CN105820234B - 一种人表皮生长因子受体的ctl表位多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或该多肽具有在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上取代、缺失、置换、插入和/或添加一个至几个氨基酸的衍生序列。本发明还提供一种疫苗，包括人表皮生长因子受体的CTL表位多肽和佐剂，所述佐剂为gp96蛋白。通过佐剂和人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的配合具有，具有提高免疫力，显著提高治疗肿瘤效果等优点。

Description

一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽及其应用。
背景技术
肺癌是目前国内乃至世界发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。大量临床资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生密切相关。由于吸烟导致的被动吸烟者肺癌患病率明显增加。此外，研究发现近年来非吸烟群体的肺癌发病率明显上升。这可能与大气污染的加重，特别是受可吸入颗粒大规模长时期的影响相关。
肺癌常用的治疗方法包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗以及不同治疗方法的联合治疗。近年来，即使肺癌的治疗方法不断创新改进，但治疗效果仍不能令人满意，复发转移几率还是较高。
目前世界上倾向于将肺癌粗分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，后者包括除小细胞癌以外的其他上皮癌。小细胞肺癌的生物学行为与其他上皮性癌(鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌)显著不同，临床上表现为高度恶性，早期即发生广泛的远处转移，对化学治疗和放射治疗较敏感，因而治疗原则也不同于其他上皮癌。目前临床上常见的肺癌病人约80％为包括鳞癌、腺癌等在内的非小细胞肺癌，这些病人确诊时有85％左右是中晚期，约75％的晚期非小细胞肺癌病人失去了手术根治性治疗机会、常规放化疗的 临床效果也不甚理想。
分子靶向药物治疗是近年新兴的一种治疗手段，因其具有高度选择性地杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅极少损伤正常细胞的特点，安全性和耐受性较好、毒付作用相对较小，许多病人都视其为治疗肺癌的一线生机。分子靶向是指在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。在非小细胞肺癌中，很多病人都存在着表皮生长因子受体(EGFR)高表达，并且肿瘤的生长依赖着EGFR信号传导通路。此外，临床研究发现肺癌患者中人体表皮生长因子受体基因突变频率高，突变后的EGFR对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性增加。因此靶向治疗对EGFR基因突变的患者效果明显，通过阻断致癌信号的传输达到控制癌症的效果。目前肺癌靶向治疗的常用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)包括易瑞沙、特罗凯、凯美纳等。研究表明，在我国非小细胞肺癌患者中，有特定的人群，包括女性、腺癌、不吸烟的患者，对易瑞沙和特罗凯治疗的有效率高。受体酪氨酸激酶抑制剂药物的问题是价格较贵，在我国属于自费药物，没有纳入医保报销范围，对有效的病人造成巨大的经济负担。此外，长时间使用靶向药物极易产生耐药性，导致药物的药效降低。再次，靶向药物对患者具有一定的毒副作用，包括后期皮疹，皮肤发干，发黑等症状。因此，迫切需要开发新的治疗性疫苗以补充或替代现有的抗肿瘤治疗方案。
研究显示，肿瘤特异性杀伤性T淋巴细胞(Cytolytic T lymphocyte，CTL)在清除肿瘤中起着至关重要的作用。大部分肿瘤患者T细胞反应低下，如何激活CTL免疫反应成为焦点。而CTL表位在CTL活化过程中扮演着关键角色，是诱导特异性CTL克隆性增殖、分化和发挥效应的最重要的激发因素，在机体免疫中发挥着重要的作用。
