WO2016144051A1 - 암 치료용 세포 치료제 및 이의 병용 요법 - Google Patents

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서해영
김성수
장다영
정진화
이영돈
황우섭
박진성
이수정
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아주대학교산학협력단
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    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cells for treating cancer, and to an adjuvant for cancer, a kit for treating cancer, and a method for treating cancer comprising the cells prepared by the method.
  • Brain tumors are very damaging to the brain and have very low survival rates. Surgical extraction is most effective as a conventional treatment for brain tumors, but surgery is often impossible depending on the type of brain tumor and the site of its occurrence.
  • BBB brain-blood barrier
  • chemotherapy using anticancer drugs requires a higher concentration of anticancer drugs than other cancers to treat brain tumors.
  • gene therapy is a method of directly introducing a gene that inhibits the proliferation of cancer cells into cancer cells, mainly using a virus for the introduction of the gene, the virus itself does not have the ability to move to the cancer must be injected surgically. However, it is practically impossible to inject the virus individually into every minute tumor or cancer, which has limitations in targeting cancer cells.
  • Korean Patent No. KR 10-1022401 is known as a method for increasing susceptibility by introducing a suicide gene into mesenchymal stem cells and treating cancer.
  • KR 10-1022401 does not disclose information about a combination treatment adjuvant which periodically manipulates mesenchymal stem cells in a special environment and co-administers them in combination with other anticancer agents to improve the effects of anticancer agents.
  • Concurrent therapy with chemotherapy and cell therapies such as mesenchymal stem cells
  • chemotherapy and cell therapies has also been studied in connection with concomitant administration in cancer, but concomitant administration with mesenchymal stem cells is impaired after chemotherapy with chemotherapy.
  • the research aimed at administering cells such as autologous stem cells to recover the cells has been focused, and there have not been many reports on attempts to utilize stem cells themselves as a therapeutic for combination therapy.
  • the present inventors are studying new cancer therapeutic agents that can overcome the limitations of conventional chemotherapy, and are prepared by freezing and thawing MSC / CD cells prepared by introducing cytosine deminase gene into mesenchymal stem cells. Completion of the present invention was found that the cells exhibit very excellent tumor suppression effect and survival improvement effect as compared to simple MSC / CD cells, and can maximize the combined treatment effect with existing anticancer agents.
  • the present invention provides a combination dosage form with a chemical anticancer agent and a combination dosage method.
  • the present invention comprises the steps of 1) preparing MSC / CD by introducing cytosine deaminase (CD) into mesenchymal stem cells (MSC); 2) freezing the prepared MSC / CD to prepare a frozen MSC / CD; And 3) thawing and suspending frozen MSC / CD to prepare F cells.
  • CD cytosine deaminase
  • MSC mesenchymal stem cells
  • the present invention provides an anticancer adjuvant comprising F cells prepared by the above method.
  • the present invention provides a kit for treating cancer comprising F cells and 5-fluorocytosine (5-FC) prepared by the above method.
  • the present invention provides a method for preparing MSC / CD by introducing cytosine deaminase (CD) into mesenchymal stem cells (MSC); 2) freezing the prepared MSC / CD to prepare a frozen MSC / CD; 3) thawing and suspending frozen MSC / CD to prepare F cells; 4) administering said F cells to a subject in need thereof; And 5) administering 5-fluorocytosine (5-FC) to the subject in need thereof; It provides a cancer prevention or treatment method comprising a.
  • CD cytosine deaminase
  • MSC mesenchymal stem cells
  • the production method of the present invention has a very good tumor suppression effect when treated with 5-FC, although there is no difference in proliferative capacity compared with the mesenchymal stem cells expressing cytosine deaminase used immediately after culture.
  • the combination treatment with other anticancer agents can provide F cells that induce a marked synergistic effect that exceeds the effects of conventional anticancer combination treatments, and thus can be utilized as a kit for cancer treatment including such F cells. It can be usefully used to maximize the effects of existing chemotherapy.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of mesenchymal stem cell lines (MSC / CD) continuously expressing cytosine dianaminase and its suicide effect and bystander effect.
  • Figure 2 is a diagram showing the results (B) confirming the MSC or MSC / CD and 5-FC treatment process (A) and the resulting cell suicide effect.
  • FIG 3 is a view showing the results of confirming the treatment process (A) of MSC or MSC / CD and 5-FC, and the bystander effect (B, C).
  • Figure 4 is a view showing the cell production and processing (A) and the viewer effect (B) of each cell to compare the viewer effect of I cells and F cells (DMSO), F cells (CS10).
  • Figure 5 is a diagram showing the results of comparing the colony forming ability of I cells and F cells by microscopic observation (A) and quantitative analysis (B) using CFU-A.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a process (A) of treating I cells or F cells and 5-FC in a brain tumor model, anatomical microscope results (B), and tumor volume change (C) indicating brain tumor changes accordingly.
  • FIG. 7 is a graph showing a change in tumor volume according to I cell or F cell treatment (A) and a representative tumor model (B) showing the external size of the tumor in a subcutaneous tumor model transplanted with liver cancer cells subcutaneously. .
  • Figure 8 (A) is a subcutaneous tumor model subcutaneously transplanted pancreatic cancer cells
  • Figure 8 (B) is a subcutaneous tumor model subcutaneously transplanted lung cancer cells
  • Figure 8 (C) is a subcutaneous transplanted colon cancer It is a graph showing the change in tumor volume according to I cell or F cell treatment in the tumor model.
  • Figure 9 shows the results of cell death confirmation (D) and IC 50 values through fluorescence image of U87MG expressing GFP expressing GFP-expressing method (A), according to the cell killing effect (B, C) It is a figure which shows the bologram (isobologram) result (E).
  • Fig. 10 shows IC 50 value isobologram results of F cell + 5FC + anticancer drug combination treatment method (A) and anticancer drug combination therapy for carmustine (B) and irinotecan (C), respectively.
  • Figure 11 shows the synergistic effect in the combined treatment process (A) of F cells + 5-FC + temozolomide (TMZ), anatomical microscopy results (B), tumor volume changes (C), and survival improvement showing brain tumor changes accordingly. It is a figure which shows the result which confirmed (D).
  • FIG. 12 shows the analysis of the combined treatment effect of I-cell or F-cell with 5-FC and temozolomide (TMZ) in subcutaneous tumor treatment model (A) and F-cell, 5-FC and temozolomide (TMZ) combination treatment.
  • Figure showing the results of confirming the change in tumor volume (B) and the synergistic effect (C) in the survival analysis.
  • the present invention comprises the steps of: 1) preparing MSC / CD by introducing cytosine deaminase (CD) into mesenchymal stem cells (MSC); 2) freezing the prepared MSC / CD to prepare a frozen MSC / CD; And 3) thawing and suspending frozen MSC / CD to prepare F cells.
  • CD cytosine deaminase
  • MSC mesenchymal stem cells
  • the method for producing F cells of the present invention is treated with 5-FC despite the fact that there is no difference in proliferative capacity compared with mesenchymal stem cells (I cells) expressing cytosine deaminase used immediately after culture.
  • F cells can be provided that show a very good tumor suppression effect and also induce a marked synergistic effect beyond the effects of conventional anticancer drugs in combination therapy with other anticancer drugs.
  • MSC / CD refers to mesenchymal stem cells prepared for expression of cytosine deminase (CD) in mesenchymal stem cells, and mesenchymal stem cells into which such cytosine deaminase is introduced are directed to cancer cells.
  • CD cytosine deminase
  • MSC / CD has the advantage of acting as an effective anticancer agent by inducing cell death by itself, reducing side effects that can be caused by unwanted and lasting effects, and by moving around cancer cells to kill surrounding cancer cells.
  • F cell a cell produced by freezing / thawing / CD
  • F cell When used in combination with the agent, it can be used as an adjuvant to enhance the effect of the anticancer agent by exhibiting a synergistic effect that significantly increases the anticancer effect.
  • MSC Mesenchymal stem cells
  • the "cytosine demininase” of the present invention is a gene that functions to convert a prodrug that is harmless to the human body into a suicide gene, and is a cytotoxic anti-cancer substance.
  • the prodrug of the anticancer drug 5-FU (5-fluorouracil) 5- Refers to the conversion of 5-fluorocytosine (FC) into 5-FU.
  • Such suicide genes may be introduced into mesenchymal stem cells according to methods for introducing cells into genes known in the art, such as non-viral vectors, viral vectors, or physical methods including the same. Examples of physical methods for such gene delivery may include electroporation, hydrodropation, injection, etc.
  • non-viral vectors examples include cationic lipids, lipid polymers ( lipid polymers), methods using nanoparticles, and viral vectors may include, without limitation, replicable viral vectors, non-replicating viral vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retroviral vectors, Viral vectors such as herpes simplex virus, hybrid adenoviral systems, pox virus, lentivirus vector, and EpsteinBarr virus.
  • the vector after inserting a suicide gene into a retroviral vector to produce an expression vector, the vector is transduced into packaging cells, the transduced packaging cells are cultured, and filtered.
  • Suicide genes can be introduced into mesenchymal stem cells by obtaining a retrovirus solution and using them to infect mesenchymal stem cells. Subsequently, mesenchymal stem cells continuously expressing suicide genes may be obtained using a selection marker included in the retroviral vector.
  • HLA human leukocyte antigen
  • the MSC / CD of the present invention may be obtained by first introducing and selecting a suicide gene into isolated stem cells and then proliferating and differentiating them under appropriate conditions in vitro, or by sufficiently proliferating the stem cells and then introducing a suicide gene thereto. This can be obtained by differentiating mesenchymal stem cells.
  • MSC / CD is injected into a subject in need of treatment by the presence of a suicide gene, but is not limited thereto, for example, a period of 2-30 days, preferably 5-15 days, more preferably 5-10 days of infusion. It can kill itself afterwards to reduce side effects that can be induced by persistent action.
  • F cells Frozen cells, F cells
  • F cells refers to cells that have not undergone an additional culture step after freezing and thawing MSC / CD, which are mesenchymal stem cells into which cytosine dianamin (CD) is introduced, Define cells that are intended to be suspended in thawed state, or suspended and washed to be administered to a subject to be treated More specifically, F cells are introduced into MSC / by introducing cytosine deaminase (CD) into mesenchymal stem cells.
  • CD cytosine deaminase
  • a cell obtained by preparing a CD, culturing it, and storing it in a frozen medium, and thawing it at room temperature immediately before use for example, but not limited thereto, and suspending it in plasma solution A containing human serum albumin.
  • the cells are distinguished from F cells of MSC / CD by freezing and thawing in the same manner, and then cultivating to maximize concentration and activity.
  • One cell that can be harvested and used immediately is a ready-to-use cell, an “immediately harvested cell (I cell)”.
  • F cell of the present invention is characterized in that the anti-cancer effect is increased even without increasing the colony forming ability, even though the culture step performed to maximize the activation as compared to the I cell in general.
  • the F cells of the present invention may have an advantage of being able to be immediately administered to a patient in need of treatment with enhancement of an anticancer effect.
  • Storing cells in a frozen or frozen state in the present invention may include any means known in the art for allowing the cells to remain frozen, such as cryopreservation, freezing medium, and the like.
  • CS10 2-10% DMSO medium, more specifically 2, 5, 10% DMSO medium, and the like can be used.
  • F cells of the present invention show a similar in vitro colony forming ability as compared to I cells, and also effectively exhibits the viewer effect of conventional MSC / CD.
  • F cells show an inhibitory effect on various tumors, including brain tumors and subcutaneous tumors, more than two times compared to I cells or controls in vivo, and are highly elevated when combined with existing anticancer drug, temozolomide (TMZ). It is characterized by having the effect of showing an anticancer effect.
  • F cells have a significant anti-cancer effect and anticancer activity that cannot be predicted in vitro compared to other I cells due to the intrinsic activity of F cells given according to the manufacturing method, although there is no difference in colony forming ability. There is an advantage of showing the effect as a bunt.
  • the F cells of the present invention can be differentiated from conventionally used I cells by being prepared through a preparation method that does not additionally perform a culture step after freezing.
  • the present invention provides a method for producing F cells, wherein the F cells do not perform a cell culture step after freezing.
  • the F cells of the present invention are cells for cancer treatment that can be used for the treatment of cancer. Cancers that can be treated using F cells, tumors can be used in all cancers from which cancer is extracted and can be administered to subjects in need of treatment before, simultaneously, or after chemotherapy using anticancer agent administration.
  • Such cancers include, for example, squamous cell cancer (e.g., squamous cell cancer of the epithelium), small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung cancer, peritoneal cancer, colon cancer, biliary tract tumors, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, bronchial cancer , Oral cancer, osteosarcoma, gallbladder cancer, kidney cancer, leukemia, bladder cancer, melanoma, brain cancer, glioma, brain tumor, skin cancer, pancreatic cancer, breast cancer, liver cancer, bone marrow cancer, esophageal cancer, colon cancer, stomach cancer, cervical cancer, prostate cancer, ovarian cancer, It is preferably at least one selected from the group consisting of head and neck cancer and rectal cancer, more preferably brain tumor, pancreatic cancer, liver cancer, lung cancer, colon cancer, skin cancer.
  • squamous cell cancer e.g., squamous cell cancer of the epithel
  • the F cells of the present invention may be an adjuvant for anticancer.
  • An anticancer adjuvant refers to an adjuvant that can be treated in combination with a primary treatment, such as chemotherapy or surgical treatment, to induce a faster action of the primary therapy and to potentiate its anticancer action.
  • Chemoadjuvant for chemotherapy can be used in chemotherapy with chemotherapy to enhance the effectiveness of chemotherapy, the primary drug used, and to maximize the effectiveness of cancer treatment through treatment of surviving cancer cells after surgery. Can be.
  • the F cells may be in the form of a composition for use in the treatment of cancer, or for use in an adjuvant for anticancer, such compositions may comprise a pharmaceutically acceptable excipient, carrier, diluent.
  • Particularly preferred infusion forms are preferably formulated in the form of injections suitable for infusion into tissues or organs.
  • the present invention provides an anticancer adjuvant comprising F cells.
