JP6474499B2 - 癌治療用細胞治療剤およびその併用療法 - Google Patents

Description

本発明は、癌を治療するための細胞の製造方法およびかかる製造方法で製造された細胞を含む抗癌用アジュバント、癌治療用キットおよび癌治療方法に関する。

世界的に数百万人が、骨、膀胱、血液（白血病）、脳、乳、結腸、頸部、食道、腸、腎臓、肺、肝、口腔、鼻腔、神経、卵巣、膵臓、皮膚、胃、前立腺、頭頸部、子宮、膣における癌を含む様々な癌で死亡する。数年間、癌を治療するために放射能および化学療法をはじめ様々な方法を使用していたが、癌患者の数は依然として増加しており、放射能および化学療法を用いた場合、病気を誘発し、一部の患者を死に致らせる副作用もあると広く報告されている。また、特定の癌の場合には、悪性細胞は治療が難しいほど残っている問題がある。結果として、癌細胞の生理学または表現型を広範に研究することで、患者の健康な細胞には副作用を起こさずに癌細胞を選択的に死滅する治療方法を講じなければならない。

特に、脳腫瘍の場合、脳に大きなダメージを与え、生存率が非常に低い癌である。脳腫瘍に対する既存の治療法としては、外科的な手術による摘出が最も効果的であるが、脳腫瘍の種類や発生箇所に応じて手術が不可能な場合が多く、完全摘出の際に手術後の合併症の危険性が非常に大きい。また、脳には薬物の浸透を抑制する血液脳関門（ｂｒａｉｎ‐ｂｌｏｏｄ ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）が存在することから、抗癌剤を用いた化学療法で脳腫瘍を治療するためには、他の癌に比べて高濃度の抗癌剤を投与する必要があり、身体の他の臓器に深刻な副作用を誘発するという深刻な問題がある。したがって、抗癌剤の効果を増強させることで抗癌剤の投与容量を減少させるための新たな補助的な方法および治療剤、補助剤が求められている。

また、遺伝子治療法は、癌細胞の増殖を抑制する遺伝子を癌細胞に直接導入する方法であり、遺伝子の導入のために、主にウイルスを利用するが、ウイルス自体は癌に移動する能力がないため、手術的に注入しなければならない。しかし、すべての微細な腫瘍または癌にまでいちいちウイルスを注入することは現実的に不可能であり、癌細胞を標的化するには限界がある。

これと関連して、間葉系幹細胞に自殺遺伝子を導入して標的性を高め、癌を治療するための方法として韓国登録特許ＫＲ１０‐１０２２４０１号が公知となっている。しかし、ＫＲ１０‐１０２２４０１号では、間葉系幹細胞を特別な環境で操作し、これを他の抗癌剤と併用投与して抗癌剤の効果を改善する併用治療補助剤に関する内容、周期的に投与する方法については開示されていない。

また、近年、２種以上の抗癌剤の併用療法といった併用治療に関する研究が多数行われている。これと関連して化学抗癌剤をともに投与する併用治療法だけでなく、化学抗癌剤と他の種類の抗癌療法を並行して行う併用治療法などが最近報告されている。しかし、併用治療の場合、それぞれの薬剤を単純投与する場合と単純和と同じ程度の薬効を示す場合も多く、薬剤の相互作用によってむしろその効果が低下するなどの予測しなかった効果を示すことが報告されており、いまだに薬物の併用投与製剤に関する研究が行われ続けている。

癌での併用投与と関連して化学抗癌剤と細胞治療剤、例えば、間葉系幹細胞を併用投与する併用療法に関する研究も行われているが、間葉系幹細胞を利用した併用投与は、化学抗癌剤による抗癌治療の後、損傷した細胞の回復のために自己幹細胞のような細胞を投与することを目的とする研究が重点的に行われているだけであって、幹細胞自体を併合療法の治療剤として活用しようとする試みはそれほど報告されていない。

したがって、癌、腫瘍治療剤を癌組織に正確に伝達するように標的性（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）が高く、腫瘍以外の箇所には影響を与えないように無毒性であり、免疫毒性がなくて癌が根絶するまで繰り返し投与が可能な治療剤および治療方法の開発が求められており、既存の抗癌剤の効果を改善または増進できる新たな治療方法、治療剤、治療補助剤および併合治療方法に関するニーズおよび必要性がある。

本発明者らは、既存の化学的抗癌治療法の限界を乗り越えるための新たな癌治療剤について鋭意研究を重ねた結果、間葉系幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子を導入して製造されたＭＳＣ／ＣＤ細胞を凍結および解凍して製造された細胞が、単純ＭＳＣ／ＣＤ細胞と比較して非常に優れた腫瘍抑制効果および生存率改善効果を示し、既存の抗癌剤との併用治療効果を極大化できることを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、癌治療のためのアジュバントとして使用可能な細胞である「Ｆ細胞」を製造するＦ細胞の製造方法、およびＦ細胞を含む癌治療用キットを提供することにあり、また、Ｆ細胞と化学抗癌剤との併用投与剤、併用投与方法を提供することにある。

前記目的するところを提供するために、本発明は、１）間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）にシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＣＤ）を導入してＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、２）製造されたＭＳＣ／ＣＤを凍結し、凍結されたＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、３）凍結されたＭＳＣ／ＣＤを解凍し懸濁してＦ細胞を製造するステップと、を含むＦ細胞の製造方法を提供する。

また、本発明は、前記の方法で製造されたＦ細胞を含む抗癌用アジュバントを提供する。

また、本発明は、前記の方法で製造されたＦ細胞および５‐フルオロシトシン（５‐ＦＣ）を含む癌治療用キットを提供する。

また、本発明は、１）間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）にシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＣＤ）を導入してＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、２）製造されたＭＳＣ／ＣＤを凍結し、凍結されたＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、３）凍結されたＭＳＣ／ＣＤを解凍し懸濁してＦ細胞を製造するステップと、４）前記Ｆ細胞を、治療を要する個体に投与するステップと、５）５‐フルオロシトシン（５‐ＦＣ）を、治療を要する個体に投与するステップと、を含む癌の予防または治療方法を提供する。

本発明に係る製造方法は、培養後、直ちに収穫して使用するシトシンデアミナーゼを発現する間葉系幹細胞と比較して増殖能には差がないにもかかわらず、５‐ＦＣとともに処理されたときに、非常に優れた腫瘍抑制効果を奏するだけでなく、他の抗癌剤との併用治療でも既存の抗癌剤併用治療の効果を上回る著しい相乗効果を誘導するＦ細胞を提供することができることから、本発明は、かかるＦ細胞を含む癌治療用キットなどとして活用が可能となり、既存の抗癌治療の効果を極大化するために有用に活用することができる。

シトシンデアミナーゼを発現し続ける間葉系幹細胞株（ＭＳＣ／ＣＤ）およびその自殺効果および傍観者効果を奏する模式図である。 ＭＳＣまたはＭＳＣ／ＣＤと５‐ＦＣの処理過程（Ａ）およびこれによる細胞自殺効果を確認した結果（Ｂ）を示す図である。 ＭＳＣまたはＭＳＣ／ＣＤと５‐ＦＣの処理過程（Ａ）およびこれによる傍観者効果（Ｂ、Ｃ）を確認した結果を示す図である。 Ｉ細胞およびＦ細胞（ＤＭＳＯ）、Ｆ細胞（ＣＳ１０）の傍観者効果を比較するための細胞製造および処理過程（Ａ）および各細胞の傍観者効果（Ｂ）を示す図である。 Ｉ細胞とＦ細胞のコロニー形成能を顕微鏡観察（Ａ）およびＣＦＵ‐Ａを用いた定量的分析（Ｂ）で比較した結果を示す図である。 脳腫瘍モデルにＩ細胞またはＦ細胞と５‐ＦＣを処理する過程（Ａ）、これによる脳腫瘍変化を示す解剖顕微鏡の結果（Ｂ）および腫瘍体積の変化（Ｃ）を示す図である。 肝癌細胞を皮下移植した皮下腫瘍モデルにおいて、Ｉ細胞またはＦ細胞処理による腫瘍体積の変化を示すグラフ（Ａ）および腫瘍の外形的サイズを示す代表的腫瘍モデル（Ｂ）を示す図である。 （Ａ）は膵臓癌細胞を皮下移植した皮下腫瘍モデルにおいて、（Ｂ）は肺癌細胞を皮下移植した皮下腫瘍モデルにおいて、（Ｃ）は大腸癌を皮下移植した皮下腫瘍モデルにおいて、Ｉ細胞またはＦ細胞処理による腫瘍体積の変化を示すグラフである。 Ｆ細胞＋５ＦＣ＋ＴＭＺ併用治療方法（Ａ）、これによる細胞死滅効果（Ｂ、Ｃ）、ＧＦＰを発現するＵ８７ＭＧの蛍光イメージ写真による細胞死滅確認結果（Ｄ）およびＩＣ_５０値のアイソボログラム（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ）結果（Ｅ）を示す図である。 Ｆ細胞＋５ＦＣ＋抗癌剤併用治療方法（Ａ）および抗癌剤併用療法のＩＣ_５０値のアイソボログラム（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ）結果をそれぞれカルムスチン（Ｂ）、イリノテカン（Ｃ）に対して示す図である。 Ｆ細胞＋５‐ＦＣ＋テモゾロミド（ＴＭＺ）の併用治療過程（Ａ）、これによる脳腫瘍変化を示す解剖顕微鏡の結果（Ｂ）、腫瘍体積の変化（Ｃ）および生存率改善における相乗的効果（Ｄ）を確認した結果を示す図である。 皮下腫瘍治療モデルにおいて、Ｉ細胞またはＦ細胞と５‐ＦＣおよびテモゾロミド（ＴＭＺ）の併用治療効果分析過程（Ａ）およびＦ細胞、５‐ＦＣおよびテモゾロミド（ＴＭＺ）併用治療による腫瘍体積の変化（Ｂ）および生存率分析での相乗的効果（Ｃ）を確認した結果を示す図である。