热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质，加热、缺氧、病毒感染、重金属中毒、氧化剂等刺激因素都可诱导其表达增加。HSP根据同源程度及分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP及泛素等多个亚家族。人类热休克蛋白90家族(HSP90)包括HSP90α,HSP90β,gp96(grp94)和Trap-1四个成员。gp96(GRP94)为内质网HSP90家族的代表，与细胞质HSP90高度同源，主要生物学功能有：分子伴侣，参与新合成蛋白的折叠与组装；与细胞内的其他肽类蛋白质尤其是变性蛋白的结合，参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程；参与蛋白质水解过程；结合抗原肽，加工提呈肿瘤抗原及维持细胞内环境稳定等作用；对细胞的生长、发育、分化及死亡具有一定的调节作用。gp96是一种遗传单态性分子，其氨基酸(aa)序列高度保守：小鼠和仓鼠的gp96氨基酸序列有95％以上的同源性，猪源、人源与禽源的gp96氨基酸序列分别有97％和89％以上的同源性。gp96由于具有显著的生物学活性，特别是在免疫学方面同时具有刺激特异性杀伤T细胞的作用和抑制调节性T细胞的作用。gp96能结合细胞中5-25mer的抗原多肽，通过抗原呈递细胞(APC)表面CD91分子进入细胞并将结合的抗原表位呈递给MHC I类和II类分子从而启动特异性T细胞免疫应。此外，gp96能有效激发天然免疫。gp96是来源于哺乳动物细胞的天然佐剂，可作用于APC及T细胞等其它免疫细胞，促进DC成熟，刺激细胞产生免疫因子IL-6、IL-12、TNF等，从而增强机体天然免疫反应。Srivastava等人首先发现了gp96在肿瘤免疫应答中的重要作用。从肿瘤中获得的gp96-抗原肽复合物能够有效地刺激机体产生抗肿瘤免疫应答。同时，由于胎盘中含有大量的癌胚抗原，将胎盘中的gp96纯化分离后免疫C57BL/6小鼠，也能取得良好的预防和治疗效果。
由于组织来源有限，从组织提取的热休克蛋白gp96蛋白产量有限，难 以工业化应用，而且组织提取的gp96蛋白结合组织细胞内的抗原多肽，影响其与外源多肽的结合，从而影响疫苗的疗效。此外，受伦理道德因素的制约，从组织提取的gp96难以直接作为药物推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种表皮生长因子受体的CTL表位多肽以及昆虫细胞分泌表达的gp96及其联合应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或
该多肽具有在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上取代、缺失、置换、插入和/或添加一个至几个氨基酸的衍生序列。
所述衍生序列仍与人表皮生长因子受体的CTL表位相关。
所述衍生序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的功能相近或一致，所述功能主要指结合HLA－A2分子的能力、刺激特异性T细胞产生、抗肿瘤生长的能力等。
本发明所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽具有水溶性好，便于临床应用等优点。
经试验验证，本发明所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的溶解度(溶剂可以为任何水溶液，纯水，生理盐水或磷酸盐缓冲液等等)可以达到至少20mg/mL，且不需要用有机溶剂溶解。
以多肽做为临床药物时，为保证具有足够的效果，需要具备一定的溶解性。但现有的多肽具有水溶性不好等缺陷，在使用时只能将多肽溶于极性溶剂(例如：油类化合物、乙醇等)。在临床药物进行主管部门审批时，受极性溶剂的影响，审查周期延长或者不能够审批通过，影响多肽类药物的进一 步应用。为了避免上述缺陷，一般采用多肽修饰的方法来改善多肽的水溶性，但是存在实验周期长、效果不理想等问题。
本发明提供的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽具有很好的水溶性，应用前景好。
本发明所述的人表皮生长因子受体的CTL表位与HLA分子还具有很强的结合能力，经试验证实具有很强大的免疫学功能。
对于衍生序列，如果在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上加或减一个氨基酸，得到的序列仍然不影响原多肽序列的功能，那么该衍生序列也在本发明的保护范围内。
除该多肽第二位和最后一位不能改变，其余氨基酸可以被其他同性质(例如亲水氨基酸被亲水氨基酸取代，疏水氨基酸被疏水氨基酸取代)的氨基酸取代。
在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，出于某种目的的需要(例如：为了便于纯化、表达、标记等操作)常常会添加一些标签序列或限制性酶切位点以及保护碱基等。所述标签序列、限制性酶切位点以及保护碱基等均可以根据具体的使用情况进行具体选择，并无特殊限制。
优选地，所述人表皮生长因子受体的CTL表位多肽为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明还提供一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的编码基因，通过上述编码基因来编码上述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽。