  • F cells may be infused into a patient's in vivo according to a doctor's prescription or by methods known in the art, wherein a single dose may be used to treat the disease, the severity of the disease, the route of administration, the weight of the patient, It may be determined by considering various related factors such as age and gender.
  • the present invention also provides a kit for treating cancer comprising F cells and 5-fluorocytosine (5-FC).
  • the kit for cancer treatment is prepared for the combination treatment of F cells and 5-fluorocytosine (5-FC), and administration of the prodrug 5-fluorocytosine (5-FC) to a subject in need of treatment.
  • the following means a kit prepared to inject F cells at the same time as administration and after administration.
  • the cancer treatment kit may be composed of a first compartment and a second compartment, and may include F cells for acting as a cancer treatment or an anticancer agent adjuvant in the first compartment, and 5-fluorocytosine in the second compartment. 5-FC).
  • the kits can be contained in one container or in several different small containers, each divided into a single dose for increased convenience and portability. Therefore, there may be several containers in each container depending on the arrangement.
  • the kit of the present invention may include equipment necessary for use and instructions indicating the method of administering each component, as necessary.
  • the cancer treatment kit of the present invention may further include an anticancer agent.
  • the anticancer agent may include without limitation anticancer agents known in the art, preferably nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, trastuzumab, zefitinib, bortezomib, sunitinib, carbople Latin, sorafenib, bevacizumab, cetuximab, biscumalboom, asparaginase, tretinoin, hydroxycarbamide, dasatinib, estramastine, gemtuzumab ozogamycin, ibritumab tucetan, heptaple Latin, methylaminolevulinic acid, amsacrine, alemtuzumab, procarbazine, alprostadil, holmium nitrate chitosan, gemcitabine, doxyfluidine, pe
  • the present invention provides a method for preparing MSC / CD by introducing cytosine deaminase (CD) into mesenchymal stem cells (MSC); 2) freezing the prepared MSC / CD to prepare a frozen MSC / CD; 3) thawing and suspending frozen MSC / CD to prepare F cells; 4) administering said F cells to a subject in need thereof; And 5) administering 5-fluorocytosine (5-FC) to the subject in need thereof; It provides a cancer prevention or treatment method comprising a.
  • CD cytosine deaminase
  • MSC mesenchymal stem cells
  • the subject is a mammal including a human, and includes a patient in need of cancer treatment, a patient who has been treated with cancer, a patient who has been treated with cancer, and a patient who needs to receive cancer treatment. Patients who underwent surgery to remove cancer may also be included.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, further comprising the step of 6) administering an anticancer agent to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising the step of administering an anticancer agent to a subject in need thereof before or concurrently with the administration of the F cells in step 4).
  • the present invention simultaneously administers F cells and an anticancer agent to a subject in need of anticancer treatment, or sequentially prevents or treats cancer, including all methods of administering F cells after administering F cells and administering F cells after administering anticancer agents.
  • the anticancer agent may include without limitation anticancer agents known in the art, preferably nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, trastuzumab, zefitinib, bortezomib, sunitinib, carbople Latin, sorafenib, bevacizumab, cetuximab, biscumalboom, asparaginase, tretinoin, hydroxycarbamide, dasatinib, estramastine, gemtuzumab ozogamycin, ibritumab tucetan, heptaple Latin, methylaminolevulinic acid, amsacrine, alemtuzumab, procarbazine, alprostadil, holmium nitrate chitosan, gemcitabine, doxyfluidine, pemetrexed, tegapur, capecitabine, gimerasi
  • Nitrosoureas include carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), and the like.
  • the anticancer agent may be appropriately prescribed according to the prescribed dose of the anticancer agent well known in the art, but may be prescribed in a dose less than the average prescription dose in consideration of the synergistic effect with the F cells of the present invention.
  • the F cells and 5-fluorocytosine of the present invention may be administered simultaneously or sequentially with each other, and the F cells are suitable for converting 5-fluorocytosine into 5-fluorouracil. It can be selected according to time and period.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, wherein the F cells of step 4) and 5-fluorocytosine of step 5) are administered simultaneously or sequentially.
  • anticancer agents used in combination with the 5-fluorocytosine of the present invention may be administered at the same time or sequentially with each other, and may be selected according to an appropriate time and cycle.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, characterized in that the 5-fluorocytosine of step 5) and the anticancer agent of step 6) are administered simultaneously or sequentially.
  • sequential administration means that a plurality of components to be administered are administered to a subject at a time difference, and the order of each of the active ingredients can be appropriately adjusted.
  • the F cells may be delivered in a pharmaceutically effective amount to a tumor site of the subject, but the delivery is not limited thereto, but preferably by injection.
  • the injection is more preferably for administration to a mammalian subject, preferably a human patient.
  • the F cells are cells that are immediately used by freezing, thawing, or thawing and washing MSC / CD, and have a cell killing effect. Therefore, the F cells may be killed by a suicide effect in a target body for 5 hours or 15 days after injection, preferably in one example. It may be administered repeatedly to repeat the continuous treatment.
  • the 5-FC, anticancer agent may be repeatedly administered depending on the purpose of treatment, the condition of the patient.
  • the cycle of the repeated administration of such F cells, 5-FC, anticancer agent can be appropriately adjusted according to the treatment state of the patient, preferably can be repeated administration every 10 to 30 days. For example, in consideration of cell death of MSC / CD, it is preferable to repeat administration at least 10 days later, and in consideration of injecting the cells into a syringe, it is also preferable to repeat administration every 30 days.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, characterized in that the administration of the F cells in step 4) is repeated every 10 days to 30 days.
  • 5-fluorocytosine may also be administered periodically, and optionally, anticancer agents for concomitant administration may also be administered periodically.
  • Cancer according to the cancer prevention or treatment method of the present invention is a cancer that can be treated using F cells, tumors can be used without limitation for any carcinoma that is cancer-extracted before, at the same time, after treatment with chemotherapy using chemotherapy It may be administered to a subject in need.
  • Such cancers include, for example, squamous cell cancer (e.g., squamous cell cancer of the epithelium), small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung cancer, peritoneal cancer, colon cancer, biliary tract tumors, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, bronchial cancer , Oral cancer, osteosarcoma, gallbladder cancer, kidney cancer, leukemia, bladder cancer, melanoma, brain cancer, glioma, brain tumor, skin cancer, pancreatic cancer, breast cancer, liver cancer, bone marrow cancer, esophageal cancer, colon cancer, stomach cancer, cervical cancer, prostate cancer, ovarian cancer, It is preferably at least one selected from the group consisting of head and neck cancer and rectal cancer, more preferably brain tumor, pancreatic cancer, liver cancer, lung cancer, colon cancer, skin cancer.
  • squamous cell cancer e.g., squamous cell cancer of the epithel
  • HISTOPAQUE 1077 (Sigma-Aldrich) in a sterile 15 mL test tube, and then centrifuged at 400xg at room temperature. Centrifuged for 30 minutes. After centrifugation, a pasteur pipette of 0.5 ml of the intermediate buffer coat was carefully collected and transferred to a test tube containing 10 ml of sterile phosphate buffer (pH 7.4). After centrifugation again at 250xg for 10 minutes, the supernatant was discarded, suspended gently by adding 10 ml of phosphate buffer solution, and then centrifuged at 250xg for 10 minutes.
  • the final precipitate was added to DMEM medium (Gibco) with 10% FBS (Hyclone) and dispensed into 1 x 10 9 cells in a 100 mm animal cell culture vessel.
  • the culture vessel was placed in the incubator and incubated for 4 hours while supplying 5% carbon dioxide and 95% air at 37 ° C. Subsequently, the supernatant was removed to remove cells which did not adhere to the bottom of the culture vessel, and fresh culture was added to the culture vessel.
  • the isolated mesenchymal stem cells were maintained at 37 ° C. in a CO 2 incubator and maintained in mesenchymal stem cell medium [10% FBS (Gibco) +10 ng / ml bFGF (Sigma-Aldrich) + 1% penicillin / streptomycin (Gibco). 4) + 89% DMEM (Gibco Co.)]. Incubate the cells while replacing the medium every two days. When the cells are about 80% full, the cells are separated using 0.25% trypsin / 0.1mM EDTA (Gibco Co., Ltd.), then about 800-1,1000. Diluted cells / cm 2 or 1:10 to 1:20 in medium, and then subcultured in a new culture vessel. Some of the cells were stored frozen using a freeze medium added with 2-10% DMSO (Sigma-Aldrich, 2, 5, 10%).
  • CD cytosine deaminase
  • DNA was isolated from E. coli K-12 MG1655 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology), followed by primer CD-F (5'-GAA TTC AGG CTA GCA ATG TCT CGA ATA ACG CTT TAC AAA C-3 '). 5 min at 94 ° C. using CD-R (5′-GGATTC TCT AGC TGG CAG ACA GCC GC-3 ′); 30 cycles at 94 ° C., 40 seconds at 60 ° C., 1 minute at 72 ° C., 27 cycles; PCR was performed at 72 ° C. for 7 minutes.
  • PCR products were cloned using pGEM-T Easy Vector Cloning Kit (Promega), followed by X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside, Sigma-Aldrich) and IPTG. (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside, Sigma-Aldrich Co., Ltd.) to prepare a pGEM-CD vector containing the CD gene through the selection of blue-white colony (blue-white colony). The obtained CD gene was confirmed to have a nucleotide sequence identical to that of GeneBank gi: 298594 through sequencing.
  • the prepared pGEM-CD plasmid and pcDNA3.1 (Clontech) were cut with EcoR I and Not I restriction enzymes respectively, and the CD gene isolated from plasmid pGEM-CD and the cleaved plasmid pcDNA3.1 were linked with T4 DNA ligase.
  • E. coli DH5 ⁇ which is competent cells, was transformed, and cultured and selected in an LB plate containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin to obtain plasmid pcDNA3.1-CD.
  • This plasmid was cut with BamH I restriction enzyme and introduced into a retroviral vector capable of producing retroviruses.
  • the resulting plasmids were separated by CsCl-ultrafast centrifugation and then transduced into FLYRD18 cells, a retroviral packaging cell line, by calcium phosphate precipitation (Jordan, Nucleic Acid Research, 24, 596-601 (1996)), followed by an incubator. Incubated at 37 ° C. with 5% carbon dioxide and 95% air. After 48 hours, only the culture medium was obtained, and the resultant was filtered with a 0.45 ⁇ m filtration membrane to obtain a retrovirus solution. Retroviral solutions were used while aliquoting and storing at -70 ° C.
  • CD gene was introduced into the mesenchymal stem cells isolated and cultured in 1.1 using the CD-containing retrovirus prepared in 1.2. More specifically, after incubating the mesenchymal stem cells by about 70% in a 100 mm culture vessel, 3 ml of retrovirus solution and 3 ml of fresh mesenchymal stem cell medium and 4 ⁇ g / ml of polybrene (polybrene, Sigma-Aldrich) It was incubated for 8 hours by adding. The virus solution was then removed, cultured with 10 ml of mesenchymal stem cell medium for 16 hours, and then infected again with retrovirus.
  • polybrene polybrene
  • MSC / CD Mesenchymal stem cell lines
  • Cytosine deminase is a suicide gene
  • MSC / CD a mesenchymal stem cell expressing it
  • 5-FC 5-fluorocytosine
  • Switch to (5-fluorouracil; 5-FU) and have a suicide effect that kills itself and an onlooker effect that kills surrounding cells. Therefore, the cell killing effect and the viewer effect of the MSC / CD prepared in 1.3 were confirmed.
  • prodrug 5-FC was treated at a concentration of 0-1,000 ⁇ M and replaced with fresh medium containing the drug once every two days.
  • MTT solution was removed.
  • U87MG KCLBNo. 30014 glioma cells expressing 10,000 GFP and 10,000 MSC / CD or mesenchymal stem cells (MSC) were cultured in 12-well plates. From the next day, the prodrug 5-FC was treated at a concentration of 0 to 1,000 ⁇ M and the cells were obtained 6 days after changing to a fresh medium containing the drug once every two days.
  • KCLBNo. 30014 glioma cells expressing 10,000 GFP and 10,000 MSC / CD or mesenchymal stem cells (MSC) were cultured in 12-well plates. From the next day, the prodrug 5-FC was treated at a concentration of 0 to 1,000 ⁇ M and the cells were obtained 6 days after changing to a fresh medium containing the drug once every two days.
  • U87MG cultured with MSC / CD decreased the number of fluorescence-expressing cells and markedly decreased the intensity of fluorescence as the concentration of 5-FC increased.
  • U87MG cultured with mesenchymal stem cells showed no significant difference in the number of fluorescence-expressing cells and their fluorescence intensity according to 5-FC concentration.
  • the IC 50 that induces 50% cell death was 50.48 ⁇ M.
  • F cell cells immediately thawed after freezing
  • Imediately harvested cells were prepared.
  • F cells freeze-stored MSC / CD at -130 degrees Celsius in passage 6 were dissolved at 37 ° C. and suspended in plasma solution A (CJ) containing 9 ml of human serum albumin for 5 minutes at 500 ⁇ g. Or centrifuged or suspended in a solution containing the final 7.5% dextran-40 (Korea Pharmaceutical Industry) and 5% human serum albumin (green cross) in physiological saline and centrifuged for 10 minutes at 800xg. Thereafter, the supernatant was removed and the precipitated cells were suspended and used in the culture medium. That is, F cells are cells in which the culture step is not performed after freeze thawing. I and F cells were washed twice before each transplant.
  • the IC 50 value which is a concentration causing 50% of apoptosis, was 60.4 ⁇ M for I cells, and F cells (DMSO) prepared with 10% DMSO freeze medium were 56.2 ⁇ M, F cells prepared with Cryostor CS10 ( CS10) showed 55.4 ⁇ M.
  • I and F cells were found to have no difference in colony forming ability. These results confirm that the increased F-cell viewer effect compared to I cells is not due to an increase in cell number such as an increase in colony formation, and that the F cells themselves have a better viewer effect than I cells. .
  • I cells prepared in Preparation Example 2 were transplanted in the same manner, and from the day after cell transplantation, 5-FC (15 mg / ml saline) was intraperitoneally injected at a dose of 500 mg / kg for 1 week.