本発明は、１）間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）にシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＣＤ）を導入してＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、２）製造されたＭＳＣ／ＣＤを凍結し、凍結されたＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、３）凍結されたＭＳＣ／ＣＤを解凍し懸濁してＦ細胞を製造するステップと、を含むＦ細胞の製造方法を提供する。

本発明におけるＦ細胞の製造方法は、培養してから直ちに収穫して使用するシトシンデアミナーゼを発現する間葉系幹細胞（Ｉ細胞）と比較して増殖能には差がないにもかかわらず、５‐ＦＣとともに処理されたときに、非常に優れた腫瘍抑制効果を奏するだけでなく、他の抗癌剤との併用治療でも既存の抗癌剤併用投与の効果を上回る著しい相乗効果を誘導するＦ細胞を提供することができる。

本明細書において、「ＭＳＣ／ＣＤ」とは、間葉系幹細胞においてシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）が発現するように製造された間葉系幹細胞を意味し、かかるシトシンデアミナーゼが導入された間葉系幹細胞は、癌細胞に対して走向性を有して癌細胞の周辺に移動し、シトシンデアミナーゼを発現し続けて自ら細胞の死滅を誘導するだけでなく、抗癌剤の前駆薬物を活性抗癌剤に転換することで周辺癌細胞を死滅させる傍観者効果（Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）を示す細胞を意味する。ＭＳＣ／ＣＤは、細胞死滅が自ら誘導されることから所望としない継続した効果によって生じ得る副作用を低減することができ、癌細胞の周辺に移動して周辺癌細胞を死滅させることで効果的な抗癌剤として作用できる利点がある。特に、ＭＳＣ／ＣＤを凍結／解凍させて製造される細胞である「Ｆ細胞」は、既存の抗癌剤と併行治療して使用される場合、抗癌効果を著しく上昇させる相乗効果（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を示し、抗癌剤の効果を増進させるアジュバントとして活用され得る。

本発明における「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）」は、骨髄と臍帯血などから採取することができる幹細胞の一種であって、増殖が可能であり、特に、血液幹細胞とは異なり、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞といった様々な類型の細胞に分化され得るｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓを指す。したがって、本発明の間葉系幹細胞は、好ましくは、ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌであってもよい。

本発明における「シトシンデアミナーゼ」は、自殺遺伝子であって、人体に無害な前駆薬物を細胞毒性を有する抗癌物質に転換する働きをする遺伝子であり、特に、抗癌剤５‐ＦＵ（５‐ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）の前駆薬物である５‐ＦＣ（５‐ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）を５‐ＦＵに転換するものを指す。

かかる自殺遺伝子は、これを含む非ウイルスベクター、ウイルスベクターを用いる方法、または物理的方法のような当分野において公知の遺伝子の細胞内の導入技術方法によって間葉系幹細胞に導入され得る。かかる遺伝子伝達のための物理的方法の例としては、電気穿孔、ヒドロポレーション（Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、注射法などが挙げられ、非ウイルスベクターを用いた遺伝子導入の例としては、カチオン性脂質（Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ）、脂質ポリマー（ｌｉｐｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、ナノ粒子を用いた方法が挙げられ、ウイルス性ベクターは、複製可能ウイルス性ベクター、複製不可ウイルスベクターを制限なく含むことができ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、ハイブリッドアデノウイルスシステム（ｈｙｂｒｉｄ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒ ｖｉｒｕｓ）といったウイルス性ベクターを含むことができる。

例えば、本発明の一具現例では、自殺遺伝子をレトロウイルスベクターに挿入して発現ベクターを作製した後、このベクターをパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）細胞に形質導入し、形質導入されたパッケージング細胞を培養してから濾過してレトロウイルス溶液を取得し、これを用いて間葉系幹細胞を感染させることで間葉系幹細胞に自殺遺伝子を導入することができる。次いで、前記レトロウイルスベクターに含まれた選択マーカーを用いて自殺遺伝子を発現し続ける間葉系幹細胞を取得することができる。

また、間葉系幹細胞は、同種移植の際にも免疫拒絶反応が少ない細胞として知られていることから他人から分離した細胞を使用するか、または癌を有する患者自身から採取して使用してもよく、血液銀行のデータベースを用いてＨＬＡ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）タイプが類似した骨髄から分離して使用することで個体間の免疫拒絶反応をより最小化することができる。

本発明におけるＭＳＣ／ＣＤは、先ず分離した幹細胞に自殺遺伝子を導入してスクリーニングした後、これを試験管内で適切な条件で増殖および分化させて取得するか、幹細胞を充分に増殖させた後、これに自殺遺伝子を導入しこれを間葉系幹細胞で分化させて取得することができる。ＭＳＣ／ＣＤは、自殺遺伝子の存在によって治療を要する対象に注入された後、これに制限されないが、例えば、注入してから２〜３０日、好ましくは５〜１５日、さらに好ましくは５〜１０日が過ぎた後、自ら死滅して継続した作用によって誘導され得る副作用を減少することができる。

本発明における「Ｆ細胞（Ｆｒｏｚｅｎ ｃｅｌｌ、Ｆ ｃｅｌｌ）」は、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）が導入された間葉系幹細胞であるＭＳＣ／ＣＤを凍結し解凍した後、更なる培養ステップを経ていない細胞を意味し、解凍状態そのまま懸濁、あるいは懸濁および洗浄して治療しようとする対象に投与することを目的とする状態の細胞を定義する。より具体的には、Ｆ細胞は、間葉系幹細胞にシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）を導入してＭＳＣ／ＣＤを製造し、これを培養して凍結培地に冷凍保管した後、使用直前に室温でこれを解凍させて、例えば、これに制限されないが、ヒト血清アルブミンが含まれたプラズマソリューションＡなどで懸濁させた後、遠心分離して得られる細胞を意味する。本発明におけるＦ細胞と区別される細胞としてＭＳＣ／ＣＤに凍結解凍ステップを同様に行うが、その後に培養過程を経て濃度および活性を極大化し、培養中の細胞をすぐ収穫し使用する即時利用細胞、すなわち「ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｃｅｌｌ（Ｉ細胞）」が挙げられる。

本発明におけるＦ細胞は、Ｉ細胞と比較して通常活性化を極大化するために行う培養ステップを行わなかったにもかかわらず、コロニー形成能の増加なしに抗癌効果が増加した細胞であることを特徴とする。また、本発明におけるＦ細胞は、抗癌効果の増進とともに治療が必要な患者に直ちに投与できるという利点を有することができる。

本発明において冷凍または凍結状態で細胞を保管するものは、凍結保存液、凍結培地など細胞を凍結状態に保つための当分野において公知の手段を用いるものをいずれも含むことができ、例示的に、凍結のためのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、デキストラン、（ｄｅｘｔｒａｎ）、ヒト血清、ヒト血清アルブミン、ウシ血清、ウシ血清アルブミン、ｐｏｌｙ‐ｌ‐ｌｙｓｉｎｅ、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｅｔｈｙｌ‐ｓｔａｒｃｈ、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、およびパーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）といった冷凍保護剤を含む培地、かかる市販物質としてｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ２、ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（バイオライフソリューションズインコーポレイテッド（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．））が挙げられ、具体的には、ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ２、ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０、２〜１０％のＤＭＳＯ培地、より具体的には、２、５、１０％のＤＭＳＯ培地などを使用することができる。

