KR20050105454A

KR20050105454A - 암 치료약

Info

Publication number: KR20050105454A
Application number: KR1020057014260A
Authority: KR
Inventors: 나오키 우토구치; 가즈오 마루야마
Original assignee: 메비오팜 가부시키가이샤
Priority date: 2003-02-17
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2005-11-04
Also published as: JPWO2004071518A1; CA2511623A1; WO2004071518A1; EP1595546A4; MXPA05008687A; AU2003277641A1; EP1595546A1; US20060062766A1; AU2003277641B2

Abstract

본 발명은, 암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 배양한 혈관 내피 세포 유래의 항원으로 자극된 수상 세포를 유효 성분으로 하는 암 치료약에 관한 것이다.

Description

암 치료약 {REMEDY FOR CANCER}

본 발명은 종양 조직의 혈관 내피 세포를 타깃으로 한 암 면역 요법에 관한 것이다.

암의 치료법에는 외과적 요법, 화학 요법, 방사선 요법 등이 있고, 각각 특징을 가지고 있어, 그들의 특성을 고려하여 가장 유효한 암 치료법이 선택되고 있다. 외과 요법은 일정한 크기 이상의 암에 대해서는 유효한 방법이지만, 수술이라고 하는 침습 (侵襲) 은 환자에게 있어서 매우 부담이 크고, 또한 뇌종양과 같이 적출이 곤란한 부위의 경우나, 수밀리미터의 작은 암은 발견 그 자체가 곤란한 것 등이, 외과 요법의 한계가 되고 있다. 화학 요법은, 주로 주사 또는 경구 투여라는 방법에 의하기 때문에, 방법으로는 환자에 대한 부담이 가볍고, 또한 혈액을 통하여 항암제가 운반되기 때문에 작은 종양에의 적응도 가능하다. 그러나, 항암제는 기본적으로는 세포독으로, 그 부작용은 매우 심하고, 사용량, 사용 기간의 제한에 따라 충분한 효과를 얻을 수 없는 경우가 많다. 방사선 요법은 목적으로 하는 부위에 선택적으로 방사선을 쏘이는 것이 곤란하고, 또한 근방의 정상 세포에도 영향을 준다는 문제점을 가지고 있다.

상기 기술한 바와 같이, 이들의 치료법은 일장일단이므로, 대부분의 경우 단독으로 실시되는 것이 아니고, 유효하게 병용되어 암치료가 실시되고 있다. 그러나, 여전히 암은 우리나라의 사인의 제 일위이며, 신규한 암 치료법의 확립은 급무한 과제이다.

그런데, 이들 3 개의 암 치료법과는 달리, 4 번째의 방법으로서 생체가 본래 가지고 있는 이물 배제의 시스템인 「면역」 에 의해 암을 배제하려는 「암 면역 요법」 이 있다. 초기의 암 면역 요법은 암 세포 단편이나 암 특이 항원을 아쥬밴트 등과 함께 암 백신으로 투여하고, 세포 상해성 T 세포 (CTL) 를 활성화하여 암을 배제하려는 것이지만, 암 세포 자체는 본래 자기의 세포가 변화된 것으로, 매우 항원성이 부족하여 암 면역 요법의 성과는 거의 얻을 수 없었다.

최근, 수상 세포의 역할이 명백해져서 신규한 암 면역 요법의 타개책으로서 주목받고 있다. 수상 세포는, 생체 내에서 가장 강력한 항원 제시능을 가지는 세포이다. 거기서 ex vivo 의 계에서 암 세포 단편이나 암 특이 항원을 수상 세포에 펄스하고 본 수상 세포를 생체 내에 되돌림으로써, 수상 세포가 CTL 을 활성화하여 암 면역에 의해 암이 배제된다는 것이다. 수상 세포를 사용한 암 면역 요법은 동물 실험에 그치지 않고, 인간에게 있어서의 임상 결과에서도 성공 예가 보고되고 있어, 그 가능성과 유효성은 신규 암 치료법으로 주목받고 있다 (J.Immunol.,156,p.2918(1996), J.Exp.Med.,183,p.7(1996), Blood,84,p.3054(1994), Immunol.,95,p.141(1998), J.Exp.Med.,185, p.1101(1997), J.Exp.Med.,187,p.1019(1998), Blood,93,p.780(1999), Science,283,p.1183(1999), J.Exp.Med,185,p.1101(1997)).