  • mice On the 28th day after glioma cell transplantation, the animals were anesthetized, and an injection needle was inserted into the left ventricle, followed by perfusion washing with physiological saline and then perfused with 10% formalin solution.
  • the brains were extracted and fixed in a mouse brain matrix (Stoleting, Inc.), and then cut at 1 mm intervals and placed in the same fixative solution for 30 minutes.
  • Brain sections were washed three times with phosphate buffer solution and then 20 mg / ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside, Koma Biotech), 5 mM potassium ferrocyanide / After soaking in phosphate buffer solution containing ferricyanide (Sigma-Aldrich), 2 mM MgCl 2 , 0.02% NP40 and reacted for 16 hours at 37 °C. An image of a brain tumor was obtained through an anatomical microscope. The tumor size was calculated using an image j (NIH) program and the following formula, and the results are shown in FIG. 6.
  • NIR image j
  • the volume of brain tumors was significantly reduced in the treatment group implanted with F cells, showing a better effect than I cells (B).
  • the average tumor size was 91.3mm 3 in the vehicle control group and 1.5mm 3 in the I cell transplantation comparison group, but 0.6mm 3 in the F group transplanted animal group.
  • F cells are more than twice as effective in reducing tumors as I cells among MSCs / CDs, and F cells may be more effective anticancer drugs.
  • phosphate buffer solution containing 1 ⁇ 10 5 Huh7 liver cancer cells (Lver cancer, Huh7, KCLB No. 60104), 20% Matrigel (BD), and 7 week old immunodeficient nude mice (Balb / c). implanted subcutaneously). After 14 days of implantation, when the tumor size was 10-100 mm 3 , I cells and F cells prepared in Preparation Example 2 were injected. More specifically, I and F cells prepared in Preparation Example 2 were suspended in phosphate buffer solution, and centrifuged at 500xg for 5 minutes.
  • the phosphate buffer solution was prepared to be 1 ⁇ 10 6/100 ⁇ l, and then I or F cells were directly injected into the tumor using a syringe. Seven days after the injection of I and F cells, 5-FC (15 mg / ml physiological saline) was intraperitoneally injected at a dose of 500 mg / kg for 1 week. The tumor size was measured once or twice using a caliper every week, and the volume of the tumor was calculated using the following formula, and the results are shown in FIG. 7.
  • Subcutaneous tumor volume (mm 3 ) width (mm) x length (mm) x height (mm) ⁇ 6
  • the tumor volume was reduced more effectively in the experimental group treated with F cells, and it was confirmed that F cells exhibited better anticancer effects than I cells.
  • the subcutaneous tumor model made of hepatocellular carcinoma cells as shown in B it was confirmed by the naked eye that the treatment effect of the F cells was very excellent (*, p ⁇ 0.05 compared with the PBS group).
  • BxPC3 pancreatic cancer cells (pancreatic cancer, BxPC3, ATCC No. CRL-1687 TM ) is fast growing and severely ulcerated, so 1x10 6 BxPC3 pancreatic cancer cells, I cells and F cells were injected at the same time. More specifically, I and F cells prepared in Preparation Example 2 were suspended in phosphate buffer solution, and centrifuged at 500xg for 5 minutes. Repeat this procedure twice, prepare 1x10 6 / 100 ⁇ l in phosphate buffer solution, and then suspend 1X10 6 I cells or F cells in 100 ⁇ l of phosphate buffer solution containing 20% Matrigel (BD). Simultaneously transplanted subcutaneously in 7 week old immunodeficiency nude mice (Balb / c nude). Seven days after the cell injection, 5-FC (15 mg / ml saline) was intraperitoneally injected at 500 mg / kg for a week.
  • 5-FC 15 mg / ml saline
  • Tumor volume measurement was performed in the same manner as in Example 2.2, and the measured tumor volume change is shown in A of FIG. 8.
  • the tumor volume was reduced more effectively in the experimental group treated with F cells, and it was confirmed that the F cells showed better anti-cancer effects than the I cells, and the therapeutic effect was superior in the pancreatic cancer subcutaneous tumor model. Confirmed. (*, p ⁇ 0.05 compared with PBS group)
  • A549 lung cancer cells (Lung cancer, A549, ATCC No.CCL-185 TM ) of 5 ⁇ 10 6 were suspended in 100 ⁇ l of a phosphate buffer solution containing 20% Matrigel (BD company). Transplanted subcutaneously in Balb / c nude). When 8 days after transplantation to the tumor size of 20 ⁇ 50mm 3 , I cells and F cells prepared in Preparation Example 2 were injected. More specifically, I and F cells prepared in Preparation Example 2 were suspended in phosphate buffer solution, and centrifuged at 500xg for 5 minutes.
  • phosphate buffer solution was prepared to be 1x10 6 / 100 ⁇ l and injected directly into the tumor using a syringe.
  • 5-FC 15 mg / ml physiological saline
  • Tumor volume measurement was performed in the same manner as in Example 2.2, and the measured tumor volume change is shown in B of FIG. 8.
  • the tumor volume was reduced more effectively in the experimental group treated with F cells, and it was confirmed that the F cells showed better anticancer effects than the I cells, and the therapeutic effect was excellent in the lung cancer subcutaneous tumor model.
  • * P ⁇ 0.05 compared with PBS group.
  • HT29 colon cancer cells colon cancer, HT29, ATCC No.HTB -38 TM
  • mat rijel Mat rijel
  • a phosphate buffer solution containing 100 ⁇ l
  • age 7 weeks old immune-deficient nude mice Balb / c nude
  • I cells and F cells prepared in Preparation Example 2 were injected. More specifically, I and F cells prepared in Preparation Example 2 were suspended in phosphate buffer solution, and centrifuged at 500xg for 5 minutes.
  • phosphate buffer solution was prepared to be 1x10 6 / 100 ⁇ l and injected directly into the tumor using a syringe.
  • 5-FC 15 mg / ml physiological saline
  • 5-FC was intraperitoneally injected at a dose of 500 mg / kg for 1 week.
  • Tumor volume measurement was performed in the same manner as in Example 2.2, and the measured tumor volume change is shown in FIG. 8C.
  • the tumor volume was reduced more effectively in the experimental group treated with F cells, and it was confirmed that the F cells exhibited better anticancer effects than the I cells, and the therapeutic effect was excellent in the colorectal cancer subcutaneous tumor model.
  • * P ⁇ 0.05 compared with PBS group; #, p ⁇ 0.05 compared with cell group).
  • F cells not only show effective anticancer effects in various cancers such as brain tumors, liver cancers, lung cancers, and colon cancers, but in particular, can exhibit superior anticancer effects than I cells in all cancers.
  • U87MG KCLBNo. 30014 glioma cells expressing 10,000 GFP and 10,000 F cells or mesenchymal stem cells (MSC) were cultured in 12-well plates. From the next day, cells were obtained 6 days after treatment with temozolomide (TMZ) 0-1000 ⁇ M and prodrug 5-FC at a concentration of 0-1,000 ⁇ M, and then changed to fresh medium containing the drug every other day.
  • TMZ temozolomide
  • prodrug 5-FC at a concentration of 0-1,000 ⁇ M
  • the solid line connecting the IC5 0 values from the isobologram alone is the theoretical additive line, which means that if the values obtained by treating two anticancer agents at the same time are in the solid line, there is simply an additive effect. On the other hand, if the value is below the solid line, the synergistic effect is on the contrary. If the value is above the solid line, the antagonistic effect is present. The results are shown in E of FIG. 9.
  • U87MG KCLBNo. 30014 glioma cells expressing GFP 10,000 U87 / GFP and 10,000 F cells (MSC / CD) were cultured in 12-well plates. From the next day, carmustin (Carmustin, BCNU, Sigma) 0-300 ⁇ M and prodrug 5-FC were treated at a concentration of 0-300 ⁇ M and incubated for 6 days while changing to a new medium containing the drug once every two days. After removing the culture on the 7th day, 200 ⁇ l of 1X Passive Lysis Buffer (Promega) was added to each well and placed at 4 ° C. for 10 minutes.
  • 1X Passive Lysis Buffer Promega
  • the cell lysate was collected and centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes to obtain a supernatant. 100 ⁇ l of this was transferred to a light-blocked black 96-well plate, and the intensity of fluorescence was measured under excitation 488 nm and emission 530 nm using a fluorimeter (GEMINI EM, Molecular Device). A schematic diagram of this experiment is shown in A of FIG. 10.
  • the IC 50 value of the irinotecan alone in the isobologram was 3.2 ⁇ M and 73.6 ⁇ M for 5-FC, connecting the theoretical additive line to indicate a simple addition effect.
  • the IC 50 value obtained when [F cell (MSC / CD) + 5-FC] and irinotecan were combined in U87 / GFP was below the solid line compared to the IC 50 value obtained when treated alone. It was confirmed that there is a synergistic effect even better than the combined effect of treatment with anticancer drugs.
  • Temozolomide, carmustine, and irinotecan are all known as anticancer agents that act on proliferating cells, so if they affect the survival of not only U87 / GFP cells but also proliferating F cells, [F cells (MSC / CD) +5 -FC's anticancer effect may be reduced. Contrary to expectations, however, when [F cell (MSC / CD) + 5FC] is used in combination treatment with temozolomide in FIG. 9E, synergistic effects may be increased rather than administration of only anticancer agent alone or in combination. Confirmed that it can. In other words, such synergistic effects are unexpected effects that cannot be expected in conventional combination therapy.
  • Synergy synergism identified in 3.1 to 3.3 was further confirmed and verified in vivo.
  • fluorocytosine 15 mg / ml saline
  • brain tissues were obtained from 8 animals in each animal group, and X-gal staining was performed in the same manner as in Example 2 to determine the size of brain tumors.
  • Such an experimental procedure is illustrated in A of FIG. 11, and the measured change in brain tumor size is shown in B and C of FIG. 11.
  • the vehicle whereas the average tumor size in the control group is the 59.8mm 3, animals received a transplant F cell is 11.8mm 3, temozolomide administered alone fauna 9.9mm 3
  • the average size of tumors was the highest in the group of animals treated with F-cell + temozolomide, which received 2.7 mm 3, and the group with F-cell and temozolomide showed the best anticancer effect.
  • the median survival in the control group was 32 days, but the F cell treated group was extended to 42 days and the temozolomide treated group to 42 days.
  • the median survival was extended to 70 days in the F-cell and temozolomide combination treatment group, and a very remarkable survival improvement effect was confirmed in comparison with the control group as well as the control group alone.
  • a non-brain cancer model was prepared by transplanting U87MG glioma cells into subcutaneous tissue. 1 ⁇ 10 6 U87MG glioma cells were suspended in 100 ⁇ l of a phosphate buffer solution containing 20% Matrigel (BD), and implanted subcutaneously in 7 week old immunodeficient nude mice. Tumor size was measured twice a week using a digital caliper and the tumor volume was calculated using the following formula.
  • Subcutaneous tumor volume (mm 3 ) width (mm) * length (mm) * height (mm) ⁇ 6
  • I cells and F cells prepared in Preparation Example 2 were suspended in plasma solution A solution, and then centrifuged at 500xg for 5 minutes. Separated. After repeating this process twice, plasma solution A was prepared to be 1 ⁇ 10 6/100 ⁇ l and injected directly into the tumor using a syringe. 5-FC (15 mg / ml physiological saline) was intraperitoneally injected at a dose of 500 mg / kg for 5 days from the day after the injection of I cells and F cells.
  • temozolomide (Sigma-Aldrich) was intraperitoneally injected at a dose of 5 mg / kg. This experimental process is briefly illustrated in A of FIG. The measured tumor volume change is shown in B of FIG. 12, and the Kaplan Meier survival graph derived from measuring the lifespan of nude mice in this subcutaneous tumor model is shown in C of FIG. 12.
  • tumor cells showed very significant tumor volume inhibition effect in the F cell treated group compared to the control group and the I cell treated group.
  • the median survival of the control group was 23 days
  • the I cell treatment group was 30 days
  • the F cell treatment group was 58 days
  • the life extension effect was also treated in the animal group transplanted with F cells. The best in the group.
  • F cell has excellent therapeutic effect in subcutaneous tumor model, and especially, it can be seen that synergistic treatment effect can be achieved through the combination treatment with temozolomide, which is a combination of F cell combination treatment that is difficult to predict by in vitro experiments alone. Results show superiority in other organ cancers.

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Abstract

본 발명은 암을 치료하기 위한 세포의 제조방법 및 이러한 제조방법으로 제조된 세포를 포함하는 암 치료용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법은 배양 후 즉시 수확하여 사용하는 시토신 디아미네이즈를 발현하는 중간엽 줄기세포와 비교하여 증식 능력에서는 차이가 없음에도 불구하고 5-FC 와 함께 처리되었을 때, 매우 우수한 종양 억제 효과를 나타낼 뿐만 아니라 다른 항암제와의 병용 치료에서도 기존의 항암제 병용 치료의 효과를 뛰어넘는 현저한 상승효과를 유도하는 F 세포를 제공할 수 있으므로, 이와 같은 F 세포를 포함하는 암 치료용 키트 등으로 활용이 가능하여 기존 항암 치료의 효과를 극대화 시키는데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

암 치료용 세포 치료제 및 이의 병용 요법
본 발명은 암을 치료하기 위한 세포의 제조방법 및 이러한 제조방법으로 제조된 세포를 포함하는 항암용 어쥬번트, 암 치료용 키트 및 암 치료방법에 관한 것이다.
세계적으로 수백만 명이 골, 방광, 혈액(백혈병), 뇌, 유방, 결장, 경부, 식도, 장, 신장, 폐, 간, 구강, 비강, 신경, 난소, 췌장, 피부, 위, 전립선, 목, 자궁, 질을 포함하는 다양한 암으로 사망한다. 수년간, 암을 치료하기 위해 방사능 및 화학요법을 포함한 여러 방법을 사용하였으나, 여전히 암 환자의 수는 증가하고 있으며, 방사능 및 화학요법을 이용한 경우에 병을 유발하고 일부 환자들이 죽기까지 하는 부작용도 널리 보고되고 있다. 또한 특정 암의 경우에는 악성 세포는 치료가 힘들 정도로 남아 있는 문제점이 있다. 결과적으로, 암 세포의 생리학 또는 표현형을 광범위하게 연구하여 환자의 건강한 세포에는 부작용을 주지 않으면서 암 세포를 선택적으로 죽이는 치료방법을 강구해야 한다.