本发明还提供一种重组载体，所述重组载体克隆、分泌和/或表达上述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽。
所述重组载体可以根据实际的实际的需要选择，与蛋白表达或复制的调控元件，例如：启动子、终止子、多克隆位点、RBS序列、抗性基因以及其他具有生理性功能的基因等等。
本发明还提供一种转化体，包括上述的重组载体。所述重组载体可以独立复制也可以整合到细菌的染色体DNA中，随染色体DNA的复制而复制。
本发明中，所述的转化子为含有上述的重组载体的细胞。
通过上述的重组载体以及转化体，可以在体外实现表达多肽。
本发明所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽在肿瘤治疗中的应用。优选地，应用于肺癌的治疗中。
本发明还一种疫苗，包括上述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽和佐剂。
本发明所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽可以作为疫苗的活性组分，用于肺癌的治疗，具有水溶性好优点。
进一步，所述佐剂包括gp96蛋白。
采用上述进一步方案的有益效果是：通过gp96蛋白与人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的联合使用，具有抑制肿瘤生长的效果好等优点。
进一步，所述gp96蛋白为采用昆虫细胞表达系统表达分泌型的gp96蛋白。
采用上述进一步方案的有益效果是：
发明人在研究过程中，进行对于表达系统的选择进行了筛选，例如：大肠表达系统和酵母表达系统等。最终意外的发现了采用昆虫细胞表达系统表达分泌型的gp96蛋白最合适，gp96蛋白产量高并且作为佐剂制备疫苗时效果好。
发明采用昆虫细胞表达系统表达分泌型的gp96蛋白，表达系统稳定，gp96蛋白的表达量高，蛋白糖基化更接近于哺乳动物细胞,蛋白稳定,且从细胞上清中提取，纯化简单。昆虫细胞分泌表达的热休克蛋白gp96不结合抗原多肽，因此可以更好地与外源多肽结合，从而增强了其免疫学功能。
进一步，所述gp96蛋白通过昆虫杆状病毒感染的昆虫细胞分泌表达。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用昆虫杆状病毒感染的昆虫细胞分泌表达具有效率高、易提纯、活性好且安全性高等优点。
进一步，所述gp96蛋白和人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的质量比为1：(0.5-10)，优选地，所述gp96蛋白和人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的质量比为1:2.5。
采用上述进一步方案的有益效果是：质量比设置为1：(0.5-10)有利于刺激特异性CTL产生，产生更好的抑制肿瘤的效果，如果比例过高，容易导致抑制机体的免疫系统，产生免疫耐受问题，如果比例过低容易导致没有效果问题；发明人在研究中发现，当比例设置为1:2.5时，刺激特异性CTL产生的效果更好。
进一步，所述gp96蛋白包括SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；和/或
所述gp96蛋白的编码基因包括SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
本发明提供一种gp96蛋白的制备方法，包括以下步骤：利用昆虫细胞分泌表达gp96蛋白，昆虫细胞培养上清依次进行HiTrap Q HP阴离子交换柱和Superdex 200 10/300GL分子筛层析得到的。
采用上述进一步方案的有益效果是：纯化简便，特异性强，可以精确控制条件，并可用于规模化工业生产，在保证蛋白纯度的前提下，既节约了时间，又减少了蛋白的丢失。
进一步，包括以下具体步骤：
1)利用昆虫杆状病毒感染的昆虫细胞分泌表达gp96蛋白：构建含有gp96蛋白的表达载体和转化子；所述转化子为转染有gp96蛋白的表达载体的细胞；
2)将杆状病毒侵染转化子后，进行悬浮培养，培养温度为27℃，培养时的转速为100-120rpm/min，培养结束后，收集上清液；
3)将上清液进行HiTrap-Q Sepharose离子交换层析，具体包括如下步 骤：
(a)将步骤2)得到的上清液上样于层析柱，流速为1mL/min；
(b)用5mL PBS缓冲液洗涤步骤(a)的层析柱，流速为1mL/min，所述PBS缓冲液含有200mM NaCl，PBS缓冲液的pH为7.5；
(c)用10mL的PBS缓冲液洗涤步骤(b)的层析柱，流速为1mL/min；所述PBS缓冲液含有300mM NaCl，PBS缓冲液的pH为7.5；
(d)用3mL的PBS缓冲液洗涤步骤(c)的层析柱，流速为1mL/min，得到的洗脱液即为含有gp96蛋白的提取物；所述PBS缓冲液含有600mM NaCl，PBS缓冲液的pH为7.5；
4)将洗脱液进行Superdex 200 10/300GL分子筛层析，具体包括如下步骤：
