CN101182355B - 抗菌肽citropin1.18融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程药物领域,具体涉及抗菌肽citropin 1.18融合蛋白基因、含有该基因的重组载体合转化体以及该基因的表达产物、体外酰胺化及其用途。本发明所公开的一种抗菌肽citropin 1.18融合蛋白,含有与抗菌肽citropin 1.18或其片段或其变体融合的抗血管生成肽或其片段或其变体。该融合蛋白能同时直接杀伤肿瘤细胞和抑制新生血管,为抗肿瘤以及和所有与新血管生成相关的疾病治疗提供了一条新的选择。
Description
技术领域
本发明属于基因工程药物领域,具体涉及抗菌肽citropin 1.18融合蛋白基因、含有该基因的重组载体和转化体以及该基因的表达产物和其用途。
背景资料
新生血管生成,是指从既存的成熟血管形成新的毛细血管网络的过程,这个过程对于脊椎动物的生理发育和损伤组织的修复是必需的,同时,许多疾病的病理过程都涉及到新生血管生成,包括肿瘤生长、心血管疾病、糖尿病性视网膜病变、银屑病和风湿性关节炎等疾病(Ortega N,Werb Z..J Cell Sci,2002,115(Pt 22):4201-4214;Sottile J.Biochim Biophys Acta,2004,1654(1):13-22;Hamano Y et al Biophys Res Commun,2005,333(2):292-298)。
肿瘤是一种环境因素与遗传因素互相作用而产生的一类疾病,是细胞中多种基因突变累积的结果。目前,肿瘤化疗技术已经取得了相当的进步,从而使肿瘤患者生存时间明显延长,特别是对白血病、恶性淋巴瘤等治疗有了突破,但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90%以上的实体瘤的治疗未能达到满意的效果。药学家和肿瘤学家越来越深刻地认识到:要提高肿瘤治疗的效果,必须从肿瘤发生发展的机制着手,才能取得新的突破性进展。1971年,Folkman(N Engl J Med,1971,285(21):1182-1186)提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”的观点。肿瘤的生长取决于肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的数量,两者相互依存,任何一种细胞群的增减都会导致另一细胞群的相应增减。
循此思路的研究,已有多种抑制新生血管生成的药物,如肿瘤抑素(tumstatin)、血管生成抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、kringle5、抗-凝血酶III用于抗肿瘤的研究,有的已经进入临床研究阶段,它们通过作用于遗传上稳定,不易产生药物抗性的内皮细胞来抑制肿瘤的生长(R.Kalluri.Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2002,67:255-266;Nyberg P et al.Cancer Res,2005,65(10):3967-3979;Maeshima Y et al.J Biol Chem,2000,275(28):21340-21348)。肿瘤抑素属于胶原蛋白IV α3链的一部分。每一个α3链单体由一个半胱氨酸丰富的N端7S区,中间的三螺旋区和C端球形非胶原区(NC1)组成。三条α3链通过NC1区相互作用、三螺旋区的缠绕、7S区的共价结合构成了三聚体结构。两个三聚体通过NC1区头与头相连。四个三聚体通过7S区共价连接构成胶原蛋白IV的网状结构。肿瘤抑素由MMP-9蛋白水解酶从胶原蛋白IV α3链水解而来,分子量为28kD,由244个氨基酸组成,其中12个氨基酸来源于三螺旋区,232个氨基酸位于NC1区;有两个活性区:一个具有抗肿瘤细胞增殖作用的靠近C端的185~203氨基酸之间,另一个具抗肿瘤血管生成作用的接近N端的54~132氨基酸之间(tum-5)。其抗肿瘤血管生成作用与二硫键无关,在去除二硫键或将二硫键烷基化时,tum-5的活性不受影响。利用这种特性将tum-5分成八个肽,人工合成重叠序列来研究其活性区,研究表明T7肽(74~98)具有与tum-5相同的抗血管生成作用,因此肿瘤抑素抗血管作用活性区可能位于中间的25个氨基酸。同时T7肽还可改造成与其具同等作用的易溶的T8肽(Maeshima Y et al.J Biol Chem,2001,276(34):31959-31968)。
抗菌肽citropin1.18来源于蓝岭树蛙(Litoria citropa)的皮腺分泌物,是16个氨基酸残基组成的活性小分子肽,可通过其C末端带正电荷的极性氨基酸,与肿瘤细胞膜表层带负电荷的磷脂(PS)产生静电引力作用,使多肽聚集于肿瘤细胞膜表面。聚集的多肽呈现α-螺旋结构,非极性的一侧疏水氨基酸借疏水作用伸入细胞膜内层,造成膜内分子位移、质膜穿孔,从而杀伤肿瘤细胞。
目前研究的抗肿瘤药物,基本上都是从抗血管活性、或直接杀伤肿瘤细胞等单方面着手,一定程度上作用手段单一,容易产生耐药性。有些如肿瘤坏死因子α(TNFα),大量的动物试验表明具有强大的抗肿瘤活性,但临床效果不理想,原因是毒副作用太大。
若可以从同时直接杀伤肿瘤细胞和抑制新生血管两方面着手,这为抗肿瘤以及和所有与新血管生成相关的疾病治疗提供了一条新思路。
发明内容
本发明所要解决的技术问题发明一种药物能直接杀伤肿瘤细胞和/或抑制肿瘤新生血管,为抗肿瘤以及和所有与新血管生成相关的疾病治疗提供了一条新的选择。
为解决的上述技术问题,本发明公开了涉及含有与抗菌肽citropin 1.18或其片段或其变体融合的抗血管生成肽或其片段或其变体的蛋白质。
本文将这些融合蛋白通称为“本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白”。本发明的这些融合蛋白表现出直接杀伤肿瘤细胞和/或抑制新生血管活性。
本文所用术语“蛋白质”和“肽”不局限于但包括蛋白质、多肽以及肽。所述抗血管生成肽包括但不限于具有抗血管生成活性的肿瘤抑素(tumstatin)、血管生成抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、kringle5、抗凝血酶III或其片段或其变体。
本发明还涉及双功能(或多功能)融合蛋白,其中抗菌肽cittopin1.18与两个(或多个)抗血管生成肽结合,任选所述抗血管生成肽是不同的抗血管生成肽,包括但不限于具有抑制血管生成之特性的肿瘤抑素(tumstatin)、血管生成抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、kringle5、抗-凝血酶III或其片段或其变体。与仅含有一种抗血管生成肽的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白相比,所述双功能(或多功能)融合蛋白还能表现出协同的抗一血管生成作用。
所述的抗菌肽citropin 1.18为具有序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列的肽。
在一实施例里,所述的抗血管生成肽优选为具有序列表中SEQ IDNO.3所述的氨基酸序列的肽。
在一实施例里,所述抗菌肽citropin 1.18融合蛋白优选为具有序列表中SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列的融合蛋白。在本发明里,该融合蛋白命名为“Tumpin”。
本发明还涉及一类citropin 1.18融合蛋白,其中一个(或多个)抗血管生成肽,任选为不同的抗血管生成肽与两个相同或不同的抗菌肽citropin 1.18分子或其片段或变体结合。
另外,本发明还包括经化学修饰本发明的融合蛋白,以增强生物活性或调制生物活性。