특히 뇌종양의 경우, 뇌에 큰 손상을 일으키며 생존율이 매우 낮은 암이다. 뇌종양에 대한 기존의 치료법으로는 외과적인 수술에 의한 적출이 가장 효과적이지만 뇌종양의 종류나 발생 부위에 따라 수술이 불가능한 경우가 많으며, 완전 적출 시 수술 후 합병증의 위험성이 매우 크다. 또한, 뇌에는 약물의 침투를 억제하는 뇌혈류장벽(brain-blood barrier; BBB)이 존재하므로, 항암제를 이용한 화학요법으로 뇌종양을 치료하기 위해서는 다른 암에 비하여 고농도의 항암제 투여가 필요하게되어 신체의 다른 장기에 심각한 부작용을 유발하게 되는 심각한 문제점이 있다. 따라서 항암제의 효과를 증강시킴으로써 항암제 투여 용량을 낮춰줄 수 있는 새로운 보조적인 방법 및 치료제, 보조제에 관한 필요성이 있다.
또한, 유전자 치료법은 암세포의 증식을 억제하는 유전자를 암세포에 직접 도입하는 방법으로서, 유전자의 도입을 위해서 주로 바이러스를 이용하는데, 바이러스 자체는 암으로 이동하는 능력이 없으므로 수술적으로 주입해야 한다. 그러나 모든 미세한 종양 또는 암에까지 일일이 바이러스를 주입하는 것이 현실적으로 불가능하여 암 세포를 표적화하는데 한계점이 있다.
이와 관련하여, 중간엽 줄기세포에 자살 유전자를 도입하여 표적성을 높이고 암을 치료하기 위한 방법으로 국내등록특허 KR 10-1022401호가 공지되어 있다. 그러나 KR 10-1022401호에서는 중간엽 줄기세포를 특별한 환경에서 조작하고 이를 다른 항암제와 병용 투여하여 항암제의 효과를 개선시키는 병용 치료 보조제에 관한 내용, 주기적으로 투여하는 방법에 관해서는 개시되어 있지 않다.
또한 최근 2종 이상의 항암제의 병용 요법과 같은 병용 치료에 관한 연구가 다수 이루어지고 있다. 이와 관련하여 화학항암제를 함께 투여하는 병용 치료법 뿐만 아니라 최근 화학항암제와 다른 종류의 항암 요법을 병행하여 수행하는 병용 치료법 등이 보고된다. 그러나 병용 치료의 경우 각각의 약제를 단순 투여하는 경우와 단순합과 동일한 정도의 약효를 나타내는 경우도 많으며, 약제의 상호작용에 의하여 오히려 그 효과가 저하되는 등의 예측하지 못한 효과를 나타내는 보고되고 있어 아직까지 약물의 병용 투여 제제에 대한 연구가 지속되고 있다.
암에서의 병용 투여와 관련하여 화학 항암제와 세포 치료제, 예컨대 중간엽 줄기세포를 병용 투여하는 병용요법에 관한 연구 역시 이루어지고 있으나, 중간엽 줄기세포를 이용한 병용 투여는 화학 항암제에 의한 항암 치료 후 손상된 세포 회복을 위해 자가 줄기세포와 같은 세포를 투여하는 것을 목적으로 하는 연구가 중점적으로 이루어지고 있을 뿐, 줄기세포 자체를 병합 요법의 치료제로 활용하고자 하는 시도는 많이 보고되지 않았다.
따라서 암, 종양 치료제를 암 조직에 정확하게 전달할 수 있도록 표적성(targeting)이 높고, 종양 외의 부위에는 영향을 주지 않도록 무독성이며, 면역독성이 없어 암이 근절될 때까지 반복투여가 가능한 치료제 및 치료방법의 개발이 요구되고 있으며, 기존 항암제의 효과를 개선 또는 증진할 수 있는 새로운 치료방법, 치료제, 치료 보조제 및 병합 치료방법에 대한 요구 및 필요성이 있다.
본 발명자들은 기존의 화학적 항암 치료법의 한계점을 극복할 수 있는 새로운 암 치료제에 관하여 연구하던 중, 중간엽 줄기세포에 시토신 디아미네이즈 유전자를 도입하여 제조된 MSC/CD 세포를 동결 및 해동하여 제조된 세포가 단순 MSC/CD 세포와 비교하여 매우 우수한 종양 억제 효과 및 생존률 개선 효과를 나타내고, 기존 항암제와의 병용 치료 효과를 극대화시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 암 치료를 위한 어쥬번트로 사용될 수 있는 세포인 “F 세포”를 제조하는 F 세포의 제조방법, 및 F 세포를 포함하는 암 치료용 키트를 제공하는 것이며, 또한 F 세포와 화학 항암제와의 병용 투여제, 병용 투여 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 제공하기 위하여, 본 발명은 1) 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)에 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase; CD)를 도입하여 MSC/CD를 제조하는 단계; 2) 제조된 MSC/CD를 동결하여 동결된 MSC/CD를 제조하는 단계; 및 3) 동결된 MSC/CD를 해동하고 현탁하여 F 세포를 제조하는 단계;를 포함하는 F 세포의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 F 세포를 포함하는 항암용 어쥬번트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 F 세포 및 5-플루오로시토신(5-FC)을 포함하는 암 치료용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 1) 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)에 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase; CD)를 도입하여 MSC/CD를 제조하는 단계; 2) 제조된 MSC/CD를 동결하여 동결된 MSC/CD를 제조하는 단계; 3) 동결된 MSC/CD를 해동하고 현탁하여 F 세포를 제조하는 단계; 4) 상기 F 세포를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 및 5) 5-플루오로시토신(5-FC)을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은 배양 후 즉시 수확하여 사용하는 시토신 디아미네이즈를 발현하는 중간엽 줄기세포와 비교하여 증식 능력에서는 차이가 없음에도 불구하고 5-FC 와 함께 처리되었을 때, 매우 우수한 종양 억제 효과를 나타낼 뿐만 아니라 다른 항암제와의 병용 치료에서도 기존의 항암제 병용 치료의 효과를 뛰어넘는 현저한 상승효과를 유도하는 F 세포를 제공할 수 있으므로, 이와 같은 F 세포를 포함하는 암 치료용 키트 등으로 활용이 가능하여 기존 항암 치료의 효과를 극대화 시키는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 시토신 디아미네이즈를 지속적으로 발현하는 중간엽 줄기세포주(MSC/CD) 및 이의 자살 효과 및 구경꾼 효과의 모식도이다.
도 2는 MSC 또는 MSC/CD와 5-FC 처리 과정(A) 및 이에 따른 세포 자살 효과를 확인한 결과(B)를 나타낸 도이다.
도 3 은 MSC 또는 MSC/CD와 5-FC 의 처리 과정(A) 및 이에 따른 구경꾼 효과(B, C)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 I 세포 및 F 세포 (DMSO), F 세포(CS10) 의 구경꾼 효과를 비교하기 위한 세포 제조 및 처리과정(A) 및 각 세포의 구경꾼 효과(B)를 나타낸 도이다.
도 5는 I 세포와 F 세포의 콜로니 형성 능력을 현미경 관찰(A) 및 CFU-A를 이용한 정량적 분석(B)으로 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 뇌종양 모델에 I 세포 또는 F 세포와 5-FC를 처리하는 과정(A), 이에 따른 뇌종양 변화를 나타내는 해부현미경 결과(B) 및 종양 부피 변화(C)를 나타낸 도이다.
도 7은 간암 세포를 피하 이식한 피하 종양 모델에서, I세포 또는 F 세포 처리에 따른 종양 부피의 변화를 나타낸 그래프(A) 및 종양의 외형적 크기를 보여주는 대표적 종양 모델(B)을 나타낸 도이다.
도 8의 (A)는 췌장암 세포를 피하 이식한 피하 종양 모델에서, 도 8의 (B)는 폐암 세포를 피하 이식한 피하 종양 모델에서, 도 8의 (C)는 대장암을 피하 이식한 피하 종양 모델에서 I세포 또는 F 세포 처리에 따른 종양 부피의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 F 세포+5FC+TMZ 병용 치료 방법 (A), 이에 따른 세포 사멸효과(B, C) GFP를 발현하는 U87MG의 형광이미지 사진을 통한 세포 사멸 확인 결과(D) 및 IC50값의 아이소볼로그램(isobologram) 결과(E)를 나타낸 도이다.
도 10은 F 세포+5FC+항암제 병용 치료 방법 (A) 및 항암제 병용요법의 IC50값 아이소볼로그램(isobologram) 결과를 각각 카무스틴(B), 이리노테칸(C)에 대하여 나타낸 도이다.
도 11은 F 세포+5-FC+테모졸로마이드(TMZ)의 병용 치료 과정(A), 이에 따른 뇌종양 변화를 나타내는 해부현미경 결과(B), 종양 부피 변화(C) 및 생존률 개선에 있어서의 상승적 효과(D)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 피하 종양 치료모델에서 I 세포 또는 F 세포와 5-FC 및 테모졸로마이드(TMZ)의 병용 치료 효과 분석 과정(A) 및 F 세포, 5-FC 및 테모졸로마이드(TMZ) 병용 치료에 따른 종양 부피의 변화(B) 및 생존률 분석에서의 상승적 효과(C)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 1) 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)에 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase; CD)를 도입하여 MSC/CD를 제조하는 단계; 2) 제조된 MSC/CD를 동결하여 동결된 MSC/CD를 제조하는 단계; 및 3) 동결된 MSC/CD를 해동하고 현탁하여 F 세포를 제조하는 단계;를 포함하는 F 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 F 세포의 제조방법은 배양 즉시 수확하여 사용하는 시토신 디아미네이즈를 발현하는 중간엽 줄기세포(I 세포) 와 비교하여 증식 능력에서는 차이가 없음에도 불구하고 5-FC 와 함께 처리되었을 때, 매우 우수한 종양 억제 효과를 나타낼 뿐만 아니라 다른 항암제와의 병용 치료에서도 기존의 항암제 병용 투여의 효과를 뛰어넘는 현저한 상승효과를 유도하는 F 세포를 제공할 수 있다.
본원 명세서에서 “MSC/CD" 란 중간엽 줄기세포에서 시토신 디아미네이즈(CD)가 발현되도록 제조된 중간엽 줄기세포를 말하며, 이러한 시토신 디아미네이즈가 도입된 중간엽 줄기세포는 암세포에 주향성을 갖고 암세포 주변으로 이동하며, 시토신 디아미네이즈를 지속적으로 발현하여 스스로의 세포 사멸을 유도할 뿐만 아니라, 항암제 전구약물을 활성 항암제로 전환시킴으로써 주변 암세포를 사멸시키는 구경꾼 효과(Bystander effect)를 나타내는 세포를 말한다. MSC/CD는 세포 사멸이 스스로 유도되므로 원하지 않는 지속적인 효과에 의하여 나타날 수 있는 부작용을 줄일 수 있고, 암세포 주변으로 이동하여 주변 암세포를 사멸시킴으로써 효과적인 항암제로서 작용할 수 있는 장점이 있다. 특히 MSC/CD를 동결/해동시켜 제조되는 세포인 "F 세포”는 기존 항암제와 병행 치료하여 사용되는 경우, 항암 효과를 현저하게 상승시키는 상승효과(synergistic effect)를 나타내어 항암제의 효과를 증진시키는 어쥬번트로 활용될 수 있다.
본 발명의 “중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)”는 골수와 제대혈 등에서 채최할 수 있는 줄기세포의 일종으로, 증식이 가능하며, 특히 혈액줄기세포와 달리 골세포, 연골세포, 근육 세포, 지방 세포와 같은 다양한 유형의 세포로 분화될 수 있는 multipotent stromal cells을 말한다. 따라서 본 발명의 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 multipotent mesenchymal stem cell 일 수 있다.
본 발명의 “시토신 디아미네이즈”는 자살유전자로 인체에 무해한 전구 약물을 세포 독성을 지닌 항암 물질로 전환시키는 기능을 하는 유전자로서, 특히 항암제 5-FU(5-fluorouracil)의 전구약물인 5-FC(5-fluorocytosine)를 5-FU로 전환시키는 것을 말한다.
이와 같은 자살유전자는 이를 포함하는 비바이러스 벡터, 바이러스 벡터를 이용하는 방법, 또는 물리적 방법과 같은 당 분야에 공지된 유전자의 세포 내 도입기술 방법에 따라 중간엽 줄기세포에 도입될 수 있다. 이와 같은 유전자 전달을 위한 물리적 방법의 예는 전기천공, 하이드로포레이션(Hydroporation), 주사법 등을 포함할 수 있고, 비바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입의 예는 양이온성 지질(Cationic lipids), 지질 폴리머(lipid polymers), 나노입자를 이용한 방법을 포함할 수 있으며, 바이러스성 벡터는 복제 가능 바이러스성 벡터, 복제 불가 바이러스 벡터를 제한 없이 포함할 수 있고, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 단순헤르페스 바이러스(herpes simplex virus), 하이브리드 아데노 바이러스 시스템(hybrid adenoviral systems), 폭스 바이러스(pox virus), 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector), EpsteinBarr virus 와 같은 바이러스성 벡터를 포함할 수 있다.
예를 들어 본 발명의 일 구현예에서는 자살유전자를 레트로바이러스 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후, 이 벡터를 포장(packaging)세포에 형질도입하고, 형질도입된 포장세포를 배양한 후 여과하여 레트로바이러스 용액을 얻고, 이를 이용하여 중간엽 줄기세포를 감염시킴으로써 중간엽 줄기세포에 자살유전자를 도입할 수 있다. 이어서, 상기 레트로바이러스 벡터에 포함된 선별마커를 이용하여 자살유전자를 지속적으로 발현하는 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있다.
또한 중간엽 줄기세포는 동종 이식시에도 면역거부 반응이 적은 세포로 알려져 있으므로 타인에서 분리한 세포를 사용하거나, 또는 암을 가진 환자 자신으로부터 채취하여 사용할 수도 있으며, 혈액 은행의 데이터베이스를 이용하여 HLA(HLA(human leukocyte antigen) 타입이 유사한 골수로부터 분리하여 사용함으로써 개체간의 면역거부반응을 더욱 최소화시킬 수 있다.