(a)将HiTrap-Q Sepharose离子交换层析所得gp96蛋白提取物通过50Kd超滤管浓缩，用pH为7.5的PBS换液，浓缩终体积为1mL的浓缩液，所述浓缩液含有gp96蛋白；
(b)通过上样环将步骤(a)的浓缩液上样于层析柱，流速为0.25mL/min；
(c)用PBS缓冲液洗涤层析柱，流速为0.25mL/min，收取gp96蛋白；将收集的gp96蛋白用pH为7.5的PBS缓冲液换液，浓缩，测定gp96蛋白浓度后分装、贮存。
采用上述进一步方案的有益效果是：
步骤3)的步骤(b)中200mM NaCl可以将部分杂蛋白洗脱，提高gp96蛋白的纯度；
步骤3)的步骤(c)中300mM NaCl既可以将杂蛋白洗脱，又能保证gp96仍然结合在离子柱上，有利于提高gp96蛋白的纯度和产量；
步骤3)的步骤(d)中600mM NaCl既可以将gp96蛋白完全洗脱，又能避免过高的盐浓度混入杂蛋白，有利于提高gp96蛋白的纯度和产量；
步骤4)中分子层析柱的使用可以提高gp96蛋白的纯度。
附图说明
图1为多肽与T2细胞表面的HLA-A2分子结合能力的实验结果。
图2为多肽与HLA-A2分子以及β2m分子构成复合物的体外重折叠(refolding)的实验结果。
图3为多肽免疫HLA-2.1/Kb转基因小鼠，其脾细胞中多肽特异性CTL免疫反应的ELISPOT检测结果。
图4裸鼠接种肺癌患者原位肿瘤组织，转输经多肽免疫的HLA-2.1/Kb转基因小鼠的脾脏淋巴细胞后，与对照组相比，其肿瘤的生长情况。肺癌患者血液细胞HLA限制性经流式细胞仪检测为HLA-2阳性。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。ATCC即美国模式培养物集存库(American typeculture collection)的简写，网址http://www.atcc.org/。
PBS缓冲液：8g NaCl、0.2g KCl、3.625g Na2HPO4·12H2O、0.24g KH2PO4，加水至1L，调pH7.4。
通过在NCBI(National Center for Biotechnology Information)的Protein数据库中搜索人表皮生长因子受体蛋白的氨基酸序列(Accession:NP_005219.2)，如序列表的SEQ ID NO.1所示，以此作为合成 多肽的序列来源。
实施例1、制备EGFR衍生的九肽，该多肽序列在EGFR的前体和成熟体中都存在。
该衍生九肽为EGFR599-607多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由氮末端至碳末端方向的氨基酸序列为：Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val。
EGFR599-607多肽片段由吉尔生化(上海)有限公司合成。
对照多肽：乙肝病毒HBc82-90肽来源于乙肝病毒核心蛋白，非肿瘤抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2、实验验证EGFR599-607多肽片段与HLA-A2分子的结合力
分别通过T2细胞结合实验和体外重折叠实验来检测EGFR599-607多肽片段与HLA-A2分子的结合力。
一、T2细胞结合实验检测多肽与细胞表面的HLA-A2分子的结合能力
T2细胞表面表达HLA-A0201分子(HLA-A0201分子也可以写成HLA-A*0201分子，是HLA－A2分子的一个分支)，且其TAP基因缺陷，所以该细胞不能加工呈递内源性的多肽，故其细胞表面的HLA-A0201分子处于不稳定且低表达的状态。当有HLA-A0201分子可结合的外源性抗原多肽存在时，这些多肽与T2细胞表面的HLA-A2分子结合，会大大增加其细胞表面的HLA-A0201稳定性，很大程度上提高细胞表达HLA－A2的强度，通过荧光标记的MHC抗体标记和流式检测即可鉴定，采用FI(fluorescence index,FI)值来说明多肽的结合力强弱。FI＝(待测多肽的平均荧光强度-不加多肽的平均荧光强度)/不加多肽的平均荧光强度，若FI≥1，则被认为是与HLA-A2分子结合力高的多肽。具体操作步骤如下：
取生长良好的细胞(来自CRL-1992TM)，用无血清的培养基洗两次，再用少量无血清培养基悬起，细胞计数，接种到96孔板中，每个孔中接种2×105个细胞，加入终浓度为100μg/mL待测多肽，1μg/mL人β2m蛋白(购自sigma)，每个孔的体系为100μL，37℃条件下培养16小时。
收集96孔板中的细胞，用PBS缓冲液洗2次，用偶联FITC的抗人－HLA-A2特异性抗体BB7.2(abcam公司，货号ab27728)标记细胞，4℃条件下反应30min。收集标记后的细胞，用PBS缓冲液洗两次，用流式细胞仪测定样品的荧光强度。用FI值来评判待测多肽的结合力强弱。
上述中，实验组加入的多肽为EGFR599-607多肽片段；对照组加入的多肽为乙肝病毒HBc82-90肽。