도 1 은 B16 암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 배양한 혈관 내피 세포 유래의 항원으로 자극된 수상 세포의 마우스 폐암에 대한 치료 효과 (폐중량) 를 나타내는 도이다. 도면 중, None 은 B16 만 투여 군을; None pulsed DC 는 B16 및 아무것도 펄스하지 않은 수상 세포 투여 군을; BAEC pulsed DC 는 BAEC 를 펄스한 수상 세포 투여 군을; B16 CM-BAEC pulsed DC 는 B16 과 B16 의 배양상청에서 배양한 BAEC 를 펄스한 수상 세포를 투여한 군을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 암 치료약의 유효 성분인 수상 세포는, 종양 조직의 혈관 내피 세포를 타깃으로 한다. 그 때문에 수상 세포를 자극하기 위한 혈관 내피 세포는 암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 배양한 것을 사용한다.

사용하는 암 세포는 인간 암 세포인 것이 바람직하지만, 암 세포의 종류는 한정되지 않는다. 암 세포의 예로는, 위암, 간암, 대장암, 폐암, 피부암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 전립선암, 뇌종양 등의 고형암의 세포를 들 수 있다. 암 세포의 배양 조건은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, RPMI1640, MEM, DMEM, 햄F12, M199 등의 배지 중, 37℃, 5% CO2, 95% air, 포화 수증기 조건 하에서 실시하는 것이 바람직하다. 또 배지에는, 항생 물질, 탄산수소나트륨, 비필수 아미노산 등을 첨가 할 수도 있다. 암 세포의 배양상청의 채취는, 예를 들면, 500∼1500rpm, 2∼10분간 원심 분리나 필터 여과함으로써 얻을 수 있다.

혈관 내피 세포로는, 종은 특별히 한정되지 않고, 인간, 소, 마우스 등의 혈관 내피 세포가 사용된다. 예를 들면, 인간 유래이면, 제대 정맥, 제대 동맥, 대동맥, 폐동맥, 신생아 포피, 성인 피부 등의 혈관의 내피 세포가 사용된다. 당해 혈관 내피 세포의 배양은 상기 암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 실시된다. 여기에서, 배지 중으로의 암 세포 배양상청의 첨가량은, 10∼100v/v％, 특히 20∼100v/v％ 가 바람직하다. 혈관 내피 세포 배양을 위한 배지는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, RPMI1640, MEM, DMEM, 햄F12, M199 등의 배지, 또한 암 세포 배양상청 이외에 혈관 내피 세포 증식 인자, 헤파린, 항생 물질 등이 첨가되어 있어도 된다. 혈관 내피 세포의 배양 조건은, 특별히 제한되지 않고, 37℃, 5% CO2, 95% air, 포화 수증기 조건 하에서 2∼4일간 실시하는 것이 바람직하다.

상기 혈관 내피 세포 유래의 항원으로는, 당해 혈관 내피 세포 자체여도 되지만, 혈관 내피 세포 내 성분 (예를 들면, Total RNA 등), 혈관 내피 세포 파쇄액또는 혈관 내피 세포막 소포를 사용해도 된다. 당해 세포 내 성분, 세포 파쇄액이나 막 소포는 조제가 용이하고, 또한 수상 세포에 대한 자극 효율이 높으므로 보다 바람직하다.

세포 파쇄액은, 예를 들면, 동결 (-160℃) 과 융해 (37℃) 를 4∼6 회 반복한 것을 저속도로 원심 (400rpm, 10분간) 함으로써 조제할 수 있다. 또한, 막 소포는, 예를 들면, DMEM 에 100mM 파라포름알데히드, 2mM 디티오스트레톨, 1mM CaCl₂, 0.5mM MgCl₂ 를 넣은 것으로 37℃, 5% CO2, 95% air, 포화 수증기 조건 하에서 하룻밤 처리하고, 다음으로 150g 에서 5분간 원심하고, 계속해서 그 상청을 4℃ 에서 30분간 30000g 의 원심에 의해 조제할 수 있다. 세포 내 성분, 예를 들면, Total RNA 는 상법에 의해 조제할 수 있다.

수상 세포로는, 인간 유래의 수상 세포, 특히 투여하고자 하는 환자 자신 유래의 수상 세포 또는 환자와 MHC 적합의 인간 유래의 수상 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 수상 세포는, 예를 들면, 비특허문헌 8, 9 등에 기재된 방법에 의해, 골수 세포, 제대혈 유래 세포, 말초혈 단핵 세포 등으로부터 분화 유도시킴으로써 얻을 수 있다. 말초혈 단핵 세포로부터 수상 세포를 분화 유도하기 위해서는, 예를 들면, GM-CSF (10-100ng/mL), IL-4 (50-500IU/mL) 를 넣은 배지에서 5∼10일간 배양하는 것이 바람직하다.

