맥박 증가, 및 근육통과 같은 증상이 발생할 수 있다. 제대혈 샘플 내의 용혈로 인해 갈색 또는 붉은색 소변 및 혈장이 예상된다. 주입 속도는 환자를 주의 깊게 모니터하면서, 약 5 내지 10㎖/분으로 유지되어야 한다. 특정 예에서, 환자는 해열제, 항히스타민, 및/또는 코르티코스테로이드를 사전-투약 받을 수 있으며, 상기 약물들은 충분히 수화되어 있어야 한다. 부작용은 보통 주입 동안에 발생하고, 주입이 중지된 후 해소된다. 그러나, 몇몇 반응은 주입 완료 후 약 6 내지 7 시간 경과시 발생할 수 있으므로, 환자는 상기 시간 동안 모니터링되어야 한다.
일반적인 사전-투약 섭생은 적절한 수화(예를 들어, 주요 ABO 미스매치), 항히스타민(예를 들어, 주요 ABO 미스매치, 코르티코스테로이드, 만니톨, 항구토제, 및 해열제(예를 들어, 주요 ABO 미스매치)를 포함하나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 부작용에 대한 통상적인 치료 시술의 비제한적인 예는 이뇨제(예를 들어, 부피 과부하), 항경련제(예를 들어, 발작), 아트로핀(예를 들어, 서맥), 혈장분리반출술(예를 들어, 뇌병증), O2(예를 들어, 폐 기능 저하), 및 마약제를 포함한다.
상기 기술은 예시를 위한 것으로, 본 발명을 이에만 한정하고자 하는 바가 아님이 이해되어야 한다. 다수의 구체예들은 상기 기술에 의해 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 기술을 참조로 하여 결정되는 것이 아니라, 첨부된 청구의 범위를 참고로 하여 결정되어야 하며, 이러한 청구의 범위와 동등한 모든 범위에 권리가 인정되어야 한다. 특허 출원서, 특허, 및 PCT 공개공보를 포함하는 모든 문헌 및 참고의 기술은 모두 참조를 목적으로 본원에 포함된다.

Claims (66)

  1. 부피당 50% 이상의 적혈구 및 항응고물질을 포함하는 제대혈(umbilical cord blood, UCB) 조성물로서, 혈장은 실질적으로 제거되어 있으나 적혈구는 비제거된, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 UCB 조성물이 부피당 약 65% 이상의 적혈구를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 UCB 조성물이 부피당 약 0% 내지 약 30%의 혈장을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 줄기세포를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 줄기세포가 조혈모세포(hematopietic stem cell)임을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 UCB 조성물이 부피당 약 5% 내지 약 40%의 항응고물질을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 UCB 조성물이 부피당 약 5% 내지 약 20%의 항응고물질을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 항응고물질이 시트르산, 구연산나트륨, 인산나트륨, 덱스트로즈, 아데노신, 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 물질임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 동결방호제(cryoprotectant)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 UCB 조성물이 부피당 약 5% 내지 약 15%의 동결방호제를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 동결방호제가 디메틸 술폭시드(DMSO)임을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 동결방호제가 DMSO 및 젠트란(젠트란) 40의 혼합물임을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 9항에 있어서, 상기 동결방호제가 DMSO 및 히드록시에틸 전 분(hydroxyethyl starch, HES)의 혼합물임을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 9항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 적혈구의 농도가 약 3.2 x 106 개 적혈구/㎕ 이상임을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 9항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 적혈구의 농도가 약 3.8 x 106 개 적혈구/㎕ 이상임을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 9항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 적혈구의 수가 약 1 x 109 내지 약 2.5 x 109 개임을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 9항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 백혈구의 농도가 약 15 x 103 백혈구/㎕임을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 9항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 백혈구의 수가 약 9O x 1O7 개 이상임을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 9항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 CD34+ 세포의 수가 약 1 x 106 내지 약 5 x 107 개임을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 9항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 총 유핵세포(nucleated cell)의 수가 약 9O x 1O7 내지 약 30O x 1O7 개임을 특징으로 하는 조성물.