实验结果如图1所示，实验组EGFR599-607多肽片段的荧光强度明显比对照组(乙肝病毒HBc82-90肽)的荧光强度要强。EGFR599-607与对照组的FI值分别为43.5、9.03，说明与对照组相比，EGFR599-607多肽片段与HLA-A2分子有很好的结合力。而能结合HLA分子是多肽具有免疫学功能的前提，本发明所述EGFR599-607多肽片段与HLA-A2分子的结合能力更强，可能具有强大的免疫学功能。
二、体外重折叠(refolding)实验检测多肽与HLA-A0201分子的结合能力
在refolding实验中，如果多肽能与HLA-A0201分子结合，那么多肽、HLA-A0201以及β2微球蛋白(β2m)就能形成稳定的多肽-HLA-β2m三元复合物，在分子筛层析图谱中出现多肽-HLA-β2m复合物蛋白峰。HLA-A2分子由重链和轻链组成，重链的编码序列如SEQ ID NO.4所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5显示。轻链的编码序列如SEQ ID NO.6显示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
1、构建HLA-A0201重链胞外区质粒
将编码HLA-A0201重链胞外区的DNA(GENBANK ACCESSION NO.AY365426自5’末端第73-897位核苷酸)导入pET-28a质粒(Novagen，69864-3CN)，得到重链重组质粒，命名为HLA-A0201-HC质粒。
2、构建人β2m表达质粒
将编码人β2m的DNA(GENBANK ACCESSION NO.NM_004048自5’末端第121-417位核苷酸)导入pET-28a质粒，得到轻链重组质粒，命名为β2m质粒。
3、原核提取HLA重链和轻链蛋白
包涵体清洗液(washing buffer)：0.5％(体积分数)Triton-100，50mM Tris pH8.0，300mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT；
包涵体重悬液(resuspension buffer)：50mM Tris pH 8.0，100mM NaCl，10mMEDTA，10mM DTT；
包涵体溶解液(dissolution Buffer)：6M Gua-HCl(或8M尿素)，10％(体积分数)甘油，50mM Tris pH8.0，100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT；
复性液(refolding buffer)：100mM Tris pH 8.0，400mM L-Arg HCl，2mM EDTA，5mM GSH(还原性谷胱甘肽，溶液预冷后加入)，0.5mM GSSG(氧化性谷胱甘肽，溶液预冷后加入)，0.5mM PMSF。
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水定容至1L。
(1)将HLA-A0201-HC质粒与β2m质粒分别转入BL21(DE3)感受态细胞中(购自天根生化科技公司，产品号CB105-02)，从平板上挑取单克隆菌落接种到5mL的LB培养基中，该培养基中含有100mg/mL氨苄霉素，小量活化，培养10-12h。然后按照1％(体积比)的接种量接种到2L LB培养基中大量培养(温度为37℃，转速为200rpm)，培养至OD＝0.4-0.6，在无菌条件下加入IPTG(终浓度为1mM)，37℃诱导4-6小时，4℃条件下，7000rpm离心10min，收集菌体。
(2)用PBS缓冲液将菌体重悬，在冰浴条件下进行超声破碎(超声6s，间隔12s，99次，250W，多个循环)，直至菌体悬液透明。收集超声后的菌液，4℃条件下12000rpm离心20min。沉淀中呈白色致密块即为包涵体。
(3)用玻璃棒将包涵体上的菌体残渣刮去，用washing buffer将包涵体悬起，用超声裂解方法进一步纯化蛋白(超声4s，间隙10s，40次，250w)，离心，收集沉淀(4℃条件，12000rpm离心20min)。此步骤重复三次。再用resuspension buffer将包涵体沉淀悬起，并超声裂解一次，离心收集包涵体(4℃条件，12000rpm离心20min)。注：每次超声裂解离心过后，都需要用玻璃棒将表面的菌体残渣尽量刮去。
(4)离心收集的包涵体，将上清除去，倒置控干，称重，按30mg的包涵体加入1mLdissolution buffer的比例加入dissolution buffer溶解，4℃条件搅拌溶解过夜。离心收集上清(4℃条件，12000rpm离心20min)，将上清分装后-20℃冻存。
通过上述方法，分别获得了β2m包涵体蛋白和重链包涵体蛋白。
4、包涵体体外复性
(1)配制refolding buffer，将装有refolding buffer的烧杯放置在磁力搅拌器上，转子的搅拌速度为1s转子转一圈较好。用1mL注射器的针头替换5mL或10mL注射器的针头，将替换组合后的注射器固定在烧杯上，在注射器中加入溶解好的包涵体，使其能一滴一滴地慢速滴入refolding buffer中。按最先轻链β2m包涵体蛋白，其次多肽，再次重链包涵体蛋白的顺序加入，以重链包涵体蛋白：轻链β2m包涵体蛋白：多肽＝1：1：3的摩尔比加入。重链包涵体蛋白最好分三次加入，每次加入的时间间隔8-10h，多肽溶解在100-200微升二甲亚砜中一次性注入。