수상 세포를 상기 혈관 내피 세포 유래의 항원으로 자극하기 위해서는, 예를 들면, 수상 세포의 현탁액에 당해 내피 혈관 세포 유래 항원을 첨가하여, 4∼24시간 인큐베이트 함으로써 실시된다. 또한, 항원 자극이 보다 효율적으로 실시되도록, 양이온성 리포솜 등을 병용하는 것이 바람직하다. 또한 수상 세포와 혈관 내피 세포의 세포 융합법에 의해 수상 세포에 혈관 내피 세포 항원을 제시시켜도 상관없다. 또한 혈관 내피 세포의 Total RNA 를 수상 세포에 도입시켜, 항원을 제시시켜도 된다. 당해 항원의 첨가량은, 수상 세포 1×10⁶ 개당 단백 농도로서 0.01∼100㎍/mL, 특히 0.1∼100㎍/mL 가 바람직하다.

이렇게 얻어진 수상 세포는, 생체 내에서 암 조직의 혈관 내피 세포 특이 항원을 제시하여, 종양 조직 혈관 내피 세포로의 세포 장해성 T 세포 (CTL) 가 유도되어, 종양 조직의 혈관 내피 세포가 공격당하여 종양 조직 내의 혈관이 파탄되어, 종양은 그 영양 공급로가 차단되어 종양이 퇴축되는 점에서 암 치료약으로 유용하다.

얻어진 수상 세포를 포함하는 세포 현탁액은, 인간에게 암 치료약으로서 투여하는 점에서 세포 증식성을 없애는 것이 바람직하다. 보다 안전하게 이용하기 위해서 가열 처리, 방사선 처리,혹은 미토마이신 C 처리 등, 암 치료약으로서의 기능을 남기면서, 암 세포의 단백질이 변성되는 정도의 조건 하에서 처리할 수 있다. 예를 들면, X 선 조사를 이용할 경우, X 선 조사기의 관구 밑에 수상 세포를 함유하는 플라스크를 두어, 총 방사선량 1000∼3300Rad 로 조사한다. 미토마이신 C 처리법은, 예를 들면, 수상 세포를 1∼3×10⁷개 세포/mL 의 밀도로 현탁하고, 세포 부유액 1mL 당 미토마이신 C 25∼50㎍ 의 비로 첨가하여, 37℃, 30∼60분간 보온 처리한다. 열에 의한 세포처리 방법은, 예를 들면, 생세포 농도를 1×10⁷개/mL 로 조제한 세포 현탁액을 넣은 원심관을 50∼65℃ 에서 20분간 가열 처리를 실시함으로써 조제할 수 있다.

본 발명의 암 치료약의 대상이 되는 암은, 특별히 제한되지 않지만 고형암이 바람직하며, 예를 들면, 위암, 간암, 대장암, 폐암, 피부암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 전립선암, 뇌종양 등을 들 수 있다. 본 발명의 수상 세포의 투여량은, 환자의 연령, 체중, 성별, 암의 종류 및 암의 진행도, 증상 등에 따라 달라 일률적으로 결정할 수 없지만, 현재 실시되고 있는 세포 백신 요법에서 주입되는 것과 같은 정도의 양이 환자에 투여되면 된다. 본 발명의 수상 세포는, 환자 본인에게 사용할 수도 있지만, 골수 뱅크, 제대혈 뱅크의 발달에 의해 MHC 적합의 동종의 다수의 환자에게 투여할 수 있다.

발명의 개시

본 발명의 목적은, 수상 세포의 기능을 이용한 새로운 암 면역 요법을 제공 하는 것에 있다.

여기서 본 발명자는, 종양 조직은 정상 조직에 비해서 증식율이 크고, 영양의 공급 및 노폐물의 배제의 파이프로서의 혈관 신생이 불가결한 것에 착안하여, 먼저, 혈관 내피 세포를 암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 배양하여 얻어진 혈관 내피 세포 유래의 항원으로 수상 세포를 자극하면, 종양 조직의 혈관 내피 세포를 타깃으로한 암 면역 요법약으로서 유용한 수상 세포를 얻을 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은, 암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 배양한 혈관 내피 세포 유래의 항원으로 자극된 수상 세포를 유효 성분으로 하는 암 치료약을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은, 암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 배양한 혈관 내피 세포 유래의 항원으로 자극된 수상 세포의 암 치료약 제조를 위한 사용을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은, 암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 배양한 혈관 내피 세포 유래의 항원으로 자극된 수상 세포를 투여하는 것을 특징으로 하는 암의 치료법을 제공하는 것이다.