본 발명의 MSC/CD는, 먼저 분리한 줄기세포에 자살유전자를 도입하여 선별한 후 이를 시험관 내에서 적절한 조건으로 증식 및 분화시켜 얻거나, 줄기세포를 충분히 증식시킨 다음 여기에 자살유전자를 도입하고 이를 중간엽 줄기세포로 분화시켜 얻을 수 있다. MSC/CD는 자살 유전자의 존재에 의하여 치료를 필요로 하는 대상에 주입된 후, 이에 제한되지 않으나 예컨대 주입 2 내지 30일, 바람직하게는 5 내지 15일, 더욱 바람직하게는 5 내지 10일 기간이 지난 후 스스로 사멸하여 지속적인 작용에 의해 유도될 수 있는 부작용을 줄일 수 있다.
본원 발명의 "F 세포(Frozen cell, F cell)”는 시토신 디아미네이즈(CD)가 도입된 중간엽 줄기세포인 MSC/CD를 동결하고 해동한 후, 추가적인 배양 단계를 거치지 않은 세포를 말하며, 해동 상태 그대로 현탁, 혹은 현탁 및 세척하여 치료하려는 대상에 투여하는 것을 목적으로 하는 상태의 세포를 정의한다. 보다 구체적으로 F 세포는 중간엽 줄기세포에 시토신 디아미네이즈(CD)를 도입하여 MSC/CD를 제조하고 이를 배양하고 동결배지에 냉동보관한 후 사용직전 실온에서 이를 해동시키고, 예컨대 이에 제한되지 않으나 사람혈청 알부민이 포함된 플라스마솔루션 A 등에서 현탁시킨 후 원심분리하여 얻어지는 세포를 말한다. 본 발명의 F 세포와 구별되는 세포로 MSC/CD 에 동결 해동 단계를 동일하게 수행하되 이 후 배양 과정을 거쳐 농도 및 활성을 극대화하고 배양 중인 세포를 바로 수확하여 사용하는 즉시 이용 세포, 즉 “immediately harvested cell(I 세포)"를 들 수 있다.
본원 발명의 F 세포는 I 세포와 비교하여 통상적으로 활성화를 극대화하기 위해서 수행하는 배양단계를 수행하지 않았음에도, 콜로니 형성 능력의 증가 없이도 항암 효과가 증가된 세포인 특징이 있다. 또한 본원 발명의 F 세포는 항암 효과의 증진과 함께 치료가 필요한 환자에 즉시 투여가 가능한 장점을 가질 수 있다.
본원 발명에서 냉동 또는 동결 상태로 세포를 보관하는 것은, 동결 보존액, 동결 배지 등 세포가 동결 상태로 유지될 수 있도록 하는 당 분야에 공지된 수단을 이용하는 것을 모두 포함할 수 있으며, 예시적으로 동결을 위한 디메틸 설폭사이드(DMSO), 덱스트란 (dextran), 사람 혈청, 사람혈청 알부민, 소혈청, 소혈청 알부민, poly-l-lysine, polyvinylpyrrolidone, hydroxy-ethyl-starch, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 및 퍼콜 (percoll)과 같은 냉동 보호제를 포함하는 배지, 이와 같은 시판 물질로서 cryostor CS2, cryostor CS10 (바이오라이프 솔루션스 인코포레이티드(BioLife Solutions Inc.)) 를 들 수 있고, 구체적으로 cryostor CS2, cryostor CS10, 2 내지 10%의 DMSO 배지, 보다 구체적으로, 2, 5, 10%의 DMSO 배지 등을 사용할 수 있다.
본원 발명의 F 세포는 I 세포와 비교하여 in vitro 상의 콜로니 형성 능력이 유사하게 나타나며, 기존 MSC/CD의 구경꾼 효과 역시 효과적으로 나타낸다. 또한 F 세포는 in vivo에서 I 세포나 대조군과 비교하여 2 배 이상의 뇌종양 및 피하 종양을 포함하는 다양한 종양의 억제 효과를 나타내며 기존 항암제인 테모졸로마이드(temozolomide; TMZ) 와 병용 치료 하였을 때 매우 상승된 항암 효과를 나타내는 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 즉, F 세포는 콜로니 형성능력에서는 I 세포와 차이가 없음에도 불구하고 제조 방법에 따라 부여되는 F 세포의 고유의 활성에 의하여 다른 I 세포 등과 비교하여 in vitro 상에서는 예측할 수 없는 현저한 항암 효과 및 항암제 어쥬번트로서의 효과를 나타내는 장점이 있다.
즉, 본원 발명의 F 세포는 동결 후 배양 단계를 추가적으로 수행하지 않는 제조방법을 통해 제조되는 것을 통해 통상적으로 사용되는 I 세포와 차별화 될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 F 세포가 동결 후 세포 배양 단계를 수행하지 않는 것을 특징으로 하는 F 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 F 세포는 암 치료에 사용될 수 있는 암 치료용 세포이다. F 세포를 이용하여 치료할 수 있는 암, 종양은 암을 적출하는 모든 암종에 제한없이 사용가능하며 항암제 투여를 이용하는 화학적 치료요법 전에, 동시에, 후에 치료를 필요로 하는 대상에 투여될 수 있다.
상기 암은 예컨대 편평세포 암(squamous cell cancer, 예를 들어, 상피의 편평세포 암), 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 두경부암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 뇌종양, 췌장암, 간암, 폐암, 대장암, 피부암일 수 있다.
또한 본 발명의 F 세포는 항암용 어쥬번트(adjuvant) 일 수 있다. 항암용 어쥬번트란 일차적인 치료법, 예컨대 화학적 치료법 또는 외과적 수술에 의한 암 치료와 병용하여 처리됨으로써 일차적 치료법의 보다 빠른 작용을 유발하고 그의 항암 작용을 강력하게 할 수 있는 보조제를 말한다. 항암용 어쥬번트는 항암제를 이용하는 화학 치료요법에서, 일차적으로 사용되는 주 치료제인 항암제의 효과를 증진시키기 위해 사용될 수 있으며, 외과적 수술 후 잔존하는 암 세포의 처리를 통해 암 치료 효과를 극대화하도록 사용될 수 있다.
상기 F 세포는 암 치료에 사용하기 위한, 또는 항암용 어쥬번트에 사용하기 위한 조성물의 형태로 존재할 수 있으며, 이와 같은 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 주입 형태는 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화된 것이 바람직하다.
따라서 본 발명은 F 세포를 포함하는 항암용 어쥬번트를 제공한다.
F 세포는 의사의 처방에 따라, 또는 당 분야에 널리 알려진 공지의 방법에 따라 환자의 생체내로 주입될 수 있으며, 1회 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 결정될 수 있다.
또한 본 발명은 F 세포 및 5-플루오로시토신(5-FC)을 포함하는 암 치료용 키트를 제공한다.
암 치료용 키트는 F 세포와 5-플루오로시토신(5-FC)의 병용처리 목적을 위하여 제조되는 것으로, 치료를 필요로 하는 대상에 전구 약물인 5-플루오로시토신(5-FC)을 투여하기 전, 투여와 동시에, 투여한 후에 F 세포를 주입할 수 있도록 제조된 키트를 의미한다.
상기 암 치료용 키트는 제 1구획과 제2구획으로 이루어질 수 있으며, 제1구획에 암치료 또는 항암제 어쥬번트로 작용하기 위한 F 세포를 포함할 수 있고, 제2구획에 5-플루오로시토신(5-FC)을 포함할 수 있다. 상기 키트는 편리성 및 휴대성을 높이기 위해 각각 1회 투여량으로 나누어 한 용기 내에 함유하거나 또는 상이한 여러 개의 소 용기 내에 함유할 수 있다. 따라서 각 용기 내에는 배열 방법에 따라 여러 개의 소용기가 존재할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 사용에 필요한 장비 및 각 성분의 투여 방법을 기재한 지시 자료 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 암 치료용 키트는 항암제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항암제는 당 분야에 알려진 항암제를 제한없이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 시타라빈, 플루다가빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 탁소테레, 글리벡, 탁솔, 허셉틴, 타르세바, 아바스틴, 졸라덱스, 아드리아마이신, 이리노데칸(irinotecan), 10058-F4, 시스플라틴(cisplatin), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamid), 니트로소 요소-기반 항암제, 메토트렉세이트(Methotrexate) 및 독소루비신(doxorubicin) 으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.. 니트로요소(nitrosourea)에는 카무스틴(Carmustine), 로무스틴(lomustine) 등이 포함된다. 상기 항암제는 암 치료용 키트의 제3 구획에 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 1) 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)에 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase; CD)를 도입하여 MSC/CD를 제조하는 단계; 2) 제조된 MSC/CD를 동결하여 동결된 MSC/CD를 제조하는 단계; 3) 동결된 MSC/CD를 해동하고 현탁하여 F 세포를 제조하는 단계; 4) 상기 F 세포를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 및 5) 5-플루오로시토신(5-FC)을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 대상은 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하며, 암 치료를 필요로 하는 환자로 암 치료 중인 환자, 암 치료를 받은 적이 있는 환자, 암 치료를 받을 필요가 있는 환자를 모두 포함하며, 암 치료를 위하여 암을 적출하는 외과적 수술을 시행한 환자 또한 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 치료방법에 6) 항암제를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 더 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 4) 단계의 F 세포의 투여 전 또는 F 세포 투여와 동시에, 항암제를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 F 세포와 항암제를 항암 치료를 필요로 하는 개체에 동시에 투여하거나, 순차적으로, 예컨대 F 세포 투여 후 항암제 투여, 항암제 투여 후 F 세포가 투여하는 방법을 모두 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 항암제는 당 분야에 알려진 항암제를 제한없이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 시타라빈, 플루다가빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 탁소테레, 글리벡, 탁솔, 허셉틴, 타르세바, 아바스틴, 졸라덱스, 아드리아마이신, 이리노데칸(irinotecan), 10058-F4, 시스플라틴(cisplatin), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamid), 니트로소 요소-기반 항암제, 메토트렉세이트(Methotrexate) 및 독소루비신(doxorubicin) 으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다. 니트로 요소(nitrosourea)에는 카무스틴(carmustine, BCNU), 로무스틴(lomustine, CCNU) 등이 포함된다. 상기 항암제는 당 분야에 널리 알려진 항암제의 처방 용량에 따라 적절하게 선택적으로 처방될 수 있으나, 본 발명의 F 세포와의 상승효과를 고려하여 평균적인 처방 용량보다 적은 용량으로 처방될 수 있다.
본 발명의 F 세포와 5-플루오로시토신은 상호 동시에 또는 시간 차를 두고 순차적으로 투여될 수 있으며, F 세포에 의해 5-플로오로시토신이 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil)로 전환되기 적절한 시간 및 주기에 따라 선택될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 4) 단계의 F 세포와 5) 단계의 5-플루오로시토신은 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명의 5-플루오로시토신과 병용하여 사용되는 항암제는 상호 동시에 또는 시간 차를 두고 순차적으로 투여될 수 있으며, 적절한 시간 및 주기에 따라 선택될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 5) 단계의 5-플루오로시토신과 6) 단계의 항암제는 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 있어 순차적으로 투여란, 투여되는 복수개의 성분이 시간 차이를 두고 개체에 투여되는 것을 말하며, 유효성분 각각의 순서가 적절하게 조절될 수 있다.
상기 F 세포는 대상의 종양 부위에 약학적으로 유효한 양으로 전달될 수 있으며, 전달은 이에 제한되는 것은 아니나 주사액 형태에 의한 것이 바람직하다. 특히 상기 주사액은 포유류 대상, 바람직하게는 인간 환자 투여용인 것이 더욱 바람직하다.
상기 F 세포는 MSC/CD를 동결, 해동 또는 해동 및 세척하여 즉시 사용하는 세포로 세포 사멸 효과를 가지고 있어 자살 효과에 의해 대상 체내에서 일정 시간, 바람직한 일예로 주입 5 내지 15일 후 사멸될 수 있으므로, 지속적인 치료를 반복하기 위하여 반복 투여할 수 있다. 또한 상기 5-FC, 항암제는 치료 목적, 환자의 상태에 따라 반복 투여될 수 있다. 이와 같은 F 세포, 5-FC, 항암제의 반복 투여의 주기는 환자의 치료 상태에 따라 적절하게 조절될 수 있으며 바람직하게는 10일 내지 30일 단위로 반복 투여할 수 있다. 예컨대 MSC/CD의 세포 사멸을 고려하면 최소 10일 경과 후 반복 투여하는 것이 바람직하며, 해당 세포가 주사기로 주입되는 것을 고려하면 30일 단위로 반복 투여하는 것 역시 바람직하다.
따라서 본 발명은 상기 4) 단계의 F 세포의 투여는 10일 내지 30일 주기로 반복되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
F 세포 투여주기의 반복에 따라, 5-플루오로시토신도 주기적으로 반복 투여될 수 있으며, 선택적으로 병용 투여를 위한 항암제 역시 주기적으로 반복 투여될 수 있다.