本发明还包括编码抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的核酸分子以及含有这些核酸的载体,被这些核酸载体转化的宿主细胞,以及使用这些核酸、载体和/或宿主细胞制备本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的方法。
本发明还包括经修饰后含有本发明的核酸分子、任选经修饰后可以表达由所述核酸分子编码的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的转基因生物体。
本发明还包括药物组合物,其含有本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和药学可接受的载体。
所述药物组合物可用于预防、治疗或改善患者(如哺乳动物或人)与血管生成有关的疾病、疾病症状或相关失调的方法,所述方法包括给患者施用药物组合物的步骤。
本发明还包括使与使用中高浓度的抗血管生成肽治疗哺乳动物有关的副作用(如注射位点反应、头疼、恶心、发烧、能量水平提高、皮疹、虚弱、腹泻、眩晕、过敏反应、异常低的中性粒细胞水平)潜在最小化的方法,所述方法包括给所述哺乳动物施用与抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。
本发明包括预防、治疗或改善由血管生成引起的相关疾病或失调的方法,所述方法包括给需要所述预防、治疗或改善的哺乳动物施用含有有效量抗血管生成肽(或其片段或其变体)的本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白,以治疗、预防或改善疾病或失调。在本发明中,抗血管生成肽也被称为“治疗性蛋白质”。
另外,本发明还涉及可用于以下方面的应用和方法:抑制肿瘤细胞和/或内皮细胞增殖和/或迁移;抑制肿瘤诱导的血管生成;抑制原发性肿瘤和转移的生长或促进其消退;以及治疗癌症、糖尿病性视网膜病、进行性黄斑变性或类风湿性关节炎和所有与血管生成相关的疾病。
本发明所公开的含有与抗菌肽citropin 1.18或其片段或其变体融合的抗血管生成肽或其片段或其变体的蛋白质能同时直接杀伤肿瘤细胞和抑制新生血管,为抗肿瘤以及和所有与新血管生成相关的疾病治疗提供了一条新的选择。
附图说明
图1Tumpin融合基因的模式图。
图2重组质粒Tumpin/pMAL-c2X cDNA的构建图。
图3蛋白SDS-PAGE电泳图。
图4一实施例中,酰胺化Tumpin的ESI-MS图谱。
图5一实施例中,酰胺化Tumpin抑制内皮细胞增殖试验。
图6一实施例中,酰胺化Tumpin对NCI-H640细胞毒活性实验。
图7一实施例中,酰胺化Tumpin对1990细胞毒活性实验。
图8一实施例中,酰胺化Tumpin抑制体外管状结构生成实验。
图9重组质粒Tumpin/pGEX-4T-3cDNA的构建图。
具体实施方式
下文将进一步详细讨论本发明的多个方面。
本文所用“抗菌肽citropin 1.18”来源于蓝岭树蛙(Litoria citropa)的皮腺分泌物,是16个氨基酸残基组成的活性小分子肽,可通过其C末端带正电荷的极性氨基酸,与肿瘤细胞膜表层带负电荷的磷脂(PS)产生静电引力作用,使多肽聚集于肿瘤细胞膜表面。聚集的多肽呈现α-螺旋结构,非极性的一侧疏水氨基酸借疏水作用伸入细胞膜内层,造成膜内分子位移、质膜穿孔,从而杀伤肿瘤细胞。抗菌肽citropin 1.18的氨基酸序列见SEQ ID NO.1,其cDNA序列见SEQID NO.2。
本文所用“肿瘤抑素”(tumstatin)分子量为28kd,由244个氨基酸组成,包括胶原IVα3的NC1活性区域的232个氨基酸和中间3股螺旋区C-端的12个氨基酸。肿瘤抑素可能是由肾、肺和睾丸的基膜释放的,这些组织富含特定的胶原IVα3链。现有的假说认为生理水平的肿瘤抑素是基膜重构的一种反应产物。
本文所用“T8”(Tumstatin69~95)分子量为3.2kd,由27个氨基酸组成,来源于Tumstatin中具抗肿瘤血管生成作用的接近N端的54~132氨基酸(tum-5)。Tumstatin(肿瘤抑素)可能是由肾、肺和睾丸的基膜释放的,其有两个活性区:一个具有抗肿瘤细胞增殖作用的靠近C端的185~203氨基酸之间,另一个具抗肿瘤血管生成作用的接近N端的54~132氨基酸之间(tum-5)。tum-5的抗肿瘤血管生成作用与二硫键无关,在去除二硫键或将二硫键烷基化时,tum-5的活性不受影响。利用这种特性将tum-5分成八个肽,人工合成重叠序列来研究其活性区,研究表明T8肽(69~95)具有与tum-5相同的抗血管生成作用,因此肿瘤抑素抗血管作用活性区可能位于中间的25个氨基酸。T8(tumstatin69-95)的氨基酸序列见SEQ ID NO.3,其cDNA序列见SEQID NO.4。
本发明所用的肿瘤抑素表现出抗血管生成活性,还可进一步具有其它的优良特征,例如增加的生物可利用度,和/或稳定性,或降低的宿主免疫识别。
使用本领域已知的方法即可鉴定出可用于本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的活性片段及其变体,所述方法包括列入本文作为参考的专利和参考文献中描述的那些方法。
本文所用“血管生成抑素”(angiostatin)于1994年O’Reilly etal首次从Lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分离得到,系纤溶酶原降解产物,Mr 38000,由350个氨基酸残基组成,特异性作用于内皮细胞,抑制血管生成。研究表明,Kringle区是血管抑素的抗血管生成作用的关键结构。所谓Kringle区为三个二硫键组成的环状区域,纤溶酶原有5个串联的Kringle区,除Kringle 4外,Kringle 1,2,3,5的产物都分别有程度不同的抑制血管生成活性。血管抑素具有前4个Kringle区。血管抑素的作用机制可能包括:(1)抑制内皮细胞表面ATP合成酶的活性;(2)抑制VEGF和bFGF活化内皮细胞细胞外信号调节酶(ERK-1,ERK-2),抑制内皮细胞迁移;(3)抑制内皮细胞的增生;(4)抑制纤溶酶活性,阻止内皮细胞迁移;(5)诱导内皮细胞凋亡;(6)抑制血管生成素的产生。血管抑素已成功治疗多种肿瘤动物模型,如:纤维肉瘤,黑色素瘤,前列腺癌,卵巢癌等。
在一个实施方案中,本发明所用的血管生成抑素的氨基酸序列见GI:19111150。
本发明所用的血管生成抑素表现出抗血管生成活性,还可进一步具有其它的优良特征,例如增加的生物可利用度,和/或稳定性,或降低的宿主免疫识别。
使用本领域已知的方法即可鉴定出可用于本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的活性片段及其变体,所述方法包括列入本文作为参考的专利和参考文献中描述的那些方法。
本文所用内皮抑素(endostatin)是O’Reilly等于1997年首次在患内皮细胞瘤的小鼠血清中分离获得的,是大分子胶原蛋白XVIII的羧基末端非胶原区片段,由183个氨基酸残基组成,相对分子质量为20kD。其抗肿瘤血管生成作用强于angiostatin。endostatin能特异地抑制内皮细胞增生并明显抑制肿瘤的生长和转移。用endostatin处理牛肺动脉内皮细胞可致细胞凋亡,且可明显减少抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl的产生,但在其它非内皮细胞中则未观察到这种作用,提示endostatin可能选择性地引起内皮细胞凋亡。近来研究发现,endostatin也可通过与纤维母细胞生长因子竞争及通过阻止G0/G1期向S期转变等不同途径抑制内皮细胞增殖。endostatin除单纯使用具有抗肿瘤活性外,作为一类新型抗肿瘤药物还可以与传统的化疗、放疗联合应用,具有明显的协同作用。目前endostatin已在不同肿瘤中进入临床试验期,并在肺癌、乳腺癌中显示出较好的疗效。我国SFDA已批准重组的endostatin作为实验性药物上市。