본 발명의 암 치료약은 종양 세포 자체를 타깃으로 하는 것이 아니고, 종양 조직의 혈관 내피 세포를 타깃으로 한 암 면역 요법이다. 따라서, 종래의 암 면역 요법에 비해서 이하의 점에서 우수하다.

(1) 종양 조직을 구성하는 세포는 암 세포: 혈관 내피 세포 = 100∼1000:1 이며, 이것은 한 개의 혈관 내피 세포가 100∼1000 개의 암 세포를 지지하고 있는 것을 의미하고 있다. 따라서, 한 개의 혈관 내피 세포의 죽음은 100∼1000 개의 암 세포의 죽음이 예상된다. 따라서, 혈관 내피 세포를 타깃으로 한 경우, 암 세포를 타깃으로 한 경우의 100∼1000 배 효율이 좋다.

(2) 종래의 암 면역 요법에서는, 원발암의 경우, 간암이면 간암, 폐암이면 폐암으로 암종에 따라 다른 세포를 면역하지 않으면 효과를 기대할 수 없다. 그러나, 혈관 내피 세포를 타깃으로 한 경우, 간암이든 폐암이든 혈관 내피 세포를 항원으로 하기 때문에, 암 세포의 영향을 받은 혈관 내피 세포라는 점으로부터, 이들은 암종류에 관계없이 공통의 성질을 가지며, 공통의 항원을 발현하고 있는 것으로부터, 어떠한 암종류에도 유효하다.

(3) 생체 내에서 혈관 신생이 왕성하게 실시되고 있는 부위는, 성인에게 있어서 종양 조직 이외로는 창상 치유 부위뿐이며, 암 혈관 내피 세포를 타깃으로 한 경우, 종양에 대한 선택성이 매우 높아 부작용이 적다.

다음으로 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 조금도 이것에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

Ａ. 방법

(1) 암 세포 배양상청 (암 CM) 의 조제

마우스 흑색종 B16 세포를 RPMI1640 배지 중, 37℃, 5% CO2, 95% air, 포화 수증기 조건에서 서브컨플루먼트 상태까지 배양했다. 새로운 배지 (인간 제대 정맥 혈관 내피 세포 배양용의 배지; 이하 HUVEC 배지. 조성은, Medium199:RPMI1640=1:1 로 혼합하고, 15% 소 태아 혈청, 혈관 내피 세포 증식 인자 (20㎍/mL), 헤파린 (25㎍/mL), 항생 물질을 첨가한 것) 으로 교환했다. 48시간 후, 배지를 회수하고, 1000rpm, 5분간 원심하여 상청을 0.22㎛ 의 필터로 여과했다. 이와 같은 양의 신선한 HUVEC 배지를 혼합한 것을 암 세포의 배양 배지 (암 CM) 로 사용했다.

(2) 암 CM 작용 혈관 내피 세포의 조제

상기한 HUVEC 배지 중에 인간 제대 정맥 혈관 내피 세포를 2500개/㎠ 의 농도로 파종, 37℃, 5% CO2, 95% air, 포화 수증기 조건에서 배양했다. 다음날, 암 CM 으로 배지를 교환했다. 37℃, 5% CO2, 95% air, 포화 수증기 조건에서 48시간 배양한 것을 암 CM 작용 혈관 내피 세포로 했다.

(3) 수상 세포에 대한 항원 펄스

배양 암 CM 작용 혈관 내피 세포에 막 소포 조제액 (DMEM 배지에 100mM 파라포름알데히드, 2mM 디티오스트레톨, 1mM CaCl₂, 0.5mM MgCl₂ 를 용해) 을 첨가하여 37℃, 하룻밤 처리했다.

다음으로 상청을 150×g 로 5분간 원심하고, 계속해서 상청을 4℃, 30분간 30000×g 로 원심하여, 그 침전을 암 CM 혈관 내피 세포의 막 소포로 하여 수상 세포에 펄스하는 항원으로 했다.

또 배양 암 CM 작용 혈관 내피 세포를 생리 식염수에 현탁하여, 동결 융해를 4 회 반복한 세포 파쇄액도 수상 세포에 펄스하는 항원으로 했다.