본 발명의 암 예방 또는 치료 방법에 따른 암은 F 세포를 이용하여 치료할 수 있는 암, 종양은 암을 적출하는 모든 암종에 제한없이 사용가능하며 항암제 투여를 이용하는 화학적 치료요법 전에, 동시에, 후에 치료를 필요로 하는 대상에 투여될 수 있다. 상기 암은 예컨대 편평세포 암(squamous cell cancer, 예를 들어, 상피의 편평세포 암), 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 두경부암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 뇌종양, 췌장암, 간암, 폐암, 대장암, 피부암일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 제조예 및 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 시토신 디아미네이즈 (CD) 발현 중간엽 줄기세포 제조
1.1 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
아주대학교 의료원의 IRB 심사 후 공여 받은 인간 골수 4 ㎖를 멸균된 15 ㎖ 시험관에서 4㎖의 히스토파크(HISTOPAQUE) 1077(Sigma-Aldrich사)에 오버레이한 후, 원심분리기를 이용하여 실온에서 400xg로 30분간 원심분리하였다. 원심분리 후 파스퇴르 피펫을 이용하여 중간의 혈액연층 (buffy coat) 0.5 ㎖를 조심스럽게 채취하여 멸균된 인산염 완충용액(pH 7.4) 10㎖가 담긴 시험관에 옮겼다. 다시 250xg에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버리고, 10 ㎖의 인산염 완충용액을 가하여 부드럽게 현탁시킨 후, 10분간 250xg에서 원심분리하였다. 이 과정을 2회 반복실시한 후, 최종 침전물을 10% FBS(Hyclone사)가 첨가된 DMEM 배지(Gibco사)에 가하여, 100 mm 동물세포 배양용 용기에 1 x109 세포가 되도록 분주하였다. 배양용기를 배양기에 넣고 37℃에서 5 % 이산화탄소 및 95 % 공기를 공급하면서 4시간 동안 배양하였다. 이어서 배양용기의 바닥에 달라붙지 않은 세포를 제거하기 위해 상층액을 제거하고 새로운 배지를 첨가하여 배양기에서 배양하였다.
분리한 중간엽 줄기세포를 CO2 배양기에서 37℃를 유지하면서 중간엽 줄기세포 배지[10 % FBS (Gibco사)+10 ng/㎖ bFGF (Sigma-Aldrich사)+1 % 페니실린/스트렙토마이신(Gibco사)+89 % DMEM(Gibco사)]에서 배양하였다. 2일 간격으로 배지를 교체하면서 세포를 배양하여, 배양용기에 약 80 % 정도 세포가 차게 되면 0.25 % 트립신/0.1mM EDTA(Gibco사)를 이용하여 세포를 분리한 후, 약 800-1,1000 cells/cm2 되게 혹은 배지로 1:10 내지 1:20으로 희석한 다음 새로운 배양용기에서 계대 배양하였다. 세포 중 일부는 2-10 % DMSO(Sigma-Aldrich사, 2, 5, 10%)가 첨가된 동결배지를 이용하여 동결 보관하였다.
1.2 시토신 디아미네이즈(CD) 포함 레트로바이러스 제작
자살 유전자인 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase; 이하, CD)를 발현하는 레트로 바이러스를 제작하였다. 보다 구체적으로 다음과 같다.
대장균(E. coli) K-12 MG1655 (한국생명공학연구원)로부터 DNA를 분리한 후, 프라이머 CD-F(5'-GAA TTC AGG CTA GCA ATG TCT CGA ATA ACG CTT TAC AAA C-3')과 CD-R (5'-GGATTC TCT AGC TGG CAG ACA GCC GC-3')을 이용하여, 94℃에서 5분; 94℃에서 30초, 60℃에서 40초, 72℃에서 1분, 27사이클; 72℃에서 7분의 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터 클로닝 키트 (Promega사)를 이용하여 클로닝한 후, X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, Sigma-Aldrich사)과 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, Sigma-Aldrich사)를 이용하여 청백색 콜로니(blue-white colony) 선별을 통해 CD 유전자가 들어간 pGEM-CD 벡터를 제작하였다. 얻어진 CD 유전자는 서열분석을 통하여 염기서열이 GeneBank의 gi:298594와 일치하는 것을 확인하였다. 제작된 pGEM-CD 플라스미드와 pcDNA3.1(Clontech사)을 각각 EcoRⅠ 및 NotⅠ제한효소로 자르고, 플라스미드 pGEM-CD로부터 분리된 CD 유전자와 절단된 플라스미드 pcDNA3.1를 T4 DNA 연결효소로 연결한 후 이를 이용하여 컴피턴트(competent) 세포인 대장균 DH5α를 형질전환시키고 50 ㎍/㎖의 앰피실린이 포함된 LB 플레이트에서 배양, 선별하여 플라스미드 pcDNA3.1-CD를 얻었다. 이 플라스미드를 BamH I 제한효소로 자르고 레트로바이러스를 생산할 수 있는 레트로바이러스 벡터에 도입하였다. 얻어진 플라스미드를 CsCl-초고속 원심분리기로 분리한 후 칼슘 포스페이트 침전법(Jordan, Nucleic Acid Research, 24, 596-601 (1996))으로 레트로바이러스 포장(packaging) 세포주인 FLYRD18 세포에 형질도입한 후, 배양기에 넣고 37℃에서 5% 이산화탄소 및 95% 공기를 공급하면서 배양하였다. 48시간 경과 후, 배양액만을 얻어 0.45 ㎛ 여과막으로 여과하여 레트로바이러스 용액을 얻었다. 레트로바이러스 용액은 분주하여 -70℃에 보관하면서 사용하였다.
1.3 CD 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포 제조
상기 1.1에서 분리 배양된 중간엽 줄기세포에 1.2에서 제조된 CD 포함 레트로 바이러스를 이용하여 CD 유전자를 도입시켰다. 보다 구체적으로 중간엽 줄기세포를 100mm 배양용기에 70 % 정도 차도록 배양한 후, 레트로바이러스 용액 3 ㎖와 신선한 중간엽 줄기세포 배지 3 ㎖ 및 4 ㎍/㎖의 폴리브렌(polybrene, Sigma-Aldrich사)을 첨가하여 8시간 동안 배양하였다. 이어서 바이러스 용액을 제거하고 16시간 동안 10 ㎖의 중간엽 줄기세포 배지를 가하여 배양한 후, 다시 레트로바이러스를 감염시켰다. 이 과정을 1 내지 3회 수행한 후, 최종적으로 중간엽 줄기세포를 트립신으로 떼어내어 배지로 1:20 희석하여 계대배양하였다. 계대배양 시 퓨로마이신(puromycin, Sigma-Aldrich 사)을 2 ㎍/㎖이 되도록 배지에 첨가하여 레트로바이러스가 감염된 세포만이 살아남을 수 있도록 2주간 선별하였으며, 최종적으로 자살 유전자인 CD를 지속적으로 발현하는 중간엽 줄기세포주 (이하, MSC/CD)를 제작하였다.
실시예 1. MSC/CD의 세포 사멸 및 구경꾼 효과
1.1 세포 사멸 효과 확인
시토신 디아미네이즈(CD)는 자살 유전자로 이를 발현하는 중간엽 줄기세포인 MSC/CD는 도 1에 도식화한 바와 같이, 전구약물인 플루오르시토신(5-fluorocytosine; 이하, 5-FC)을 플루오르우라실(5-fluorouracil; 이하 5-FU)로 전환하고 자기 자신도 죽는 자살 효과와 주변 세포를 죽이는 구경꾼 효과를 가질 수 있다. 따라서 상기 1.3에서 제조된 MSC/CD의 세포 사멸 효과 및 구경꾼 효과를 확인하였다. 먼저 10,000개의 MSC/CD 혹은 중간엽 줄기세포(MSC)를 12-well 플레이트에서 배양하였다. 다음날부터 전구약물 5-FC를 0-1,000μM의 농도로 처리하고 이틀에 한 번씩 약물이 포함된 새로운 배지로 바꾸어주었다. 5-FC을 처리하고 6일째에 살아있는 세포를 측정할 수 있는 MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich사)가 0.5 mg/ml 농도로 포함된 세포배양 배지로 바꾸어 주고 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, MTT 용액을 제거하였다. 500 μl의 DMSO를 각 웰에 넣어 발색반응을 시킨 후, 96-well 플레이트로 옮겨 ELISA 리더(E-max, Molecular device사)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험 방법 모식도 및 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, MSC/CD는 전구약물인 5-FC의 농도가 증가할수록 살아있는 세포가 감소하는 자살효과가 있음을 확인하였고, 50%의 세포사멸을 유도하는 IC50는 60.4 μM 이었다. 대조군인 중간엽 줄기세포의 경우에는 5-FC의 농도가 증가해도 세포가 죽지 않아 세포 자살효과가 없다는 것을 확인하였다.
1.2 구경꾼 효과 (Bystander effect)
10,000개의 GFP를 발현하는 U87MG (한국세포주은행 KCLBNo.30014) 신경교종 세포와 10,000개의 MSC/CD 혹은 중간엽 줄기세포(MSC)를 12-well 플레이트에서 배양하였다. 다음날부터 전구약물 5-FC를 0 내지 1,000μM의 농도로 처리하고 이틀에 한 번씩 약물이 포함된 새로운 배지로 바꾸어준 후 6일 후에 세포를 얻었다. 이와 같은 실험 방법을 도 3의 A에 간략하게 나타내었다.
이후 해부형광현미경(Olympus사)을 이용하여 웰 전체에 남아 있는 GFP를 발현하는 U87MG의 형광이미지 사진을 찍었다. 형광사진을 찍은 후 1X 페시브 라이시스 버퍼(passive lysis buffer, Promega사)를 200μl 넣고 10분간 얼음에 둔 후 세포 용해물을을 E-tube로 옮기고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 새로운 용기로 옮겨 주었다. 이중 100μl를 검정 96-well 플레이트에 옮긴 후 플루오르미터(GEMINI EM, molecular device사)를 이용해 excitation 488nm, emission 530nm 조건에서 형광의 정도를 측정하였다. 결과를 도 3의 B,C에 나타내었다.
도 3의 B, C에 나타낸 바와 같이, MSC/CD와 함께 배양된 U87MG은 5-FC의 농도가 높아짐에 따라 형광을 발현하는 세포의 수가 줄어들고 형광의 강도가 현저히 감소하였으나, CD를 발현하지 않는 중간엽 줄기세포와 함께 배양된 U87MG은 형광 발현 세포 수 및 형광 강도가 5-FC 농도에 따라 큰 차이를 나타내지 않았다. 이때 50%의 세포사멸을 유도하는 IC50는 50.48μM이었다. 이와 같은 결과는 CD가 도입된 중간엽 줄기세포인 MSC/CD가 세포 자살 효과뿐만 아니라 주변의 세포도 함께 죽이는 구경꾼 효과를 나타내는 것을 보여주었다.
제조예 2. "I 세포" 및 "F 세포"의 제조
세포 치료제의 경우 다양한 조건에 의한 세포의 상태 변화에 따라 그 효과가 달라질 수 있다. 따라서 MSC/CD의 상태에 따라 세포의 능력이 변화되는지 여부를 확인하기 위하여 동결 후 즉시 해동한 상태의 세포 (이하, "F 세포(frozen cell)") 및 배양 중인 세포를 바로 수확한 상태의 세포 (이하,"I 세포(immediately harvested cell)"를 제조하였다.
F 세포와 I 세포를 각각 제조하기 위하여 MSC/CD를 배양한 후, 2 내지 10% (2, 5, 10%) DMSO가 함유된 동결배지 1ml에 2X106 세포씩 분주하거나, Cryostor CS10 (BioLife Solutions사) 1ml에 2X106 세포씩 분주하고 동결한 후 액체질소 통에서 보관하였다. 먼저 MSC/CD의 “I 세포”를 얻기 위해 passage 5의 세포를 37℃에서 녹이고 9ml의 배양배지에 세포를 넣은 후 500g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 침전된 세포를 배양액에 현탁하여 150mm 배양용기에 분주하였다. 다음날 1.5X105 세포를 150mm 배양용기에 옮긴 후 2일에 한 번씩 새로운 배지로 바꾸어 주고 6일 후에 세포를 수거하여 passage 6에 해당하는 “I 세포”를 준비하였다.
“F 세포”를 얻기 위해서 passage 6에서 섭씨 -130도 이하에서 동결보관된 MSC/CD 를 37℃에서 녹이고 9ml의 사람혈청알부민이 포함된 플라스마솔루션 A (CJ사)에 현탁한 후 500xg에서 5분간 원심분리하거나, 생리 식염수에 최종 7.5% 덱스트란-40 (대한약품공업)과 5% 사람혈청알부민(녹십자)이 포함된 용액에 현탁한 후 800xg에서 10분간 원심분리하였다. 이후 상층액을 제거한 후 침전된 세포를 배양배지에 현탁하여 사용하였다. 즉 F 세포는 동결 해동 후 배양 단계를 수행하지 않은 상태의 세포이다. 뇌에 이식하기 전 I 세포와 F 세포를 각각 두 번 세척하여 사용하였다.
실시예 1. F 세포의 구경꾼 효과 및 콜로니 형성
1.1 F 세포의 구경꾼 효과
F 세포가 MSC/CD의 구경꾼 효과를 정상적으로 나타낼 수 있는지 여부 및 이와 같은 구경꾼 효과가 배지의 종류와 같은 제조방법과 무관하게 효과적으로 나타나는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 제조예 2의 방법에 따라 제조된 I 세포와, 10% DMSO 동결배지로 제조된 F 세포 (DMSO) 및 Cryostor CS10으로 제조된 F 세포 (CS10) 10,000개를 플라스마솔루션 A로 세척한 후 한국세포주은행으로부터 공여 받은 U87MG (KCLB No.30014)에 형광을 발현하도록 GFP 유전자를 이입시킨 신경교종 U87/GFP세포와 함께 12-well 플레이트에서 공동배양하였다. 다음날부터 전구약물인 5-FC를 0 내지 1,000μM의 농도로 처리하고 이틀에 한 번씩 약물이 포함된 새로운 배지로 바꾸어준 후 6일 후에 세포를 얻었다. 1X 페시브 라이시스 버퍼 (passive lysis buffer, Promega사)를 200㎕ 넣고 10분간 얼음에 둔 후 세포용해물을 E-tube로 옮기고 12,000rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 새로운 용기로 옮겨 주었다. 이중 100㎕를 빛이 차단되는 검정 96-well 플레이트에 옮긴 후 플루오르미터(GEMINIEM, molecular device사)를 이용해 excitation 488nm, emission 530nm 조건에서 형광의 정도를 측정하였다. 이와 같은 실험 과정의 모식도 및 구경꾼 효과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 세포사멸을 50% 일으키는 농도인 IC50값이 I 세포는 60.4μM, 10% DMSO 동결배지로 제조된 F 세포 (DMSO)는 56.2μM, Cryostor CS10로 제조된 F 세포 (CS10)는 55.4μM 나타났다. 이와 같은 결과는 F 세포가 I 세포보다 구경꾼 효과를 효과적으로 나타낼 수 있는 세포임을 나타내며, 이를 통해 F 세포가 DMSO 배지 또는 CS10 배지를 사용한 제조방법과 무관하게 I 세포보다 우수한 구경꾼 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
따라서 이하에서는 제조예 2에서 제조된 F 세포 중 10% DMSO 동결배지로 제조된 F 세포 (DMSO)를 이용하였다.
