CN101252834B - 去除了血浆但未去除红细胞的脐带血组合物以及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明的脐带血(UCB)组合物具有的独特特征在于基本上去除了该UCB单位的血浆但未去除该UCB单位的红细胞(RBC)。可通过联用血浆去除与冷冻保藏、筛选、融化和/或移植造血干细胞的方法制备这种UCB单位，从而通过最大程度提高加工后细胞回收率和融化后输注细胞剂量来提供优良的临床效果。还提供了通过给予本发明UCB组合物来治疗造血系统相关的各种恶性疾病和良性疾病的方法。

Description

去除了血浆但未去除红细胞的脐带血组合物以及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请涉及2005年6月2日提交的美国临时申请号60/687,127和2005年12月3日提交的60/733,956，该两份申请的内容出于所有目的全文纳入本文作为参考。

发明背景

人类干细胞的鉴定、分离和制备引起了人们的极大兴趣。人类干细胞是能自我更新和产生各种成熟人细胞谱系的全能或多能前体细胞。该能力是器官和组织发育所需的细胞分化和专门化基础。近年来，干细胞移植的成功为疾病、接触毒性化合物和/或辐射所致骨髓细胞消融(myeloablation)后的骨髓重建和/或补充提供了新的临床工具。有其它证据证明可利用于细胞再生许多(即使不是全部)组织，恢复其生理学和解剖学功能。

已表征了许多不同类型的哺乳动物干细胞。例如，已知有胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成人干细胞和其它定向性干细胞(committed stem cell)或祖细胞。事实上，不仅分离和表征某些干细胞，也在允许有限程度分化的条件下进行了培养。由于人群中HLA类型可能的组合有数千万种，存在的基本问题是非常难于获得足够数量、种群和HLA类型不同的能分化成可与各患者HLA匹配的所有细胞类型的人类干细胞。不同HLA类型的干细胞供应极其短缺。由于它们对治疗各种疾病，包括恶性肿瘤、代谢先天性缺陷、血红蛋白病和免疫缺陷中的重要性，各种HLA类型干细胞来源充足将极其有利。

难于获得足够数量的人类干细胞的原因有以下几个。首先，在成人组织中分离正常产生的干细胞在技术上和成本上有难度，部分是因为血液或组织中的干细胞数量极其有限。第二，从胚胎或胎儿组织，包括流产胎儿中取得这些细胞会产生伦理问题。因此，无需使用取自胚胎或胎儿组织的细胞的其它来源对于干细胞临床应用的进一步发展至关重要。然而，干细胞，特别是人类干细胞的其它可行来源非常少，因此供应有限。此外，为治疗和研究目的而从其它来源收集足量干细胞通常费力，包括，例如收集献血者或患者的细胞或组织，体外培养和/或繁殖细胞，分离等。

例如，美国专利号5,486,359披露了源自骨髓的人间充质干细胞(HMSC)组合物，其可用作间充质细胞谱系的祖细胞。通过正向选择不含有与造血细胞或分化的间充质细胞相关标记的黏附性骨髓细胞(adherent marrow cell)或骨膜细胞可获得均一的HMSC组合物。分离的间充质细胞群显示与间充质干细胞相关的特征，其能在培养基中再生而不分化，在体外诱导或置于体内组织受损部位时能分化成特定的间充质谱系细胞。然而，为随后分离HMSC，这些方法的缺陷在于首先需要侵入性且疼痛地收集人献血者的骨髓细胞或骨膜细胞。

PCT公布号WO 00/73421披露了源自分娩时胎盘的人羊膜上皮细胞，这些细胞可经分离、培养或冷冻保存待用，或诱导分化。按照标准细胞分离技术从羊膜分离羊膜上皮细胞。这些细胞是多能细胞，能分化成上皮组织，例如角膜表面上皮或阴道上皮。然而，这些方法的缺陷在于制备费力并且干细胞产率低。事实上，为获得足够数量的干细胞用于典型的治疗或研究目的，首先必须从羊膜分离羊膜上皮细胞，然后体外扩增。

已知脐带血是造血祖细胞干细胞(hematopoietic progenitor stem cell)的另一种来源。通常冷冻保存脐带血干细胞用于造血重建，这是一种用于骨髓和其它相关移植的治疗方法(参见，例如美国专利号5,004,681和5,192,553)。收集脐带血的常规技术使用针管或套管借助重力作用从胎盘引流脐带血(参见，例如美国专利号5,004,681；5,192,553；5,372,581和5,415,665)。一般将针管或套管置于脐静脉中，轻柔按摩胎盘以促进脐带血从胎盘引流。然而，从脐带血取得干细胞的主要局限在于取得的脐带血量往往不足，导致细胞数量不够，从而不能在移植后有效重建骨髓。

干细胞可能用于治疗各种疾病和病症，包括恶性肿瘤、遗传疾病、血红蛋白病和免疫缺陷。然而，因为收集的局限性，从脐带血收集的细胞数量不足(特别是如果用于治疗成年患者)和建立大库存量的花费高昂，脐带血干细胞的供应极其短缺。因此，本领域强烈需要含有数量充足的造血干细胞的脐带血组合物，从而足以在移植后有效重建骨髓。本领域也需要制备这种脐带血组合物和用它们治疗的方法。本发明满足了这些和其它需求。

发明概述

本发明脐带血(UCB)组合物的优选特征是在UCB单位中基本上去除了血浆但未去除红细胞(RBC)，即去除血浆但未去除红细胞的组合物。可联用血浆去除与造血干细胞的冷冻保存、选择、融化和/或移植等方法来制备这种UCB单位，通过最大程度提高处理后细胞的回收率和融化后输注细胞剂量而提供优于全血或RBC去除的UCB单位的临床效果。也通过给予本发明UCB组合物提供了治疗造血系统相关的各种恶性疾病和良性疾病的方法。

一方面，本发明提供含有至少约50％(以体积计)的红细胞和抗凝剂的脐带血(UCB)组合物，其中基本上去除了血浆但未去除红细胞。以体积计，UCB组合物优选含有至少约65％的红细胞。在某些情况中，以体积计，UCB组合物含有约0％-约30％的血浆，优选约10％-约30％的血浆。

在一个实施方式中，UCB组合物包含干细胞，包括例如造血干细胞。在另一实施方式中，以体积计，UCB组合物包含约5％-约40％的抗凝剂，优选约5％-约20％的抗凝剂。抗凝剂通常含有柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸钠、葡萄糖和/或腺苷。抗凝剂优选含有所有这些组分(即，CPDA)。

在还有另一实施方式中，UCB组合物还包含冷冻保护剂。以体积计，UCB组合物优选包含约5％-约15％的冷冻保护剂。在某些情况中，冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。在某些其它情况中，冷冻保护剂是DMSO和Gentran 40或DMSO和羟乙基淀粉(HES)的混合物。在一优选的实施方式中，加入冷冻保护剂溶液直至DMSO的终浓度是约5％-约10％。

在本发明的另一实施方式中，UCB组合物具有以下一种或多种特征：(1)红细胞(RBC)浓度至少约0.4×10⁶RBC/μl(例如，约0.4×10⁶-约8×10⁶RBC/μl)，优选至少约3.2×10⁶RBC/μl，更优选至少约3.8×10⁶RBC/μl；(2)RBC数量为约0.5×10⁹-约5×10⁹ RBC，优选约1×10⁹-约2.5×10⁹RBC；(3)白细胞(WBC)浓度约3×10³-约70×10³WBC/μl，优选约15×10³WBC/μl；(4)WBC数量为至少约20×10⁷WBC(例如，约20×10⁷-约500×10⁷WBC)，优选至少约90×10⁷WBC；(5)CD34+细胞数量为约1×10⁴-约1×10⁸个CD34+细胞，优选约1×10⁶-约5×10⁷个CD34+田胞；(6)WBC组分中CD34+细胞的百分比为约0.018％-约4.3％，优选约0.15％-约1.8％；(7)有核细胞总数约20×10⁷-约500×10⁷个有核细胞，优选约90×10⁷-约300×10⁷个有核细胞；和(8)细胞组分中有核细胞的百分比为约0.18％-约1.8％，优选约0.54％。本领域技术人员应知道CD34+细胞数依据所采用的具体试验而不同。在某些情况中，UCB组合物在加入冷冻保护剂之前便具有一种或多种上述特征。UCB组合物优选在加入冷冻保护剂后才具有一种或多种上述特征。

在另一方面，本发明提供含有至少约50％(以体积计)的红细胞和抗凝剂的脐带血(UCB)组合物，其中红细胞浓度至少约3.2×10⁶个红细胞/μl，该组合物中基本上去除了血浆但未去除红细胞。以体积计，UCB组合物优选含有至少约65％的红细胞。在某些情况中，以体积计，UCB组合物含有约0％-约30％的血浆，优选约10％-约30％的血浆。UCB组合物还包含冷冻保护剂。以体积计，UCB组合物优选包含约5％-约15％的本文所述任何冷冻保护剂或其混合物(例如，DMSO和Gentran 40的混合物)。在本发明的其它实施方式中，UCB组合物在加入冷冻保护剂之前和/或优选之后具有一种或多种上述特征(例如，至少约3.8×10⁶个RBC/μl等)。

在还有另一方面，本发明提供通过给予哺乳动物对象(例如，人)有效量的本文所述血浆去除UCB组合物来治疗恶性疾病(例如，血液恶性肿瘤)或良性疾病或病症(例如，与造血系统相关的疾病或病症)的方法。在某些情况中，人的体重大于约50 kg(即，成年患者)。在某些其它情况中，人的体重小于约50kg(即，儿科患者)。

在一个实施方式中，所述恶性疾病是血液恶性肿瘤，包括但不限于：急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓发育不良疾病(myelodysplastic disorder)、青少年慢性髓细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤。在另一实施方式中，所述良性疾病或病症与造血系统有关，包括但不限于血红蛋白病、骨髓衰竭综合征(bone marrow failure syndrome)、免疫缺陷、代谢病/贮积病、嗜中性白细胞病症(neutrophil disorder)、血小板疾病(platelet disease)、病毒感染，例如HIV感染和自身免疫疾病。血红蛋白病优选珠蛋白生成障碍性贫血(例如，输血依赖性珠蛋白生成障碍性贫血(transfusion-dependent thalassemia)、重症珠蛋白生成障碍性贫血(thalassemia major))或镰状红细胞病。下文描述了适合用本发明血浆去除的脐带血组合物预防或治疗的造血系统相关恶性疾病和良性疾病的其它例子。

在本发明的其它实施方式中，对于血液疾病的治疗或治疗性移植，给予哺乳动物对象血浆去除的UCB组合物能提供一种或多种以下优良的临床效果：(1)与全脐带血或红细胞去除的脐带血相比，嗜中性白细胞植入(neutrophil engraftment)的累计发生率(cumulative incidence)升高；(2)与全脐带血或红细胞去除的脐带血相比，血小板植入(platelet engraftment)的累计发生率升高；(3)与全脐带血或红细胞去除的脐带血相比，嗜中性白细胞植入的速度上升；(4)与全脐带血或红细胞去除的脐带血相比，血小板植入的速度上升；(5)与全脐带血、红细胞去除的脐带血、骨髓或外周血干细胞相比，无病存活率(disease free survival rate)升高；(6)与全脐带血、红细胞去除的脐带血、骨髓或外周血干细胞相比，移植物相关的死亡率降低；(7)与全脐带血、红细胞去除的脐带血、骨髓或外周血干细胞相比，总存活率升高；和(8)与骨髓或外周血干细胞相比，急性或慢性移植物抗宿主病的发生率降低。如本文所用，上述任何一种临床效果的升高或降低指与全脐带血、红细胞去除的脐带血、骨髓或外周血干细胞相比，差异至少约为1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。给予哺乳动物对象的血浆去除UCB组合物优选能提供至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种上述临床效果。

在另一实施方式中，血浆去除的UCB组合物以多剂量给予哺乳动物对象。例如，所述多剂量可以是两个脐带血单位剂量、三个脐带血单位剂量等。与单剂量相比，优选多剂量以降低所述哺乳动物对象中的复发率。在还有另一实施方式中，可将血浆去除的脐带血组合物与HLA匹配的、不匹配的或单倍体相同(haploidentical)的骨髓、外周血干细胞或间充质干细胞联合给予。

可在融化和给予哺乳动物对象之间清洗或不清洗血浆去除的脐带血组合物。最好不清洗组合物。然而，本领域技术人员应知道如果哺乳动物对象肾功能受损或体重低的话，可以清洗组合物。在某些情况中，可在融化和给予哺乳动物对象之间稀释组合物。最好通过输液将组合物给予哺乳动物对象。

在还有另一方面，本发明提供的方法通过除去含抗凝剂的UCB样品中一定体积的血浆来制备血浆去除的脐带血(UCB)组合物。

一般从诸如新生儿和/或新生儿的母亲等献血者收集UCB样品。在一个实施方式中，以体积计，血浆去除的脐带血组合物含有约5％-约40％的抗凝剂，优选约5％-约20％的抗凝剂。抗凝剂通常含有柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸钠、葡萄糖和/或腺苷。抗凝剂优选含有所有这些组分(即，CPDA)。

在另一实施方式中，该方法还包括加入冷冻保护剂的步骤。以体积计，血浆去除的脐带血组合物优选包含约5％-约15％的冷冻保护剂。在某些情况中，冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。在某些其它情况中，冷冻保护剂是DMSO和Gentran40或DMSO和羟乙基淀粉(HES)的混合物。在一优选的实施方式中，将冷冻保护剂以溶液加入直至DMSO的终浓度是约5％-约10％。

在还有另一实施方式中，该方法还包括冷冻含有冷冻保护剂的血浆去除脐带血组合物的步骤，即以每分钟约-1℃的速度从约4℃冷冻至约-50℃，随后以每分钟约-10℃的速度从约-50℃冷冻至约-90℃。该方法还包括将该冷冻组合物保存在低于约-135℃，优选低于约-150℃温度下的步骤。该方法还包括融化该冷冻的组合物和在给予哺乳动物对象之前清洗或不清洗该融化组合物的步骤。在某些情况中，该方法还包括在冷冻保存之前或之后离体扩增干细胞群。在某些其它情况中，该方法还包括先测定血浆去除的脐带血组合物是否符合某些选择标准后，再在进行随后步骤，例如给予哺乳动物对象。

在另一方面，本发明提供通过先收集献血者来源的干细胞来收集活的干细胞，例如造血干细胞的方法。将此来源的干细胞与抗凝剂混合后，在约15℃-约26℃之间的温度进行离心以减少干细胞来源的体积。离心后，除去干细胞来源中的液体，例如血浆，留下体积减小的浓缩干细胞来源。将浓缩的干细胞来源转移至冷冻容器中，在约2℃-约8℃之间冷却约30分钟-约60分钟。制备含约50％DMSO和低分子量多糖的1∶1(体积/体积)溶液混合物的冷冻保护剂溶液，维持在约2℃-约8℃之间。将冷冻保护剂溶液加入冷冻容器中的浓缩干细胞来源中。在加入冷冻保护剂的同时摇动冷冻容器中的浓缩干细胞来源，从而边加入冷冻保护剂溶液边混合。可将含有浓缩干细胞来源的冷冻容器置于，例如摇动平台上(rocking platform)以提供摇动。含有浓缩干细胞来源的冷冻容器维持在约2℃-约8℃之间的温度。最好用可编程的注射器泵加入冷冻保护剂。如此形成的冷冻保护剂-干细胞混合物中DMSO浓度以体积计在约5％-约15％之间，优选约5％-约10％之间。

在某些情况中，保存所收集的活干细胞。一个非限制性例子是，可将装有按照上述方法制备的冷冻保护剂-干细胞混合物的冷冻容器置于预冷至约2℃-约8℃的铝制储存盒中。然后可将铝储存盒置于控速冰箱(controlled rate freezer)中，以受控的速度冷冻。这些操作通常应在收到冷冻容器的约10分钟内完成。冷冻后，可将含有冻结冷冻保护剂-干细胞混合物的冻结冷冻容器从控速冰箱转移至用于保存活干细胞的液氮储罐中。

合适的干细胞来源包括但不限于：成人干细胞来源、胎儿干细胞来源、胚胎干细胞来源、胎盘血、脐带血、外周血、骨髓和胎儿肝脏。在某些情况中，干细胞来源是胎盘血和/或脐带血。在某些实施方式中，干细胞来源包括有核细胞，浓缩的干细胞来源中存在约95％以上的有核细胞。

在其它实施方式中，抗凝剂包括柠檬酸、磷酸和葡萄糖(CPD)。在另一实施方式中，含浓缩干细胞来源的冷冻容器的温度在加入冷冻保护剂期间维持于约2℃-约8℃之间，例如用冰袋包裹袋子。在某些情况中，将冷冻保护剂-干细胞混合物分在至少两个冷冻容器中再冷冻。