암 CM 혈관 내피 세포의 막 소포 또는 세포 파쇄액과 리포펙틴을 (양비) 혼합하고, 지질 농도로서 10㎍/mL 가 되도록 조제하여, 20분간 실온에서 방치했다. 이것을 마우스 수상 세포주 DC 2.4 세포 또는 골수 유래 초대 배양 수상 세포의 세포 현탁액 (1×10⁶개/mL) 에 첨가하여, 5시간 인큐베이트했다. 인산 완충액으로 원심, 세정 후, 미토마이신 C (50㎍/mL) 에 의해 37℃, 30분간 처리했다. 인산 완충액으로 2회 원심, 세정하여, 인산 완충액에 재현탁했다.

(4) 수상 세포의 투여

상기 방법에 의해 조제한 DC 2.4 세포 또는 초대 배양 수상 세포 (1×10⁵ cells) 를 B57/BL6 마우스에 피하 또는 피내 투여했다.

(5) 암 세포의 투여

DC 2.4 세포 또는 초대 배양 수상 세포 투여의 1주일 후, B16F10 세포 (1×10⁶ cells) 를 꼬리 정맥 내 주사했다.

(6) 폐 전이수의 평가

B16F10 세포 투여 1주일 후, 폐를 적출하여 실체 현미경에 의해 폐에 전이된 콜로니 수를 계측했다.

Ｂ. 결과

각 3 예의 수상 세포를 투여하지 않은 군의 폐 전이수는 (924,799,550) 이며, 수상 세포를 투여한 군의 폐 전이수는 (184,414,0) 이었다. 이 결과, 본 발명의 수상 세포는 암 세포의 폐 전이를 유의하게 억제하여, 암 치료약으로서 유용한 것이 판명되었다.

실시예 2

Ａ. 방법

소 대동맥에서 박리법에 의해 계대 배양한 혈관 내피 세포 (BAEC) 를 사용했다. 혈관 내피 세포의 배양은, DMEM 에 10% 소 태아 혈청을 첨가한 것을 배지로 했다. 이 혈관 내피 세포를 실시예 1 과 동일하게 하여 세포 파쇄액을 항원으로 했다.

그 외의 조작은 실시예 1 과 동일하게 하여 B16 세포의 배양상청을 함유하는 배지에서 소 대동맥 유래 혈관 내피 세포를 배양하여, 얻어진 세포의 파쇄액을 항원으로서 수상 세포에 펄스했다. 얻어진 수상 세포를 실시예 1 과 동일하게 하여 B57/BL6 마우스에게 투여했다. 암 세포 투여 2주일 후, 폐를 적출하여 폐 중량을 측정했다.

Ｂ. 결과

그 결과, 도 1 에 나타낸 바와 같이 None 군 (B16 만 투여), None pulsed DC 군 (B16 및 아무것도 펄스하지 않는 수상 세포를 투여) 및 BAEC pulsed DC 군 (B16과 BAEC 를 펄스한 수상 세포를 투여) 은, 폐의 대부분이 B16 에서 흑색이 되어 있고, 폐 중량도 증가하고 있었다. 이에 반하여, B16CM-BAEC pulsed DC 군 (B16과 B16의 배양상청에서 배양한 BAEC 를 펄스한 수상 세포를 투여) 은 흑색부가 얼마 안되고, 폐 중량의 증가도 억제되어 있었다.

Claims

암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 배양한 혈관 내피 세포 유래의 항원으로 자극된 수상 세포를 유효 성분으로 하는 암 치료약.
제 1 항에 있어서, 혈관 내피 세포 유래의 항원이, 혈관 내피 세포, 그 세포 내 성분, 그 세포 파쇄액 또는 그 세포막 소포인 암 치료약.
암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 배양한 혈관 내피 세포 유래의 항원으로 자극된 수상 세포의 암 치료약 제조를 위한 사용.
제 3 항에 있어서, 혈관 내피 세포 유래의 항원이, 혈관 내피 세포, 그 세포 내 성분, 그 세포 파쇄액 또는 그 세포 소포인 사용.
암 세포 배양상청을 함유하는 배지에서 배양한 혈관 내피 세포 유래의 항원으로 자극된 수상 세포를 투여하는 것을 특징으로 하는 암의 치료법.
제 5 항에 있어서, 혈관 내피 세포 유래의 항원이, 혈관 내피 세포, 그 세포 내 성분, 그 세포 파쇄액 또는 그 세포 소포인 치료법.