实验组加入的多肽为EGFR599-607多肽片段；对照组加入的多肽为乙肝病毒HBc82-90肽。
(2)将复性结束后的复性液用浓缩杯进行浓缩(在加入浓缩杯之前最好12000rpm，4℃离心20min，尽量去除沉淀以减小沉淀堵住浓缩膜的可能性)，并换液到分子筛缓冲液(含有20mM Tris，50mM NaCl，pH8.0)，当溶液体积最终小于50mL之后换到浓缩管继续浓缩至5mL以内，12000rpm，4℃条件离心10min后取上清准备上样。将准备好的复性浓缩液注入AKTA FPLC，根据Hi load 16/60superdex 200(GE公司，货号为17-1139-01)分子筛层析的结果检测复性效果。分子筛层析过程中，收集各个蛋白峰的样品，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
复性结果由图2所示，EGFR599-607多肽片段在目标位置10-15mL处出现了明显的复合物蛋白峰，而对照组的多肽则没有蛋白复合物峰，说明EGFR599-607多肽片段与HLA-A0201分子具有多肽结合力。
通过T2细胞结合实验和体外重折叠实验，可以看出本发明所述的EGFR599-607多肽片段与HLA-A2分子具有很好的多肽结合力。
实施例3、昆虫杆状病毒表达系统表达热休克蛋白gp96
pFastBacTM1空载质粒购自普如汀生物技术(北京)有限公司，产品号BioVector1058 19-1。
DH10BacTME.coli(简写为DH10Bac)购自北京原平皓生物技术有限公司，产品号CL108-01。
HiTrap-Q Sepharose：层析柱为HiTrap Q HP，购自GE公司，产品号17-1153-01，层析柱的内径和柱长是0.7×2.5cm。
Superdex 200 10/300GL：层析柱为Superdex 200 10/300GL，购自GE公司，产品号17-5175-01，层析柱的内径和柱长是1.0×3.0cm。
一、构建pFastBacTM1-gp96质粒
1、gp96引物的设计与合成：以GenBank中人gp96基因的序列为模板，序列号为NM_003299，其基因序列如SEQ ID NO.8所示，其编码氨基酸序列如序列SEQ ID NO.9所示。在gp96基因5’端加入EcoRI酶切位点，3’端加入XbaI酶切位点。用于PCR扩增的正向引物序列为：5’-GGAATTCATGGGCAGCAGCCATCAT-3’；反向引物序列为：5’-GCTCTAGACTATTACAATTCATCTTTTTC-3’，委托上海生工生物工程技术服务公司合成该引物，测序验证引物的序列正确无误。
2、提取人肺癌细胞A549(Number:CCL-185TM)的总mRNA,反转录合成cDNA。
3、以步骤1的cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因。
4、用EcoRI和XbaI双酶切gp96的PCR产物，回收酶切产物。
5、用EcoRI和XbaI双酶切pFastBacTM1空载质粒，回收酶切产物。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到连接产物。
7、将连接产物转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞(购自北京原平皓生物技术有限公司，产品号CL108-01)，通过挑取单克隆获得重组大肠杆菌的质粒。用PCR验证阳性克隆，用于PCR验证的pUC/M13正向引物序列为：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’,反向引物序列为：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’。PCR产生了一个含有目的序列的4.7-5kb扩增子随后对其进行测序。测序结果验证正确的为阳性重组质粒。该阳性重组质粒是能表达杆状病毒的质粒，在由DH10Bac自身含有的的辅助质粒的帮助下发生重组，重组后的质粒可以同时表达杆状病毒和目的蛋白，通过观察病毒侵染情况可以部分反应目的蛋白的表达情况。
二、利用昆虫细胞表达gp96重组蛋白