干细胞来源-抗凝剂混合物通常保存在约15℃-约26℃之间。干细胞来源-抗凝剂混合物可以此方式保存最多约48小时，随后减少其体积。在另一实施方式中，将冷冻保护剂溶液冷却至约2℃-约8℃之间。在某些情况中，低分子(量)多糖溶液包含葡聚糖。在还有另一实施方式中，从控速冰箱向液氮罐的转移在10分钟内完成。在某些情况中，从控速冰箱向液氮罐的转移在约10秒内完成。

在另一实施方式中，冷冻保护剂-干细胞混合物包含有核细胞，融化后至少约80％、85％、90％或95％的有核细胞为活细胞。

本发明的其它特征、目的和优点及其优选实施方式可从以下详述，实施例和权利要求书中得以明白。

附图简述

图1显示所有患者的总结果。图1A显示了所有患者(n＝106)的ANC500植入的未经调整的累计发生率；图1B显示了所有患者(n＝89)血小板20植入的未经调整的累计发生率；图1C显示了所有患者(n＝118)的第一年存活率；和图1D显示了所有恶性肿瘤患者(n＝85)的第一年无复发存活率。

图2显示了首次移植缓解患者亚组(remission 1^st transplant subset of patient)的结果。图2A显示了首次移植缓解患者(n＝87)的ANC500植入的未经调整的累计发生率；图2B显示了首次移植缓解患者(n＝72)的血小板20K植入的未经调整的累计发生率；图2C显示了首次移植缓解患者(n＝93)的第一年患者存活率；和图2D显示了首次移植缓解恶性肿瘤患者(n＝67)的第一年无复发存活率。

图3比较了NMDP、非-NMDP美国和非-NMDP台湾患者。图3A显示了嗜中性白细胞(ANC500)植入的累计发生率；图3B显示了血小板20K植入的累计发生率；图3C显示了复发率；图3D显示了患者的死亡率和总存活率。

图4比较了儿科患者、成人患者和一个单位移植的患者(single unit transplantpatient)。图4A显示了嗜中性白细胞(ANC500)植入的累计发生率；图4B显示了血小板20K植入的累计发生率；图4C显示了复发率；图4D显示了患者的死亡率和总存活率。

图5比较了患有良性疾病或恶性疾病的患者。图5A显示了首次移植缓解患者(n＝87)的ANC500植入的未经调整的累计发生率；图5B显示了首次移植缓解患者(n＝72)的血小板20K植入的累计发生率；和图5C显示了首次移植缓解患者(n＝98)的总存活率。

图6比较了接受清洗或未清洗脐带血单位的患者。图6A显示了嗜中性白细胞(ANC500)植入的累计发生率；图6B显示了血小板20K植入的累计发生率；和图6C显示了血小板50K植入的累计发生率。

发明详述

I.定义

除非另有规定，本文所用的以下术语具有属于它们的意义。

术语“干细胞”指能无限分裂并产生专一细胞(specialized cell)的任何细胞。干细胞源自所有的胚层(即，外胚层、中胚层和内胚层)。干细胞的典型来源包括胚肽、骨髓、外周血、脐带血、胎盘血和脂肪组织。干细胞可以是全能细胞，表示它们能产生生命体的大多数组织。例如，全能干细胞可产生皮肤细胞、肝细胞、血细胞、肌肉细胞、骨细胞等。相反，多能或成人干细胞通常产生的细胞类型有限。例如，造血干细胞通常产生淋巴细胞、髓细胞和红细胞谱系的细胞。活细胞是活的，常常是生长和分裂的细胞。本领域技术人员知道测定细胞活力的方法，例如通过排斥台盼蓝染料的能力测定。除非另有指出，本文所用的术语“干细胞”包括祖细胞。

“有核细胞”指具有细胞核的细胞，即含有染色体DNA的细胞器。有核细胞包括，例如白细胞和干细胞。“无核细胞(unnucleated cell)”包括，例如成人红细胞。

本文所用的术语“基本上去除了血浆”和“去除了血浆”指去除了约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％体积以上血浆的本发明脐带血组合物。在一优选实施方式中，通过离心脐带血-抗凝剂混合物分离细胞组分和血浆组分从而基本上去除了血浆。基本上去除后，剩余的血浆体积以体积计通常约0％-约30％，优选约10％-约30％。

本文所用的术语“未去除红细胞”和“红细胞未去除”指不到约30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％体积的红细胞被除去的本发明脐带血组合物。虽然本发明不包括从脐带血单位除去红细胞的步骤，但本领域技术人员应知道去除血浆单位的步骤和/或任何其它加工步骤可除去少量体积的红细胞。

术语“嗜中性白细胞植入速度”表示新植入骨髓所产生的新免疫系统起作用有多快，通常以单位体积的受者血液中嗜中性白细胞带(band)的数量总和表示。患者优选在嗜中性白细胞植入前免疫受损。嗜中性白细胞植入的速度或时间越短，对患者越有利。类似地，术语“血小板植入的速度”表示新植入的骨髓起作用有多快从而能产生对于凝血至关重要的血小板。血小板植入前，患者依赖于献血者的血小板输入，因此他们没有任何出血问题(bleeding problem)。血小板植入的速度或时间越短，对于患者越有利。

术语“植入的累计发生率”指最终显示能稳定产生特定造血细胞谱系，例如嗜中性白细胞或血小板的移植物百分比。

本文所用的术语“脐带血单位”和“UCB单位”指从一位献血者收集的脐带血体积。本发明的UCB组合物通常含有一份UCB单位，但也可含有多份UCB单位，例如可给予患者两份脐带血单位以进一步提高细胞剂量。

本文所用的术语“冷冻保护剂”指用于提高冷冻时细胞活力的试剂。冷冻保护剂包括但不限于：二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲酰胺和羟乙基淀粉(HES)。优选将低分子量多糖，例如葡萄糖(例如，Gentran 40)加入冷冻保护剂混合物。在一优选实施方式中，冷冻保护剂溶液包含约10∶1比例(体积/体积)的DMSO和Gentran 40，例如50％DMSO与5％Gentran 40，将其加入脐带血和抗凝剂的混合物中至DMSO终浓度为约5％-约10％。

“有效量”的本发明血浆去除的脐带血组合物表示其用量足以产生所需作用，例如预防或治疗与造血系统有关的恶性疾病或良性疾病。

本文所用的术语“给予”指通过任何途径递送本发明血浆去除的脐带血组合物，包括但不限于口服、鼻内、静脉内、骨内、腹膜内、肌肉内、关节内、心室内、颅内、病损内(intralesional)、气管内、鞘内、皮下、真皮内、经皮或经粘膜给予。优选给患者输注按照本发明方法制备的一份、两份、三份或多份脐带血单位。可同时或连续(例如，在数分钟、数小时或数天期间)给予患者多份单位，例如两份脐带血单位。在某些情况中，在进行骨髓细胞消融性的、强度降低的或非骨髓细胞消融性的治疗以除去患病骨髓后或在放疗、化疗或其它射线照射使宿主骨髓消融后，再给予本发明去除了血浆的脐带血单位。在某些其它情况中，用本发明血浆去除的脐带血单位与骨髓和/或外周血细胞联合治疗，同时或依次共同给予。

II.概要

与其它来源的造血干细胞不同，脐带血供应的干细胞局收集物中存在的细胞总数有限。相反，骨髓和外周血几乎可以提供无限的造血干细胞。由于此固有的局限性，一份给定单位的脐带血中有核细胞的总剂量对于临床效果，例如嗜中性白细胞植入、血小板植入和新骨髓的建立的最重要决定因素。因为缺乏白细胞植入表示缺乏功能性免疫系统，对植入有影响进而会影响患者的存活。植入失败后，除非患者能恢复自身的自体骨髓，用保存的其自身骨髓或外周血干细胞拯救或进行另一次相关或无关干细胞移植，否则患者最终将死于感染。

脐带血移植始于1988-1994年，在此期间脐带血单位作为全血单位冷冻保存和库存，无体积降低。例如，1993-1994年间，纽约血液中心(New York Blood Center)(NYBC)库存了2,257份全血单位。因此，那时进行的脐带血移植使用全血单位。事实上，自从2003年起，NYBC移植了460份这样的全血单位，代表了所保存的不同类型单位的最高利用率。

由于储存空间花费高，1994年NYBC脐带血库开发了降低全血冷冻体积的方法，该方法通过加入Hespan(羟乙基淀粉)，然后离心除去过量的红细胞和血浆从而达到终体积约20ml。另一种流行的技术包括采用Ficoll-沉降梯度离心以除去红细胞和中性白细胞来纯化单核的细胞。然而，这些技术不能回收到足够的造血干细胞，因为大量的这种细胞截留在红细胞团中而随红细胞除去了。事实上，羟乙基淀粉法加工后的造血干细胞回收率通常是70-75％，而Ficoll法通常只有25-50％。

本发明部分基于出乎意料地发现按照本文所述方法加工脐带血单位能最大程度减少严重限制了应用上述羟乙基淀粉和Ficoll法等技术的有核细胞损失。事实上，与去除了红细胞的血液单位或全血单位相比，本发明方法能提供在加工、冷冻保存和融化后含有较多数量活的干细胞的脐带血组合物，从而导致输注入患者体内的平均细胞剂量较高，惊人地发现用去除了血浆的脐带血单位能显著提高临床效果。本发明还基于惊人地发现在给予患者前不对融化的本发明脐带血组合物进行清洗步骤获得的植入累计发生率较高以及嗜中性白细胞和血小板的植入速度更快。因此，与获自其它公共脐带血库的那些脐带血产品相比，本文所述加工脐带血单位的方法和得到的去除血浆但不去除红细胞的组合物的植入速度优良，存活率较高

III.脐带血的血浆去除加工

本发明的脐带血(UCB)组合物的独特特征在于基本上去除了UCB单位中的血浆但未去除UCB单位中的红细胞(RBC)。可通过将血浆去除与造血干细胞的冷冻保存、选择、融化和/或移植相组合的方法来制备这种UCB单位，从而能最大程度提高加工后的细胞回收率和融化后的输注细胞剂量而提供优良的临床效果。还提供了通过给予本发明UCB组合物来治疗造血系统相关各种恶性疾病(例如，血液恶性肿瘤)和良性疾病的方法。

在一方面，通过下述方法制备去除了血浆但未去除红细胞的UCB单位。

将新生儿的UCB收集入例如含有抗凝剂的多袋血液收集袋(multi-bag bloodcollection bag)等收集容器中。此收集容器通常含有约0.1-约100ml抗凝剂(例如，约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ml)。收集容器优选含有约23ml-约35ml的抗凝剂。抗凝剂的非限制性例子包括：柠檬酸(盐)、磷酸(盐)、葡萄糖和腺苷混合物(CPDA)，柠檬酸(盐)、磷酸(盐)和葡萄糖混合物(CPD)，及某种酸、柠檬酸(盐)和葡萄糖混合物(ACD)。抗凝剂优选CPDA，其含有0.299％无水柠檬酸、0.263％无水柠檬酸钠、0.222％磷酸二氢钠(一水合物)、3.19％葡萄糖和0.0275％腺苷。CPDA是等渗的，pH中性，因此抗凝剂与血液的比例无关紧要。然而，本领域技术人员应知道收集容器中组合物和/或抗凝剂的体积取决于收集的献血者脐带血的体积。

将收集的UCB传递至UCB加工实验室，最好在43小时以内从而能在出生约48小时内冷冻保存。

称重收集袋，从总重量中减去含抗凝剂的收集袋重量来确定UCB收集物体积。UCB体积加上抗凝剂的体积确定袋体积。

此时化验全脐带血确定全血计数。对于95％以上的样品，含抗凝剂的加工前血细胞比容(hematocrit)(即，红细胞体积百分比)通常是约20％-约60％。红细胞浓度通常在约2-约10×10⁶/μl之间，白细胞浓度通常在约1-约30×10⁶/ml。

离心UCB单位(例如3-袋收集血液袋)以分离细胞组分和上部血浆组分(upperplasma fraction)。

将上部血浆组分转移入第二袋中，然后密封。在某些情况中，如果剩余的大多数细胞组分超过60cc，将该产物分成两部分(例如，分装在原始袋中和在第三袋中)，各部分在其自己的收集/转移袋中。血浆去除后，与全血单位或红细胞去除单位相比，此UCB单位的血细胞比容(HCT)和RBC浓度增加约1.2-约3倍(平均值＝约1.6-约1.8倍；中值＝约1.7倍-约1.8倍)(参见表1)。

表1.比较含有抗凝剂但不含冷冻保护剂的血浆去除、全血和红细胞去除的脐带血单位的血细胞计数

HCT(％)

RBC(×106/μl)

WBC(×105/μl)

有核细胞总计数(×107/μl)

％CD34+细胞(前计数方法)

总CD34+细胞#

加工后的血浆去除样品

平均值/中值

65/66

5.7/5.8

19/18

96/87(60ml)

0.43％/0.38％TW0.56％/0.50％US

TW2.4×106；US3.5×106/TW1.8×106；US2.7×106

全血样品

平均值/中值

40/40

3.5/3.4

10/9.6

96/87(60m1)

0.24％/0.21％TW0.31％/0.28％US

TW2.4×106；US3.5×106/TW1.8×106；US2.7×106

加工后的RBC去除样品

平均值/中值

40/40

3.5/3.4

30/28

72/65(60ml)

0.72％/0.63％TW0.93％/0.84％US

TW1.8×106；US2.6×106/TW1.4×106；US2.0×106

IW＝台湾样品；US＝美国样品。加工后的血浆去除样品的红细胞、白细胞和CD34+细胞回收率达99％，因为它们在血浆组分中不到约0.1％。红细胞去除后，加工后的RBC去除样品红细胞产率是原始全血的20％，红细胞浓度与全血相似。加工后的RBC去除样品的白细胞和CD34+细胞的平均回收率是75％，体积平均减少75％。

然后通过无菌对接装置将各收集袋/转移袋中的产品转移至一冷冻袋中(例如，赛罗赛特(CryoCyte

)袋)。通常在去除血浆并加入预冷的(即，约4℃)冷冻保护剂后，将UCB单位冷冻保存在一冷冻袋中，例如最大体积约为75cc。然而，可将一些UCB单位分成两袋，例如合并后最大体积约为150cc。

然后将血浆去除的UCB/抗凝剂混合物冷却至约4℃，再加入一种或多种冷冻保护剂。加入溶液形式的冷冻保护剂的用量通常等于UCB/抗凝剂体积的约25％-约50％。例如，以血浆去除样品中UCB/抗凝剂体积为60ml为例，冷冻保护剂溶液的体积可以是15ml。因此，以体积计，UCB单位通常包含约5％-约15％的冷冻保护剂，例如以体积计，约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的冷冻保护剂。在一优选的实施方式中，冷冻保护剂溶液包含约50％DMSO和约5％Gentran 40的混合物(即，约10∶1比例的DMSO与Gentran40)，提供的DMSO终浓度为约5％-约10％。可通过注射器泵将DMSO/Gentran 40冷冻保护剂溶液以约0.75ml/分钟的速度加入UCB/抗凝剂混合物中，同时将冷冻袋维持在冰袋间，从而达到DMSO终浓度为约5％-约10％。如表2所示，与全血或红细胞去除单位相比，含有抗凝剂和冷冻保护剂的血浆去除UCB单位具有较高的血细胞比容(HCT)和RBC浓度(即，至少约1.6倍)。

表2.比较含有抗凝剂和冷冻保护剂(25％体积的DMSO)的血浆去除、全血和红细胞去除的脐带血单位的血细胞计数

HCT(％)

RBC(×106/μl)

WBC(×103/μl)

有核细胞总计数(×107/μl)

％CD34+细胞(前计数方法)

总CD34+细胞#

加工后的血浆去除样品

平均值/中值

52/53

4.6/4.7

15/14

96/87(60ml)

0.34％/0.30％TW0.56％/0.50％US

TW2.4×106；US3.5×106/TW1.8×106；US2.7×106

全血样品

平均值/中值

32/32

2.8/2.8

8/8

96/87(60ml)

0.19％/0.168％TW0.248％/0.22％US

TW2.4×106；US3.5×106/TW1.8×106；US2.7×106

加工后的RBC去除样品

平均值/中值

32/32

2.8/2.8

24/22

72/65(60ml)

0.58％/0.50％TW0.74％/0.67％US

TW1.8×106；US2.6×106/TW1.4×106；US2.0×106

TW＝台湾样品；US＝美国样品。加工后的血浆去除样品的红细胞、白细胞和CD34+细胞回收率达99％，因为它们在血浆部分中不到约0.1％。红细胞去除后，加工后的RBC去除样品的红细胞产率是原始全血的20％，红细胞浓度与全血相似。加工后的RBC去除样品的白细胞和CD34+细胞的平均回收率是75％，体积平均减少75％。

没有冷冻保护剂存在下，血浆去除UCB/抗凝剂混合物的加工后血细胞比容通常是约20％-约100％，优选在约40％-约100％之间，更优选在约50％-约100％之间，例如至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。因此，在优选的实施方式中，本发明经加工UCB单位的血细胞比容高于全血UCB单位的(即，40％)和羟乙基淀粉(HES)红细胞去除UCB单位的血细胞比容(即，40％)(参见表1)。