本発明におけるＦ細胞は、Ｉ細胞と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ上のコロニー形成能が類似に示され、既存のＭＳＣ／ＣＤの傍観者効果もまた効果的に示される。また、Ｆ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでＩ細胞や対照群と比較して、２倍以上の脳腫瘍および皮下腫瘍を含む様々な腫瘍の抑制効果を示しており、既存の抗癌剤であるテモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ；ＴＭＺ）と併用治療したときに非常に上昇した抗癌効果を奏する効果を有することを特徴とする。すなわち、Ｆ細胞は、コロニー形成能にはＩ細胞と差がないにもかかわらず、製造方法に応じて付与されるＦ細胞の固有の活性によって他のＩ細胞などと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ上では予測することのできない著しい抗癌効果および抗癌剤アジュバントとしての効果を奏する利点がある。

すなわち、本発明におけるＦ細胞は、凍結後、培養ステップをさらに行わない製造方法で製造されることにより、通常使用されるＩ細胞と差別化することができる。

したがって、本発明は、前記Ｆ細胞が凍結後に細胞培養ステップを行わないことを特徴とするＦ細胞の製造方法を提供する。

本発明におけるＦ細胞は、癌治療に使用され得る癌治療用細胞である。Ｆ細胞は、用いて治療することができる癌、腫瘍として摘出可能なすべての癌腫に制限なく使用可能であり、抗癌剤投与を用いる化学的治療療法の前に、同時に、後に治療を要する対象に投与され得る。

前記癌は、例えば、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ、例えば、上皮の扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非‐小細胞肺癌、肺癌、腹膜癌、結腸癌、胆管腫瘍（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｕｍｏｒ）、鼻咽頭癌、喉頭癌、気管支癌、口腔癌、骨肉腫、胆嚢癌、腎臓癌、白血病、膀胱癌、黒色腫、脳癌、神経膠腫、脳腫瘍、皮膚癌、膵臓癌、乳癌、肝癌、骨髄癌、食道癌、大腸癌、胃癌、子宮頸癌、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌および直腸癌からなる群から選択される１種以上が好ましく、より好ましくは、脳腫瘍、膵臓癌、肝癌、肺癌、大腸癌、皮膚癌であってもよい。

また、本発明におけるＦ細胞は、抗癌用アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）であってもよい。抗癌用アジュバントとは、一次的な治療法、例えば、化学的治療法または外科的手術による癌治療と併用して処理されることで一次的治療法のより迅速な作用を誘発し、その抗癌作用が強力な補助剤を意味する。抗癌用アジュバントは、抗癌剤を用いる化学治療療法において、一次的に使用される主治療剤である抗癌剤の効果を増進させるために使用され得、外科的手術後に残存する癌細胞の処理により癌治療効果を極大化するように使用され得る。

前記Ｆ細胞は、癌治療に使用するための、または抗癌用アジュバントに使用するための組成物の形態で存在してもよく、かかる組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤を含んでもよい。特に好ましい注入形態は、組織または臓器に注入するに適する注射剤の形態に剤形化されたものが好ましい。

したがって、本発明は、Ｆ細胞を含む抗癌用アジュバントを提供する。

Ｆ細胞は、医者の処方に応じて、または当分野において広く知られた公知の方法により患者の生体内に注入されてもよく、１回投与量は、治療しようとする疾患、疾患の重度、投与経路、患者の体重、年齢および性別などの様々な関連因子を考慮して決定され得る。

また、本発明は、Ｆ細胞および５‐フルオロシトシン（５‐ＦＣ）を含む癌治療用キットを提供する。

癌治療用キットは、Ｆ細胞と５‐フルオロシトシン（５‐ＦＣ）の併用処理の目的のために製造されるものであり、治療を要する対象に前駆薬物である５‐フルオロシトシン（５‐ＦＣ）を投与する前、投与と同時に、投与した後にＦ細胞を注入するように製造されたキットを意味する。

前記癌治療用キットは、第１区画と第２区画からなってもよく、第１区画に癌治療または抗癌剤アジュバントとして作用するためのＦ細胞を含んでもよく、第２区画に５‐フルオロシトシン（５‐ＦＣ）を含んでもよい。前記キットは、便利性および携帯性を高めるために、それぞれ１回の投与量に分けて一つの容器内に含有するかまたは相違するいくつかの小容器内に含有してもよい。したがって、各容器内には配列方法に応じていくつかの小容器が存在し得る。本発明のキットは、必要に応じて、使用に必要な装備および各成分の投与方法を記載した指示資料などを含んでもよい。

また、本発明の癌治療用キットは、抗癌剤をさらに含んでもよい。前記抗癌剤は、当分野において知られた抗癌剤を制限なく含んでもよく、好ましくは、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ビスカムアルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・チウキセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシル、オテラシル、アザシチジン、シタラビン、フルダラビン、エノシタビン、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ミトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ぺプロマイシン、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、タキソテレ、グリベック、タキソール、ハーセプチン、タルセバ、アバスチン、ゾラデックス、アドリアマイシン、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、１００５８‐Ｆ４、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄ）、ニトロソウレア‐基盤抗癌剤、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）およびドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群から選択される１種以上であってもよい。ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）にはカルムスチン（Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）などが含まれる。前記抗癌剤は、癌治療用キットの第３区画に含まれ得る。

また、本発明は、１）間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）にシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＣＤ）を導入してＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、２）製造されたＭＳＣ／ＣＤを凍結し、凍結されたＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、３）凍結されたＭＳＣ／ＣＤを解凍し懸濁してＦ細胞を製造するステップと、４）前記Ｆ細胞を、治療を要する個体に投与するステップと、５）５‐フルオロシトシン（５‐ＦＣ）を、治療を要する個体に投与するステップと、を含む癌の予防または治療方法を提供する。

前記対象は、ヒトを含む哺乳類であることが好ましく、癌治療を要する患者として、癌治療中の患者、癌治療を受けた事がある患者、癌治療を受ける必要がある患者をいずれも含み、癌治療のために癌を摘出する外科的手術を施した患者も含まれ得る。

また、本発明は、前記治療方法に、６）抗癌剤を、治療を要する個体に投与するステップをさらに含む癌の予防または治療方法を提供する。

また、本発明は、４）ステップのＦ細胞の投与の前またはＦ細胞投与と同時に、抗癌剤を、治療を要する個体に投与するステップを含む癌の予防または治療方法を提供する。

すなわち、本発明は、Ｆ細胞と抗癌剤を抗癌治療を要する個体に同時に投与するか、順次に、例えば、Ｆ細胞投与後の抗癌剤の投与、抗癌剤の投与後のＦ細胞が投与する方法をいずれも含む癌の予防または治療方法を提供する。

前記抗癌剤は、当分野に知られた抗癌剤を制限なく含んでもよく、好ましくは、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ビスカムアルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・チウキセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシル、オテラシル、アザシチジン、シタラビン、フルダラビン、エノシタビン、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ミトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ぺプロマイシン、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、タキソテレ、グリベック、タキソール、ハーセプチン、タルセバ、アバスチン、ゾラデックス、アドリアマイシン、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、１００５８‐Ｆ４、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄ）、ニトロソウレア‐基盤抗癌剤、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）およびドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群から選択される１種以上であってもよい。ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）にはカルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ、ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ、ＣＣＮＵ）などが含まれる。前記抗癌剤は当分野に広く知られた抗癌剤の処方容量に応じて適宜選択的に処方され得るが、本発明におけるＦ細胞との相乗効果を考慮して平均的な処方容量より少ない容量で処方されてもよい。

本発明におけるＦ細胞と５‐フルオロシトシンは、互いに同時にまたは時間差を置いて順次に投与されてもよく、Ｆ細胞によって５‐フルオロシトシンが５‐フルオロウラシル（５‐ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）に転換されるに適する時間および周期に応じて選択され得る。

したがって、本発明は、前記４）ステップのＦ細胞と５）ステップの５‐フルオロシトシンは、同時にまたは順次に投与されることを特徴とする、癌の予防または治療方法を提供する。

また、本発明における５‐フルオロシトシンと併用して使用される抗癌剤は、互いに同時にまたは時間差を置いて順次に投与されてもよく、適切な時間および周期に応じて選択されてもよい。

したがって、本発明は、前記５）ステップの５‐フルオロシトシンと６）ステップの抗癌剤は、同時にまたは順次に投与されることを特徴とする、癌の予防または治療方法を提供する。

本発明において順次に投与とは、投与される複数個の成分が時間差を置いて個体に投与されることを意味し、有効成分それぞれの手順が適宜調節されてもよい。

前記Ｆ細胞は、対象の腫瘍箇所に薬学的に有効な量で伝達されてもよく、伝達はこれに制限されるものではないが、注射液の形態によるものが好ましい。特に前記注射液は、哺乳類対象、好ましくはヒト患者投与用であることがさらに好ましい。