  21. 부피당 약 50% 이상의 적혈구 및 항응고물질을 포함하는 제대혈(umbilical cord blood, UCB) 조성물로서, 적혈구의 농도가 약 3.2 x 106 개 적혈구/㎕ 이상이며, 혈장이 실질적으로 제거되어 있으나 적혈구는 비제거된 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 UCB 조성물이 부피당 약 65%의 적혈구를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 UCB 조성물이 부피당 약 0% 내지 약 30%의 혈장을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 21항에 있어서, 동결방호제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 적혈구의 농도가 약 3.8 x 106 개 적혈구/㎕이상 임을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 적혈구의 수가 약 1 x 109 내지 약 2.5 x 109 개임을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 24항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 백혈구의 농도가 약 15 x 103 개 백혈구/㎕임을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 24항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 백혈구의 수가 약 9O x 1O7 개 이상임을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제 24항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 CD34+ 세포의 수가 약 1 x 106 내지 약 5 x 107 개임을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 24항에 있어서, 상기 UCB 조성물에 포함된 총 유핵세포(nucleated cell)의 수가 약 9O x 1O7 내지 약 30O x 1O7 개임을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 9항 또는 제 24항의 조성물을 유효한 양으로 포유동물 피검체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조혈 체계와 연관된 양성 질환 또는 양성종양 장애를 치료하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 양성 질환이 혈액암(hematologic malignancy)임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 혈액암이 급성 림프모세포성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myelogeneous leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 골수형성이상 장애(myelodysplastic disorders), 유년기 만성 골수성 백혈병(juvenile chronic myelogenous leukemia), 및 비호치킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)으로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 31항에 있어서, 상기 조혈 체계와 연관된 상기 양성종양 장애가 혈색소병증(hemoglobinopathy), 골수 부전 증후군(bone marrow failure syndrome), 면역결핍(immune deficiency), 대사병/축적병(metablolic/storage disease), 호중구 장애(neutrophile disorder), 혈소판병증(platelet disease), 및 자가면역장애(autoimmune disorder)로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 혈색소병증이 지중해빈혈(thalassemia)임을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 34항에 있어서, 상기 혈색소병증이 겸상적혈구병(sickle cell disease)임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 전체 제대혈 또는 적혈구가 제거된 제대혈에 비하여 상기 포유동물 피검체에서 호중구 생착의 누적 빈도를 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 전체 제대혈 또는 적혈구가 제거된 제대혈에 비하여 상기 포유동물 피검체에서 혈소판 생착의 누적 빈도를 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 전체 제대혈 또는 적혈구가 제거된 제대혈에 비하여 상기 포유동물 피검체에서 호중구 생착 속도를 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 전체 제대혈 또는 적혈구가 제거된 제대혈 에 비하여 상기 포유동물 피검체에서 혈소판 생착 속도를 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 전체 제대혈, 적혈구가 제거된 제대혈, 골수, 또는 말초혈액 줄기세포에 비하여 상기 포유동물 피검체에서 무질병 생존율을 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 전체 제대혈, 적혈구가 제거된 제대혈, 골수, 또는 말초혈액 줄기세포에 비하여 상기 포유동물 피검체에서 장기이식과 관련된 사망률을 감소시킴을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 전체 제대혈, 적혈구가 제거된 제대혈, 골수, 또는 말초혈액 줄기세포에 비하여 상기 포유동물 피검체에서 전반적인 생존율을 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 골수 또는 말초혈액 줄기세포에 비하여 상기 포유동물 피검체에서 급성 및 만성 이식편대숙주 질환의 발생률을 감소시킴을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 상기 포유동물 피검체에 복합 용 량(multiple dose)으로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 복합 용량이 단일 용량(single dose)에 비하여 상기 포유동물 피검체에서 재발율을 감소시킴을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 골수 또는 말초혈액 줄기세포와 조합되어 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 해동 단계 및 상기 포유동물 피검체에게 투여하는 단계 사이에 비세척됨을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 해동 단계 및 상기 포유동물 피검체에게 투여하는 단계 사이에 세척됨을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 해동 단계 및 상기 포유동물 피검체에게 투여하는 단계 사이에 희석됨을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 31항에 있어서, 상기 조성물이 주입(infusion)에 의해 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 31항에 있어서, 상기 포유동물 피검체가 사람임을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 사람의 체중이 약 50kg 또는 이를 초과함을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 52항에 있어서, 상기 사람의 체중이 약 50kg 또는 그 미만임을 특징으로 하는 방법.
  55. 항응고물질을 함유한 UCB 샘플로부터 소정 부피의 혈장을 제거하는 단계를 포함하는, 제 1항 또는 제 21항의 제대혈(UCB) 조성물을 제조하는 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 상기 UCB 샘플이 제공자(donor)로부터 수집됨을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 56항에 있어서, 상기 제공자가 신생아임을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 55항에 있어서, 상기 항응고물질이 시트르산, 구연산나트륨, 인산나트륨, 덱스트로즈, 아데노신, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질임을 특징으로 하는 조성물.
  59. 제 55항에 있어서, 동결방호제를 첨가하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 59항에 있어서, 상기 동결방호제가 디메틸 술폭시드(DMSO)임을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 59항에 있어서, 상기 동결방호제가 DMSO와 젠트란 40의 혼합물임을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 59항에 있어서, 상기 동결방호제가 DMSO와 히드록시에틸 전분(HES)의 혼합물임을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 59항에 있어서, 상기 UCB 조성물을 약 4℃에서 약 -50℃까지 분당 약 -1℃의 동결속도로 동결시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 상기 UCB 조성물을 약 -50℃에서 약 -90℃까지 분당 약 -10℃의 동결속도로 동결시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 상기 UCB 조성물을 약 -135℃ 이하에서 저장하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 65항에 있어서, 상기 UCB 조성물을 해동하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
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