含冷冻保护剂的血浆去除UCB/抗凝剂混合物的加工后血细胞比容通常是约16％-约80％，优选在约32％-约80％之间，更优选在约40％-约80％之间，最优选在约50％-约80％之间，例如至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％和80％。因此，在优选的实施方式中，含冷冻保护剂的本发明经加工UCB单位的血细胞比容高于全血UCB单位的(即，32％)和HES红细胞去除UCB单位的血细胞比容(即，32％)(参见表2)。

没有冷冻保护剂存在下，血浆去除UCB/抗凝剂混合物的加工后红细胞浓度通常是约0.5-约10×10⁶/μl，优选在约3-约10×10⁶/μl之间，最优选在约4-约10×10⁶/μl之间，例如约4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10×10⁶/μl。因此，在优选的实施方式中，本发明经加工UCB单位的红细胞浓度高于全血UCB单位的(即，3.5×10⁶/μl)和HES红细胞去除UCB单位的浓度(即，3.5×10⁶/μl)(参见表1)。

含冷冻保护剂的血浆去除UCB/抗凝剂混合物的加工后红细胞浓度通常是约0.4-约8×10⁶/μl，优选在约2.4-约8×10⁶/μl之间，最优选在约3.2-约8×10⁶/μl之间，例如约3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8×10⁶/l。因此，在优选的实施方式中，含冷冻保护剂的本发明经加工UCB单位的红细胞浓度高于全血UCB单位的(即，2.8×10⁶/μl)和HES红细胞去除UCB单位的浓度(即，2.8×10⁶/μl)(参见表1)。

没有冷冻保护剂存在下，血浆去除UCB/抗凝剂混合物的加工后白细胞浓度通常是约3-约90×10⁶/ml，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90×10⁶/ml。在冷冻体积约为75cc的一袋UCB产品中，加工并加入冷冻保护剂后，白细胞浓度优选高于约10×10⁶/ml，例如约10、15、20、25、30、35、40、45或50×10⁶/ml。

在一优选的实施方式中，本发明血浆去除UCB单位的细胞浓度比全血单位至少高约25％，例如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更高。

UCB单位的上述加工过程部分导致血浆去除和全血或红细胞去除(单位)之间的差异。本发明经加工UCB单位优选具有较低的血浆体积，其产生的细胞浓度和血细胞比容较高。不想局限于任何具体的理论，但与全血或红细胞去除单位相比，这些特性中的一种或多种提高了冷冻保护作用并改善了临床效果。非限制性例子是，与纽约血液中心(NYBC)的全血效果相比，本发明的血浆去除UCB单位改善了临床效果。

与去除UCB单位中红细胞的HES或其它方法相比，本文所述的血浆去除方法还具有以下优点：(1)有核细胞损失减少；(2)CD34+细胞损失减少；(3)菌落形成单位损失减少；(4)血细胞比容基本上较高；和(5)细胞浓度较高(即，包含红细胞)。此外，存在大体积的(红细胞)使本发明经加工的UCB单位能经受融化后技术操作，因为融化全部产品所需的时间长于通常体积较低(例如，25ml)的红细胞去除产品所需的。因此，一种或多种上述特性可解释在接受血浆去除UCB移植物的患者中观察到的优良临床效果。然而，与纽约血液中心(NYBC)的红细胞去除效果相比，本发明的血浆去除单位无论以常规杜瓦液氮罐或生热公司(ThermoGenesis Corp)制造的拜尔阿卡弗(BioArchive

)液氮罐保存均能提供改善的临床效果。

然后采用非常规程序化平坦冷冻曲线(non-conventional programmedflatline freezing curve)，以每分钟降低约1℃将含有抗凝剂和冷冻保护剂的血浆去除UCB混合物从约4℃冷冻至约-50℃。该冷冻步骤可以在没有骤降(dip)的情况下进行，所述骤降可补偿组合物从液态向冰相变中释放的热量(即，融化热)。初步冷冻步骤后，以每分钟降低约10℃将经加工的UCB单位从约-50℃进一步冷冻至约-90℃。其它细胞库(例如，圣路易斯脐带血库(St.Louis Cord BloodBank))的传统程序化冷冻曲线采取在预定的融化热温度点骤降，原因是补偿所产生的融化热。然而，该补偿有时会过度并产生每分钟5℃以上的急剧降温冷却速度从而杀伤细胞。对于本文所述的平坦冷冻曲线，融化热在相变前产生的温度急剧升高不会杀伤细胞。此外，每分钟约1℃的平坦冷冻曲线不会产生杀伤细胞的急剧冷却速度。经加工的UCB单位通常保存在约-135℃以下的液氮中(例如，液态和/或气态)，优选约-150℃以下。

虽然本发明的血浆去除UCB单位与全血UCB单位含有相似数量的细胞在理论上应能达到相似的细胞回收率，但其所达到的临床效果优于全血UCB单位是出乎意料的。例如，与NYBC的全血UCB单位历史数据相比，血浆去除UCB单位提高了临床效果。不想局限于任何具体理论，但血浆去除的UCB单位效力更强，提供了更好的干细胞存活保存和/或经加工除去而没有血浆抑制性因子，因而能在患者中更快进行免疫重建和/或浓缩状态的红细胞和裂解的血红蛋白有助于保护干细胞活力。事实上，细胞浓度和效力至少是全血UCB的1.5倍。

在一优选实施方式中，本发明的血浆去除UCB符合以下选择标准：(1)一个单位或两个单位组合剂量的最低有核细胞数约为2.0×10⁷/kg；(2)一个单位或两个单位组合剂量的标准化CD34+细胞剂量约为1.0×10⁵/kg；和(3)高分辨时4/6 HLA A/B/DR的匹配最低。CD34+剂量通常标准化为实验室间差异(inter-laboratory variation)，其测定方法如下：取某具体实验室的100份脐带血单位的CD34+平均百分数，将该值除以0.300％(如果采用贝克坦迪金森前计数流式细胞术枚举法(Becton Dickinson Pro-Count flow cytometry enumerationmethod)，其是美国普通人群中CD34+细胞的近似平均百分数)，其中将各剂量乘以该比值从而获得标准化CD34+细胞剂量。技术人员不难知道任何或所有上述选择标准会依据各种情况和所用的检验方法而不同。

移植前，融化本发明血浆去除的UCB单位。清洗或不清洗融化的单位然后给予。优选不清洗融化的单位。在某些情况中，通过直接输注将融化且未清洗的单位给予患者。在某些其它情况中，用含有，例如人血清白蛋白和Gentran(葡聚糖)的等渗溶液稀释和/或重建融化且末清洗的单位，然后通过输注给予患者。如实施例4所示，融化后未清洗的血浆去除UCB单位提高了移植这种单位的患者的临床效果。事实上，与经清洗的单位相比，血细胞植入的累计发生率和嗜中性白细胞及血小板的植入速度均提高，这表明融化后清洗实际上延迟或降低了造血干细胞植入的发生率。此外，与经清洗单位相比，融化后未清洗的血浆去除UCB单位的有核细胞回收率更好，从而提高了给予的有核细胞(TNC)总剂量。

然而，在某些其它情况中，例如对于儿童或患者的肾功能受损时，用含有，例如人血清白蛋白和Gentran(葡聚糖)的等渗溶液清洗融化的血浆去除单位，然后通过输注给予患者。

在另一实施方式中，可对装有大量脐带血的冷冻袋附带的或分置的密封管或塑料小袋中融化的血浆去除脐带血，或对冷冻袋中实际的融化血浆去除UCB单位进行CFU试验来证明具体UCB单位的复制能力，如果反复测试后CFU试验未能显示生长则撤销该单位。在某些情况中，CFU试验考虑了与全血和红细胞去除单位相比，红细胞密度较高、游离血红蛋白浓度较高和红细胞空壳(red blood cellghost)浓度较高。因此，融化后可立即用含人血清白蛋白或胎牛血清和葡聚糖的溶液稀释约1-约10倍或约1-约20倍，然后将细胞接种到用于CFU生长的半固体介质上。

在植入累计发生率、植入速度、存活率、无疾病存活、复发率和移植物抗宿主病(发生)率方面，给予本发明的血浆去除UCB单位能提供了无关UCB移植物的前所未有临床效果。对于造血系统相关的良性疾病，在植入累计发生率、植入速度、存活率、无疾病存活、复发率和移植物抗宿主病(发生)率方面，本文所述UCB单位能提供无关UCB移植物的前所未有临床效果，优点是使危险比率倾向于促进存活率的益处。例如，移植有无关HLA-不匹配的血浆去除UCB单位的良性疾病患者的临床效果优于以前报道的使用全血或红细胞去除脐带血单位的相关HLA-匹配的脐带血移植物。事实上，在良性适应症的总存活率和无疾病存活率以及嗜中性白细胞植入速度方面，利用无关HLA-不匹配的血浆去除UCB的临床效果与使用相关HLA-匹配的骨髓移植的临床效果相当。此外，Kurtzberg等，N.Engl.J.Med.，352：2069-2081(2005)描述了血浆去除UCB单位的植入速度快于红细胞去除的UCB单位，尽管该研究利用了较高的细胞剂量和更年轻以及(疾病程度)更轻的患者。对于恶性疾病，在植入累计发生率、植入速度、存活率、无疾病存活、复发率和移植物抗宿主病(发生)率方面，本文所述UCB单位能提供无关UCB移植物的前所未有临床效果。

总之，对于某给定的脐带血单位，本发明的UCB血浆去除加工能提供以下益处：(1)加工后有核细胞回收率最高；(2)加工后CD34+细胞回收率最高；(3)加上后集落形成单位回收率最高；(4)加工后干细胞回收率最高(通过外推法)；(5)融化后有核细胞回收率最高；(6)融化后CD34+细胞回收率最高；(7)融化后集落形成单位回收率最高；(8)融化后干细胞回收率最高(通过外推法)；(9)融合的有核细胞剂量最高；(10)融合的CD34+细胞剂量最高；(11)融合的集落形成单位剂量最高；和(12)融合的干细胞剂量最高(通过外推法)。此外，由于本文所述的加工、冷冻保存、融合和选择技术最大程度提高了细胞剂量，本发明改善了移植一份或两份血浆去除UCB单位的儿科和成人患者的以下临床效果参数：(1)嗜中性白细胞植入的累计发生率；(2)免疫重建的累计发生率(提高外推法)；(3)血细胞植入的累计发生率；(4)嗜中性白细胞植入的速度；(5)免疫重建的速度(提高外推法)；(6)血细胞植入的速度；(7)无疾病存活率；(8)复发率；(9)移植物相关死亡率，特别是因移植失败和感染所致的死亡(植入慢或移植失败)；和(10)最重要的是总存活率。

收集脐带血

本发明提供经加工基本上去除了血浆但未去除红细胞的脐带血组合物。脐带血是干细胞的丰富来源，其易于获得并对献血者没有损伤。相反，收集移植用骨髓细胞是创伤性过程，因需住院而费时费钱。优选通过脐带直接引流来收集脐带血。因此，婴儿分娩后，将脐带两端双交叉钳住，紧挨着钳子夹持部分的上方作横切口，将胎血从脐血管流入收集容器中。通常不用挤脐带便可获得充足的收集物，约两分钟后即可完成，然后剥离胎盘。应当心以免污染了分娩场所的母血、尿或其它液体。也可采用本领域已知的其它方法获得脐带血。

对于本发明目的，献血者可以包括母亲献血者，其是对于献血知情同意的献血者和对实际新生儿献血者具有监护权的母亲，脐带血的实际献血者是新生儿。母亲献血者是健康状况良好，年龄约16-约50岁之间的个体。可以在脐带血献血之前或之后收集母亲献血者的某些信息，从而能确定献血者是否适合且未患有输血传播的传染性疾病、遗传疾病和造血系统癌症。例如，可让母亲献血者填一份医学问卷调查。在本发明的一个实施方式中，母亲献血者应先进行医学检查再献血。

应在无菌条件下收集脐带血。收集后，应立即将脐带血与抗凝剂混合。通常将约23ml-约35ml的抗凝剂与最多约255ml的脐带血混合(即，一份脐带血单位)。合适的抗凝剂包括本领域已知的任何抗凝剂，例如CPDA(柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺苷)、CPD(柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖)、ACD(酸-柠檬酸盐-葡萄糖)、Alsever溶液(Alsever等，N.Y.St.J.Med.，41：126(1941))、De Gowin溶液(De Gowin等，J.Am.Med.Assoc，114：850(1940))、Edglugate-Mg(Smith等，J.Thome.Cardiovasc.Surg.，38：573(1959))、Rous-Turner溶液(Rous等，J.Exp.Med.，23：219(1916))、其它葡萄糖混合物、肝素、双香豆素乙酯等。抗凝剂优选CPDA。

为促进脐带血加工并提高安全性，各种血液组分的加工袋可以是无菌血液袋系统的一部分。在一个实施方式中，可以将血浆保存溶液加入一个加工袋中。此外，收集袋和加工袋均可装有端口和断开连接器(break connector)。可用此端口向袋内加入物质，或从中提取物质。可用断开连接器暂时封闭试管或袋子的入口。

除脐带血外，可用胎盘血或胎血制备适合于移植的血浆去除血液组合物，例如用于治疗恶性疾病，如造血系统相关的血液恶性肿瘤或良性疾病。可通过本领域已知的任何方法获得胎盘或胎血。例如，可在胎盘根部通过超声、胎盘穿刺或胎镜检查的引导，用针管从胎儿循环系统获得胎血。例如，可在根部和扩张静脉处通过针管抽吸从分娩的胎盘获得胎盘血。

在一些实施方式中，请求生育后的妇女捐献脐带血和胎盘血。联系并请求医院参与脐带血/胎盘血收集项目。潜在的献血者是临产的和待通过自然分娩或剖腹产生孩子的妇女。美国专利5,993,387描述了获得生育后妇女的脐带血和胎盘血的一种方法，例如在孩子出生前由(脐带血)库进行家庭登记并为出生后收集和保存脐带干细胞收取一定费用。

在一个实施方式中，分娩后，收集并检查脐带血和/或胎盘(血)。在一些实施方式中，检查确保脐带血或胎盘血是否适合于进一步加工。检查可包括检查胎盘以确定其完整性和不含粪便或脓性排出物。可以检查脐带以确定其是否具有完整的两根动脉和一根静脉并除去了脐带真结或其它异常组织。如上所述，可用最好含有抗凝剂，例如柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺苷(CPDA)溶液的袋子进行收集。

在优选的实施方式中，加工后，血浆去除的UCB单位含有足量的干细胞，从而能成功地移植给儿童或成人患者。由于真正的造血干细胞不具有常规细胞表面标记而只能通过功能来确定，必须使用替代品。例如，有核细胞总数常可预示脐带血单位中干细胞的数量，经证明其在临床上与植入和存活率相关。在另一例子中，有时可利用具有细胞表面标记，例如CD34或能形成各种集落形成单位的祖细胞数量，其在临床上也与植入和存活率相关。

加入抗凝剂并与脐带血混合后，可以将得到的混合物在例如约0℃-约42℃之间或约15℃-约26℃之间的温度下保存，最长约48小时。

血浆去除加工

例如，首先将混合物在约0℃-约42℃之间，优选约15℃-约26℃之间的温度下离心以减少所收集的含抗凝剂的脐带血体积。进行离心以除去混合物中的大部分液体，例如血浆体积。优选在约1,000×g到约2,500×g离心约5到约20分钟，该离心力和离心时间足以沉淀大多数细胞而不会导致细胞破裂。离心后，除去了大部分体积的血浆，脐带血混合物的体积得以降低，从而产生了血浆去除但红细胞未去除的脐带血单位。在某些情况中，血浆去除的脐带血单位中留下了至少约10ml血浆。然后将血浆去除的单位转移至冷冻容器，例如克莱赛特(Cryocyte

)袋中，在约2℃-约8℃之间冷却约30-约60分钟。在优选的实施方式中，通过上清液血浆的细胞计数证实，弃去上清液时，损失的有核细胞不到约5％(例如，不到约5％、4％、3％、2％或1％)。

所用克莱赛特(Cryocyte

)袋的存储体积(holding volume)、待冷冻保存的细胞数量和冷冻保存溶液的浓度确定了可接受的体积。如果血浆去除的脐带血单位的体积太大，例如体积超过约60或约75ml，则可使用较大的Cryocyte

袋或可将样品分装在两个或多个克莱赛特(Cryocyte

)袋中。

离体扩增干细胞

任选在冷冻保存之前或之后采用体外培养技术扩增血浆去除的脐带血单位中的造血干细胞，从而能增加用于治疗的干细胞数量。应小心确保离体扩增的造血干细胞不会产生分化的后代细胞，从而减少了移植治疗所需的多能干细胞。培养脐带血干细胞的各种方案已见描述(参见，例如Smith等，Br.J.Haematol，63：29-34(1986)；Dexter等，J.Cell.Physiol.，91：335(1977)；Witlock等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，79：3608-3612(1982))。本领域技术人员可知培养扩增干细胞群的其它方法。也可利用各种因子刺激干细胞体外增殖。非限制性例子是，可单用或联用各种细胞因子和生长因子，例如白介素-1(IL-1)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF)来刺激本发明血浆去除脐带血单位中的造血干细胞体外扩增。