本发明所用的内皮抑素表现出抗血管生成活性,还可进一步具有其它的优良特征,例如增加的生物可利用度,和/或稳定性,或降低的宿主免疫识别。
使用本领域已知的方法即可鉴定出可用于本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的活性片段及其变体,所述方法包括列入本文作为参考的专利和参考文献中描述的那些方法。
本文所用kringle5是纤溶酶原中存在的、内皮抑素结构以外的纤溶酶原内部片段。Kringle 5显示出与纤溶酶原前4个kringle结构域约50%的序列同一性和结构相似性(Cao,Y et al,J Biol Chem.Vol.271,No 46,pp 29461-29467,1996;Cao,Y etal,J Biol Chem.Vol.272,No36,pp 22924-22928,1997和Lu H,et al;BiochemBiophysical Research Cornmunications,Vol.258,pp 668-673,1999)。
本发明所用的“Kingie 5”肽表现出抗血管生成活性,还可进一步具有其它的优良特征,例如增加的生物可利用度,和/或稳定性,或降低的宿主免疫识别。
使用本领域已知的方法即可鉴定出可用于本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的活性片段及其变体,所述方法包括列入本文作为参考的专利和参考文献中描述的那些方法。
Alphastatin是Carolyn等于2004年在对纤维蛋白原(fibrinogen)不同片断对血管生成活性影响的分析后发现的具抑制血管生成功能的内源性物质,由24个氨基酸组成,是现阶段发现的最小内源性肽段血管生成抑制物质。Alphastatin主要通过抑制内皮细胞的迁移和管状化而发挥抑制血管生成作用,但具体的作用机制尚不清楚。Alphastatin抑制血管生成活性强,在动物实验中,使用较低剂量即能获得很好抗肿瘤活性(0.025mg/kg/d),有较好的潜在临床应用前景。
在一个实施方案中,Alphastatin的氨基酸序列和DNA序列参见Staton等的报道(Staton CA et al.,Blood 2004;103(2):601-6)。)
本文所用“抗菌肽citropin 1.18融合蛋白”指的是至少一个抗菌肽citropin 1.18(或其片段或变体)分子与至少一个治疗性蛋白质(或其片段或变体)分子融合形成的蛋白质。
本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白含有至少一个治疗性蛋白质片段或变体以及至少一个抗菌肽citropin 1.18片段或变体,彼此通过例如基因融合(即通过翻译核酸表达抗菌肽citropin 1.18融合蛋白,在所述核酸中,编码全部或部分治疗性蛋白质的多核苷酸与编码全部或部分抗菌肽citropin 1.18的多核苷酸框内连接)相互连接。
在一个实施方案中,本发明提供了抗菌肽citropin 1.18融合蛋白,其含有治疗性蛋白质和抗菌肽citropin 1.18,或由它们组成。在其它实施方案中,本发明提供了抗菌肽citropin 1.18融合蛋白,其含有治疗性蛋白质的生物活性和/或治疗活性片段和抗菌肽citropin1.18,或由它们组成。
在一个实施方案中,抗菌肽citropin 1.18融合蛋白含有抗菌肽ci tropin 1.18作为N-末端部分,含有治疗性蛋白质作为C-末端部分。或者,也可使用含有抗菌肽citropin 1.18作为C-末端部分,含有治疗性蛋白质作为N-末端部分的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。
在其它实施方案中,抗菌肽citropin 1.18融合蛋白具有与抗菌肽citropin 1.18N-末端和C-末端融合的治疗性蛋白质。在一个实施方案中,在N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是相同的治疗性蛋白质。
在另一个实施方案中,在N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质。在另一个实施方案中,在N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是可用于治疗或预防相同疾病的、不同的治疗性蛋白质。在另一个实施方案中,在N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是可用于治疗或预防本领域已知一般同时出现于患者身上的疾病的、不同的治疗性蛋白质。
另外,本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白可在融合部分之间包括接头肽,以在组成成分之间提供较大的物理间距,从而使治疗性蛋白质部分的可靠近性最大化,例如用于结合其相应的受体。接头肽可由易弯曲或更刚性的氨基酸组成。
因此,如上所述,本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白可具有下式:R2-R1、R1-R2、R1-L-R2-L-R1、R1-L-R2、R2-L-R1或R2-L-R1-L-R1,其中R1是至少一个治疗性蛋白质,肽或多肽序列(包括其片段或变体),但不必是相同的治疗性蛋白质,L是接头肽,R2是抗菌肽citropin 1.18序列(包括其片段或变体)。接头肽包括例如:(GGGGS)N或(GGGS)N或(GGS)N,其中N是大于或等于l的整数,G表示甘氨酸,S表示丝氨酸。当R1是两个或多个治疗性蛋白质、肽或多肽序列时,任选通过接头连接这些序列。
本文所用“治疗性蛋白质”指的是具有抑制血管生成治疗和/或生物活性的抗血管生成肽,例如具有一种或多种治疗和/或生物活性的具有抑制血管生成之特性的肿瘤抑素、血管生成抑素、内皮抑素、kringle5、抗-凝血酶III或其片段或其变体。因此,本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白至少含有一治疗性蛋白质的片段或变体。
另外,术语“治疗性蛋白质”可指治疗性蛋白质的内源性或天然关联物。变体包括突变体、类似物和模拟物以及同系物,包括治疗性蛋白质的内源性或天然关联物。
显示出“治疗活性”的多肽或具有“治疗活性”的蛋白质指的是:具有一种或多种与治疗性蛋白质有关的已知生物和/或治疗活性的多肽,例如本文所述的或本领域已知的一种或多种治疗性蛋白质。作为一个非限制性的例子,“治疗性蛋白质”是可用于治疗、预防或改善疾病的蛋白质。本文所用的“治疗活性”或“活性”可指其效果与希望在人或非人哺乳动物或其它物种或生物体中出现的治疗结果一致的活性,可以在体内或体外测定治疗活性。例如,可以在细胞培养物中检测所需的效果。对于多种本领域已知的治疗性蛋白质而言,所述体外或细胞培养试验一般是容易做到的。
另外,可通过结合一个或多个寡糖基团来修饰对应于本发明抗菌肽citropin 1.18融合蛋白中治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质。被称为糖基化的这种修饰可显著影响蛋白质的物理特性,对于蛋白质的稳定性、分泌和定位也很重要。所述修饰详细描述于美国临时申请流水号60/355,547和WO 01/79480(列入本文作为参考)。
可以修饰对应于本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质及其类似物和变体,以使作为对其核酸序列进行操作的结果,或由于其表达的其它条件所致,对其进行表达的宿主细胞改变了一个或多个位点处的糖基化。例如,通过取消或导入糖基化位点,例如通过取代或缺失氨基酸残基,如用谷氨酸胺取代天冬酰胺即可产生糖基化异构体,或者通过在不会使其糖基化的宿主细胞,如大肠杆菌或糖基化一缺陷酵母中表达蛋白质,即可产生非糖基化的重组蛋白质。这些方法的例子更详细地描述于美国临时申请流水号60/355,547和WO 01/79480(列入本文作为参考)中并且是本领域已知的。