1.2. F 세포의 콜로니 형성 효과
상기 제조예 2와 같이 동결 및 해동을 통해 제조된 F 세포가 I 세포와 비교하여 증식 능력의 차이를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 콜로니 형성 능력(Colony forming unit assay)를 확인하였다. 제조예 2와 같이 제조되고 동일한 passage에 해당하는 I 세포와 10% DMSO 동결배지를 통해 제조된 F 세포를 Countess (Invitrogen사)로 계수한 후, 세포 100개씩 100 mm 배양용기에 넣고 2일에 한 번씩 새로운 배지로 바꾸어 배양하였다. 2주 후 10% 포르말린(formalin)으로 10분간 고정하고 인산염완충용액(Gibco사)으로 세척한 후에 크리스탈 바이올렛 용액(crystal violet solution, Sigma-Aldrich사)으로 10분간 염색하고 물로 3번 세척한 후에 Versa doc (BioRad사)으로 이미지를 얻었으며, 세포 한 개가 2주간 자라서 생겨난 콜로니를 육안으로 계수한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, I 세포와 F 세포는 콜로니 형성 능력에서 차이가 없는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과를 통해 I 세포에 비해 증가된 F 세포의 구경꾼 효과가 콜로니 형성의 증가와 같은 세포수의 증가에 의해서 기인하는 것이 아니며, F 세포 자체가 I 세포보다 우수한 구경꾼 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
실시예 2. F 세포의 항암 효과
2.1. 뇌종양에 대한 F 세포의 항암 효과
F 세포의 뇌종양에 대한 항암 효과를 확인하기 위하여, 뇌종양 동소이식모델(orthotopic glioma model)을 제작하였다. 먼저 생후 7주된 면역결핍 누드마우스(중앙실험동물)를 마취시킨 후 마우스 틀(sterotaxic frame)에 입과 귀를 고정시켰다. 절개할 머리 부분을 70% 에탄올로 소독하고 정수리 부분을 0.5cm 정도로 수직 절개하였다. LacZ를 발현시킨 U87MG 신경교종세포 3x105/3μl 를 뇌의 좌표 AP=+0.5mm, ML=-1.8mm, DV=-3mm인 지점에 0.3μl/분의 속도로 이식하여 뇌종양 동소이식모델을 만들었다. LacZ를 발현하는 U87MG 신경교종세포 이식 3일 후 제조예 2에서 제조된 F 세포를 플라스마솔루션 A 용액에 현탁시킨 후, 500xg에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 세척과정을 1회 또는 2회 반복한 후 3x105/6μl 농도가 되게 준비하였다. 이를 뇌의 좌표 AP=+0.5mm, ML=-1.8mm, DV=-3mm인 지점에 0.3μl/분의 속도로 이식하였다. 세포이식 다음날부터 5-FC (15mg/ml 생리식염수)을 500mg/kg 용량으로 일주일간 복강 주사하였다. F 세포의 항암 효과와 비교하기 위하여 제조예 2에서 제조된 I 세포를 동일한 방법으로 이식하고 세포이식 다음날부터 5-FC (15mg/ml 생리식염수)을 500mg/kg 용량으로 일주일간 복강 주사하였다.
신경교종세포 이식 후 28일째 되는 날 동물을 마취한 상태에서 좌심실에 주사바늘을 삽입하여 생리식염수로 관류세척한 후 10% 포르말린 용액으로 관류 고정하였다. 뇌를 적출하여 마우스 매트릭스(mouse brain matrix, Stoelting사)에 고정후 1mm 간격으로 가로절단하고 동일한 고정액에 담아 30분간 고정하였다. 뇌절편을 인산염완충용액으로 세 번 세척한 후 20㎎/㎖ X-gal (5-bromo-4-chloro-3- indolyl-β-D-galactopyranoside, Koma Biotech사), 5 mM 포타슘 페로시아나이드/페리시아나이드 (Sigma-Aldrich사), 2 mM MgCl2 , 0.02% NP40가 함유된 인산염완충용액에 담근 후 37℃에서 16시간 반응시켰다. 해부현미경을 통해 뇌종양의 이미지를 얻었으며, image j (NIH) 프로그램과 아래의 수식을 사용하여 종양의 크기를 계산하고 그 결과를 도 6 에 나타내었다.
Figure PCTKR2016002188-appb-I000001
도 6에 나타낸 바와 같이, 뇌종양의 부피가 F 세포를 이식한 처리군에서 현저하게 감소하였으며, I 세포보다 더욱 우수한 효과를 나타내었다(B). 계산된 종양의 평균 크기는 비히클 대조군에서 91.3mm3, I 세포 이식 비교군에서 1.5mm3로 나타났으나, F 세포를 이식받은 동물군에서는 0.6mm3으로 확인되었다. 즉 in vivo 결과에 따르면 MSC/CD 중에서도 F 세포가 I 세포보다 종양을 감소시키는 효과가 2 배 이상 큰 것으로 확인되었으며, F 세포가 더욱 효과적인 항암 치료제가 될 수 있음을 알 수 있다.
2.2. 간암에 대한 F 세포의 항암 효과
1X105의 Huh7 간암 세포(Lver cancer, Huh7, KCLB No. 60104), 20% 매트리젤(Matrigel, BD사)이 함유된 인산염완충용액 100μl에 현탁하여, 생후 7주령 면역결핍 누드마우스(Balb/c nude)의 피하에 이식하였다. 이식하고 14일 후, 종양의 크기가 10~100mm3 되었을 때, 제조예 2에서 제조된 I 세포와 F 세포를 주입하였다. 보다 구체적으로, 제조예 2에서 제조된 I 세포와 F 세포를 인산염완충용액에 현탁시킨 후, 500xg에서 5분간 원심 분리하였다. 이 과정을 두 번 반복한 후 인산염완충용액에 1x106/100μl 가 되게 준비한 후 주사기를 사용하여 I 또는 F 세포를 종양에 직접 주입하였다. I 세포와 F 세포를 주입한 다음날부터 7일간 5-FC (15mg/ml 생리식염수)을 500mg/kg 용량으로 일주일간 복강 주사하였다. 매주 디지털측정기(caliper)를 이용하여 1~2회 종양의 크기를 측정하고 아래의 수식을 사용하여 종양의 부피를 계산하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
피하종양부피 (mm3)=가로 (mm) x 세로 (mm) x 높이 (mm) ÷6
[Tumor volume 측정 참고문헌 Cancer Chemother Pharmacol (1989) 24: 148-154]
도 7의 A에 나타낸 바와 같이 종양의 부피는 F 세포를 처리한 실험군에서 더 효과적으로 감소하여 I 세포보다 F 세포가 더욱 우수한 항암 효과를 나타낸다는 것을 확인하였고, 이와 같은 증가된 항암 효과는 도 7의 B와 같이 간암세포로 만든 피하 종양모델에서 육안으로도 확인되어 F 세포의 치료 효과가 매우 우수함을 확인하였다 (*, p<0.05 PBS군과 비교시).
2.3. 췌장암에 대한 F 세포의 항암 효과
BxPC3 췌장암 세포(pancreatic cancer, BxPC3, ATCC No. CRL-1687TM)은 성장 속도가 빠르고 궤양이 심하므로, 1X106 BxPC3 췌장암 세포와 I 세포와 F 세포를 동시에 주입하였다. 보다 구체적으로, 제조예 2에서 제조된 I 세포와 F 세포를 인산염완충용액에 현탁시킨 후, 500xg에서 5분간 원심 분리하였다. 이 과정을 두 번 반복한 후 인산염완충용액에 1x106/100μl 가 되게 준비한 후 1X106 I 세포 또는 F 세포를 20% 매트리젤(Matrigel, BD사)이 함유된 인산염완충용액 100μl에 현탁하여, 생후 7주령 면역결핍 누드마우스(Balb/c nude)의 피하에 동시 이식하였다. 세포를 주입한 다음날부터 7일간 5-FC (15mg/ml 생리식염수)을 500mg/kg 용량으로 일주일간 복강 주사하였다.
종양 부피 측정은 실시예 2.2 와 동일하게 수행하였으며, 측정한 종양 부피 변화를 도 8의 A 에 나타내었다.
도 8의 A 에 나타낸 바와 같이 종양의 부피는 F 세포를 처리한 실험군에서 더 효과적으로 감소하여 I 세포보다 F 세포가 더욱 우수한 항암 효과를 나타낸다는 것을 확인하였고, 췌장암 피하 종양모델에서 치료 효과가 우수함을 확인하였다. (*, p<0.05 PBS군과 비교시)
2.4. 폐암에 대한 F 세포의 항암 효과
5X106의 A549 폐암 세포(Lung cancer, A549, ATCC No.CCL-185TM)를 20% 매트리젤(Matrigel, BD사)이 함유된 인산염완충용액 100μl에 현탁하여, 생후 7주령 면역결핍 누드마우스(Balb/c nude)의 피하에 이식하였다. 이식하고 8일 후 20~50mm3의 종양 크기가 되었을 때, 제조예 2에서 제조된 I 세포와 F 세포를 주입하였다. 보다 구체적으로, 제조예 2에서 제조된 I 세포와 F 세포를 인산염완충용액에 현탁시킨 후, 500xg에서 5분간 원심 분리하였다.
이 과정을 두 번 반복한 후 인산염완충용액에 1x106/100μl 가 되게 준비한 후 주사기를 사용하여 종양에 직접 주입하였다. I 세포와 F 세포를 주입한 다음날부터 7일간 5-FC (15mg/ml 생리식염수)을 500mg/kg 용량으로 일주일간 복강 주사하였다. 종양 부피 측정은 실시예 2.2 와 동일하게 수행하였으며, 측정한 종양 부피 변화를 도 8의 B 에 나타내었다.
도 8의 B에 나타낸 바와 같이 종양의 부피는 F 세포를 처리한 실험군에서 더 효과적으로 감소하여 I 세포보다 F 세포가 더욱 우수한 항암 효과를 나타낸다는 것을 확인하였고, 폐암 피하 종양모델에서 치료 효과가 우수함을 확인하였다 (*, p<0.05 PBS군과 비교시) .
2.5. 대장암에 대한 F 세포의 항암 효과
5X106의 HT29 대장암 세포(colon cancer, HT29, ATCC No.HTB-38TM)를 20% 매트리젤(Matrigel, BD사)이 함유된 인산염완충용액 100μl에 현탁하여, 생후 7주령 면역결핍 누드마우스(Balb/c nude)의 피하에 이식하였다. 이식하고 난 후, 종양 크기가 40~100mm3 되었을 때, 제조예 2에서 제조된 I 세포와 F 세포를 주입하였다. 보다 구체적으로, 제조예 2에서 제조된 I 세포와 F 세포를 인산염완충용액에 현탁시킨 후, 500xg에서 5분간 원심 분리하였다.
이 과정을 두 번 반복한 후 인산염완충용액에 1x106/100μl 가 되게 준비한 후 주사기를 사용하여 종양에 직접 주입하였다. I 세포와 F 세포를 주입한 다음날부터 7일간 5-FC (15mg/ml 생리식염수)을 500mg/kg 용량으로 일주일간 복강 주사하였다. 종양 부피 측정은 실시예 2.2 와 동일하게 수행하였으며, 측정한 종양 부피 변화를 도 8의 C 에 나타내었다.
도 8의 C 에 나타낸 바와 같이 종양의 부피는 F 세포를 처리한 실험군에서 더 효과적으로 감소하여 I 세포보다 F 세포가 더욱 우수한 항암 효과를 나타낸다는 것을 확인하였고, 대장암 피하 종양모델에서 치료 효과가 우수함을 확인하였다(*, p<0.05 PBS군과 비교시; #, p<0.05 I 세포군과 비교시).
상기와 같은 결과를 통해, F 세포가 뇌종양, 간암, 폐암, 대장암과 같은 각종 암에서 효과적인 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 특히 모든 암 종에서 I 세포보다 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 3. F 세포의 병용치료 시너지 효과 (in vitro)
3.1 테모졸로마이드와의 in vitro 병용치료 효과
10,000개의 GFP를 발현하는 U87MG (한국세포주은행 KCLBNo.30014) 신경교종 세포와 10,000개의 F 세포 혹은 중간엽줄기세포(MSC)를 12-well 플레이트에서 배양하였다. 다음날부터 테모졸로마이드(temozolomide; TMZ) 0-1000μM과 전구약물 5-FC를 0-1,000μM의 농도로 처리하고 이틀에 한 번씩 약물이 포함된 새로운 배지로 바꾸어준 후 6일후에 세포를 얻었다. 본 실험의 모식도를 도 9의 A에 나타내었다. 해부형광현미경(Olympus사)을 이용하여 웰 전체에 남아 있는 GFP를 발현하는 U87MG의 형광이미지 사진을 찍어 세포 사멸을 확인하였으며 결과를 도 9의 D 에 나타내었다.
도 9의 D 에 나타낸 바와 같이, 테모졸로마이드의 처리 농도 증가와 5-FC 처리 농도 증가에 따라 형광 발현이 감소하여 F 세포의 구경꾼 효과가 테모졸로마이드와의 병용 투여에 의하여 상승된다는 것이 확인되었다.
형광사진을 찍은 후 1X 페시브 라이시스 버퍼(passive lysis buffer, Promega사)를 200μl를 넣고 10분간 얼음에 둔 후 세포 용해물을을 E-tube로 옮기고 12,000rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 새로운 용기로 옮겨주었다. 이중 100 μl를 검정 96-well 플레이트에 옮긴 후 플루오르미터(GEMINI EM, molecular device사)를 이용해 excitation 488nm, emission 530nm 조건에서 형광의 강도를 측정하였다(도 9의 B 및 C). 두 종류의 항암제를 함께 처리하여 얻은 실제 IC50값을 아이소볼로그램(isobologram)으로 표시하였다. 아이소볼로그램에서 단독 처리했을 때의 IC50값을 연결한 실선은 theoretical additive line으로서, 두 항암제를 동시에 처리해서 얻은 값이 실선에 있으면 단순히 가산효과(additive effect)가 있음을 의미한다. 반면에 그 값이 실선보다 아래쪽에 있으면 상승효과(synergistic effect)가, 반대로 실선보다 위쪽에 있으면 길항효과(antagonistic effect)가 있음을 나타낸다. 결과를 도 9의 E 에 나타내었다.