冷冻保存和储存

冷冻细胞通常是破坏性的。冷却后，胞内的水冻结。然后因对细胞膜的渗透作用、细胞脱水、溶质浓缩和冰晶形成而产生伤害。随着冰在胞外形成，溶液和细胞中可用的水被除去，造成渗透脱水和溶质浓度升高，最终破坏了细胞。可通过以下方法克服这些伤害作用：(a)使用冷冻保护剂；(b)控制冷冻速度；和/或(c)在足够低的温度储存以最大程度减少细胞死亡。

本发明优选的实施方式将血浆去除的脐带血单位与冷冻保护剂溶液混合。本领域技术人员已知许多冷冻保护剂。合适的冷冻保护剂的非限制性例子包括但不限于：二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲酰胺、羟乙基淀粉(HES)、聚乙烯吡咯烷(PVP)、白蛋白、氯化胆碱、氨基酸、甲醇、乙酰胺、单乙酸甘油酯、无机盐和低分子量多糖，例如葡聚糖(如Gentran 40)、蔗糖、i-赤藓醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨醇、i-肌醇或D-乳糖。冷冻保护剂溶液优选含有约10∶1比例(体积/体积)的DMSO与Gentran 40，例如50％DMSO与5％Gentran 40，将冷冻保护剂溶液加入(血浆去除的脐带血单位)使DMSO终浓度为约5％-约10％，所述冷冻保护剂溶液预冷至约4℃。在某些情况中，混合冷冻保护剂溶液，加载入注射器中，将加载的注射器在约2℃-约8℃冷却约30-约60分钟。

冷却后，将预冷的冷冻保护剂溶液加入血浆去除的脐带血中以形成含有抗凝剂和冷冻保护剂的脐带血混合物。将冷冻保护剂溶液加入冷冻容器内的血浆去除脐带血中的同时摇动冷冻容器。例如，可将冷冻容器置于摇动平台上并维持在约2℃-约8℃之间的温度，例如用冰袋包裹冷冻容器。在一些实施方式中，用可编程注射器泵将冷冻保护剂溶液加入冷冻容器内的血浆去除脐带血中。注射器泵可以市售购自，例如J-KEM科技公司(J-KEM Scientitfic，Inc.)，新纪元泵系统公司(New EraPump Systems，Inc.)和肯特科技公司(Kent Scientific)。在一优选的实施方式中，将冷冻保护剂以约0.75ml/分钟的速度加入。因此，稀释速度是每分钟用冷冻保护剂溶液对血浆去除脐带血单位作约1∶100稀释。可通过冷冻保护剂溶液的稀释速度(冷冻保护剂的加入速度)、血浆去除脐带血单位的体积和冷冻保护剂溶液的浓度来确定冷冻保护剂加入血浆去除脐带血中可接受的稀释速度。

通常将含有抗凝剂和冷冻保护剂的本发明血浆去除脐带血混合物保存在约-135℃以下的液氮中(例如，液态和/或气态)，优选约-150℃以下。小心控制冷冻混合物的条件以提高融化后细胞的生存力。在一些实施方式中，将含有冷冻保护剂-干细胞混合物的冷冻容器置于预冷至约2℃-约8℃之间的铝储存盒中。在一些实施方式中，所述铝储存盒专门设计成具有显示所储存脐带血单位的条形码的视窗，该盒可部分打开从而能取出该单位所附的小袋样品(attached segment sample)而不搅乱冷冻袋中的主要脐带血。然后可将铝储存盒置于控速冰箱中，优选在收到装行含抗凝剂和冷冻保护剂的脐带血混合物的冷冻容器约10分钟内。然后将混合物以受控速度冷冻。编程的冷冻速度优选以每分钟降低约1℃从约4℃冷冻至约-50℃。该冷冻步骤不用骤降方法可补偿组合物从液态向冰相变中释放的热量(即，融化热)。初步冷冻步骤后，以每分钟降低约10℃将经加工的UCB单位从约-50℃进一步冷冻至约-90℃，用同一控速冰箱中模仿容器(dummy container)内的探头检测温度来模拟脐带血单位进行冷冻保存时的条件。控速冰箱可市售购自，例如FTS系统公司(FTS Systems)和膳摩福马公司(Thermo Forma)。

然后将装有冷冻脐带血混合物的冷冻容器转移至用于储存活干细胞的液氮罐中。该转移优选在约10分钟或更短时间内完成，例如少于约8分钟、少于约5分钟、少于约4分钟、少于约3分钟、少于约2分钟、少于约1分钟、少于约45秒、少于约30秒、少于约20秒或在约10秒或更短的时间内完成。该转移最优选在约1分钟或更短时间内完成。

优选快速融化(例如，用维持在约37℃-约41℃之间的水浴)冷冻脐带血单位，融化后立即冷藏。在某些情况中，可将装有冷冻脐带血单位的冷冻袋浸在热水浴中，任选轻轻转动以确保在融化的同时混合该单位并促进热量从热水浴向冰块内部传递。在某些其它情况中，可能需要在冷冻前和/或后加入DNA酶、低分子量葡聚糖和柠檬酸盐或羟乙基淀粉(HES)来处理脐带血单位，从而防止融化后细胞成块。一旦此脐带血单位呈现轻微“泥泞”状态，可将冷冻袋置于冰中准备给予患者。以下实施例7和8提供了融化本发明的血浆去除脐带血单位的示范性方案。

在本发明的优选实施方式中，可将融化的脐带血单位直接输注入患者而无需清洗步骤。因此，可以考虑，为治疗目的可以直接输注经冷冻保存和融化但未清洗的血浆去除脐带血。然而，考虑到冷冻保存有效的冷冻保护剂浓度对患者有毒性时，应在给予前除去冷冻保护剂或稀释。稀释毒性浓度的冷冻保护剂的一种技术是将其稀释和/或重建成微不足道的浓度，对细胞的毒性较低。优选通过简单地加入稀释/重建溶液来实现此目的，而无需清洗步骤。在此情况中，输注入受者的冷冻保护剂、红细胞、白细胞、游离的血红蛋白和裂解的红细胞空壳的绝对量类似于直接输血。在某些其它情况中，通过加入清洗溶液，然后进行一轮或多轮以下操作：离心沉淀细胞、除去上清液和重悬细胞来稀释毒性浓度的冷冻保护剂。融化和任选除去冷冻保护剂后，可进行细胞计数(例如，利用血球计数器)和细胞活力试验(例如，通过台盼蓝排除法，参见下文)来证实细胞存活情况。

可用于进一步加工融化的脐带血单位的其它方法包括但不限于富集干细胞和离体扩增干细胞。然而，可省去这些步骤以最大程度减少细胞损失。

测定细胞活力

可测定上述过程中的任一点的细胞活力。除了干细胞活力，还可以表征例如有核细胞和/或无核细胞的细胞数目。本领域技术人员知道可采用许多方法来测定细胞活力。一些实施方式采用染料排除试验，例如台盼蓝排除法来测定细胞活力。在一些实施方式中，融化冷冻的脐带血样品并用染料排除试验检验活力。采用本文的方法，融化后至少约80％，或优选约85％的有核细胞为活细胞，或者更优选融化后至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％或99％的有核细胞为活细胞。

治疗性应用

本发明的血浆去除但红细胞(RBC)未去除的脐带血(UCB)组合物对于许多疾病和病症，例如造血系统相关的那些疾病和病症有治疗价值。本文所述的UCB组合物也在再生性医药(regenerative medicine)领域中有价值，例如用干细胞激发患者的治愈过程或缺失或受损组织的再次生长。

可通过给予本发明UCB组合物治疗的疾病和病症的非限制性类型包括恶性疾病，例如造血系统相关的血液恶性肿瘤和良性疾病。血液恶性肿瘤是骨髓衍生细胞恶变(malignant transformation)产生的一类赘生物。

血液恶性肿瘤和其它类型的恶性疾病包括但不限于：白血病和淋巴瘤(例如，急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、青少年慢性髓细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、青少年粒单核细胞白血病、双表型白血病(biphenotypic leukemia)、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性未分化性白血病、急性恶性骨髓硬化症(acutemalignant myelosclerosis)、红细胞增多症、特发性骨髓化生(agnogenicmyelometaplasia)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、急性双谱系白血病(acutebilineage leukemia)、急性肥大细胞白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、毛细胞性白血病、浆细胞性白血病、前淋巴细胞性白血病等)、脊髓发育不良疾病(例如，具有或不具环形铁粒幼红细胞性难治性贫血、未成熟细胞过多的难治性贫血(refractory anemia with excess blast)、难治性细胞减少症、5q综合征等)、淋巴增生性障碍、骨髓纤维化、恶性肿瘤(例如，乳腺癌、成神经细胞瘤、恶性黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺小细胞肺癌(breast small cell lung carcinoma)、视网膜母细胞瘤、睾丸癌、成胶质细胞瘤、横纹肌肉瘤、中枢神经系统肿瘤、尤因肉瘤等)和组织细胞增多病(例如，朗格汉斯细胞组织细胞增生症、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症、吞噬细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis)、X连锁性淋巴增生病等)。

造血系统相关的良性疾病包括但不限于：血红蛋白病(例如，珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞性贫血等)、骨髓衰竭综合征(bone marrow failure syndrome)(例如，血小板减少症、巨核细胞性血小板减少症(amegakaryocyticthrombocytopenia)、布-戴综合征、先天性角化不良、范可尼贫血、骨硬化症、网状细胞发育不全、高铁成红细胞性贫血、施-戴综合征(Schwachman-Diamondsyndrome)、重度再生障碍性贫血、各类血细胞减少症、粒细胞缺乏症、红细胞发育不全、自发性再生障碍性贫血(idiopathic aplastic anemia)、获得性自发性高铁成红细胞性贫血(acquired idiopathic sideroblastic anemia)等)、免疫缺陷(例如，DiGeorge综合征、淋巴细胞附着疾病(lymphocyte adhesion disease)、奈泽洛夫(氏)综合征、Omenn综合征、重度联合免疫缺陷(severe combined immunedeficiency)、威-奥综合征、X-连锁的高IgM综合征(X-linked hyper-IgMsyndrome)、α1-抗胰蛋白酶缺乏等)、代谢/贮积病(storage disease)(例如，天冬氨酰基葡萄糖胺尿、脑白质肾上腺萎缩症、α-甘露糖苷过多症、岩藻糖苷贮积症、高歇病、神经节苷脂贮积病、赫尔利综合征、胡-射综合征、沙伊综合征、I-细胞病、幼稚型蜡样质脂褐质沉淀症(infantile ceroid lipofucoscinosis)、克拉伯病、莱-萘综合征、异染性脑白质营养不良、马-兰综合征、唾液酸沉积症、泰-萨病、沃尔曼病、粘多糖贮积病、粘脂贮积病等)、嗜中性白细胞病症(例如，慢性肉芽肿病、切-东综合征、先天性嗜中性白细胞减少症、科斯特曼综合征等)、血小板疾病(例如，血小板无力症(Glanzmann′s thrombobasthenia)等)、卟啉症(例如，先天性红细胞生成性卟啉症等)、病毒感染(例如，HIV感染)和自身免疫疾病(例如，全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、I型糖尿病、多发性硬化症、慢性肝炎、炎性骨病等)。

本发明的血浆去除脐带血组合物对影响造血谱系细胞的各种遗传疾病和病症的治疗也极有价值。这种疾病的例子包括但不限于：珠蛋白生成障碍性贫血(例如，α、β、γ)、家族性再生障碍性贫血、范康尼综合征、布卢姆综合征、单纯红细胞再生障碍、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症、先天性角化不良症(dyskeratosis congenital)、布-戴综合征、先天性红细胞生成异常综合征I-IV(congenital dyserythropoietic syndromes I-IV)、施-戴综合征(Chwachmann-Diamond syndrome)、二氢叶酸还原酶缺乏症、甲醛胺基转移酶缺乏症、天冬氨酰基氨基葡萄糖苷酶缺乏症(aspartyl glucosaminidase deficiency)、β-葡糖醛酸酶缺乏症、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症、莱-萘综合征、先天性球形红细胞增多症、先天性椭圆形红细胞增多症、先天性口形红细胞增多、先天性无Rh病(congenital Rh null disease)、阵发性夜间血红蛋白尿、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症、先天性促红细胞生成素敏感(congenital erythropoietin sensitivity)、镰状细胞病和特征、高铁血红蛋白血症、严重联合免疫缺陷病、无T细胞和B细胞的严重联合免疫缺陷病、无T细胞的严重联合免疫缺陷病、严重联合免疫缺陷病、腺苷脱胺酶缺乏症、裸淋巴细胞综合征、联合免疫缺陷、离子载体响应性联合免疫缺陷(ionophore-responsivecombined immunodeficiency)、具有加帽异常的联合免疫缺陷(combinedimmunodeficiency with a capping abnormality)、常见变异型免疫缺陷病、核苷磷酸化酶缺乏症、粒细胞肌动蛋白缺乏(granulocyte actin deficiency)、嗜中性白细胞肌动蛋白缺乏(neutrophil actin deficiency)、婴儿粒细胞缺乏症(infantileagranulocytosis)、高歇病、腺苷脱胺酶缺陷、科斯特曼综合征、网状细胞发育不全和先天性白细胞机能障碍综合征(congenital leukocyte dysfunctionsyndromes)。

本文所用的术语“珠蛋白生成障碍性贫血”指一类遗传性血液病。患珠蛋白生成障碍性贫血的个体因为α和β血红蛋白合成不平衡而不能产生足够的正常血红蛋白，从而导致严重的贫血。血红蛋白在红细胞中发现，其将氧携带至身体的所有部分。血红蛋白由两种不同的蛋白质，α和β链构成。如果身体不能产生足够的这两种蛋白或者二者之间不平衡，则不能正确形成红细胞从而不能携带足够的氧。其结果是始于幼年早期并持续终身的贫血，终身需要频繁输血并进行铁螯合治疗来除去频繁输血所致的铁过载。尽管进行了铁整合治疗，但器官最终还是会负载过量的铁，从而不能正常行使其功能。

与β蛋白相比，红细胞产生的α蛋白不足的个体患有α珠蛋白生成障碍性贫血。α珠蛋白生成障碍性贫血有几种类型，它们对身体的影响程度从轻微到严重不等。沉默携带者状态(silent carrier state)通常没有健康问题，因为所缺乏的α蛋白极少，血红蛋白仍能正常行使其功能。康斯坦特斯普瑞血红蛋白病症(hemoglobin constant spring condition)是α珠蛋白基因突变导致的沉默携带者状态的一种非正常形式。在沉默携带者状态中，患此病症的个体通常不经历相关的健康问题。α珠蛋白生成障碍性贫血特征或轻度α珠蛋白生成障碍性贫血病症的特征在于α蛋白的缺乏程度略高一些。患该病症患者的红细胞较少，并具有轻度贫血，虽然许多患者没有各种症状。血红蛋白H病的特征在于α蛋白的缺乏程度足够高，从而会导致严重的贫血和严重的健康问题，例如脾肿大、骨变形(bone deformity)和疲倦。血红蛋白H-康斯坦特斯普瑞病是比血红蛋白H病更严重的病症。患该病的个体易患更严重的贫血并且会更频繁地发生脾肿大和病毒感染。纯合康斯坦特斯普瑞病是血红蛋白H-康斯坦特斯普瑞病的一种改变形式，该病在两位康斯坦特斯普瑞携带者将其基因遗传给他们的孩子时发生。该病症的严重程度通常低于血红蛋白H康斯坦特斯普瑞病，更类似于血红蛋白H病。胎儿水肿或重型α珠蛋白生成障碍性贫血的特征在于缺乏α基因，这导致胎儿产生的γ珠蛋白形成称为血红蛋白Barts的异常血红蛋白。大多数患此病症的个体在出生前或出生后不久死亡。在一些极其少见的病例中，该病症能在出生前发现，进行子宫内输血能让患婴儿水肿的儿童出生，然后他需要终身输血和医疗护理。还可进行子宫内造血干细胞移植(包括脐带血移植)来治愈该病症。

红细胞产生的β蛋白不足的个体患有β珠蛋白生成障碍性贫血。β珠蛋白生成障碍性贫血有几种类型，它们对身体的影响程度从轻微到严重不等。轻型珠蛋白生成障碍性贫血或珠蛋白生成障碍性贫血特性的特征在于β蛋白的缺乏程度不足以引起血红蛋白正常行使功能问题。患该病症的个体只是携带珠蛋白生成障碍性贫血的遗传特性，除了可能有轻度贫血外通常没有健康问题。中间型珠蛋白生成障碍性贫血(Thalassemia intermedia)是血红蛋白中缺乏β蛋白，足以引起中等严重程度的贫血和明显健康问题(包括骨变形和脾肿大)的病症。重型珠蛋白生成障碍性贫血或库利贫血是β珠蛋白生成障碍性贫血的最严重形式，其中血红蛋白中完全缺乏β蛋白造成致命的贫血，这种病症需要定期输血和时刻进行充分医疗护理。这种长期终身输血导致铁过载，必须用螯合疗法来治疗从而能防止器官衰竭造成的早夭。