前記Ｆ細胞は、ＭＳＣ／ＣＤを凍結、解凍または解凍および洗浄し直ちに使用する細胞であり、細胞死滅効果を有しており、自殺効果によって対象体内で所定の時間、好ましい一例として注入５〜１５日後に死滅し得るため、継続した治療を繰り返すために繰り返し投与してもよい。また、前記５‐ＦＣ、抗癌剤は、治療目的、患者の状態に応じて繰り返し投与されてもよい。かかるＦ細胞、５‐ＦＣ、抗癌剤の繰り返し投与の周期は、患者の治療状態に応じて適宜調節されてもよく、好ましくは、１０日〜３０日の単位で繰り返し投与することができる。例えば、ＭＳＣ／ＣＤの細胞死滅を考慮すると、最小１０日経過後に繰り返し投与することが好ましく、当該細胞が注射器で注入されることを考慮すると、３０日単位で繰り返し投与することもまた好ましい。

したがって、本発明は、前記４）ステップのＦ細胞の投与は１０日〜３０日の周期に繰り返して行わることを特徴とする、癌の予防または治療方法を提供する。

Ｆ細胞の投与周期の繰り返しによって、５‐フルオロシトシンも周期的に繰り返し投与されてもよく、選択的に併用投与のための抗癌剤も周期的に繰り返し投与されてもよい。

本発明における癌の予防または治療方法において、Ｆ細胞は、用いて治療することができる癌、腫瘍として摘出可能なすべての癌腫に制限なく使用可能であり、抗癌剤投与を用いる化学的治療療法の前に、同時に、後に治療を要する対象に投与することができる。前記癌は、例えば、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ、例えば、上皮の扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非‐小細胞肺癌、肺癌、腹膜癌、結腸癌、胆管腫瘍（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｕｍｏｒ）、鼻咽頭癌、喉頭癌、気管支癌、口腔癌、骨肉腫、胆嚢癌、腎臓癌、白血病、膀胱癌、黒色腫、脳癌、神経膠腫、脳腫瘍、皮膚癌、膵臓癌、乳癌、肝癌、骨髄癌、食道癌、大腸癌、胃癌、子宮頸癌、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌および直腸癌からなる群から選択される１種以上が好ましく、より好ましくは、脳腫瘍、膵臓癌、肝癌、肺癌、大腸癌、皮膚癌であってもよい。

以下、本発明の理解を容易にするために、好ましい製造例および実施例を提示する。しかし、下記の製造例および実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるだけであって、製造例および実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

製造例１．シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）発現間葉系幹細胞の製造
１．１ 間葉系幹細胞の分離および培養
亜洲大学校医療院のＩＲＢ審査後、供与を受けたヒト骨髄４ｍｌを滅菌した１５ｍｌ試験管で４ｍｌのヒストパック（ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ）１０７７（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にオーバレイした後、遠心分離機を用いて室温で４００ｘｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、パスツールピペットを用いて中間のバフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）０．５ｍｌを注意深く採取し、滅菌したリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）１０ｍｌで満たされた試験管に移した。また、２５０ｘｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を捨て、１０ｍｌのリン酸塩緩衝溶液を加えてスムーズに懸濁させた後、１０分間２５０ｘｇで遠心分離した。この過程を２回繰り返し実施した後、最終沈殿物を１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）が添加されたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に加えて、１００ｍｍ動物細胞培養用容器に１×１０^９細胞になるように分注した。培養容器を培養器に入れて３７℃で５％二酸化炭素および９５％空気を供給しながら４時間培養した。次いで、培養容器の底部にくっついていない細胞を除去するために上澄み液を除去し、新たな培地を添加して培養器で培養した。

分離した間葉系幹細胞をＣＯ_２培養器で３７℃を維持しながら間葉系幹細胞培地［１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）＋１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）＋８９％ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）］で培養した。二日置きに培地を交換しながら細胞を培養して、培養容器が約８０％程度細胞で満たされると、０．２５％トリプシン／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて細胞を分離した後、約８００〜１，１０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるように、あるいは培地で１：１０〜１：２０に希釈した後、新たな培養容器で継代培養した。細胞の一部は２‐１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、２、５、１０％）が添加された凍結培地を用いて凍結保管した。

１．２ シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）含有レトロウイルスの作製
自殺遺伝子であるシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ；以下、ＣＤ）を発現するレトロウイルスを作製した。より具体的には、以下のとおりである。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ‐１２ ＭＧ１６５５（韓国生命工学研究院）からＤＮＡを分離した後、プライマーＣＤ‐Ｆ（５'‐ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＧＧ ＣＴＡ ＧＣＡ ＡＴＧ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＴＡ ＡＣＧ ＣＴＴ ＴＡＣ ＡＡＡ Ｃ‐３'）とＣＤ‐Ｒ（５'‐ＧＧＡＴＴＣ ＴＣＴ ＡＧＣ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＣＣ ＧＣ‐３'）を用いて、９４℃で５分；９４℃で３０秒、６０℃で４０秒、７２℃で１分、２７サイクル；７２℃で７分の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ‐Ｔ Ｅａｓｙベクタークローニングキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてクローニングした後、Ｘ‐ｇａｌ（５‐ｂｒｏｍｏ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｙl‐β‐Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）とＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β‐Ｄ‐１‐ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて青白色コロニー（ｂｌｕｅ‐ｗｈｉｔｅ ｃｏｌｏｎｙ）のスクリーニングによりＣＤ遺伝子が入っているｐＧＥＭ‐ＣＤベクターを作製した。得られたＣＤ遺伝子は、配列分析により塩基配列がＧｅｎｅＢａｎｋのｇｉ：２９８５９４と一致することを確認した。作製されたｐＧＥＭ‐ＣＤプラスミドとｐｃＤＮＡ３．１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をそれぞれＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断し、プラスミドｐＧＥＭ‐ＣＤから分離されたＣＤ遺伝子と切断されたプラスミドｐｃＤＮＡ３．１をＴ４ ＤＮＡ連結酵素で連結した後、これを用いてコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞である大腸菌ＤＨ５αを形質転換させて５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが含まれたＬＢプレートで培養、選別してプラスミドｐｃＤＮＡ３．１‐ＣＤを取得した。このプラスミドをＢａｍＨ Ｉ制限酵素で切断し、レトロウイルスを生産できるレトロウイルスベクターに導入した。取得したプラスミドをＣｓＣｌ‐超高速遠心分離機で分離した後、カルシウムホスフェート沈殿法（Ｊｏｒｄａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、５９６‐６０１（１９９６））でレトロウイルスパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）細胞株であるＦＬＹＲＤ１８細胞に形質導入した後、培養器に入れて３７℃で５％二酸化炭素および９５％空気を供給しながら培養した。４８時間の経過後、培養液のみを取得し０．４５μｍ濾過膜で濾過してレトロウイルス溶液を取得した。レトロウイルス溶液は分注し、−７０℃で保管しながら使用した。

１．３ ＣＤ遺伝子が導入された間葉系幹細胞の製造
前記１．１で分離培養された間葉系幹細胞に１．２で製造されたＣＤ含有レトロウイルスを用いてＣＤ遺伝子を導入させた。より具体的には、間葉系幹細胞を１００ｍｍ培養容器に７０％程度満たされるように培養した後、レトロウイルス溶液３ｍｌと新鮮な間葉系幹細胞培地３ｍｌおよび４μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加して８時間培養した。次いで、ウイルス溶液を除去して１６時間１０ｍlの間葉系幹細胞培地を加えて培養した後、またレトロウイルスで感染させた。この過程を１〜３回行った後、最終的に間葉系幹細胞をトリプシンで剥離し、培地で１：２０希釈して継代培養した。継代培養の際、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を２μｇ／ｍｌになるように培地に添加してレトロウイルスが感染された細胞だけが生き残るように２週間スクリーニングし、最終的に自殺遺伝子であるＣＤを発現し続ける間葉系幹細胞株（以下、ＭＳＣ／ＣＤ）を作製した。

実施例１．ＭＳＣ／ＣＤの細胞死滅および傍観者効果
１．１ 細胞死滅効果の確認
シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は、自殺遺伝子であり、これを発現する間葉系幹細胞であるＭＳＣ／ＣＤは、図１に図式化したように、前駆薬物であるフルオロシトシン（５‐ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ；以下、５‐ＦＣ）をフルオロウラシル（５‐ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ；以下、５‐ＦＵ）に転換し、自分自身も死滅する自殺効果と、周辺細胞を死滅する傍観者効果を有し得る。したがって、前記１．３で製造されたＭＳＣ／ＣＤの細胞死滅効果および傍観者効果を確認した。先ず、１０，０００個のＭＳＣ／ＣＤあるいは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を１２‐ウェルプレートで培養した。翌日から前駆薬物５‐ＦＣを０‐１，０００μＭの濃度で処理し、二日に一回薬物が含まれた新たな培地に変えた。５‐ＦＣを処理して６日目に生きている細胞を測定することができるＭＴＴ（３‐（４，５‐ｄｉｍｅｔｈｙｌ‐ｔｈｉａｚｏｌ‐２‐ｙｌ）‐２，５‐ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）が、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で含まれた細胞培養培地に変えて２時間３７℃で反応させた後、ＭＴＴ溶液を除去した。５００μｌのＤＭＳＯを各ウェルに入れて発色反応をさせた後、９６‐ウェルプレートに移してＥＬＩＳＡリーダー（Ｅ‐ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ社製）で５４０ｎｍで吸光度を測定した。実験方法の模式図およびその結果を図２に示す。