提取阳性重组质粒，利用Cellfectin II reagent(Life technologies,货号：10362-100)将阳性重组质粒转染到Sf9细胞(购自普如汀生物技术(北京)有限公司，产品号NTCC411123)中。将转染阳性质粒的Sf9细胞培养72h，通过细胞病变情况表明含有重组的一代杆状病毒(命名为P1毒)已经释放到培养基中，收取细胞上清获得P1毒。加适量P1毒到Sf9单层细胞中，控制细胞浓度达到1×106细胞/mL，加入的P1量(mL)＝MOI(pfu/cell)×number of cells/titer of viral stock(pfu/mL)，其中MOI(multiplicity ofinfection)取0.05-0.1，titer of P1 viral stock取1x106-1x107pfu/mL，之后在27℃条件下培养72h，4000rpm离心5min，收取上清获得二代毒(命名为P2毒)。将适量P2毒加到100mLSf9的悬浮细胞中，控制细胞浓度达到1.6×106细胞/mL，在27℃条件下100-120rpm培养72h，扩增获得三代毒(命名为P3毒)。将P3毒进行westernblotting杂交，结果表明gp96蛋白已经在Sf9细胞中表达。
随后，在新鲜的Sf9细胞(1.5×106细胞/mL，300mL)中加入适量P3毒，27℃条件下100-120rpm在Insect-XPRESSTMProtein-free Insect Cells medium with L-Glutamine培养基(Catalog No:12-730Q)中进行悬浮培养。感染72小时后，将悬浮液在7000rpm转速条件下离心20分钟得到清澈的上清液，经过0.22mm滤膜滤过后，再经过HiTrap Q HP柱，Superdex 200 10/300GL离子柱纯化后得到较纯的gp96蛋白。gp96蛋白经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。将上述收集的穿透用PBS缓冲液换液，浓缩，采用BCA法测定蛋白浓度，最后将蛋白分装，贮存于-80℃。
上述中，HiTrap Q HP柱，Superdex 200 10/300GL离子柱纯化的具体方法为：
1)将感染后收集的上清液进行HiTrap-Q Sepharose离子交换层析，具体包括如下步骤：
(a)将上述步骤得到的上清液过滤后上样于层析柱，流速为1mL/min；
(b)用5mL PBS缓冲液洗涤步骤(a)的层析柱，流速为1mL/min，所述PBS缓冲液含有200mM NaCl，PBS缓冲液的pH为7.5；
(c)用10mL的PBS缓冲液洗涤步骤(b)的层析柱，流速为1mL/min；所述PBS缓冲液含有300mM NaCl，PBS缓冲液的pH为7.5；
(d)用3mL的PBS缓冲液洗涤步骤(c)的层析柱，流速为1mL/min，得到的洗脱液即为含有gp96蛋白的提取物；所述PBS缓冲液含有600mM NaCl，PBS缓冲液的pH为7.5；
2)将洗脱液进行Superdex 200 10/300GL分子筛层析，具体包括如下步骤：
(a)将HiTrap-Q Sepharose离子交换层析所得gp96蛋白提取物通过50Kd超滤管浓缩，用pH为7.5的PBS换液，浓缩为终体积为1mL的浓缩液，所述浓缩液中含有gp96蛋白；
(b)通过上样环将步骤(a)的浓缩液(含gp96的1mL PBS溶液)上样于层析柱，流速为0.25mL/min；
(c)用PBS缓冲液洗涤层析柱，流速为0.25mL/min，收取gp96蛋白；将(c)收集的gp96蛋白用pH为7.5的PBS缓冲液换液，浓缩，测定gp96蛋白浓度后分装、贮存。
实施例4、多肽刺激HLA-2.1/Kb转基因鼠特异性CTL的产生
利用实施例3中制备得到的昆虫细胞表达的gp96蛋白进行动物免疫。
实施例中用于动物免疫的多肽购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度为95％以上。
实验组的动物免疫多肽为EGFR599-607多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；对照组的动物免疫多肽为乙肝病毒HBc82-90肽，其氨基酸序 列如SEQ ID NO.3所示。
一、分组免疫
HLA-A2.1/Kb转基因小鼠(购自Jackson laboratory)进行分组，每组10只，分别免疫。
第一次免疫多肽EGFR599-607多肽片段(50微克/只)、gp96蛋白(20微克/只)；第二次免疫多肽EGFR599-607多肽片段(50微克/只)、gp96蛋白(20微克/只)；第三次免疫多肽EGFR599-607多肽片段(50微克/只)、gp96蛋白(20微克/只)。对照组免疫相同剂量的gp96和乙肝病毒HBc82-90多肽。
进行蛋白免疫前，将用于免疫的gp96蛋白在组装体系中进行组装。组装体系的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl 8g/L,KCl 0.2g/L,KH2PO40.24g/L,Na2HPO4·12H2O3.63g/L；组装条件为55℃反应10min，之后室温放置30分钟。免疫方式为皮下注射，第一次免疫时间为实验第一周、第二次免疫时间为实验第三周、第三次免疫时间为实验第四周。
二、免疫相关因子的分析
取小鼠脾细胞进行ELISPOT分析。(ELISPOT检测试剂盒购自BD公司，产品号551083，操作方法见试剂盒产商说明书)，实验结果见图3。与对照组几乎没有特异性IFN-γ分泌相比，实验组EGFR599-607多肽片段能引起很强的特异性IFN-γ分泌，说明EGFR599-607多肽片段可以在小鼠体内激起较强的特异性T细胞免疫反应，有利于特异性杀伤肿瘤细胞。