除了上述不同类型的α和β珠蛋白生成障碍性贫血外，还有其它相关的病症，例如E β珠蛋白生成障碍性贫血和镰状β珠蛋白生成障碍性贫血(sickle betathalassemia)。这些病症也适合通过给予本发明的血浆去除脐带血组合物来治疗。

在某些情况中，本发明的血浆去除脐带血组合物含有造血干细胞，所述干细胞不携带在患者中发现的遗传缺陷，或不携带纯合状态或处于双杂合状态的遗传缺陷，因而能产生功能正常的造血系统。在某些其它情况中，本发明脐带血组合物中的造血细胞稳定地掺入了其后代细胞能表达的异源基因，可用这种重组干细胞治疗造血系统的遗传疾病。例如，可将掺有缺乏基因的相应有功能基因的造血干细胞输注给造血干细胞缺乏该基因或该基因突变的患者。可用于基因治疗的这些基因包括但不限于：血红蛋白或介导其合成途径的酶，例如用于治疗贫血，如β-珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞病等。

本领域已知有许多将外来基因引入细胞的技术，可为治疗目的利用这些技术构建重组的造血干细胞。所用的技术应能将异源基因序列稳定地转移至干细胞中，因而该异源基因序列可遗传并为干细胞后代所表达，因此不会破坏受者细胞所需的发育和生理功能。可采用的技术包括但不限于：细胞融合、染色体介导的基因转移、显微细胞介导的基因转移、转染、转化、转导、电穿孔、感染(例如，重组DNA病毒、重细RNA病毒)、球形体融合、显微注射、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体、溶酶体融合、合成的阳离予脂质、利用基因枪或DNA载体运载体等。转化或转染哺乳动物细胞的各种技术可参见，例如Keown等，Methods Enzymol.，185：527-37(1990)；Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第三版，冷泉港实验室出版社，纽约州，(2001)。

可用本发明的血浆去除脐带血组合物治疗的其它疾病和病症包括但不限于：骨髓硬化症、获得性溶血性贫血(acquired hemolytic anemias)、获得性免疫缺陷、导致原发性或继发性免疫缺陷的感染性病症、细菌感染(例如，布(鲁)氏(杆)菌病、利斯特菌病、结核病、麻风病)、寄生虫感染(例如，疟疾、利什曼病)、真菌感染、涉及淋巴样细胞亚组比例失调和因衰老导致免疫功能受损的疾病、吞噬细胞病(例如，嗜中性白细胞肌动蛋白缺乏(neutrophil actindeficiency)、嗜中性白细胞膜GP-180缺乏(neutrophil membrane GP-180deficiency))、遗传红细胞异常(inherited erythrocyte abnormality)、遗传免疫系统疾病、遗传淋巴和血红素谱系疾病、遗传代谢病、遗传血小板病、浆细胞病、其它恶性疾病、其它非恶性疾病、先天性血栓症(congenital thrombosis)、运动失调性毛细血管扩张症、软骨-毛发发育不全、糖原贮积病(glucose storagedisease)、HIV感染、吞噬血细胞作用、亨特综合征、免疫缺陷和嗜中性白细胞减少症、白细胞粘附缺陷、溶酶体贮存病、骨髓纤维化伴骨髓化生、莫基奥综合征、尼-皮病、神经元腊样脂褐质症和A、B、C和D型圣菲利波综合征。

本文所述的血浆去除脐带血组合物在再生性医药领域中也有价值，例如，例如用干细胞激发患者的治愈过程或缺失或受损组织的再次生长。例如，为再生性治疗，可将一份或多份血浆去除脐带血单位给予患者来治愈断骨或治疗严重烧伤(bad burns)、失明、耳聋、心脏损伤(例如，因心脏病发作所致，等等)、神经损伤(例如，脊髓损伤)、中风、帕金森病、阿尔茨海默病、糖尿病(I或II型)和其它病症。

通过本文所述的加工、冷冻保存、筛选和/或融化工艺，本发明的血浆去除脐带血组合物最大程度提高了有核细胞总剂量，从而能在一份给定的脐带血单位中提供了最大量的造血干细胞。因此，患有任何上述疾病或病症的患者经历的临床效果优于用全血或RBC去除的脐带血单位获得的临床效果。具体地说，患者的例如嗜中性白细胞的血小板植入的累计发生率和速度、无疾病存活的程度、复发率、移植物相关的死亡率和总存活率等参数显示有明显改善。

IV.实施例

以下实施例更详细地描述了本发明。提供以下实施例是为了说明目的，而不是以任何方式限制本发明。本领域技术人员知道可以改变或改进各种非关键性的参数而不难获得基本上相同的结果。

实施例1.示范性的血浆去除脐带血单位

本实施例提供基本上去除了血浆但未去除红细胞的示范性脐带血(UCB)组合物。

标准的冷冻保护剂体积：约60ml血浆去除单位使用约15ml冷冻保护剂。

如果CV＝收集的脐带血体积，AV＝抗凝剂体积(例如，在约23-约35ml之间)，PV＝血浆去除脐带血体积，PAV＝加工后抗凝剂体积，和APV＝含抗凝剂的血浆去除脐带血体积，则示范性的本发明UCB组合物含有：

PV＝60ml×(CV/(CV+AV))；

PAV＝60ml×(AV/(CV+AV))；

PV+PAV＝APV＝60ml；和

冷冻前体积＝APV+冷冻保护剂体积＝60ml+15ml＝75ml。

实施例2.去除脐带血单位的血浆提高了血细胞比容和红细胞浓度

本实施例说明了根据本发明方法加工收集的脐带血(UCB)提高了UCB单位的血细胞比容(即，最终体积中红细胞的百分比)和红细胞(RBC)浓度。

先化验从488位新生儿收集的UCB来测定这些样品的血细胞比容(“PRE-HCT％”)和RBC浓度(“PRE-RBC(10⁶/μl)”)，再进行本文所述的血浆去除加工。加工后，测定血细胞比容(“POST-HCT％”)、RBC浓度(“POST-RBC(10⁶/μl)”)和白细胞浓度(“POST-WBC(10³/μl)”)。如表3所示，按照本文所述方法通过血浆去除来加工UCB单位能实质性提高血细胞比容和RBC浓度。

表3.488份脐带血单位在加工前后的数值

	PRE-HCT％	PRE-RBC(106/μl)	POST-HCT％	POST-RBC(106/μl)	POST-WBC(l03/μl)
						平均值	39.7	3.5	65.1	5.7	22.3
中值	39.8	3.4	66.5	5.9	17.7

不想局限于任何具体的理论，但加工后的UCB单位具有较高的血细胞比容和/或较高的RBC浓度有利于提供更好的冷冻保护特性和/或改善的临床效果。

实施例3.比较血浆去除的、红细胞去除的和全血脐带血单位

本实施例比较了本发明的血浆去除脐带血组合物与全血和HES红细胞去除单位。

血细胞比容：

血浆去除(PD)的脐带血(UCB)单位的平均血细胞比容是全血单位或红细胞去除(RD)单位的约1.8倍。以体积计，某给定单位的血细胞比容对应于红细胞(RBC)的百分数。不想局限于任何具体的理论，但本发明的PD UCB单位具有较高的血细胞比容有利于提供更好的冷冻保护特性和/或改善的临床效果。

血细胞比容	全血	PD血液	RD血液
					≤40％	≥50％	≤50％

红细胞浓度：

PD单位的平均RBC浓度是全血和RD单位的约1.8倍。不想局限于任何具体的理论，但本发明的PD UCB单位具有较高的RBC浓度有利于提供更好的冷冻保护特性和/或改善的临床效果。

RBC浓度	全血	PD血液	RD血液
					＜3.2×106/μl	≥3.2×106/μl	＜3.2×106/μl

血浆体积：

以体积计，PD和RD UCB单位的血浆的百分数低于全血单位。

血浆体积	全血	PD血液	RD血液
					50-60％	0-30％	0-30％

白细胞数量：

PD UCB单位的白细胞(WBC)数量与全血和RD单位相似。

WBC数量	全血	PD血液	RD血液
					≥90×107	≥90×107	≥90×107

白细胞浓度：

PD UCB单位的WBC浓度介于全血和RD单位之间，是全血WBC浓度的约1.8倍，而RD单位的WBC浓度约为全血的3倍。

WBC浓度	全血	PD血液	RD血液
					8×103/μl	15×103/μl	24×103/μl

红细胞数量：

PD单位的RBC数量与全血单位的相似，约是RD单位的5倍。

RBC数量	全血	PD血液	RD血液
					1-2.5×109	1-2.5×109	0.2-0.5×109

CD34+细胞数量：

PD单位的CD34+细胞数量与全血和RD单位相似。

CD34+细胞数量	全血	PD血液	RD血液
					1×106-5×107	1×106-5×107	1×106-5×107

WBC组分中CD34+细胞％

PD单位WBC组分中的CD34+细胞百分比介于全血和RD单位之间。

WBC部分中的CD34+细胞％	全血	PD血液	RD血液
					0.08％-1.0％	0.15％-1.8％	0.24％-3.0％

有核细胞数量：

PD单位的有核细胞(TNC)总数与全血和RD单位相似。

有核细胞数量	全血	PD血液	RD血液
					90-300×107	90-300×107	90-300×107

细胞组分中有核细胞％

PD单位细胞组分中的有核细胞百分比介于全血和RD单位之间。

细胞部分中的有核细胞％	全血	PD血液	RD血液
					0.3％	0.54％	1％

实施例4.利用去除了血浆但未去除红细胞的脐带血(UCB)单位进行造血干细胞移植(HSCT)

本实施例说明基本上去除了血浆但未去除红细胞的脐带血(UCB)单位是造血干细胞安全而有效的来源，在大多数情况中其临床效果优于病史对照并且融化后未清洗的血浆去除(PD)的UCB单位能改善血小板植入的发生率和嗜中性白细胞和血小板的植入时间。

UCB是造血干细胞移植(HSCT)有吸引力的来源，因为严格的HLA匹配要求不高，移植物抗宿主病的发病率和严重程度较低。然而，与骨髓或外周血来源不同，UCB单位相关的细胞剂量有限妨碍了其在成人中的广泛应用。本领域中广泛使用的红细胞去除技术是羟乙基淀粉(HES)和Ficoll方法，二者导致加工后有核细胞明显丧失，这进一步加剧了细胞剂量有限的缺点。许多提高UCB单位细胞剂量的方案包括两份单位移植、组合UCB/单倍相同的移植和离体扩增，本实施例所述的方法的优点是通过去除血浆但不去除红细胞提高了加工和融化期间的有核细胞回收率。结果避免了捕获有核细胞和祖细胞及干细胞，并因除去了血浆而在一定程度减少了体积。应用该方法导致加工后在弃去的血浆组分中丧失的有核细胞不到0.1％(n＝27)。

本实施例所述的方法还通过省去融化冷冻UCB后的清洗步骤而提高了有核细胞的回收率。为除去冷冻保护剂DMSO和裂解红细胞产生的游离血红蛋白，在冷冻脐带血单位融化后普遍进行清洗(Kurtzberg等，NEJM，335：157-166(1996))。例如，据报道采用清洗融化后的活力更好(Rubinstein等，PNAS，92：10119-10122(1995))。此外，已有报道说先除去冷冻保护剂再输注有利于更快植入(Kurtzberg等，同上)。然而，近年来有几份报道对融化后先清洗脐带血单位再输注入患者的作用提出了质疑(Nagamura-Inoue等，Transfusion，43：1285-1294(2003)；Hahn等，Bone Marrow Transplantation，32：145-150(2003)；Antoneanas等，BoneMarrow Transplantation，34：739(2004)；Creer等，Proceedings of the 3^rd AnnualInternational Cord Blood Transplantation Symposium(国际脐带血移植论坛第三年论文集))。在这些研究中，无论在融化后是否进行清洗，用标准的红细胞去除脐带血单位均观察到相似的临床效果和融化后活力。对于去除了血浆但未去除红细胞的脐带血单位采用融化后清洗没有这种数据。

建立了大量的人种多样性的PD UCB存货，自2005年4月起用这些产品在全世界进行了162起以上的HSCT。该项研究的设计如下所示：

研究设计

1.包括标准-所有移植均在2001年11月-2005年4月之间：n＝162。

2.#移植数据尚未获得：n＝44。

3.NMDP和移植中心提供和核查数据。

4.“所有患者”-获得了162位移植患者中118人的植入或存活数据-73％。

5.162人中有44人的数据尚未获得-27％。

6.获得了64次NMDP移植中58次的数据-91％。

7.获得了117次美国移植中89次的数据-76％。

8.获得了45次台湾移植物中29次的数据-64％。

9.“复发/再移植”移植(先前移植(prior transplant)和/或复发期间移植)＝20。

10.“首次移植缓解”患者＝98(无先前移植缓解的患者)。

11.一份UCB移植＝99；两份UCB移植＝19；无髓细胞消融＝7；UCB/单倍型相同的PSCT＝1。

如研究设计所示，获得了118位患者的植入和/或存活数据，总数据收集率为73％。该118位患者的特征如下所示：

患者特征：

1.性别：男性(M)＝72(61％)；女性(F)＝56(39％)。

2.年龄：平均值＝14；中值＝8；范围＝0.3-55。患者中31例移植者年龄在16岁以上(26％)。

3.体重：平均值＝35kg；中值＝26kg；范围＝4.5-103kg。患者中36例移植者体重超过50kg(31％)。

良性适应症占29例(25％)，其中14例血红蛋白病(hemoglobinapathy)，6例再生障碍性贫血，5例威-奥综合征(WAS)、2例重度联合免疫缺陷症(SCID)和2例其它适应症。89例移植用于恶性适应症(75％)，其中有37例为急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，22例急性髓细胞性白血病(AML)，9例慢性髓细胞性白血病(CML)和21例其它适应症。20例移植(22％恶性)的患者是1CR/1CP，20例移植(22％恶性)的患者是复发/再移植患者，7例移植曾有先前移植的患者，16例移植的患者是在复发、诱导失败(induction failure)、耐受性肿瘤(resistanttumor)或白血病急性发作(blast crisis)期间移植。

NMDP提供并核查58/118(49％)的患者数据，移植中心再次核查；移植中心提供并核查剩下的数据。计算植入的绝对嗜中性白细胞计数为500(ANC500)、血小板计数为20,000(Plt20K)和血小板计数为50,000(Plt50K)的未调整累计发生率。计算未调整的所有累计发生率，即植入前的所有死亡计为移植失败。采用Kaplan Meier估算分析存活率和无疾病存活率。

所有118位患者的PD UCB单位的特征为冷冻前有核细胞(TNC)剂量中值为5.6×10⁷/kg，冷冻前平均TNC剂量为7.6×10⁷/kg。融化后TNC剂量中值(n＝68)为5.2×10⁷/kg(93％回收)和融化后TNC平均剂量为7.9×10⁷/kg(100％回收)。冷冻前CD34剂量中值(n＝117)为1.8×10⁵/kg，冷冻前平均CD34剂量为2.6×10⁵/kg。HLA ABDR匹配的中值数为4.0，I类为低到中等分辨率，II类为高分辨率。每个移植中心的融化后存活率中值为75％。41例移植(35％)在美国以外进行。89(75％，其中58例NMDP和31例非-NMDP)例移植使用美国永生公司(StemCyte U.S.)的脐带血；29(25％)例移植利用台湾永生公司(StemCyte Taiwan)的脐带血。

可获得植入或存活结果数据的118位移植了PD UCB的患者的临床效果表明植入ANC500、Plt20K和Plt50K的未调整累计发生率分别是90±3％(图1A)、77±5％(图1B)和75±5％。由于累计发生率未经调整，将预期植入时间前的所有死亡视作移植失败。植入ANC500(n＝87)、Plt20K(n＝72)和Plt50K(n＝68)的中值时间分别是22.0(范围是7-64)、49.5(范围是13-95)和58.5天(范围是21-132)。如表4所示，与移植了纽约血液中心(NYBC)或国家骨髓捐赠计划(NMDP)的RD UCB单位的患者相比，PD UCB移植患者的植入累计发生率和植入的中值时间高得多。

表4.PD UCB单位能提供优于RD UCB单位的临床效果。

ANC500植入的累计发生率

ANC500植入的中值时间(范围)

Plt20K植入的累计发生率

Plt20K植入的中值时间(范围)

Plt50K植入的累计发生率

Plt50K植入的中值时间(范围)

一年存活率

PD UCB单位(所有患者)

90±3％(未调整)

22天(7-64)

77±5％(未调整)

49.5天(13-95)