本文所用“片段”还涉及所述治疗性蛋白质、抗菌肽citropin 1.18和/或本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的片段。即使从蛋白质的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸会导致治疗性蛋白质、抗菌肽citropin 1.18和/或抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的一或多种生物功能的修饰或损失,但仍会保留其它的治疗活性和/或功能活性(例如生物活性、多聚化的能力、与配体结合的能力)。
因此,对应于本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质片段包括全长蛋白质,以及从对应多肽氨基酸序列的氨基末端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还包括编码这些多肽的多核苷酸。
另外,对应于本发明抗菌肽citropin 1.18融合蛋白中抗菌肽citropin 1.18多肽片段包括全长多肽以及从对应多肽氨基酸序列的氨基末端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还包括编码这些多肽的多核苷酸。
如上所述,即使从参照多肽(如治疗性蛋白质和/或抗菌肽citropin 1.18)的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸会导致蛋白质一或多种生物功能的修饰或损失,但仍会保留其它的功能活性(例如生物活性、多聚化的能力、与配体结合的能力)和/或治疗活性。
本文所用“变体”指的是与参照核酸或多肽不同,但保留了其必需特性的多核苷酸或核酸。一般说来,变体总体上非常类似,很多区域与参照核酸或多肽相同。
本文所用“变体”指的是所述治疗性蛋白质部分、抗菌肽citropin1.18部分或本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白部分在序列上与治疗性蛋白质、抗菌肽citropin 1.18和/或本发明的抗菌肽citropin1.18融合蛋白有所不同,但如本文其它地方所述或如本领域所知,前者仍能保留其至少一种功能和/或治疗特性。一般说来,变体总体上非常类似,很多区域与对应于本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质、对应于本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的抗菌肽citropin 1.18、和/或本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的氨基酸序列相同。
本发明还包括编码这些变体的核酸。所述变体包括根据本领域已知的一般规则进行选择,因而对活性影响不大的缺失、插入、倒位、重复和取代。
本发明的多肽可由肽键或经修饰的肽键互相连接的氨基酸,即肽等组成,并可含有除了这20个由基因编码的氨基酸以外的氨基酸。可以用其它天然的方法,如翻译后加工,或通过本领域众所周知的化学修饰技术对多肽进行修饰。基础教科书和更详细的专著以及多篇研究文献中详细描述了所述修饰。修饰可发生在多肽中的任何位置,包括肽主链,氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应懂得给定多肽的几个位点处可存在相同或不同程度的相同类型的修饰。
另外,给定多肽可含有多种类型的修饰。例如,多肽可以是分支的,多肽也可以是具有或不具有分支的环形。环形、分支、和带分支的环形多肽可以由翻译后的天然过程产生,也可以通过合成方法制备得到。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、与黄素(flavin)共价结合、与血红素组成成分(heme moiety)共价结合、与核苷酸或核苷酸衍生物共价结合、与脂质或脂质衍生物共价结合、与磷脂酰肌醇共价结合、交联、环化、二硫键化、脱甲基化、共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、PEG修饰、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化(prenylation)、外消旋化、硒化、硫酸盐化(sulfation)、由转运-RNA介导在蛋白质上添加氨基酸(如精氨酰化)和遍在蛋白化。
本发明包括的其它翻译后修饰包括例如:N-联或O-联糖链,加工N-末端或C-末端,使化合物组成成分与氨基酸主链结合,对N-联或O-联糖链进行化学修饰,以及作为原核宿主细胞表达的结果添加或缺失N-末端甲硫氨酸残基。也可以用例如但不限于如药物的化学治疗剂和/或如酶、荧光、同位素和/或亲和标记的可测标记来修饰抗菌肽citropin 1.18融合蛋白,以检测和分离蛋白质。所述修饰的例子是本领域已知的,参见例如美国临时申请流水号60/355,547和WO 01/79480(列入本文作为参考)。
融合蛋白的表达
通过从酵母、如细菌的微生物或人或动物细胞系中分泌,可产生重组分子形式的本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。任选从宿主细胞中分泌多肽。
许多表达系统是已知的和可用的,包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽袍杆菌),酵母(例如酿酒酵母、乳克鲁维酵母)和巴斯德毕赤酵母),丝状真菌(例如曲霉),植物细胞,动物细胞和昆虫细胞。
本发明包括编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸以及含有这些多核苷酸的载体、宿主细胞和生物体。
本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的抗菌肽citropin1.18融合蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸、载体、宿主细胞和生物体。
用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来,多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞,包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如F.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992)和Sambrook et al.(1989)。然而,需注意的是:当使用复制缺损的逆转录病毒载体时,病毒增殖一般仅发生在互补的宿主细胞中。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使DNA与载体可操作相连。例如,可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段,所述的两种聚合酶用其3’,5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端,并用其聚合活性补平3’-凹端。因此,这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶,如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此,反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段,并连接至已用酶裂解的表达载体中,所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体久PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点,并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA,UGA或UAG)。