図２に示すように、ＭＳＣ／ＣＤは、前駆薬物である５‐ＦＣの濃度が増加するほど生きている細胞が減少する自殺効果があることを確認し、５０％の細胞死滅を誘導するＩＣ_５０は６０．４μＭであった。対照群である間葉系幹細胞の場合には、５‐ＦＣの濃度が増加しても細胞が死滅せず細胞自殺効果がないことを確認した。

１．２ 傍観者効果（Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）
１０，０００個のＧＦＰを発現するＵ８７ＭＧ（韓国細胞株銀行ＫＣＬＢＮｏ．３００１４）神経膠腫細胞と１０，０００個のＭＳＣ／ＣＤあるいは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を１２‐ウェルプレートで培養した。翌日から前駆薬物５‐ＦＣを０〜１，０００μＭの濃度で処理して二日に一回薬物が含まれた新たな培地に変えた後、６日後に細胞を取得した。かかる実験方法を図３のＡに簡単に示す。

以降、解剖蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いてウェル全体に残っているＧＦＰを発現するＵ８７ＭＧの蛍光イメージ写真を撮った。蛍光写真を撮った後、１×パッシブライシスバッファー（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２００μｌ入れて１０分間氷上に放置した後、細胞溶解物をＥ‐ｔｕｂｅに移して１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液を新たな容器に移した。このうち１００μｌを黒色の９６‐ウェルプレートに移した後、フルオロミト（ＧＥＭＩＮＩ ＥＭ、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いてｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８８ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ５３０ｎｍの条件で蛍光の程度を測定した。結果を図３のＢ、Ｃに示す。

図３のＢ、Ｃに示すように、ＭＳＣ／ＣＤとともに培養されたＵ８７ＭＧは、５‐ＦＣの濃度が高くなるにつれて蛍光を発現する細胞の数が減少し蛍光の強度が著しく減少したが、ＣＤを発現しない間葉系幹細胞とともに培養されたＵ８７ＭＧは蛍光発現細胞数および蛍光強度が５‐ＦＣ濃度に応じてそれほど差を示さなかった。この際、５０％の細胞死滅を誘導するＩＣ_５０は５０．４８μＭであった。かかる結果は、ＣＤが導入された間葉系幹細胞であるＭＳＣ／ＣＤが細胞自殺効果だけでなく、周辺の細胞もともに死滅する傍観者効果を奏することを示した。

製造例２．「Ｉ細胞」および「Ｆ細胞」の製造
細胞治療剤の場合、様々な条件による細胞の状態変化に応じてその効果が異なり得る。したがって、ＭＳＣ／ＣＤの状態に応じて細胞の能力が変化するか否かを確認するために、凍結後に直ちに解凍した状態の細胞（以下、「Ｆ細胞（ｆｒｏｚｅｎ ｃｅｌｌ）」）および培養中の細胞をすぐ収穫した状態の細胞（以下、「Ｉ細胞（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｃｅｌｌ）」を製造した。

Ｆ細胞とＩ細胞をそれぞれ製造するためにＭＳＣ／ＣＤを培養した後、２〜１０％（２、５、１０％）ＤＭＳＯが含有された凍結培地１ｍｌに２×１０^６細胞ずつ分注したり、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）１ｍｌに２×１０^６細胞ずつ分注して凍結した後、液体窒素筒で保管した。先ず、ＭＳＣ／ＣＤの「Ｉ細胞」を取得するために、ｐａｓｓａｇｅ５の細胞を３７℃で溶解して９ｍｌの培養培地に細胞を入れた後、５００ｇで５分間遠心分離して上澄み液を除去した後、沈殿された細胞を培養液に懸濁して１５０ｍｍ培養容器に分注した。翌日、１．５×１０^５細胞を１５０ｍｍ培養容器に移した後、二日に一回新たな培地に変えて６日後に細胞を収去し、ｐａｓｓａｇｅ ６に相当する「Ｉ細胞」を準備した。

「Ｆ細胞」を取得するためにｐａｓｓａｇｅ ６で摂氏−１３０度以下で凍結保管されたＭＳＣ／ＣＤを３７℃で溶解して９ｍｌのヒト血清アルブミンが含まれたプラズマソリューションＡ（ＣＪ社製）に懸濁した後、５００ｘｇで５分間遠心分離するか、生理食塩水に最終７．５％デキストラン、‐４０（大韓薬品工業製）と５％ヒト血清アルブミン（緑十字製）が含まれた溶液に懸濁した後、８００ｘｇで１０分間遠心分離した。以降、上澄み液を除去した後、沈殿された細胞を培養培地に懸濁して使用した。すなわち、Ｆ細胞は、凍結解凍後に培養ステップを行わない状態の細胞である。脳に移植する前にＩ細胞とＦ細胞をそれぞれ２回洗浄して使用した。

実施例１．Ｆ細胞の傍観者効果およびコロニーの形成
１．１．Ｆ細胞の傍観者効果
Ｆ細胞がＭＳＣ／ＣＤの傍観者効果を正常に示すことができるか否かおよびかかる傍観者効果が培地の種類のような製造方法と関係なく効果的に示されるか否かを確認するための実験を行った。製造例２の方法によって製造されたＩ細胞と、１０％ＤＭＳＯ凍結培地で製造されたＦ細胞（ＤＭＳＯ）およびＣｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０で製造されたＦ細胞（ＣＳ１０）１０，０００個をプラズマソリューションＡで洗浄した後、韓国細胞株銀行から供与を受けたＵ８７ＭＧ（ＫＣＬＢ Ｎｏ．３００１４）に蛍光を発現するようにＧＦＰ遺伝子を移入させた神経膠腫Ｕ８７／ＧＦＰ細胞とともに１２‐ウェルプレートで共培養した。翌日から前駆薬物である５‐ＦＣを０〜１，０００μＭの濃度で処理して二日に一回薬物が含まれた新たな培地に変えた後、６日後に細胞を取得した。１×パッシブライシスバッファー（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２００μｌ入れて１０分間氷上に放置した後、細胞溶解物をＥ‐ｔｕｂｅに移して１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離後上澄み液を新たな容器に移した。このうち１００μｌを光が遮断される黒色の９６‐ウェルプレートに移した後、フルオロミト（ＧＥＭＩＮＩＥＭ、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いてｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８８ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ ５３０ｎｍの条件で蛍光の程度を測定した。かかる実験過程の模式図および傍観者効果を図４に示す。

図４に示すように、細胞死滅を５０％起こす濃度であるＩＣ_５０値がＩ細胞は６０．４μＭ、１０％ＤＭＳＯ凍結培地で製造されたＦ細胞（ＤＭＳＯ）は５６．２μＭ、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０で製造されたＦ細胞（ＣＳ１０）は５５．４μＭと示された。かかる結果はＦ細胞がＩ細胞より傍観者効果を効果的に示すことができる細胞であることを示し、これによりＦ細胞がＤＭＳＯ培地またはＣＳ１０培地を使用した製造方法と関係なくＩ細胞より優れた傍観者効果を奏するということを確認した。

したがって、以下では、製造例２で製造されたＦ細胞のうち１０％ＤＭＳＯ凍結培地で製造されたＦ細胞（ＤＭＳＯ）を用いた。

１．２．Ｆ細胞のコロニー形成の効果
前記製造例２のように凍結および解凍により製造されたＦ細胞がＩ細胞と比較して増殖能の差を示すか否かを確認するために、コロニー形成能（Ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ ａｓｓａｙ）を確認した。製造例２のように製造され、同じｐａｓｓａｇｅに相当するＩ細胞と１０％ＤＭＳＯ凍結培地により製造されたＦ細胞をＣｏｕｎｔｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に計数した後、細胞１００個ずつ１００ｍｍ培養容器に入れて二日に一回新たな培地に変えて培養した。２週後１０％ホルマリン（ｆｏｒｍａｌｉｎ）で１０分間固定してリン酸塩緩衝液（Ｇｉｂｃｏ社製）で洗浄した後、クリスタルバイオレット溶液（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で１０分間染色して水で３回洗浄した後、Ｖｅｒｓａ ｄｏｃ（ＢｉｏＲａｄ社製）でイメージを取得しており、細胞一つが２週間生育して生成されたコロニーを目視で計数した結果を図５に示す。