75±5％(未调整)

58.5天(21-132)

65±5％

PD UCB单位(首次缓解患者

94±3％(未调整)

22天

81±5％(未调整)

49.5天

80±5％(未调整的)

58天

73±5％

NYBC RDUCB单位

72％(未调整)

28天(10-120)

50±7％(未调整)

58％(经调整的)*

90天(16-250)

40±45％

NMDP RDUCB单位

87±4％(经调整的)*

21天(8-62)

61±7％(经调整的)*

64天(12-473)

45±8％

圣路易斯RD UCB单位

54％

^*调整排除了第21天之前的死亡，造成表观植入(率)较高。

存活患者的中值随访时间是526天(范围是106-1,284天)，Kaplan-Meier估算所有病例的1年存活率和1年时恶性病例的无疾病存活率(DFS)分别是65±5％(图1C)和50±6％(图1D)。表4也显示与移植了NYBC、NMDP或圣路易斯脐带血库的RD UCB单位的患者相比，PD UCB移植患者的一年存活率高得多。在第100天时III-IV级急性移植物抗宿主病(GvHD)和慢性GvHD的发病率是15％，在1年时是13％，均低于以前报道的数值。1年时，恶性病例的复发率和所有病例的移植相关死亡率(TRM)分别是25±6％和26±4％。这些结果表明与移植了RD或全血UCB单位的患者相比，接受本发明PD UCB单位的患者能获得更佳的临床效果(例如，ANC500、Plt20K和Plt50K植入的累计发生率改善，ANC500、Plt20K和P1t50K植入的中值时间较快和一年存活率增加)。此外，与骨髓和外周血干细胞移植相比，移植PD UCB单位的GvHD、1-年存活率和无疾病存活率更佳。

当独立分析首次移植缓解患者时(即，没有先前移植的患者和缓解期间移植的患者；n＝98)，植入ANC500、Plt20K和Plt50K的未调整累计发生率分别是94±3％(图2A)、81±5％(图2B)和80±5％。植入ANC500、Plt20K和Plt50K的中值时间分别是22.0、49.5和58.5天。Kaplan-Meier估算所有病例的1年存活率和恶性病例的1年无疾病存活率(DFS)分别是73±5％(图2C)和59±7％(图2D)。1年时，恶性病例的复发率和缓解患者的TRM分别是20±6％和20±4％。表4显示，与移植了RD UCB单位的患者相比，首次PD UCB移植缓解患者的ANC500、Plt20K和Plt50K植入的累计发生率极大提高，ANC500、Plt20K和Plt50K植入的中值时间较快和一年存活率提高。这些结果表明利用PD UCB可以安全而有效地进行HSCT。

也比较了NMDP与非NMDP美国和非NMDP台湾患者。具体地说，图3比较了该三亚组患者的ANC500植入的累计发生率(图3A)、血小板20K植入的累计发生率(图3B)、复发率(图3C)和患者死亡率及1-年存活率(图3D)。因为这些患者的NMDP效果数据收集率超过91％，基本上去除了移植中心报道的偏爱倾向。通过外推法比较非NMDP亚组与NMDP结果，发现了基本相似的结果，从而也排除了那些组中报道的明显偏向。

也在儿科体重组(＜50kg)、成人体重组(≥50kg)和一单位移植的患者亚组之间进行了比较。具体地说，图4比较了该三亚组患者的ANC500植入累计发生率(图4A)、血小板20K植入的累计发生率(图4B)、复发率(图4C)和患者死亡率及1-年存活率(图4D)。该比较显示与例如Laughlin等，NEJM 351：2265(2004)和Rocha等，NEJM 351：2276-85(2004)相比，成人体重患者实现了显著且更佳的效果。与NYBC的年龄分层结果相比，儿科结果更显著。一单位效果显示另一中心的第二单位未产生显著的临床效果。

也在缓解亚组中的良性或恶性疾病患者之间进行了比较。具体地说，图5比较了该两个亚组患者的ANC500植入的累计发生率(图5A)、血小板20K植入的累计发生率(图5B)和1-年存活率(图5C)。

对于良性适应症的造血干细胞移植，冷冻前TNC中值剂量为7.7×10⁷/kg，冷冻后TNC中值剂量为7.7×10⁷/kg，冷冻前CD34中值剂量为3.1×10⁵/kg。ANC500(n＝21)、Plt20K(n＝20)和Plt50K(n＝18)植入的中值时间分别为14.5天(范围11-41)、47.0天(范围13-82)和56.5天(范围21-96)。ANC500、Plt20K和Plt50K植入的未调整累计发生率分别是89±7％、89±7％和87±8％。据报道，II级急性GvHD的发病率是33％，没有患者发生III-IV级急性GvHD。50％(患者)产生了局部慢性GvHD(7/14)，迄今为止只有1位患者报道发生了广泛的慢性GvHD。中值随访时间为356天(范围93-1,100天)，1-年TRM、总存活率和无疾病存活率的卡普伦-迈尔(Kaplan-Meier)估算值分别是11±6％、89±6％和89±6％。

对于恶性适应症的造血干细胞移植，冷冻前TNC中值剂量为6.4×10⁷/kg，冷冻后TNC中值剂量为5.3×10⁷/kg，冷冻前CD34中值剂量为2.5×10⁵/kg。ANC500(n＝66)、Plt20K(n＝52)和Plt50K(n＝50)植入的中值时间分别为24天(范围7-49天)、53天(范围15-94天)和63天(范围37-132天)。ANC500、Plt20K和Plt20K植入的未调整累计发生率分别是93±3％、76±6％和75±6％。据报道，II-IV级和III-IV级急性GvHD的发病率分别是37％和20％。12％的患者发生了局部慢性GvHD，15％的患者发生了广泛的慢性GvHD。中值随访时间为282天(范围50-1,263天)，1-年TRM、总存活率和无复发存活率的卡普伦-迈尔估算值分别是20±6％、67±6％和59±7％。

输注PD UCB移植物没有相关的严重不良作用，无论融化后该单位是否经清洗。所报道的共同副作用包括血红蛋白尿、高血压、荨麻疹、恶心和呕吐及呼吸困难。血红蛋白尿更常见于接受未清洗脐带血的患者。一位患者发生了暂时性癫痫发作和脑病，看来与输注未清洗脐带血瞬时相关，可以治疗消退而没有任何后遗症。

对于融化后清洗与未清洗的PD UCB移植物，获得了84位没有先前移植病史的缓解患者的数据，这些患者为HSCT而接受了清洗(n＝43)或未清洗(n＝40)的PDUCB单位。无论所用的方案，将进行了任何一种清洗(例如，稀释和离心分离)的所有PD脐带血单位分为清洗组。无论输注前是否稀释(例如，重建)，将未进行离心步骤的融化后输注的所有PD脐带血单位分为未清洗组。输注期间发生一次以上的任何级别的不良情况包括：血红蛋白尿(9份未清洗的，1份清洗的)、高血压(6份未清洗的，4份清洗的)、荨麻疹(1份未清洗的，1份清洗的)、恶心/呕吐(2份未清洗的)和呼吸困难(1份未清洗的，1份清洗的)。一位未清洗患者发生了癫痫发作和脑病，消退后没有任何后遗症，虽然与输血的关系尚不确定。

未清洗组的融化后有核细胞总回收率(TNC)(中值95％)高于清洗组(中值75％)。两组的嗜中性白细胞植入的未调整累计发生率相似：未清洗组是91±5％(n＝36)，清洗组是93±4％(n＝41)。然而，未清洗组的嗜中性白细胞植入(20与26天)和血小板植入(血小板20K：47与55天；血小板50K：55与63天)的中值时间出现较早。用单变量和多变量分析血小板植入速度的这种差异十分显著。在单变量分析中，嗜中性白细胞植入速度的这种差异也十分显著。此外，在单变量和多变量分析中，未清洗组的血小板20K植入的累计发生率(n＝28；92±6％)显著高于清洗组(n＝39；75±7％)。急性III-IV级GvHD是10％(未清洗)和19％(清洗)，广泛的慢性GvHD是0％(未清洗)和22％(清洗)。未清洗组的TRM是18±6％，而清洗组是20±7％，未清洗组中恶性病例复发率是11±7％，清洗组是25±8％。未清洗组和清洗组的一年总存活率分别是75±7％(n＝40)与72±8％(n＝43)，一年DFS分别是69±10％(n＝23)与54±9％(n＝34)。

对于良性适应症的造血干细胞移植，清洗组与未清洗组的ANC500、血小板20K和血小板50K植入的中值时间分别是27与12天、58与44天和73与53天。对于恶性适应症的造血干细胞移植，清洗组与未清洗组的ANC500和血小板20K植入的中值时间分别是28与23天，55与49天。

图6显示，在多变量分析中，当总共94位无先前移植史的缓解患者为HSCT而接受清洗(n＝52)或未清洗(n＝42)的PD UCB单位时，不清洗显著改善了血小板植入。总之，经调整的分析证实了单变量分析结果，显示未清洗单位移植(P20K和P50K)的植入快于清洗单位。

清洗与未清洗病例(n＝94)的特征

受者因素女性	未清洗(n＝42，45％)19(45％)	清洗(n＝52，55％)19(36％)	P*0.41
				年龄(岁)
0-23-1112-1819-55两份脐带血	6(14％)21(50％)5(12％)10(24％)8(19％)	14(27％)19(36％)10(19％)9(17％)9(17％)	0.270.99

恶性移植因素高风险(岁)	26(62％)6(14％)	45(86％)20(38％)	0.0080.01
				冷冻前TNC剂量×107/kg
＜33-56-9＞9HLA6年龄匹配	6(14％)20(48％)4(9％)12(28％)7(17％)	9(17％)16(31％)14(27％)13(25％)8(15％)	0.130.99

^*采用费希尔精密检验(Fjsher′s Exact Test)计算P-值。

对237位患者(纳入了上述118位儿科患者)进行了随访研究。中值年龄是9岁(范围是0.3-59)，其中33％＞16岁；中值体重是30kg(范围是4.5-112)，其中35％＞50kg；60％是男性；HLA ABDR匹配的中值#是4.0；中值TNC剂量是5.6×10⁷/kg；中值CD34剂量是1.8×10⁵/kg；移植中心报道的融化后TNC中值剂量是5.2×10⁷/kg；70％为恶性适应症；39％的移植在美国以外进行；27％是两份移植；16％的移植在非髓细胞消融治疗后进行。III-IV级aGVHD和广泛的cGVHD的发病率分别是13％和14％。ANC500、血小板20K和血小板50K植入的未调整植入率分别是88±3％、82±4％和76±4％。ANC 500、血小板20K和血小板50K植入的中值时间分别是22、48和63天。复发率是23±4％，TRM是29±3％。进行的中值随访时间(median follow-up)是325天，1-年总存活率和无疾病存活率分别是59±4％和54±4％。分层分析(stratification analysis)显示CD34+细胞剂量低于0.7×10⁷/kg时植入和存活率结果更糟。

移植了113份清洗的(W)和95份未清洗的(NW)PD脐带血。未超过推荐的DMSO阈值1g/kg受者体重时，没有发生显著的不良作用。移植中心报道融化后TNC的回收率高于NW的(中值为89％对75％)。

NW的未调整植入率高于W PD CB，而前者植入的中值时间也早于后者：对于ANC500，NW是91±4％和20天，而W是88±4％和24天(p＝0.03)；对于血小板20K，NW是86±6％和44天，而W是78±5％和58天(p＝0.004)；对于血小板50K，NW是85±6％和57天，而W是72±6％和75天(p＝0.01)。急性III-IV级GvHD发病率分别是12％(NW)和13％(W)，广泛的慢性GvHD发病率分别是4％(NW)和19％(W)。NW的复发率是16±5％，W是28±5％(p＝0.15)；NW的TRM为25±5％，W是34±5％(p＝0.52)。NW和W的1-年总存活率分别是63±6％与49±5％(p＝0.40)，1-年DFS分别是62±6％与36±7％(p＝0.21)。

PD脐带血移植的结果与使用RBC去除脐带血移植的所公布效果相当，对于植入、TRM和存活率可能更好。融化后清洗PD脐带血没什么好处，不清洗的(PD脐带血)的嗜中性白细胞和血小板植入率和植入速度、TRM、复发率、1-年总存活率和DFS显著优于融化后清洗的PD脐带血。

本实施例证明了以下结果：(1)PD UCB移植的平均和中值细胞剂量较高；(2)对于儿童和成人，嗜中性白细胞和血小板植入的未调整累计发生率看来明显优于红细胞去除(RD)单位；(3)嗜中性白细胞和血小板植入的速度优异，接近良性适应症的骨髓移植；(4)对于成人和儿童，特别是儿童的良性适应症，1-年存活率和移植相关的死亡率显著改善；(5)复发率与RD UCB移植的一样好；和(6)与清洗的相比，未清洗的融化后PD UCB单位显著改善了植入。因此，本实施例说明可以在患者中安全地进行PD UCB移植，其效果与病史对照相当或更好。本实施例还显示融化后未清洗的PD UCB单位改善了血小板植入的发生率和嗜中性白细胞及血小板的植入时间，这表明融化后清洗延迟了造血干细胞的植入。

实施例5.患有输血依赖性珠蛋白生成障碍性贫血的儿童在无关脐带血移植后的快速而持久的植入

本实施例说明本发明脐带血组合物能在患输血依赖性珠蛋白生成障碍性贫血的患者中产生快速而持久的植入，从而能提供最佳的有核细胞总剂量。

脐带血(UCB)是有吸引力的珠蛋白生成障碍性贫血的造血干细胞移植的无关来源。然而，细胞剂量是脐带血移植的关键因素。事实上，脐带血移植在治疗珠蛋白生成障碍性贫血中往往不成功，因为需要给予大量的移植细胞以维持造血作用并防止排异(Rund等，N.Engl.J.Med.353：1135-1146(2005))。本实施例证明采用本发明方法最大程度提高了细胞剂量使得无关脐带血移植能在选择的患者中获得前景良好的结果。

在2003年10月和2006年9月之间，在髓细胞消融治疗后利用无关脐带血移植在10位患输血依赖性珠蛋白生成障碍性贫血的儿科患者中进行了造血重建(hematopoietic reconstitution)(参见表5)。

表5.病例总结

病例编号	年龄(以年计)，性别和体重	Lucarelli分类^	HLA匹配	TNC剂量(×107/kg)	CD34剂量(×105/kg)	ANC 500植入的天数	急性GvHD级别	状况CBT后的天数	进行CBT后的天数	最近出现的嵌合现象CBT后的天数
											1	3.7/F17Kg	I	5/6	11.3	2.4	17	I	存活713	85	100％557
2	2.3/F12Kg	I	3/6	15.0	5.1	12	II	存活604	80	100％419
											3	3.6/F17Kg	I	3/6	13.4	2.1	14	I	存活570	76	100％410
4	5.8/M18Kg		4/6	5.3	3.4	12	II	存活514	70	100％378
											5	11.4/M30Kg	I	3/6(单位1)3/6(单位2)	11.3(组合剂量)	5.7(组合剂量)	12	III	存活416	98	100％285
6	8.2/F21Kg	I	6/6	7.7	8.0	NA	NA	死亡8	NA	NA
											7	6.5/F23Kg	I	6/6	4.8	3.6	12	II	存活339	46	100％205
8	2.7/F14Kg	I	5/6	7.6	2.9	24	III	存活311	78	85.6％162
											9	3.3/F15kg	I	6/6	9.6	5.5	18	II	存活283	50	100％109
10	9.5/M38kg	II	5/6(单位1)4/6(单位2)	7.9(组合剂量)	4.6(组合剂量)	19	I	存活82	仍在住院	91.6％I5.6％II42
											平均值	5.6岁20.5kg		4.6	9.4	4.3	15.6	384	384	73	98.2％331.5
中值	4.8岁17.5kg		4.5	8.7	4.1	14.0	378	378	77	100％315.5

^常广(Chung Gung)患者未进行常规的肝脏生物活检。根据Lucarelli分类的其余两种特征(肝肿大和螯合不佳)是0、1还是2来分类患者。

10位患者使用2份双单位移植物和12份脐带血单位，其中有三位6/6、3位5/6、4位4/6和2位3/6高分辨率HLA A/B/DR匹配。所有的脐带血单位由永生台湾国家脐带血中心(StemCyte Taiwan National Cord Blood Center)提供，去除了血浆但未去除红细胞(RBC)，从而能在体积降低加工后最大程度保留了有核细胞。为进一步提高输注的细胞剂量，融化所有单位，不清洗立即输注。虽然在大多数病例中有严重的ABO不相容(major ABO incompatibility)，但输注后未观察到明显的不良作用。加工后冷冻前的有核细胞(TNC)中值总数是8.7×10⁷/kg(范围4.8-15.0×10⁷/kg)，加工后冷冻前CD34细胞的中值数是4.1×10⁵/kg(范围2.1-8.0×10⁵/kg)受者体重。输注没有严重的不良作用。一位患者在“预计的”嗜中性白细胞植入时间前8天死于青霉素耐药的缓症链球菌(S.mitis)脓毒症。其余9位患者存活，自2005年10月8日起进行的中值随访时间是378天。嗜中性白细胞植入的8位患者在+21天显示完全的供者嵌合现象(fulldonor chimerism)，其余患者在第162天(目前是移植后第311天)达到稳定的混合嵌合(mixed chimerism)(85.6％的供者细胞)。在任何患者中未见自身恢复(autologous recovery)。