如上所述,表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性;以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于:细菌细胞,如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞;真菌细胞,如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母);昆虫细胞,如果蝇S2和夜蛾SF9细胞;动物细胞,如CHO,COS,NSO,293和Bowes黑素瘤细胞;和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。
在一个实施方案中,可将编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸与信号序列融合,所述信号序列能介导本发明的蛋白质定位于原核或真核细胞的特定区室,和/或能介导本发明的蛋白质从原核或真核细胞中分泌出来。
本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞,所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达,或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下,某些启动子启动的表达会升高;因此,可以控制经基因改造的多肽的表达。另外,不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法,即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中,如Davis et al.,BasicMethods In Molecular Biology(1986)。
编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来,可在沉淀物,如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒,可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装,再转导至宿主细胞。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞,即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如,可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞,使用如Southem(1975)J.Mol.Biol.95,503或Berent et al(1985)Biotech.3,208所述的方法,检测其DNA内容物中DNA的存在。或者,使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白较为有利,所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中,可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。
在一些实施方案中,可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。在其它实施方案中,可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白,所述层析柱有:Q sepharose FF柱、SP sepharose FF柱、Qsepharose High Performance柱、Blue sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF或Methyl柱。
另外,可使用国际公开号WO 00/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。
本发明提供了通过施用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸来治疗与新血管生成相关之疾病的方法。
可以用本发明的多核苷酸和多肽或激动剂或拮杭剂治疗的恶性和转移疾病包括但不限于本文所述和本领域已知的恶性肿瘤、实体肿瘤和癌症(有关所述疾病的评述可参见Fishlnan等,Medicine,2d Ed.,J.B.Lippincott Co.,Philadelphia(1985))。
因此,本发明提供了治疗血管生成相关疾病的方法,所述方法包括给需要治疗的个体施用治疗有效量的本发明的抗菌肽citropin1.18融合蛋白和/或编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸。例如,可以在多种旨在治疗癌症或肿瘤的方法中使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸。
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸治疗的癌症包括但不限于实体肿瘤,包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食管癌、睾丸癌、肝脏癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾脏癌、膀胱癌、甲状腺癌;原发性肿瘤和转移;黑素瘤;胶质母细胞瘤;卡波济氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma);平滑肌肉瘤;非-小细胞肺癌;结肠直肠癌;晚期恶性肿瘤;和血液肿瘤,如白血病。例如,可以局部传递本发明的融合蛋白和/或编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸,以治疗诸如皮肤癌、头颈肿瘤、乳腺癌和卡波济氏肉瘤的癌症。
本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸也可用作内皮细胞增殖和肿瘤-诱导的血管生成的抑制剂。
本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸可用于治疗除癌症外的其它与血管生成有关的疾病。这些疾病包括但不限于:良性肿瘤(benign tumor),例如血管瘤、听神经瘤)、神经纤维瘤、沙眼和脓性肉芽肿;动脉粥样硬化性斑(artheroscleric plaque);眼血管生成病(ocular angiogenic disease),如糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)、早熟视网膜病(ret inopathy of prematuri ty)、黄斑变性(macular degeneration)、角膜移植物排斥(corneal graft rejection)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma);晶体后纤维增生症(retrolental fibroplasia)、发红(rubeosis)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、眼色素层炎(uvietis)和翼状背肉(Pterygia)(异常血管生长);类风湿性关节炎;牛皮癣;创伤愈合延迟(delayedwound healing);子宫内膜异位(endometriosis);血管发生(vasculogenesis);肉芽发生(granulateon);肥大性瘢痕(hepe-trophic