図５に示すように、Ｉ細胞とＦ細胞は、コロニー形成能に差がないことが確認された。かかる結果により、Ｉ細胞に比べて増加したＦ細胞の傍観者効果がコロニー形成の増加のような細胞数の増加によって起因するものではなく、Ｆ細胞自体がＩ細胞より優れた傍観者効果を奏するということを確認した。

実施例２．Ｆ細胞の抗癌効果
２．１．脳腫瘍に対するＦ細胞の抗癌効果
Ｆ細胞の脳腫瘍に対する抗癌効果を確認するために、脳腫瘍同所移植モデル（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｇｌｉｏｍａ ｍｏｄｅｌ）を作製した。先ず、生後７週の免疫不全ヌードマウス（中央実験動物）を麻酔させた後、マウスフレーム（ｓｔｅｒｏｔａｘｉｃ ｆｒａｍｅ）に口と耳を固定させた。切開する頭部分を７０％エタノールで消毒し、頭頂部を０．５ｃｍ程度に垂直切開した。ＬａｃＺを発現させたＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞３×１０^５／３μｌを脳の座標ＡＰ＝＋０．５ｍｍ、ＭＬ＝‐１．８ｍｍ、ＤＶ＝‐３ｍｍである点に０．３μｌ／分の速度で移植して脳腫瘍同所移植モデルを作製した。ＬａｃＺを発現するＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞を移植してから３日後、製造例２で製造されたＦ細胞をプラズマソリューションＡ溶液に懸濁させた後、５００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を捨て洗浄過程を１回または２回繰り返した後、３×１０^５／６μｌ濃度になるように準備した。これを脳の座標ＡＰ＝＋０．５ｍｍ、ＭＬ＝‐１．８ｍｍ、ＤＶ＝‐３ｍｍである点に０．３μｌ／分の速度で移植した。細胞移植翌日から５‐ＦＣ（１５ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を５００ｍｇ／ｋｇの容量で一週間腹腔内注射した。Ｆ細胞の抗癌効果と比較するために製造例２で製造されたＩ細胞を同じ方法で移植して細胞移植翌日から５‐ＦＣ（１５ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を５００ｍｇ／ｋｇの容量で一週間腹腔内注射した。

神経膠腫細胞の移植後、２８日目になる日に動物を麻酔した状態で左心室に注射針を挿入して生理食塩水で貫流洗浄した後、１０％ホルマリン溶液で貫流固定した。脳を摘出してマウスマトリックス（ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｍａｔｒｉｘ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社製）に固定した後、１ｍｍの間隔で横切断し、同じ固定液に浸漬して３０分間固定した。脳切片をリン酸塩緩衝液で３回洗浄した後、２０ｍｇ／ｍｌ Ｘ‐ｇａｌ（５‐ｂｒｏｍｏ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｙｌ‐β‐Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、Ｋｏｍａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、５ｍＭのカリウムフェロシアニド／フェリシアニド（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０２％ＮＰ４０が含有されたリン酸塩緩衝液に浸漬した後、３７℃で１６時間反応させた。解剖顕微鏡により脳腫瘍のイメージを取得しており、ｉｍａｇｅ ｊ（ＮＩＨ）プログラムと以下の数式を使用して腫瘍のサイズを計算し、その結果を図６に示す。

図６に示すように、脳腫瘍の体積が、Ｆ細胞を移植した処理群で著しく減少し、Ｉ細胞よりもさらに優れた効果を奏する（Ｂ）。計算された腫瘍の平均サイズはビヒクル対照群で９１．３ｍｍ^３、Ｉ細胞移植比較群で１．５ｍｍ^３に示されたが、Ｆ細胞の移植を受けた動物群では０．６ｍｍ^３と確認された。すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ結果によると、ＭＳＣ／ＣＤの中でもＦ細胞がＩ細胞より腫瘍を減少させる効果が２倍以上大きいことが確認され、Ｆ細胞がさらに効果的な抗癌治療剤になり得ることが分かる。

２．２．肝癌に対するＦ細胞の抗癌効果
１×１０^５のＨｕｈ７肝癌細胞（Ｌｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ、Ｈｕｈ７、ＫＣＬＢ Ｎｏ．６０１０４）、２０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ社製）が含有されたリン酸塩緩衝液１００μｌに懸濁して、生後７週齢の免疫不全ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ）の皮下に移植した。移植して１４日後、腫瘍のサイズが１０〜１００ｍｍ^３になったときに、製造例２で製造されたＩ細胞とＦ細胞を注入した。より具体的には、製造例２で製造されたＩ細胞とＦ細胞をリン酸塩緩衝液に懸濁させた後、５００ｘｇで５分間遠心分離した。この過程を２回繰り返した後、リン酸塩緩衝液に１×１０^６／１００μｌになるように準備した後、注射器を使用してＩまたはＦ細胞を腫瘍に直接注入した。Ｉ細胞とＦ細胞を注入した翌日から７日間、５‐ＦＣ（１５ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を５００ｍｇ／ｋｇの容量で一週間腹腔内注射した。毎週、デジタル測定器（ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて１〜２回腫瘍のサイズを測定し、以下の数式を使用して腫瘍の体積を計算し、その結果を図７に示す。

皮下腫瘍体積（ｍｍ^３）＝横（ｍｍ）×縦（ｍｍ）×高さ（ｍｍ）÷６

［Ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ測定参考文献Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９８９）２４：１４８‐１５４］
図７のＡに示すように、腫瘍の体積はＦ細胞を処理した実験群でさらに効果的に減少し、Ｉ細胞よりＦ細胞がさらに優れた抗癌効果を奏するということを確認し、かかる増加した抗癌効果は、図７のＢのように肝癌細胞で作製した皮下腫瘍モデルから目視でも確認され、Ｆ細胞の治療効果に非常に優れていることを確認した（＊、ｐ＜０．０５ ＰＢＳ群との比較時）。

２．３．膵臓癌に対するＦ細胞の抗癌効果
ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ、ＢｘＰＣ３、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ‐１６８７^ＴＭ）は、成長速度が速く潰瘍がひどいため、１×１０^６ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞とＩ細胞とＦ細胞を同時に注入した。より具体的には、製造例２で製造されたＩ細胞とＦ細胞をリン酸塩緩衝液に懸濁させた後、５００ｘｇで５分間遠心分離した。この過程を２回繰り返した後、リン酸塩緩衝液に１×１０^６／１００μｌになるように準備した後、１×１０^６Ｉ細胞またはＦ細胞を２０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ社製）が含有されたリン酸塩緩衝液１００μｌに懸濁し、生後７週齢の免疫不全ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ）の皮下に同時移植した。細胞を注入した翌日から７日間、５‐ＦＣ（１５ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を５００ｍｇ／ｋｇの容量で一週間腹腔内注射した。

腫瘍体積の測定は、実施例２．２と同様に行っており、測定した腫瘍体積の変化を図８のＡに示す。

図８のＡに示すように、腫瘍の体積は、Ｆ細胞を処理した実験群でさらに効果的に減少し、Ｉ細胞よりＦ細胞がさらに優れた抗癌効果を奏するということを確認し、膵臓癌皮下腫瘍モデルで治療効果に優れていることを確認した（＊、ｐ＜０．０５ＰＢＳ群との比較時）。

２．４．肺癌に対するＦ細胞の抗癌効果
５×１０^６のＡ５４９肺癌細胞（Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ、Ａ５４９、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ‐１８５^ＴＭ）を２０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ社製）が含有されたリン酸塩緩衝液１００μｌに懸濁し、生後７週齢の免疫不全ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ）の皮下に移植した。移植してから８日後、２０〜５０ｍｍ^３の腫瘍サイズになったときに、製造例２で製造されたＩ細胞とＦ細胞を注入した。より具体的には、製造例２で製造されたＩ細胞とＦ細胞をリン酸塩緩衝液に懸濁させた後、５００ｘｇで５分間遠心分離した。

この過程を２回繰り返した後、リン酸塩緩衝液に１×１０^６／１００μｌになるように準備した後、注射器を使用して腫瘍に直接注入した。Ｉ細胞とＦ細胞を注入した翌日から７日間、５‐ＦＣ（１５ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を５００ｍｇ／ｋｇの容量で一週間腹腔内注射した。腫瘍体積の測定は、実施例２．２と同様に行っており、測定した腫瘍体積の変化を図８のＢに示す。

図８のＢに示すように、腫瘍の体積は、Ｆ細胞を処理した実験群でさらに効果的に減少し、Ｉ細胞よりＦ細胞がさらに優れた抗癌効果を奏するということを確認し、肺癌皮下腫瘍モデルで治療効果に優れていることを確認した（＊、ｐ＜０．０５ＰＢＳ群との比較時）。