实施例5、多肽免疫的抗肿瘤效果
对10例肺癌患者进行鉴定。取病人血液并通过BB7.2单克隆抗体(购自Abcam，货号为ab27728)染色，流式检测，分析其细胞表面HLA-A2分子的表达。选择HLA-A2分子阳性表达的患者进行追踪。待患者术后，取部分 肿瘤组织做石蜡切片，通过免疫组化检测其EGFR表达水平。选择其中EGFR强阳性的患者肿瘤组织进行裸鼠移植实验。
本实施例中用于动物免疫的gp96蛋白是实施例3中制备得到的gp96蛋白。本实施例中用于动物免疫的多肽均购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度为95％以上。实验组的动物免疫多肽为EGFR599-607多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；对照组的动物免疫多肽为乙肝病毒HBc82-90肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本实施例中用于转输的脾脏淋巴细胞来源于实施例4中免疫后的小鼠。
一、人肿瘤组织裸鼠移植
取新鲜肿瘤组织置于无菌平皿内(平皿内放置少许生理盐水或细胞培养液)，将肿瘤组织剪成2-3mm的小块，接种于健康裸鼠前腋窝皮下。待移植的肿瘤生长至100-200mm3时，挑选肿瘤生长均匀的小鼠平均分成两组，每组10只，转输脾脏淋巴细胞。
二、免疫小鼠脾脏淋巴细胞的分离
无菌环境中取脾脏，将脾脏放于200目筛网上，在10mL无血清1640培养基中用玻璃研磨棒研磨，将液体转移到15mL离心管中，1000rpm条件下离心10分钟；弃上清，加入3mL红细胞裂解液于室温裂解2-3分钟，加入10mL PBS缓冲液终止反应，颠倒混匀，1500rpm离心10min；弃上清，用10mL无血清1640培养基(购自Gibco，货号为22400105)洗两遍，1000rpm离心10分钟；弃上清，用5mL含体积分数10％的FBS(购自Hyclone)的无血清1640培养基重悬。
三、淋巴细胞转输
将细胞计数，并用PBS缓冲液清洗一遍，并用PBS缓冲液按1x107/200μL的浓度重悬；将200μL的细胞悬液慢速尾静脉注射至移植肿瘤的裸鼠体内。
四、抗肿瘤效果评价
自初次免疫开始，每隔三天测量一次小鼠肿瘤大小，肿瘤大小按照0.5×长×宽×宽计算。
实验组与对照组之间的比较结果见图4，与对照组相比，实验组的小鼠肿瘤大小在转输淋巴细胞一周后开始下降，第3周时，实验组与对照组肿瘤大小对比如下，实验组VS对照组＝246±23 VS 364±37，P＜0.01。说明EGFR599-607多肽片段具有显著的抗肿瘤能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
。

Claims (11)

1.一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
2.一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的编码基因，其特征在于，编码权利要求1所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体表达权利要求1所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽。
4.一种转化体，其特征在于，包括权利要求3所述的重组载体。
5.一种权利要求1所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
6.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽和佐剂。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂包括gp96蛋白。
8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白为采用昆虫细胞表达系统表达分泌型的gp96蛋白。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白通过昆虫杆状病毒感染的昆虫细胞分泌表达。
10.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白和人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的质量比为1：（0.5-10）。
11.根据权利要求7-10任一项所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；和/或所述gp96蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
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