scar)(瘢痕疙瘩(keloids));骨不连合性骨折(nonunion fracture);硬皮病(scleraoderma);沙眼;血管粘连(vascular adhesion);心肌血管生成(myocardial angiogenesis);冠状侧突(coronay collaterall);大脑侧突(cerebral collateral);动静脉畸形(arteriovenous malformation);局部缺血性肢体血管生成(ischemic limb angiogenesis);奥斯勒综合征(Osler-Webber Syndrome);斑新血管生成(Plaque neovasculari zation);毛细管扩张(telangiectasia);血友病关节(hemophiliac joints);血管纤维瘤(angiofibroma);纤维肌性发育不良症(bromuscular dysplasia);伤口肉芽发生(wound granulation);节段性回肠炎(crohn’s disease);和动脉粥样硬化(atherosclerosis)。
另外,本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白可用于治疗或预防疾病。例如,本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白可用作预防或治疗剂以预防原发性肿瘤和转移的生长或促使其消退;并可用于治疗癌症、糖尿病性视网膜病、进行性黄斑变性或类风湿性关节炎。
另外一方面,编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的重组载体可用作基因治疗方案的一部分,用于传递治疗有效量的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。将核酸体内导入细胞的一种方法是使用含有核酸的病毒载体,所述核酸编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白。用病毒载体感染细胞的好处是大部分靶细胞能接受到核酸。另外,病毒载体内编码的分子,如病毒载体所含cDNA编码的分子能在接受病毒载体核酸的细胞中有效表达。所述抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的延长血浆半衰期甚至能补偿有可能较低的表达水平。
逆转录病毒载体和腺-伴随病毒载体可用作重组基因传递系统,用于在体内转移编码抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的外源核酸分子。这些载体能有效地将核酸传递至细胞内,转移的核酸能稳定整合至宿主的染色体DNA中。
可通过多种方法中的任一种将编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白之基因的基因传递系统导入患者。例如,可通过静脉内注射全身性导入基因传递系统的药物制品,由于基因传递载体提供的转染特异性,控制受体基因表达的转录调节序列所致的细胞一类型或组织一类型表达或其组合,靶细胞中蛋白质的特异性转导占优势。
可通过任何包括非肠道(如皮下或肌内)注射或静脉内输注的常规方法施用本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白或其制剂。治疗由单个剂量或一段时间内的多个剂量组成。另外,与不同抗菌肽citropin 1.18融合的治疗性蛋白质相比,施用单个剂量或多个剂量的频率较低。尽管本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白可以单独施用,但与一种或多种可接受载体一起作为药物制剂的形式被提供也是合乎需要的。在与抗菌肽citropin 1.18融合蛋白相容并且对其受体无害的意义上说,载体必须是“可接受的”。一般说来,载体是无菌和无热原质的水或盐水。
可以方便地以单位剂量形式提供配制剂,可通过药学领域众所周知的任何方法制备所述配制剂。所述方法包括使抗菌肽citropin 1.18融合蛋白与构成一种或多种辅助成分的载体联合的步骤。一般说来,通过使活性成分与液体载体或经细分的固体载体或这两者均匀和密切地混合,然后,必要时使产品成形即可制备出配制剂。
适用于非肠道给药的配制剂包括含水和不含水的无菌注射溶液,其中可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂适用于欲治疗受体的溶质;以及含水和不含水的无菌悬浮液,其中包括悬浮剂和增稠剂。可以单位剂量或多剂量容器,例如密封的安氛、小管或注射器提供制剂,也可将所述制剂储存于仅需要在使用前添加无菌液体载体。可由无菌粉末制备临时用的注射溶液和悬浮液。
本发明还提供了治疗和/或预防疾病(例如本文所述的一种或多种疾病)的方法,所述方法为给受试者施用处于药物可接受载体中的、有效量的本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白或编码本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的多核苷酸(“抗菌肽citropin 1.18融合蛋白多核苷酸”)。
通过本领域众所周知的提到如生物半衰期、生物可利用度和毒性的参数的方法,包括利用使用本领域技术人员众所周知的方法进行的常规体外和体内研究所述的研究中得出的数据,可以测定欲施用的本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸的有效剂量。以与常见医学实践相一致的方式配制抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸并确定其剂量,此时应考虑到各个患者的临床条件(特别是单独用抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸治疗的副作用)、传递位点、给药方法、给药的时间安排和操作者已知的其它因素。
因此,由这些考虑因素来决定用于本文目的的“有效量”。例如,决定欲传递之物质的有效量取决于多个因素,包括例如物质的化学结构和生物活性,患者的年龄和体重,需要治疗的准确病情及其严重程度和给药的途径。治疗的频率取决于多个因素,如每个剂量施用的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白或多核苷酸重组载体的量,以及受试者的健康状况和病史。护理的医生或兽医可决定精确的量、剂量数目和剂量的时间安排。
本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和多核苷酸可施用给任何动物,优选施用给哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、马和猪,特别优选施用于人。
作为一般性的建议,本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的配制剂量或给药频率(在未融合的治疗性蛋白质的摩尔基础上)应低于未融合的治疗性蛋白质。治疗有效剂量指的是足以导致症状改善或疾病稳定化或患者存活期延长或生命质量改善的化合物的量。
可通过口服、直肠、非肠道、淋巴间隙内、阴道内、腹膜内、局部(通过粉末、软膏、凝胶、滴剂或经皮膏药)、口腔、或作为口或鼻喷雾剂施用抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸。
“药物可接受载体”指的是任何无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、胶囊材料或配制助剂。
本文所用术语“非肠道”指的是包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和灌注的给药模式。