２．５．大腸癌に対するＦ細胞の抗癌効果
５×１０^６のＨＴ２９大腸癌細胞（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ、ＨＴ２９、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ‐３８^ＴＭ）を２０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ社製）が含有されたリン酸塩緩衝液１００μｌに懸濁し、生後７週齢の免疫不全ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ）の皮下に移植した。移植してから、腫瘍サイズが４０〜１００ｍｍ^３になったときに、製造例２で製造されたＩ細胞とＦ細胞を注入した。より具体的には、製造例２で製造されたＩ細胞とＦ細胞をリン酸塩緩衝液に懸濁させた後、５００ｘｇで５分間遠心分離した。

この過程を２回繰り返した後、リン酸塩緩衝液に１×１０^６／１００μｌになるように準備した後、注射器を使用して腫瘍に直接注入した。Ｉ細胞とＦ細胞を注入した翌日から７日間、５‐ＦＣ（１５ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を５００ｍｇ／ｋｇの容量で一週間腹腔内注射した。腫瘍体積の測定は、実施例２．２と同様に行っており、測定した腫瘍体積の変化を図８のＣに示す。

図８のＣに示すように、腫瘍の体積は、Ｆ細胞を処理した実験群でさらに効果的に減少し、Ｉ細胞よりＦ細胞がさらに優れた抗癌効果を奏するということを確認し、大腸癌皮下腫瘍モデルで治療効果に優れていることを確認した（＊、ｐ＜０．０５ＰＢＳ群との比較時；＃、ｐ＜０．０５Ｉ細胞群との比較時）。

前記のような結果により、Ｆ細胞が脳腫瘍、肝癌、肺癌、大腸癌のような各種の癌で効果的な抗癌効果を奏するだけでなく、特にすべての癌腫でＩ細胞よりも優れた抗癌効果を奏することができるということを確認した。

実施例３．Ｆ細胞の併用治療の相乗効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
３．１ テモゾロミドとのｉｎ ｖｉｔｒｏ併用治療の効果
１０，０００個のＧＦＰを発現するＵ８７ＭＧ（韓国細胞株銀行ＫＣＬＢＮｏ．３００１４）神経膠腫細胞と、１０，０００個のＦ細胞あるいは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を１２‐ウェルプレートで培養した。翌日からテモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ；ＴＭＺ）０‐１０００μＭと前駆薬物５‐ＦＣを０‐１，０００μＭの濃度で処理し、二日に一回薬物が含まれた新たな培地に変えた後、６日後に細胞を取得した。本実験の模式図を図９のＡに示す。解剖蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いてウェル全体に残っているＧＦＰを発現するＵ８７ＭＧの蛍光イメージ写真を撮り、細胞死滅を確認し結果を図９のＤに示す。

図９のＤに示すように、テモゾロミドの処理濃度の増加と５‐ＦＣ処理濃度の増加によって蛍光発現が減少し、Ｆ細胞の傍観者効果がテモゾロミドとの併用投与により上昇するということが確認された。

蛍光写真を撮った後、１×パッシブライシスバッファー（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２００μｌ入れて１０分間氷上に放置した後、細胞溶解物をＥ−ｔｕｂｅに移して１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を新たな容器に移した。このうち、１００μｌを黒色の９６‐ウェルプレートに移した後、フルオロミト（ＧＥＭＩＮＩ ＥＭ、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いてｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８８ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ５３０ｎｍの条件で蛍光の強度を測定した（図９のＢおよびＣ）。２種の抗癌剤を同時に処理して取得した実際ＩＣ_５０値をアイソボログラム（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ）で表示した。アイソボログラムで単独処理した時のＩＣ_５０値を連結した実線は、ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｌｉｎｅとして、二つの抗癌剤を同時に処理して取得した値が実線にあると、単純に加算効果（ａｄｄｉｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ）があることを意味する。一方、その値が実線よりも下側に存在すると、相乗効果（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が、反対に実線よりも上側に存在すると拮抗効果（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）があることを示す。結果を図９のＥに示す。

図９のＥに示すように、ＭＳＣ／ＣＤに５‐ＦＣとテモゾロミドを併用処理したときに、表示された点は、いずれも単独処理ＩＣ_５０値と比較して下側に存在することで、単純に二つの抗癌剤を同時に処理した効果を合わせた加算効果よりもさらに優れた相乗効果があることを確認した。

３．２ カルムスチン（ＢＣＮＵ）とのｉｎ ｖｉｔｒｏ併用治療の効果
ＧＦＰを発現させたＵ８７ＭＧ（韓国細胞株銀行ＫＣＬＢＮｏ．３００１４）神経膠腫細胞であるＵ８７／ＧＦＰ１０，０００個とＦ細胞（ＭＳＣ／ＣＤ）１０，０００個を１２‐ウェルプレートで培養した。翌日からカルムスチン（Ｃａｒｍｕｓｔｉｎ、ＢＣＮＵ、Ｓｉｇｍａ社製）０〜３００μＭと前駆薬物５‐ＦＣを０〜３００μＭの濃度で処理し、二日に一回薬物が含まれた新たな培地に変えながら６日間培養した。７日目になる日に培養液を除去した後、各ウェルに１×パッシブライシスバッファー（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２００μｌ入れて１０分間４℃で放置した。細胞溶解物を収去して１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を取得した。このうち１００μｌを光が遮断された黒色の９６‐ウェルプレートに移し、蛍光測定器（ＧＥＭＩＮＩ ＥＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いてｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８８ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ５３０ｎｍの条件で蛍光の強度を測定した。本実験の模式図を図１０のＡに示す。

２種の抗癌剤を同時に処理して取得した実際のＩＣ_５０値をアイソボログラム（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ）で表示し、その結果を図１０のＢに示す。

図１０のＢに示すように、Ｕ８７／ＧＦＰに［Ｆ細胞（ＭＳＣ／ＣＤ）＋５‐ＦＣ］とカルムスチンを併用処理したときに取得した点は、単独処理ＩＣ５０値と比較して実線の下側に存在することで、単純に二つの抗癌剤を同時に処理した効果を合わせた加算効果よりもさらに優れた相乗効果があることを確認した。

３．３ イリノテカンとのｉｎ ｖｉｔｒｏ併用治療の効果
Ｕ８７／ＧＦＰ１０，０００個とＦ細胞（ＭＳＣ／ＣＤ）１０，０００個を１２‐ウェルプレートで培養した。翌日からイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、Ｓｉｇｍａ社製）０〜３０μＭと前駆薬物５‐ＦＣを０〜３００μＭの濃度で処理し、二日に一回薬物が含まれた新たな培地に変えながら６日間培養した。７日目になる日に培養液を除去した後、各ウェルに１×パッシブライシスバッファーを２００μｌを入れて１０分間４℃で放置した。細胞溶解物を収去し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を取得した。このうち１００μｌを光が遮断された黒色の９６‐ウェルプレートに移し、蛍光測定器（ＧＥＭＩＮＩ ＥＭ）を用いてｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８８ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ５３０ｎｍの条件で蛍光の強度を測定した。２種の抗癌剤を同時に処理して取得した実際のＩＣ_５０値をアイソボログラム（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ）で表示し、その結果を図１０のＣに示す。

図１０のＣに示すように、アイソボログラムでイリノテカンを単独処理したときのＩＣ_５０値は、３．２μＭ、５‐ＦＣの場合に７３．６μＭであり、これを連結して単純加算効果を意味する実線（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｌｉｎｅ）を求めた。Ｕ８７／ＧＦＰに［Ｆ細胞（ＭＳＣ／ＣＤ）＋５‐ＦＣ］とイリノテカンを併用処理したときに取得したＩＣ_５０値は単独処理した時に取得したＩＣ_５０値と比較して実線の下側に存在することで、単純に二つの抗癌剤を同時に処理した効果を合わせたよりもさらに優れた相乗効果があることを確認した。

テモゾロミド、カルムスチン、イリノテカンは、いずれも増殖する細胞に作用する抗癌剤として知られており、万が一Ｕ８７／ＧＦＰ細胞だけでなく、増殖するＦ細胞の生存にも影響を与えることになると、［Ｆ細胞（ＭＳＣ／ＣＤ）＋５‐ＦＣ］の抗癌効果が減少し得る。しかし、予想とは逆に、図９のＥで［Ｆ細胞（ＭＳＣ／ＣＤ）＋５ＦＣ］をテモゾロミドと併用治療して使用する場合、抗癌剤のみを単独、併用投与することよりむしろ上昇した相乗効果を奏し得ることを確認した。すなわち、かかる上昇した相乗効果は、既存の併用治療では期待することのできない予想外の効果である。