移植后，嗜中性白细胞植入(连续3天嗜中性白细胞绝对计数≥500)、RBC输血不依赖性和血小板植入(连续7天不进行血小板输入，血小板计数≥20,000，)的中值时间分别是14(范围12-24天)、35(范围20-50天)和51天(范围45-60天)。患有经治疗消退的I、II和III级急性移植物抗宿主病(GvDH)的患者数目分别是3、4和3位。在最近的随访中，没有广泛的慢性GvDH发生。

32％的输血依赖性珠蛋白生成障碍性贫血患者活不过35岁(Cao，Haematologica 89：1157-1158(2004))。几项研究证明在不同疾病中采用含较高细胞剂量的脐带血移植后能提高存活率(Wagner等，Blood 100：1611-1618(2002)；Barker等，Blood 105：1343-1347(2005)；Locatelli等Blood 93：3662-3671(1999))。鉴于此种脐带血单位含有足够的细胞剂量，无关UCB是无关供者骨髓的合理备选物。本项研究证明，通过选择两份单位移植物和/或加工和融化技术可最大程度提高设定的充足细胞剂量，使无关脐带血移植在选择的输血依赖性珠蛋白生成障碍性贫血患者中产生快速而持久的植入。本项研究中，移植后的中值住院期是77天(范围46-98天)，与利用输血和铁螯合治疗的常规终身治疗相比，明显合算并改善了生活质量。

在15位输血依赖性珠蛋白生成障碍性贫血患者的随访研究中(包括上述10位儿科患者)，利用本发明脐带血组合物的无关脐带血移植能产生快速而持久的植入(参见表6)。

表6.病例总结

年龄(岁)/性别和体重

Lucarelli分类b

HLA匹配

TNC剂量d(×107/kg)

CD34剂量e(×105/kg)

嗜中性白细胞植入的天数f

血小板20K植入的天数g

aGvHDcGvHDh

状况CBT后的天数i

移植后的天数

CBT后出现嵌合现象j

3/F17Kg

I

5/6

11.3

2.4

17

49

ILtd

存活d925

75

100％d557

2/F12Kg

I

3/6

15.0

5.1

12

46

ILtd

存活d806

69

100％d419

3/F17Kg

I

3/6

13.4

2.1

14

50

I无

存活d772

76

100％d410

5/F16kg

II

4/6

5.1

4.4

23

66

无无

存活d728

46

100％d101

5/M18Kg

I

4/6

5.3

3.4

12

43

IILtd

存活d716

58

100％d671

11/M30Kg

I

3/6(1)3/6(2)

11.3k(组合)

5.7k(组合)

12

55

IILtd

存活d618

86

100％(1)d285

8/F21Kg

I

6/6

7.7

8.0

NA

NA

死亡1d8

NA

NA

6/F23Kg

I

6/6

4.8

3.6

11

47

ILtd

存活d541

44

100％d376

2/F14Kg

I

5/6

7.6

2.9

21

50

IILtd

存活d513

78

72.7％d365

3/F15kg

I

6/6

9.6

5.5

18

43

ILtd

存活d485

50

100％d109

m

9/M38kg7/F21kg

III

5/6(1)4/6(2)第一-3/6第二-5/6(1)第二-4/6(2)

7.9k(组合的)第一-7.7第二-18.0k(组合的)

4.6k(组合的)第一-3.3第二-5.5k(组合的)

19第一-移植失败第二--20

68NA

I无IV无

存活d284死亡nd60

82NA

100％(1)d100第二100％d48

10/M30kg

II

4/6(1)4/6(1)

147k(组合的)

6.5k(组合的)

19

135

IIIExt

存活d207

137

100％d193

9/M20kg

I

4/6

5.5

3.6

16

34

III无

存活d72

NA

100％d60

11/F33kg

I

4/6(1)4/6(1)

11.7k(组合的)

5.5k(组合的)

14

28

I无

存活d39

36

100％(I)d42

7岁22kg

44

9.4

4.2

16

55

461(526°)

70

6岁20kg

4.0

7.8

3,9

17

49

523(551°)

72

^a1XCBT＝一份单位脐带血移植；2XCBT＝双份单位脐带血移植。

^b根据Lucarelli分类的两个特征(肝肿大和螯合不佳)为0、1还是2分类患者。

^cHLA匹配是高分辨率，其中(1)和(2)表示第一和第二份脐带血单位的HLA匹配数。

^dTNC＝总有核细胞。

^eCD34＝CD34+细胞。

^f嗜中性白细胞植入的天数是第一次连续3天达到嗜中性白细胞绝对计数≥500，16位移植患者中的14位(88％)实现植入并显示持久的供体嵌合现象，从而使得卡普伦-迈尔植入率为93±6％。

^g血小板植入的天数是不进行输入，第一次连续7天达到血小板计数≥20,000或50,000，血小板20K和50K植入率的卡普伦-迈尔估算值分别是91±9％和82±8％。

^haGvHD＝I-IV级急性移植物抗宿主病；cGvHD＝慢性移植物抗宿主病，其级别是局部(Ltd)或广泛的(Ext)。

ⁱ随访于2006年5月8日。

^j最新的供者嵌合现象数据，括号内是植入单位。

^k两单位脐带血移植中两份脐带血单位的合并细胞剂量。

^l患者7在第8天死于青霉素耐药的缓症链球菌脓毒症。

^m患者12的初次3/6HLA匹配脐带血移植失败，但随后植入了双份单位脐带血移植物。

ⁿ患者12在实现植入后的第60天因颅内出血导致创伤性意外而死亡。

^o随访时间平均值和中值，排除了死亡患者。

融化基本上去除了血浆但未去除红细胞的冷冻脐带血单位，不清洗可最大程度提高输注的细胞剂量。尽管ABO不相容，但未观察到明显的不良作用。髓细胞消融后，将21份脐带血单位植入15位亚洲珠蛋白生成障碍性贫血患者，其中5人是双份无关脐带血移植，1人是再次移植。虽然86％的脐带血单位-受者配对HLA时不匹配，但几乎没有严重的GvHD；经治疗均消退。供者嵌合性的嗜中性白细胞植入的未调整累计发生率是93±6％。达到嗜中性白细胞植入、不依赖RBC输血和血小板植入的中值时间分别是16、35和46天。无珠蛋白生成障碍性贫血存活率是87±9％，1-年总存活率是86±9％，1-年时移植相关死亡率是13±9％，复发率是0％。由于68％的重症珠蛋白生成障碍性贫血患者活不过35岁并且大多数患者没有HLA-匹配的兄弟姊妹，与终身输血和螯合(治疗)相比，无关脐带血移植能带来满意的存活率并提供合算的备选方案同时改善生活质量。

实施例6.对用红细胞去除和血浆去除脐带血单位进行移植的核查配对分析(Audited Matched Pair Analysis)

本实施例说明了对PD和红细胞去除(RD)UCB移植物之间进行配对分析的方法，从而能测定利用PD UCB和RD UCB进行造血干细胞移植之间临床效果的显著差异。

配对回顾分析(matched pair retrospective analysis)可能是测定用PD UCB和RD UCB进行HSCT之间临床效果明显差异的最确定回顾方法。为对PD和RD UCB移植物之间进行配对分析，按照以下特性匹配和配对移植RD或PD UCB的患者：

(1)受者年龄(16岁以下的患者±2岁。16岁以上的患者±5岁)；(2)体重(50kg以下的患者±5kg，50kg以上的患者±10kg)；(3)诊断；(4)HLA匹配程度；(5)先前移植或复发期间移植，诱导失败或耐药性疾病；(6)恶性肿瘤和某些疾病的风险状态(例如，对于白血病：CR#或CP#和风险程度的证据是已知曾诊断为脊髓发育不良(MDS)，高风险细胞遗传学方法证明例如具有t(9∶22)，t(1∶19)，t(4∶11)的那些人，或其它MLL重排或MDS相关的复杂核型的证据；对于淋巴瘤：淋巴瘤的级别应匹配；对于珠蛋白生成障碍性贫血：佩萨罗(Pesaro)分类应匹配)；(7)任选一份和两份脐带血单位(以双份单位移植物为例，应以相同方法加工此二单位)；和(8)任选髓细胞消融与强度降低。如果多位RD UCB移植物受者与PD UCB移植物受者匹配，则优选体重最接近然后是移植年份最接近的RD UCB受者。如果根据以上所有标准，RD UCB移植患者与PD UCB受者不匹配，则从居先的优先条件开始优选优先条件匹配最高的RD UCB患者。不因匹配的优先条件数目而优先选择。例如优先选择与前5条优先条件匹配的RD UCB患者，而不是与前4条加上第6、7和8条优先条件匹配的RD UCB患者。

也可如下所示分析患者：

(1)由于理论上两种加工方法的加工后有核细胞回收率不同，这样最终可能影响这种移植物的细胞剂量平均值和中值以及最终的临床效果，有核细胞和CD34细胞剂量最初不应匹配。如果在PD和RD单位之间观察到明显的差异，则可将具有相似(a)有核细胞(彼此±0.5×10⁷/kg)或(b)CD34+细胞剂量(彼此±0.25×10⁵/kg)的匹配配对与不具有相似细胞剂量的配对相比较。如果在两类脐带血之间观察到统计学显著差异并且细胞剂量是主要原因，则细胞剂量匹配的配对在PD和RD单位之间的临床效果差异低于细胞剂量不匹配的配对是合理的。或者，如果剂量匹配的配对和剂量不匹配的配对的PD和RD单位之间均存在效果差异，则细胞剂量可能不是解释临床效果差异的唯一机制。可利用PD和RD组的细胞剂量分层来观察细胞剂量匹配时是否有任何差异。

(2)对于恶性肿瘤，没有先前移植并在缓解期间进行移植配对可能与具有先前移植和/或在复发期间，诱导失败期间进行或具有耐药疾病的配对相反。如果可能，可以比较此两类患者的(1)性别；(2)CMV血清阳性；(3)冷冻或冷冻保护前的移植物和融化后有核细胞及CD34+细胞剂量；(4)移植的年份；(5)中值随访时间；(6)诊断到移植的时间；(7)移植的区域(美国、西欧、澳大利亚、中南美洲、亚洲)，和如果可得到，(8)调节方案(conditioning regimen)。

对于PD和RD UCB单位之间的配对分析，可利用以下研究终点：

I.初步效果：

1.移植后12个月时的总存活率。

2.嗜中性白细胞持续植入的未调整累计发生率(未对预期植入期之前的死亡进行调整)。

3.嗜中性白细胞持续植入的速度。

II.次级效果：

1.移植后12个月时的无疾病存活率。

2.移植后12个月时的TRM。

3.血小板持续植入的未调整累计发生率(未对达到预定植入期之前的死亡进行调整)。

4.血小板持续植入的速度。

5.急性和慢性移植物抗宿主病(GVHD)的发病率和严重程度。

6.恶性肿瘤复发的发生率。

7.输注后不良反应的发生率和严重程度。

实施例7.融化后直接输注冷冻脐带血单位的方法

本实施例描述了融化和直接输注本发明的血浆去除并经冷冻保存的脐带血单位的方法，所述方法不进行任何清洗步骤。

在患者不是新生儿并且肾功能未受损的情况下，优选以下方法，因为该方法最大程度降低了活的有核细胞丧失，而这是融化后清洗的长时间操作所不可避免的。该方法在患者中产生的耐受性良好，只有偶发的副作用，可用标准方法方便地治疗。因此，可将最高剂量的活干细胞安全而有效地输注入需要的患者中。

融化前的注意事项：

步骤	行为
		1	如果可能，在患者的床侧融化脐带血单位。考虑到该单位中DMSO(7.5-15g)和游离血红蛋白的含量以及该单位中可能存在ABO/Rh不相容性红细胞，患者应按惯例在移植中心进行术前用药。
2	将保存在液氮保存容器中的冷冻脐带血单位运至患者的床侧，该容器能将产品维持在≤-135℃的温度。
		3	先验证患者身份和脐带血单位，再融化脐带血产品。
4	有时，脐带血单位可以装在2个冷冻袋中，或者两份单位移植可利用两份脐带血单位。一次只应融化一袋，应先完成第一袋的输注待患者状态稳定，再融化另一袋。类似地，应先完成一袋或多袋第一脐带血单位的输注待患者状态稳定，再融化一袋或多袋第二脐带血单位。
		5	该单位输注后，利用附带的小袋样品或袋中的残留物检验该脐带血单位。
6	融化后，必需立即输注脐带血单位。一旦融化或部分融化后不要再次冷冻脐带血单位。

融化脐带血单位

步骤	行为
		1	在水浴中注入足够的无菌水以完全浸没脐带血单位。
2	将水升温至37℃±2℃。在整个融化过程中水浴中的水应维持在该温度。
		3	将一塑料袋(优选无菌)拿至水浴侧。如果该袋可以密封，不要将其放入水浴中。万一含有脐带血单位的冷冻袋破损导致渗漏，该袋可用于抢救脐带血单位。
4	小心地从金属盒中取出冷冻单位，验证该单位的标识并检查袋子是否有任何破损。
		5	将冷冻的脐带血单位放入塑料袋中以防止脐带血单位直接与水接触。对于开封的袋子，在塑料袋外轻轻揉捏脐带血，小心不要让水进入袋中。
6	对于密封的袋子，挤出大部分空气后密封袋子，将其浸在水中并经塑料袋轻轻揉捏脐带血单位来融化该脐带血单位。

7	融化过程中脐带血单位要随时有人看管。
		8	融化过程中检查脐带血袋是否有渗漏。如果有渗漏，按照输注破损或渗漏产品的内部方案，监测输注了可能受污染产品的患者并作预防性抗菌治疗。不要弃去脐带血，特别是移植受者已经条件化(conditioned)。
9	一旦轻微“发粘”便从水浴中取出脐带血单位，并不让其完全融化。从外层塑料袋中取出冷冻袋，用酒精拭子消毒输注端口。

输注

步骤	行为
		1	立即并尽可能快地通过冷冻袋的一个消毒端口将产品吸取入无菌的60cc注射器中，该操作使用最粗针头以最大程度减少细胞剪切。如果有(脐带血)渗入外层塑料袋中，小心地从外层塑料袋中取出冷冻袋，通过消毒的输注端口吸取冷冻袋中剩余的产品，然后小心地吸取漏入外层塑料袋的渗漏产品。
2	然后通过中心线尽可能快地(例如，5-10ml/分钟)静脉内推注注射器中的产品。由于脐带血产品有粘性，估计有很大的阻力。
		3	用10-20cc的8％葡聚糖/5％人血清白蛋白溶液清洗冷冻袋。
4	如果可用的话，第一袋输注完成后再融化第二袋脐带血。

给予造血干细胞相关的可能不良反应：

轻度到中度

常见的：恶心、呕吐、高血压、低血压、心动过缓、血红蛋白尿、颤栗、甜奶油玉米味或蒜味(呼吸DMSO所致)。

少见的：头痛、腹部绞痛、腹泻、面色潮红(flushing)、寒颤、发热、面色潮红、胸部紧迫感、眩晕、脑病、癫痫发作、心动过缓、高胆红素血症、血清转氨酶水平升高。

严重到致命的

非常少见的(在1,410位患者的所公布研究中最大约0.4％)，通常局限于自身。

心脏：心动过缓、心脏传导阻滞、心律不齐、中风、心博停止。

神经：脑病(可能与大于2g DMSO/kg受者体重相关，可通过血浆取出法治疗)、癫痫发作。

肺部：呼吸抑制。

免疫：过敏反应。

肾脏：高浓度的游离血红蛋白所致的急性肾功能衰竭(用抗组胺和皮质类固醇、充分饮水、尿碱化、甘露醇利尿剂进行术前用药来缓解)。

潜在不良反应的原因

DMSO毒性：虽然DMSO对人的急性毒性剂量尚未测定，但据报道，静脉内给予DMSO的LD50值(即，杀伤50％测试动物的DMSO用量)在3.1-9.2g/kg小鼠，狗是2.5g/kg，猴子是11g/kg以上。大多数公布的报道将DMSO剂量维持在1g/kg以下。在一典型的本发明脐带血单位中，最高DMSO含量在约7.5(1袋)-约15g(2袋)之间。因此，在获得充足的细胞剂量不是问题的肾功能受损患者或低龄患者中(例如，7kg以下的那些患者用1袋；如果要同时给予两袋的话，指15kg以下的患者)，推荐清洗该产品。10％DMSO冷冻保存的干细胞产品的优选输注速度在约5-约10ml/分钟之间。