本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸也适于通过缓释系统给药,所述缓释系统描述于例如美国临时申请流水号60/355,547和WO01/79480(列入本文作为参考)。
在一个实施方案中,为了进行非肠道给药,一般通过在单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液或乳剂)中使所需纯度水平的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸与药物可接受载体混合来配制药品,所述载体就是在所用剂量和浓度下对受体无毒,并且与制剂中的其它成分相容的载体。例如,制剂任选不包括氧化剂和其它已知对治疗剂不利的化合物。
本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸可以单独施用或与其它治疗剂联合施用。可与本发明的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和/或多核苷酸药剂包括但不限于:化学治疗剂、抗生素、类固醇和非类固醇抗炎症剂、常规的免疫治疗剂和/或如美国临时申请流水号60/355,547和WO01/79480(列入本文作为参考)中所述的治疗。组合物可相伴使用,例如作为混合物,分开但同时施用;或依次施用。它包括作为治疗混合物同时施用组合药剂,以及分开但同时(例如通过分开的静脉内线进入相同的个体)施用组合药剂。“联合”给药还包括分开施用首先使用的一种化合物或药剂,接着施用第二种。
适用于本发明的药物组合物包括包含有效量的活性成分以达到其目的的组合物。
发明说明鉴于上文对本发明的一般性描述,参考下文的实施例将更容易理解本,提供下述实施例只是为了阐明而不是限制本发明。
无需进一步描述,可以相信本领域技术人员可使用上文的描述和下文性的实施例来制备和利用本发明中检测到的改变并且实践所要求的方法。因此,下述工作实施例具体描述了本发明的某些实施方案,不能将其看成是对其余内容的限制。
实施例1、Tumpin在大肠杆菌中的表达
1、目的基因的设计:
融合多肽N端为tumstatin(T8)序列,通过多聚甘氨酸的桥连GlyGly Gly Gly Ser连接C端的citropin 1.18序列。由融合肽的氨基酸序列,根据遗传密码在原核生物中的偏爱性,设计得到融合肽基因DNA序列。分别构建目的基因:(1)tumstatin(T8)基因片段,该序列的5’端引入BamH I酶切位点(GGATCC);(2)柔性连接(GGTGGCGGTGGCTCT);(3)citropin1.18序列,其3’端引入终止密码子(TGATAA)及Xho I酶切位点(CTCGAG),以便与表达载体片段连接。
2、单链寡核苷酸的序列(SEQ ID NO.6)的合成委托上海生物工程有限公司进行,合成cDNA总长度为162bp,包括Tumpin cDNA、5′端BamH I酶切位点和3′端Xho I酶切位点参见图1;两个终止密码子TGA和TAA。单链寡核苷酸的序列(SEQID NO.6)拼接及克隆到pGEX-4T-3步骤见图9。
3、DNA序列测定,在Tumpin/pGEX-4T-3cDNA转化的大肠杆菌培养皿上挑取单克隆,摇菌提取质粒DNA测序,结果完全与预计序列相符,表明克隆成功。
二、Tumpin基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的酰胺化、纯化、鉴定
1、重组质粒pMAL-c2X/Tumpin cDNA的构建
重组质粒pMAL-c2X/Tumpin cDNA的构建图见图2。
1)、目的片断pMAL-c2X/Tumpin cDNA的获得
用质粒抽提试剂盒提取pGEX-4T-3/Tumpin cDNA及pMAL-c2X质粒DNA,对pGEX-4T-3/Tumpin cDNA进行BamH I、Xho I双酶切,酶切反应体系为:10×Buffer BamH I:2μl,100×BSA:0.2μl,Tumpin/pGEX-4T-3:8μl(1.2μg),BamH I:1.2μl,Xho I:1.2μl,ddH2O:7.4μl,共20μl,混匀,37℃孵育2h,胶回收试剂盒回收酶切后的Tumpin cDNA片断。对pMAL-c2X质粒进行BamH I、Sal I双酶切,酶切反应体系为:10×Buffer BamH I:2μl,100×BSA:0.2μl,pMAL-c2X:5μl(1μg),BamH I:0.8μl,Sal I:0.8μl,ddH2O:11.2μl,共20μl,混匀,37℃孵育2h,酶切后的pMAL-c2X质粒DNA片断用DNA清洁试剂盒纯化。
2)、连接
连接反应体系:酶切后的pMAL-c2X质粒DNA:4μl(0.5μg),胶回收的Tumpin片段:3μl(0.05μg),10×DNA ligase Buffer:2μl,DNAligase:1μl,ddH2O:10μl,混匀,短暂离心后16℃孵育6h,因为XhoI与Sal I酶切后粘性末端序列互补,故可将Tumpin cDNA片断插入pMAL-c2X质粒中。
2、重组质粒的筛选和鉴定
按氯化钙常规方法制备感受态大肠杆菌BL21(DE3),取上述连接混合液10μl转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)100μl,均匀涂布于LB琼脂培养平板(含Amp100μg/μl),放置隔水式电热恒温培养箱37℃孵育20h。然后从孵育平板中挑取单克隆,接种于5ml液体LB培养基(含Amp100μg/ul)过夜振摇培养。部分菌液保存用于送检DNA序列测定,剩余菌液用质粒提取试剂盒抽提质粒pMAL-c2X/Tumpin cDNA,并用EcoR I和HinddIII进行双酶切鉴定。双酶切后可见到约160bp的片断,说明Tumpin cDNA片断已插入到表达载体pMAL-c2X中。
3、重组pMAL-c2X/Tumpin的表达
挑带有pMAL-c2X/citrostatin cDNA重组质粒的BL21(DE3)单克隆于50ml液体LB培养基中(Amp100μg/ml),37℃、200rpm培养过夜,然后以2%-5%的比例接种到250ml液体LB培养基中,培养4hr,以4%的比例接种到5L发酵培养基中,温度37℃,起始转速200rpm,通气量5L/min,PH7.0,培养过程中通过控制转速、通气量维持溶氧在30%以上,培养约2h-3h后,开始补加少量葡萄糖,至OD600达到10左右,加入终浓度为0.1mM-0.5mM的IPTG诱导,27℃-37℃诱导3-5h后,停止发酵。8000g、4℃离心10min收集菌体,弃上清。
4、超声破菌
菌体以每克菌液加10ml冰冷的裂解缓冲液(0.1mol/L BPS,0.15mol/L NaCl,0.25%Tween 20,10mmol/L 2-巯基乙醇,10mmol/L EDTA)中悬浮,超声破菌,9000g离心30min,收集上清液,弃去残渣。
5、亲和层析纯化
采用Amylose Resin亲合层析柱,层析柱先用柱平衡液(20mMTris-HCL,200mM NaCL,1mM EDTA,1Mm az ide,1Mm DTT)平衡,然后取超声破碎上清液直接上柱,流速<1ml/minute,上样完毕后,以12倍柱体积平衡液淋洗,以柱平衡液+10mM麦芽糖洗脱液洗脱,收集融合蛋白。电泳可见约48KD的条带,纯度在80%以上(参见图3泳道1)。
6、酶切
将收集的融合蛋白测定蛋白含量后,以融合蛋白∶Xa=100∶1的比例加入Xa,室温放置5小时,电泳可见融合蛋白切割率在95%以上,出现42.5kD和0.5KD两条条带,分别是MBP和Tumpin(参见图3泳道2)。
7、分离纯化
纯化的融合蛋白用Xa因子蛋白酶切割后,经缓冲液[PH 8.0,20mmol/L Tris-HCl,20mmol/L NaCl]平衡的Q Sepharose Fast Flow过柱,25-500mmol/L NaCl梯度洗脱,方法参照New England Biolabs公司操作指南进行。MBP在大约125mmol/L NaCl溶液中被洗脱,Tumpin在大约225mmol/L NaCl溶液中被洗脱。Tumpin电泳,经凝胶扫描分析系统分析,纯度达95%以上,分子量与理论值一致(参见图3泳道3)。