３．４．テモゾロミドとのｉｎ ｖｉｖｏ併用治療効果
前記３．１〜３．３で確認された相乗効果をｉｎ ｖｉｖｏでさらに確認および検証した。ＬａｃＺを発現するＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞を移植した後、６日が過ぎた後、製造例２で製造されたＦ細胞をプラズマソリューションＡ溶液に懸濁させた後、５００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を捨てて洗浄過程を２回繰り返した後、３×１０^５／６μｌの濃度になるように準備した。これを脳の座標ＡＰ＝＋０．５ｍｍ、ＭＬ＝‐１．８ｍｍ、ＤＶ＝‐３ｍｍである点に０．３μｌ／分の速度で移植した。細胞移植した翌日からフルオロシトシン（１５ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を５００ｍｇ／ｋｇの容量で一週間腹腔内注射した。４日が過ぎた後、テモゾロミド（１ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ＤＭＳＯ：生理食塩水＝１：１）を５ｍｇ／ｋｇの容量で５日間腹腔内注射した。２８日になったときに各動物群から８匹ずつ脳組織を取得して実施例２と同じ方法でＸ‐ｇａｌ染色を行って脳腫瘍のサイズを測定した。かかる実験過程を図１１のＡに図式化して示し、測定された脳腫瘍サイズの変化を図１１のＢおよびＣに示す。

図１１のＢおよびＣに示すように、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌe）対照群腫瘍の平均サイズは５９．８ｍｍ^３である一方、Ｆ細胞の移植を受けた動物群は１１．８ｍｍ^３、テモゾロミド単独投与動物群では９．９ｍｍ^３、Ｆ細胞＋テモゾロミドの移植を受けた動物群では２．７ｍｍ^３であり、Ｆ細胞とテモゾロミドの移植を受けた併用治療動物群で腫瘍の平均サイズが最も多幅に減少し、最も優れた抗癌効果を奏する。

また、かかる脳腫瘍治療による生存率を９０日までに測定し、各実験群で比較した結果を図１１のＤに示す。

図１１のＤに示すように、対照群でのｍｅｄｉａｎ ｓｕｒｖｉｖａｌは、３２日であったが、Ｆ細胞処理群は４２日、テモゾロミド処理群は４２日に延長された。特に、Ｆ細胞とテモゾロミド併用治療群ではｍｅｄｉａｎ ｓｕｒｖｉｖａｌが７０日まで延長され、対照群だけでなく、単独投与群と比較しても非常に著しい生存率改善の効果が確認された。

これは、既存抗癌剤との併用治療でもＦ細胞との併用治療が著しく優れた効果を奏するため、既存の化学治療法を改善した治療法で活用することができるという点を示唆する。

実施例４．Ｆ細胞の皮下腫瘍治療効果
脳腫瘍以外の腫瘍でもＦ細胞が抗癌効果を奏することができるか確認するために、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞を皮下組織に移植し、他臓器癌モデル（ｎｏｎ‐ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ）を作製した。１×１０^６のＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞を２０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ社製）が含有されたリン酸塩緩衝液１００μｌに懸濁し、生後７週齢の免疫不全ヌードマウスの皮下に移植した。デジタルカリパス（ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて一週間に２回腫瘍のサイズを測定し、以下の数式を使用して腫瘍の体積を計算した。

皮下腫瘍体積（ｍｍ^３）＝横（ｍｍ）＊縦（ｍｍ）＊高さ（ｍｍ）÷６

Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞を皮下組織に移植し、２０日後、腫瘍のサイズが３０ｍｍ^３以上になったときに、製造例２で製造されたＩ細胞とＦ細胞をプラズマソリューションＡ溶液に懸濁させた後、５００ｘｇで５分間遠心分離した。この過程を２回繰り返した後プラズマソリューションＡに１×１０^６／１００μｌになるように準備した後、注射器を使用して腫瘍に直接注入した。Ｉ細胞とＦ細胞を注入した翌日から５日間、５‐ＦＣ（１５ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を５００ｍｇ／ｋｇの容量で一週間腹腔内注射した。５‐ＦＣ投与を中断し、一週間が過ぎた後から５日間テモゾロミド（Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を５ｍｇ／ｋｇの容量で腹腔内注射した。かかる実験過程を図１２のＡに簡単に図式化した。測定した腫瘍体積の変化を図１２のＢに示し、この皮下腫瘍モデルでヌードマウスの寿命を測定して導出したＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存グラフを図１２のＣに示す。

図１２のＢに示すように、テモゾロミドの投与前の１１日目まで腫瘍の体積は、Ｆ細胞を処理した実験群でさらに効果的に減少し、Ｉ細胞よりもＦ細胞がさらに優れた抗癌効果を奏するということを確認しただけでなく、テモゾロミド投与後の２１日目には対照群である非処理群とＩ細胞処理群と比較してＦ細胞処理群で非常に著しい腫瘍体積抑制効果を確認した。また、図１２のＣに示すように、対照群のｍｅｄｉａｎ ｓｕｒｖｉｖａｌは２３日、Ｉ細胞処理群は３０日であることと比較して、Ｆ細胞処理群は５８日であり、寿命延長効果もＦ細胞で処理された動物群で最も優れていることが認められた。したがって、Ｆ細胞は、皮下腫瘍モデルでの治療効果に優れ、特に、テモゾロミドとの併用治療により相乗的な治療効果を奏することができることが分かり、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験だけでは予想が難しいＦ細胞併用治療の他の臓器の癌での優秀性を示す結果である。

Claims (12)

1. １）間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）にシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＣＤ）をコードする遺伝子を導入してＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、
   ２）製造されたＭＳＣ／ＣＤを凍結し、凍結されたＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、３）凍結されたＭＳＣ／ＣＤを解凍し懸濁してＦ細胞を製造するステップと、を含むＦ細胞の製造方法であって、前記Ｆ細胞は、凍結及び解凍後、培養ステップを行わない、Ｆ細胞の製造方法。
2. 前記Ｆ細胞は、癌治療用である、請求項１に記載のＦ細胞の製造方法。
3. 前記癌は、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺癌、腹膜癌、結腸癌、胆管腫瘍、鼻咽頭癌、喉頭癌、気管支癌、口腔癌、骨肉腫、胆嚢癌、腎臓癌、白血病、膀胱癌、黒色腫、脳癌、神経膠腫、脳腫瘍、皮膚癌、膵臓癌、乳癌、肝癌、骨髄癌、食道癌、大腸癌、胃癌、子宮頸癌、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌および直腸癌からなる群から選択される１種以上である、請求項２に記載のＦ細胞の製造方法。
4. 前記Ｆ細胞は、抗癌用アジュバントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＦ細胞の製造方法。
5. １）間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）にシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＣＤ）をコードする遺伝子を導入してＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、
   ２）製造されたＭＳＣ／ＣＤを凍結し、凍結されたＭＳＣ／ＣＤを製造するステップと、３）凍結されたＭＳＣ／ＣＤを解凍し懸濁してＦ細胞を製造するステップと、
   ４）前記Ｆ細胞を、治療を要する個体に投与するステップと、
   ５）５‐フルオロシトシン（５‐ＦＣ）を、治療を要する個体に投与するステップと、を含む癌の予防または治療用医薬の製造における請求項１に記載の製造方法により調製されたＦ細胞の使用であって、前記Ｆ細胞は、凍結及び解凍後、培養ステップを行わない、Ｆ細胞の使用。
6. ６）抗癌剤を、治療を要する個体に投与するステップをさらに含む請求項５に記載の使用。
7. 前記４）ステップのＦ細胞の投与の前またはＦ細胞投与と同時に、抗癌剤を、治療を要する個体に投与するステップを含む請求項５に記載の使用。
8. 前記抗癌剤は、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ビスカムアルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・チウキセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシル、オテラシル、アザシチジン、シタラビン、フルダラビン、エノシタビン、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ミトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ぺプロマイシン、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、タキソテレ、グリベック、タキソール、ハーセプチン、タルセバ、アバスチン、ゾラデックス、アドリアマイシン、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、１００５８‐Ｆ４、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄ）、ニトロソウレア‐基盤抗癌剤、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）およびドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群から選択される１種以上である、請求項６又は７に記載の使用。
9. 前記４）ステップのＦ細胞と５）ステップの５‐フルオロシトシンは、同時にまたは順次に投与されることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載の使用。
10. 前記５）ステップの５‐フルオロシトシンと６）ステップの抗癌剤は、同時にまたは順次に投与されることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載の使用。
11. 前記４）ステップのＦ細胞の投与は１０日〜３０日の周期に繰り返して行わることを特徴とする、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の使用。
12. 前記癌は、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺癌、腹膜癌、結腸癌、胆管腫瘍、鼻咽頭癌、喉頭癌、気管支癌、口腔癌、骨肉腫、胆嚢癌、腎臓癌、白血病、膀胱癌、黒色腫、脳癌、神経膠腫、脳腫瘍、皮膚癌、膵臓癌、乳癌、肝癌、骨髄癌、食道癌、大腸癌、胃癌、子宮頸癌、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌および直腸癌からなる群から選択される１種以上である、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の使用。