体积过载：输注的最大体积应是约5-约15ml/kg/剂量。

严重的ABO血型不相容：虽然患者和供者之间的ABO血型不相容在脐带血移植中不是问题，但万一发生严重的血型不相容，例如患者的血型是O而脐带血单位不是O型，应提供以下额外的信息。虽然已知输入大量的严重ABO不相容红细胞会导致抗-A和/或抗-B抗体滴度明显的患者输血反应(Bensinger等，Transplantation 33：427-429(1982))，但应注意当受者的抗-A和抗-B血凝素滴度是1∶16或更低时，可以安全输注完全单位的ABO不相容红细胞。Sauer-Heilborn等，Transfusion 44：907-916(2004)描述了输注ABO不相容外周血干细胞(PBSC)和骨髓单位的经历，注意到与骨髓组分(红细胞体积＝300-400ml)相比，用PBSC单位(红细胞体积＝75-100ml)的风险较低。本发明脐带血单位中的红细胞体积为约40-约100ml。不知该红细胞体积是否会导致严重的不良反应，但诸如体温升高、脉搏加快和肌肉疼痛等症状可能发生。由于脐带血样品的溶血作用，估计尿液和血浆会呈黑色或红色。输注速率应是约5-约10ml/分钟，密切监测患者。在某些情况中，患者术前可以采用解热药、抗组胺和/或皮质类固醇药物并应充分饮水。不良反应通常在输注时和输注结束后的缓解期间发生。然而，一些反应可在输注完成后约6-7小时发生，所以应监测整个期间的患者情况。

常规的术前用药方案包括但不限于：充分饮水(例如，严重的ABO不匹配)、抗组胺药(例如，严重的ABO不匹配)、皮质类固醇、甘露醇、止吐药和解热药(例如，严重的ABO不匹配)。不良反应的常规治疗性干预的非限制性例子包括利尿剂(例如，体积过载)、抗惊厥药(例如，癫痫发作)、阿托品(例如，心动过缓)、血浆取出法(例如，脑病)、给O₂(例如，肺郁)和麻醉剂。

实施例8.融化、重建和输注冷冻脐带血单位的方法

本实施例描述了融化、重建和输注本发明的血浆去除并冷冻保存脐带血单位的方法。

在体积过载不是严重顾虑的某些情况中，为降低本发明脐带血单位的粘度并促进依靠重力静脉内输注，可按照以下方案用，例如约两倍体积的人血清白蛋白/Gentran溶液稀释或重建这些单位。这降低了稀释后该单位中的DMSO浓度以及DMSO可能诱导的任何干细胞毒性，同时也使得融化和输注之间的时间更长。其优点包括易于给予和给予时间延长。

融化前的注意事项：

步骤	行为
		1	在生物学安全工作橱中融化冷冻脐带血单位。
2	考虑到该单位中DMSO(7.5-15g)和游离血红蛋白的含量以及该单位中的红细胞ABO/Rh可能不相容，患者应按惯例在移植中心术前用药。
		3	先验证患者身份和脐带血单位，再融化脐带血产品。
4	有时，脐带血单位可以装在2个冷冻袋中，或者两份单位移植可利用两份脐带血单位。一次只应该融化一袋，应先完成第一袋的输注待患者状态稳定，再融化另一袋。类似地，应先完成一袋或多袋第一单位的输注待患者状态稳定，再融化一袋或多袋第二脐带血单位。
		5	该单位输注后，利用附带的小袋或袋中的残留物检验该脐带血单位。
6	融化后，必需立即稀释或重建脐带血单位。一旦融化或部分融化后不要再次冷冻脐带血单位。
		7	称重重建袋。

制备人血清白蛋白/Gentran重建溶液：

步骤	行为
		1	关闭融化袋组件和血浆转移袋组件上的所有旋夹(roller clamp)。
2	用血浆转移袋组件的一端刺入(spike)融化袋组件中1号袋的注射端口。
		2	除去50ml人血清白蛋白(HAS)小瓶的盖子，用酒精制品清洁橡胶隔膜。
3	用血浆转移袋组件的另一端刺入HAS隔膜。
		4	将皮下针头插入与血浆(转移组件)刺入之处相邻的HAS隔膜以排空该小瓶。
5	对于体积100ml或较少的脐带血：·将HAS小瓶提到1号袋上方，打开旋夹，小瓶(50ml)的内含物流入1号袋。对于体积大于100ml的脐带血：·使用2小瓶HSA(总共100ml)，均加入1号袋。
		6	热封HAS小瓶和1号袋之间接近1号袋注射口处的导管。弃去HAS小瓶和多余的导管。
7	用第二血浆转移袋组件刺入1号袋的另一注射端口。
		8	用该转移组件的另一端刺入Gentran 40袋的注射端口。

9	将1号袋放在电子秤上，称重为0。
		10	对于体积100ml或较少的脐带血：·打开旋夹，让200克Gentran 40流入1号袋。对于体积大于100ml的脐带血：·打开旋夹，让400克Gentran 40流入1号袋。
11	热封接近1号袋的血浆转移导管，弃去导管。
		12	1号袋中的终体积应是250ml或500ml(HAS的终浓度是5％，Gentran的终浓度是8％)。
13	给1号袋标注准备清洗溶液的日期和时间以及准备清洗所用技术的首字母。
		14	在融化袋组件的各3个袋上记录冷冻脐带血单位的单位号，或贴上单位标识标记。
15	将融化袋组件与清洗液置于2℃-8℃冰箱中冷藏至少30分钟。一旦制备了清洗溶液，应在24小时内使用。

融化脐带血单位

步骤	行为
		1	在水浴中注入足够的无菌水以完全浸没脐带血单位。
2	将水浴中的水升温至37℃±2℃。在整个融化过程中水浴中的水应维持在该温度。
		3	将一塑料袋(优选无菌)拿至水浴侧。如果该袋可以密封，不要将其放入水浴中。万一含有脐带血单位的冷冻袋破损导致渗漏，该袋可用于抢救脐带血单位。
4	小心地从金属盒中取出冷冻单位，验证该单位的标识并检查袋子是否有任何破损。
		5	将冷冻的脐带血单位放入塑料袋中以防止脐带血单位直接与水接触。该步骤应在该单位从液氮中取出并验证了身份和检查了该单位之后立即进行。对于开封的袋子，在塑料袋外轻轻揉捏脐带血，小心不要让水进入袋中。如果冷冻袋有裂缝，最大程度减少污染至关重要，因为该袋的内含物可能渗入外侧的塑料袋。
6	对于密封的袋子，通过挤出大部分空气后密封袋子，将其浸在水中并经塑料袋轻轻揉捏脐带血单位来融化该脐带血单位。
		7	融化过程中脐带血单位要随时有人看管。
8	融化过程中检查脐带血袋是否有渗漏。如果有渗漏，按照输注破损或渗漏产品的内部方案，监测输注了可能受污染产品的患者并作预防性抗菌治疗。不要弃去脐带血。
		9	一旦处于“冰融(icy slushy)”状态便从水浴中取出脐带血单位。从外层塑料袋中取出冷冻袋，用酒精拭子消毒输注端口。该融化步骤不应超过5分钟。

脐带血产品的稀释或重建

步骤	行为
		1	立即并尽可能快地通过冷冻袋的一个消毒端口将产品吸取入无菌的60cc注射器中，该操作使用最粗的针头以最大程度减少细胞剪切。如果有(脐带血)渗入外层塑料袋中，小心地从外层塑料袋中取出冷冻袋，通过消毒的输注端口吸取冷冻袋中剩余的产品，然后小心地吸取渗入外层塑料袋的产品。
2	然后尽可能快地将注射器中的脐带血产品注入重建袋中。由于脐带血产品

	有粘性，估计有很大的阻力。
		3	现在称重含脐带血产品的重建袋，从含产品的袋重量和空重建袋的重量之间的差异确定融化脐带血产品的重量和体积。
4	然后向重建袋中加入两倍体积的5％人血清白蛋白/8％葡聚糖(HSA/Gentran)重建溶液。稀释不应超过5分钟。例如，如果脐带血单位的融化后体积为75cc或者融化后重量为75g，则加入150cc的HAS/Gentran重建溶液。
		5	重建步骤不应超过5分钟。

输注

步骤	行为
		1	立即并尽可能快地将该单位拿至患者室，通过悬吊重建袋经中心线输注产品。融化并重建的产品应在约30分钟内输注。如果产品太粘而流动不畅，轻柔而缓慢地推挤产品以协助输注。
2	如果可用的话，第一袋输注完成并确定患者状态稳定和耐受后再融化第二脐带血袋。
		3	从融化到转移到输注的整个过程不应超过60分钟。

给予造血干细胞相关的可能不良反应：

轻度到中度

常见的：恶心、呕吐、高血压、低血压、心动过缓、血红蛋白尿、战栗、甜奶油玉米味或蒜味(呼吸DMSO所致)。

少见的：头痛、腹部绞痛、腹泻、面色潮红(flushing)、寒颤、发热、面色潮红、胸部紧迫感、眩晕、脑病、癫痫发作、心动过缓、高胆红素血症、血清转氨酶水平升高。

严重到致命的

非常少见的(在1,410位患者的所公布研究中最大约0.4％)，通常局限于自身。

心脏：心动过缓、心脏传导阻滞、心律不齐、中风、心博停止。

神经：脑病(可能与大于2g DMSO/kg受者体重相关，可通过血浆取出法治疗)、癫痫发作。

肺部：呼吸抑制。

免疫：过敏反应。

肾脏：高浓度的游离血红蛋白所致的急性肾功能衰竭(用抗组胺和皮质类固醇、充分饮水、尿碱化、甘露醇利尿剂进行术前用药来缓解)。

潜在不良反应的原因

DMSO毒性：虽然DMSO对人的急性毒性剂量尚未测定，但据报道，静脉内给予DMSO的LD50值(即，杀伤50％测试动物的DMSO用量)在3.1-9.2g/kg小鼠，狗是2.5g/kg，猴子是11g/kg以上。大多数公布的报道将DMSO剂量维持在1g/kg以下。在一典型的本发明脐带血单位中，最高DMSO剂量在约7.5(1袋)-约15g(2袋)之间。因此，在获得充足细胞剂量不是问题的肾功能受损患者或低龄患者中(例如，7kg以下的那些患者用1袋；如果要同时给予两袋的话，指15kg以下的患者)，推荐清洗产品。10％DMSO冷冻保存的干细胞产品的优选输注速度在约5-约10ml/分钟之间。

体积过载：输注的最大体积应是约5-约15ml/kg/剂量。

严重的ABO血型不相容：虽然患者和供者之间的ABO血型不相容在脐带血移植中不是问题，但万一发生严重的血型不相容，例如患者的血型是O而脐带血单位不是O型，应提供以下额外的信息。虽然已知输入大量的严重ABO不相容红细胞会导致抗-A和/或抗-B滴度明显的患者输血反应(Bensinger等，Transplantation33：427-429(1982))，但应注意当受者的抗-A和抗-B血凝素滴度是1∶16或更低时，可以安全输注完全单位的ABO不相容红细胞。Sauer-Heilborn等，Transfusion44：907-916(2004)描述了输注ABO不相容外周血干细胞(PBSC)个骨髓单位的经历，注意到与骨髓组分(红细胞体积＝300-400ml)相比，用PBSC单位(红细胞体积＝75-100ml)的风险较低。本发明脐带血单位中的红细胞体积为约40-约100ml。不知该红细胞体积是否会导致严重的不良反应，但诸如体温升高、脉搏加快和肌肉疼痛等症状可能发生。由于脐带血样品的溶血作用，估计尿液和血浆会呈黑色或红色。输注速率应是约5-约10ml/分钟，密切监测患者。在某些情况中，患者术前可以用解热药、抗组胺药和/或皮质类固醇药物并应充分饮水。不良反应通常在输注时和输注结束后的缓解期间发生。然而，一些反应可以在输注完成后约6-7小时发生，所以应监测整个期间的患者情况。

常规的术前用药方案包括但不限于：充分饮水(例如，严重的ABO不匹配)、抗组胺药(例如，严重的ABO不匹配)、皮质类固醇、甘露醇、止吐药和解热药(例如，严重的ABO不匹配)。不良反应的常规治疗性干预的非限制性例子包括利尿剂(例如，体积过载)、抗惊厥药(例如，癫痫发作)、阿托品(例如，心动过缓)、血浆取出法(例如，脑病)、O₂(例如，肺郁)和麻醉剂。

应该知道上述描述只是说明性而非限制性的。本领域技术人员阅读以上说明书可明白许多实施方式。因此，本发明的内容不应取决于以上说明书，而应取决于随附的权利要求书连同授权的这些权利要求的等价方式的全部范围。所有文章和参考文献，包括专利申请、专利和PCT公开出于所有目的纳入本文作为参考。

Claims (41)

1.一种脐带血组合物，其含有以体积计0％-30％的血浆，以体积计至少50％的红细胞，20×10⁷-500×10⁷个有核细胞，抗凝剂，和以体积计5％-15％的所述冷冻保护剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脐带血组合物含有干细胞。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述干细胞是造血干细胞。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脐带血组合物含有以体积计5％-40％的所述抗凝剂。

5.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述脐带血组合物含有以体积计5％-20％的所述抗凝剂。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗凝剂是选自：柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸钠、葡萄糖、腺苷和它们的混合物。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗凝剂包含柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸钠、葡萄糖和腺苷。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述脐带血组合物含有以体积计7％、8％、9％或10％的所述冷冻保护剂。

9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述冷冻保护剂是二甲基亚砜。

10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述脐带血组合物还包含选自Gentran 40和羟乙基淀粉的冷冻保护剂。

11.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脐带血组合物含有的红细胞浓度至少3.2×10⁶个红细胞/μl。

12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脐带血组合物含有以体积计至少65％的红细胞。

13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脐带血组合物含有：

(a)至少3.8×10⁶个红细胞/μl；

(b)1×10⁹至2.5×10⁹个红细胞；

(c)大于10×10⁶个白细胞/μl；

(d).至少90×10⁷个白细胞；

(e)1×10⁶至5×10⁷个CD34+细胞；或

(f)总数90×10⁷至300×10⁷个有核细胞。

14.权利要求1所述的组合物用于制造治疗造血系统相关恶性疾病或良性病症的药物的用途。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述恶性疾病是血液恶性肿瘤。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述血液恶性肿瘤选自：急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、脊髓发育不良疾病、青少年慢性髓细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤。

17.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述造血系统相关良性病症选自：血红蛋白病、骨髓衰竭综合征、免疫缺陷、代谢病/贮积病、嗜中性白细胞病症、血小板疾病和自身免疫疾病。

18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述血红蛋白病是珠蛋白生成障碍性贫血。

19.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述血红蛋白病是镰状细胞病。

20.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于提高所述哺乳动物对象中嗜中性白细胞植入的累计发生率，所述提高是与全脐带血或红细胞去除的脐带血相比。

21.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于提高所述哺乳动物对象中血小板植入的累计发生率，所述提高是与全脐带血或红细胞去除的脐带血相比。

22.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于提高所述哺乳动物对象中嗜中性白细胞植入的速度，所述提高是与全脐带血或红细胞去除的脐带血相比。

23.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于提高所述哺乳动物对象中血小板植入的速度，所述提高是与全脐带血或红细胞去除的脐带血相比。

24.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于提高所述哺乳动物对象的无疾病存活率，所述提高是与全脐带血、红细胞去除的脐带血、骨髓或外周血干细胞相比。

25.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于降低所述哺乳动物对象的移植相关死亡率，所述降低是与全脐带血、红细胞去除的脐带血、骨髓或外周血干细胞相比。

26.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于提高所述哺乳动物对象的总存活率，所述提高是与全脐带血、红细胞去除的脐带血、骨髓或外周血干细胞相比。

27.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于降低所述哺乳动物对象的急性和慢性移植物抗宿主病的发病率，所述降低是与骨髓或外周血干细胞相比。

28.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物为多剂量形式。

29.如权利要求14所述的用途，所述药物联合了骨髓或外周血干细胞。

30.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物配制成输注剂型。

31.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物对象是人。

32.一种制备如权利要求1所述的脐带血组合物的方法，所述方法包括：

(a)从含抗凝剂的脐带血样品中除去一定体积的血浆；和

(b)在步骤(a)获得的样品中加入冷冻保护剂，由此制得权利要求1所述的脐带血组合物。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，从供者收集所述脐带血样品。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述供者是新生儿。

35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述抗凝剂是选自：柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸钠、葡萄糖、腺苷和它们的混合物。

36.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述冷冻保护剂是二甲基亚砜。

37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，还加入选自Gentran 40和羟乙基淀粉的冷冻保护剂。

38.如权利要求32所述的方法，其特征在于，还包括以每分钟降低1℃的速度将所述脐带血组合物从4℃冷冻至-50℃的步骤。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，还包括以每分钟降低10℃的速度将所述脐带血组合物从-50℃冷冻至-90℃的步骤。

40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，还包括将所述脐带血组合物保存在-135℃以下的步骤。

41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，还包括融化所述脐带血组合物的步骤。

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