도 9의 E 에 나타낸 바와 같이, MSC/CD 에 5-FC와 테모졸로마이드를 병용 처리하였을 때 표시된 점은 모두 단독 처리 IC50값과 비교하여 아래쪽에 존재함으로써, 단순히 두 개의 항암제를 함께 처리한 효과를 합한 가산 효과보다 더욱 우수한 시너지 상승효과가 있음을 확인하였다.
3.2 카무스틴 ( BCNU ) 과의 in vitro 병용치료 효과
GFP를 발현시킨 U87MG (한국세포주은행 KCLBNo.30014) 신경교종세포인 U87/GFP 10,000개와 F 세포(MSC/CD) 10,000개를 12-well 플레이트에서 배양하였다. 다음날부터 카무스틴(Carmustin, BCNU, Sigma사) 0 내지 300 μM과 전구약물 5-FC를 0 내지 300 μM의 농도로 처리하고 이틀에 한 번씩 약물이 포함된 새로운 배지로 바꾸면서 6일간 배양하였다. 7일째 되는 날 배양액을 제거한 후, 각 well에 1X 페시브 라이시스 버퍼(passive lysis buffer, Promega사)를 200 μl를 넣고 10분간 4℃에서 놓아두었다. 세포용해물을 수거하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이중 100 μl를 빛이 차단된검정 96-well 플레이트에 옮기고 형광측정기(GEMINI EM, Molecular Device사)를 이용해 excitation 488nm, emission 530nm 조건에서 형광의 강도를 측정하였다. 본 실험의 모식도를 도 10의 A에 나타내었다.
두 종류의 항암제를 함께 처리하여 얻은 실제 IC50값을 아이소볼로그램(isobologram)으로 표시하고 그 결과를 도 10의 B에 나타내었다.
도 10의 B 에 나타낸 바와 같이, U87/GFP에 [F 세포(MSC/CD)+5-FC]와 카무스틴을 병용처리하였을 때 얻은 점은 단독 처리 IC50값과 비교하여 실선의 아래쪽에 존재함으로써, 단순히 두 개의 항암제를 함께 처리한 효과를 합한 가산효과보다 더욱 우수한 상승효과가 있음을 확인하였다.
3.3 이리노테칸과의 in vitro 병용치료 효과
U87/GFP 10,000개와 F 세포 (MSC/CD) 10,000개를 12-well 플레이트에서 배양하였다. 다음날부터 이리노테칸(irinotecan, Sigma사) 0 내지 30 μM과 전구약물 5-FC를 0 내지 300 μM의 농도로 처리하고 이틀에 한 번씩 약물이 포함된 새로운 배지로 바꾸면서 6일간 배양하였다. 7일째 되는 날 배양액을 제거한 후, 각 well에 1X 페시브 라이시스 버퍼를 200μl를 넣고 10분간 4℃에서 놓아두었다. 세포용해물을 수거하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이중 100 μl를 빛이 차단된 검정 96-well 플레이트에 옮기고 형광측정기(GEMINI EM)를 이용해 excitation 488nm, emission 530nm 조건에서 형광의 강도를 측정하였다. 두 종류의 항암제를 함께 처리하여 얻은 실제 IC50값을 아이소볼로그램(isobologram)으로 표시하고 그 결과를 도 10의 C에 나타내었다.
도 10의 C에 나타낸 바와 같이 아이소볼로그램에서 이리노테칸을 단독 처리했을 때의 IC50값은 3.2μM, 5-FC의 경우 73.6μM이었으며, 이를 연결하여 단순가산효과를 의미하는 실선 (theoretical additive line)을 구하였다. U87/GFP에 [F 세포 (MSC/CD)+5-FC]와 이리노테칸을 병용처리하였을 때 얻은 IC50값은 단독 처리했을 때 얻은 IC50값과 비교하여 실선의 아래쪽에 존재함으로써, 단순히 두 개의 항암제를 함께 처리한 효과를 합한 것보다 더욱 우수한 상승효과가 있음을 확인하였다.
테모졸로마이드, 카무스틴, 이리노테칸은 모두 증식하는 세포에 작용하는 항암제로 알려져 있으므로, 만일 U87/GFP세포뿐만 아니라 증식하는 F세포의 생존에도 영향을 주게 되면, [F 세포(MSC/CD)+5-FC]의 항암효과가 감소될 수 있다. 하지만 예상과는 반대로, 도 9의 E에서 [F 세포(MSC/CD)+5FC]를 테모졸로마이드와 병용 치료하여 사용하는 경우, 항암제만을 단독, 병용 투여하는 것보다 오히려 상승된 시너지 효과를 낼 수 있음을 확인하였다. 즉 이와 같은 상승된 시너지 효과는 기존 병용 치료에서는 기대할 수 없는 예상외의 효과이다.
3.4. 테모졸로마이드와의 in vivo 병용치료 효과
상기 3.1 내지 3.3 에서 확인된 시너지 상승효과를 in vivo에서 추가적으로 확인 및 검증하였다. LacZ를 발현하는 U87MG 신경교종세포를 이식하고 한 후 6일이 지난 후 제조예 2에서 제조된 F 세포를 플라스마솔루션 A 용액에 현탁시킨 후, 500xg에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 세척과정을 두 번 반복한 후 3x105/6μl 농도가 되게 준비하였다. 이를 뇌의 좌표 AP=+0.5mm, ML=-1.8mm, DV=-3mm인 지점에 0.3μl/분의 속도로 이식하였다. 세포이식 다음날부터 플루오르시토신 (15mg/ml 생리식염수)을 500mg/kg 용량으로 일주일간 복강 주사하였다. 4일이 지난 후 테모졸로마이드 (1mg/ml in DMSO:생리식염수=1:1)를 5mg/kg 용량으로 5일간 복강 주사하였다. 28일이 되었을 때 각 동물군에서 8마리씩 뇌조직을 얻어서 실시예 2와 동일한 방법으로 X-gal 염색을 수행하여 뇌종양의 크기를 측정하였다. 이와 같은 실험 과정을 도 11의 A에 도식화하여 나타내었으며, 측정된 뇌종양 크기의 변화를 도 11의 B 및 C에 나타내었다.
도 11의 B 및 C에 나타낸 바와 같이, 비히클(vehicle) 대조군 종양의 평균 크기는 59.8mm3인 반면, F 세포를 이식받은 동물군은 11.8mm3, 테모졸로마이드 단독 투여 동물군에서는 9.9mm3, F 세포+테모졸로마이드를 이식받은 동물군에서는 2.7mm3로 F 세포와 테모졸로마이드를 이식받은 병용 치료 동물군에서 종양의 평균 크기가 가장 많이 감소하여, 가장 우수한 항암효과를 나타내었다.
또한 이와 같은 뇌종양 치료에 따른 생존률을 90일까지 측정하여 각 실험군에서 비교한 결과를 도 11의 D에 나타내었다.
도 11의 D에 나타낸 바와 같이, 대조군에서의 median survival은 32일 이였으나, F 세포 처리군은 42일, 테모졸로마이드 처리군은 42일로 연장되었다. 특히 F 세포와 테모졸로마이드 병용 치료군에서는 median survival이 70일까지 연장되어, 대조군뿐만 아니라 단독 투여군과 비교하여도 매우 현저한 생존률 개선 효과가 확인되었다.
이는 기존 항암제와의 병용 치료에서도 F 세포와의 병용 치료가 현저히 우수한 효과를 나타내므로 기존 화학 치료법을 개선한 치료법으로 활용할 수 있다는 점을 시사한다.
실시예 4. F 세포의 피하종양 치료 효과
뇌종양 외 종양에서도 F 세포가 항암 효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위하여, U87MG 신경교종세포를 피하조직에 이식하여 타장기 암모델(non-brain cancer model)을 제작하였다. 1X106의 U87MG 신경교종세포를 20% 매트리젤(Matrigel, BD사)이 함유된 인산염완충용액 100μl에 현탁하여, 생후 7주령 면역결핍 누드마우스의 피하에 이식하였다. 디지털측경기(caliper)를 이용하여 일주일에 두 번씩 종양의 크기를 측정하고 아래의 수식을 사용하여 종양의 부피를 계산하였다.
피하종양부피 (mm3)=가로 (mm) * 세로 (mm) * 높이 (mm) ÷6
U87MG 신경교종세포를 피하조직에 이식하고 20일 후 종양의 크기가 30mm3이상이 되었을 때, 제조예 2에서 제조된 I 세포와 F 세포를 플라스마솔루션 A 용액에 현탁시킨 후, 500xg에서 5분간 원심분리하였다. 이 과정을 두 번 반복한 후 플라스마솔루션 A에 1x106/100μl 가 되게 준비한 후 주사기를 사용하여 종양에 직접 주입하였다. I 세포와 F 세포를 주입한 다음날부터 5일간 5-FC (15mg/ml 생리식염수)을 500mg/kg 용량으로 일주일간 복강 주사하였다. 5-FC 투여를 중단하고 일주일이 지난 후부터 5일간 테모졸로마이드(Temozolomide, Sigma-Aldrich사)를 5mg/kg의 용량으로 복강 주사하였다. 이와 같은 실험 과정을 도 12의 A에 간략히 도식화 하였다. 측정한 종양 부피 변화를 도 12의 B에 나타내었으며, 이 피하종양 모델에서 누드마우스의 수명을 측정하여 도출한 Kaplan Meier 생존 그래프를 도 12의 C 에 나타내었다.
도 12의 B 에 나타낸 바와 같이, 테모졸로마이드 투여 전 11일째 까지 종양의 부피는 F 세포를 처리한 실험군에서 더 효과적으로 감소하여 I 세포보다 F 세포가 더욱 우수한 항암 효과를 나타낸다는 것이 확인되었을 뿐만 아니라 테모졸로마이드 투여 후인 21일째에는 대조군인 비처리군과 I 세포 처리군과 비교하여 F 세포 처리군에서 매우 현저한 종양 부피 억제 효과를 확인하였다. 또한 도 12의 C에 나타낸 바와 같이, 대조군의 median survival은 23일, I 세포 처리군은 30일인 것과 비교하여, F 세포 처리군은 58일로, 수명 연장 효과 역시 F 세포를 이식받은 동물군에서 처리군에서 가장 우수하게 나타났다. 따라서 F 세포는 피하 종양모델에서의 치료 효과가 우수하며, 특히 테모졸로마이드와의 병용 치료를 통해 상승적인 치료 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있으며, 이는 in vitro 실험만으로는 예상하기 어려운 F 세포 병용 치료의 다른 장기 암에서의 우수성을 보여주는 결과이다.

Claims (17)

1) 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)에 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase; CD)를 도입하여 MSC/CD를 제조하는 단계;
2) 제조된 MSC/CD를 동결하여 동결된 MSC/CD를 제조하는 단계; 및
3) 동결된 MSC/CD를 해동하고 현탁하여 F 세포를 제조하는 단계;를 포함하는 F 세포의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 F 세포는 동결 후 세포 배양단계를 수행하지 않는 것을 특징으로 하는, F 세포의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 F 세포는 암 치료용인, F 세포의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 암은 편평세포 암, 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 두경부암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, F 세포의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 F 세포는 항암용 어쥬번트인, F 세포의 제조방법.
제1항의 F 세포를 포함하는 항암용 어쥬번트.
제1항의 F 세포 및 5-플루오로시토신(5-FC)을 포함하는 암 치료용 키트.
제7항에 있어서, 상기 키트는 항암제를 추가로 더 포함하는 것인, 암 치료용 키트.
제8항에 있어서, 상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 시타라빈, 플루다가빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 탁소테레, 글리벡, 탁솔, 허셉틴, 타르세바, 아바스틴, 졸라덱스, 아드리아마이신, 이리노데칸(irinotecan), 10058-F4, 시스플라틴(cisplatin), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamid), 니트로소 요소-기반 항암제, 메토트렉세이트(Methotrexate), 카무스틴(carmustine, BCNU), 로무스틴(lomustine, CCNU) 및 독소루비신(doxorubicin) 으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인, 암 치료용 키트.
1) 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)에 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase; CD)를 도입하여 MSC/CD를 제조하는 단계;
2) 제조된 MSC/CD를 동결하여 동결된 MSC/CD를 제조하는 단계;
3) 동결된 MSC/CD를 해동하고 현탁하여 F 세포를 제조하는 단계;
4) 상기 F 세포를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 및
5) 5-플루오로시토신(5-FC)을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법.
제10항에 있어서, 6) 항암제를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 더 포함하는 암 예방 또는 치료방법.
제10항에 있어서, 4) 단계의 F 세포의 투여 전 또는 F 세포 투여와 동시에, 항암제를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암 예방 또는 치료방법.
제11항에 있어서, 상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 시타라빈, 플루다가빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 탁소테레, 글리벡, 탁솔, 허셉틴, 타르세바, 아바스틴, 졸라덱스, 아드리아마이신, 이리노데칸(irinotecan), 10058-F4, 시스플라틴(cisplatin), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamid), 니트로소 요소-기반 항암제, 카무스틴(carmustine, BCNU), 로무스틴(lomustine, CCNU), 메토트렉세이트(Methotrexate) 및 독소루비신(doxorubicin) 으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인, 암 예방 또는 치료방법.
제10항에 있어서, 상기 4) 단계의 F 세포와 5) 단계의 5-플루오로시토신은 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료방법.
제11항에 있어서, 상기 5) 단계의 5-플루오로시토신과 6) 단계의 항암제는 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료방법.
제10항에 있어서, 상기 4) 단계의 F 세포의 투여는 10일 내지 30일 주기로 반복되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료방법.
제10항에 있어서, 상기 암은 편평세포 암, 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 두경부암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 암 예방 또는 치료방법.
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