8、酰胺化
利用CPD-Y催化体外的转酰胺化反应,可实现对Tumpin的C端修饰。使Tumpin C末端亮氨酸与精胺酰胺交换,产生末端为酰胺的Tumpin(酰胺化Tumpin)。间隔取样HPLC分析发现,反应在90~120min时达到峰值,产率大于50%,反应时间延长产率反而下降,故120min后终止反应。反应产物用HPLC进行纯化,ESI-MS测定分子量为5270,与理论计算的分子量相符,冷冻干燥保存。(参见图4)
实施例2、酰胺化的Tumpin活性
1、细胞的培养
复苏ECV304内皮细胞、成纤维细胞929、肿瘤细胞1990、NCI-H640,自液氮罐中取出保存的冻存管迅速放入37℃水浴中快速解冻,将冻存管放入离心机中,500rpm离心5~10min;在超净台中打开冻存管,吸出原培养液;加入新鲜的培养液1~2ml,小心吹打;吸出吹打后的细胞悬液,装入培养瓶中,并加入培养液6ml,显微镜下观察后置CO2孵箱培养;培养8~10h后观察到大部分细胞贴壁,换液;以后每两天换液一次,细胞长至单层汇合后传代培养;
2、内皮细胞杀伤实验
参照Mosmann的MTT方法进行[10]。ECV304内皮细胞接种于96孔细胞培养板,每孔100μl,37℃、5%CO2培养箱中培养24h,弃去培养液,每孔加入不同浓度的药物培养基100μl,PBS为空白对照,共同孵育48h后,每孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl,4-6小时后弃去培养液,每孔加入100μl DMSO,震荡后测定波长570nm处的吸光度值。根据所得到的OD值计算citrostatin对内皮细胞ECV304的抑制率。计算抑制率(%)=(A空白对照组-A实验组)/A空白对照组×100%。结果表明:Tumpin在剂量为3.1μg/ml时,与未酰胺化的Tumpin相比较,能明显抑制ECV304内皮细胞增殖(p<0.05);在剂量为6.2μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml时,与未酰胺化的Tumpin相比较,能显著抑制ECV304内皮细胞增殖(p<0.01)。酰胺化的Tumpin在剂量为1.5μg/ml、6.2μg/ml、50μg/ml时,与相同剂量的T8与Citropin1.18的混合物(1∶1)相比较,都能明显抑制ECV304内皮细胞增殖(p<0.05);在剂量为3.2μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml时,与相同剂量的T8与Citropin1.18的混合物(1∶1)相比较,能显著抑制ECV304内皮细胞增殖(p<0.01)。(参见图5)
3细胞毒活性分析
取对数生长期的肿瘤细胞(1990细胞、NCI-H640细胞),制成细胞悬液,细胞数为2-2.5×105个/ml,100μl/孔接种96孔细胞培养板,37℃、5%CO2培养箱中培养,观察到孔中细胞长至占各孔表面积的70-80%时,在上述RPMI-1640完全培养基中加入放线菌素D,使终浓度为1.5μg/ml,配成样品稀释液,倍比稀释,将加好样品的96孔板置37℃、5%的CO2培养箱中继续培养22h,弃除培养板中的培养基,每孔加入100μl染色液(1.5mmol/L结晶紫)染色20min。洗去染色液,充分干燥后,每孔加入33%的冰醋酸100μl,充分振荡,于λ=595nm处在测定各孔的吸光值。结果表明:酰胺化的Tumpin对1990细胞、NCI-H640细胞的ED50的浓度分别为10.4μg/ml、20μg/ml。对1990细胞,在剂量为6.2μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml时,与未酰胺化的Tumpin相比较,能明显抑制ECV304内皮细胞增殖(p<0.05);在剂量为3.1μg/ml、50μg/ml、100μg/ml时,与未酰胺化的Tumpin相比较,能显著抑制ECV304内皮细胞增殖(p<0.01)。对NCI-H640细胞,酰胺化的Tumpin在剂量为3.1μg/ml、6.2μg/ml、6.2μg/ml、12.5μg/ml、100μg/ml时,与未酰胺化的Tumpin相比较,能明显抑制ECV304内皮细胞增殖(p<0.05);在剂量为25μg/ml时,与未酰胺化的Tumpin相比较,能显著抑制ECV304内皮细胞增殖(p<0.01)。与相同剂量的T8与Citropin1.18的混合物(1∶1)相比较,酰胺化的Tumpin对1990细胞,在各剂量组都能显著抑制1990细胞的增殖(p<0.01)(参见图6);对NCI-H640细胞,酰胺化的Tumpin在剂量为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml时,与相同剂量的T8与Citropin1.18的混合物(1∶1)相比较,能明显抑制NCI-H640细胞增殖(p<0.05)。(参见图7)
4、体外管状结构生成抑制实验
ECMatrixTM在22~35℃时会很快固态化,因此要在低温0℃以下保存,Dilunent Buffer亦冷冻保存。在实验前一天将装有ECMatrixTM的小瓶在冰上或4℃冰箱过夜,预冷无菌的微量移液管、96孔板、吸管等仪器。
在Eppendorf管中,将100μl 10×的Diluent Buffer加入900μlECMatrixTM溶液中,缓慢混匀,避免空气进入(最好在冷冻室完成此项工作)。
在预冷过的96孔培养板中加入混合均匀的液体,每孔50μl,Tip头与ECMatrixTM溶液应始终保持冰冷。
将加好样的培养板放置在37℃,保持1h以上,使ECMatrixTM溶液形成固态。
收集内皮细胞ECV304使成细胞悬液,每孔接种细胞5000~10000个,加在ECMatrixTM的表面,每孔加完全培养基100μl。同时用培养基稀释样品,按不同浓度加入细胞悬液中,每孔加入50μl。
将培养板放置在37℃、5%CO2的细胞培养箱种,经8~14h孵育,在100×放大的显微镜下观测结果并拍照。
结果显示:在实验组可观察到管状结构数目减少或断裂等现象;在低剂量组(0.2),酰胺化的Tumpin与未酰胺化的Tumpin以及相同剂量的T8与Citropin1.18的混合物(1∶1)相比较,抑制管状结构更明显,有明显性差异。(p<0.05);在中、高(1μg/ml、5μg/ml)时,酰胺化的Tumpin与未酰胺化的Tumpin以及相同剂量的T8与Citropin1.18的混合物(1∶1)相比较,抑制管状结构更明显,有显著性差异(p<0.01)。(参见图8)
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制,所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子,本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上,除了本文所述的内容外,本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
序列表.txt
<110>中国人民解放军海军医学研究所
<120>抗菌肽融合蛋白基因、其重组载体、其转化体及其表达产物
<160>5
<210>SEQ ID NO.1
<211>16
<212>PRT
<213>蓝岭树蛙(Litoria citropa)
<220>
<221>
<222>
<400>
Gly Leu Phe Ala Val Ile Lys Lys Val Ala Lys Val Ile Lys Lys Leu
1 5 10 15
<210>SEQ ID NO.2
<211>48
<212>DNA
<213>蓝岭树蛙(Litoria citropa)
<220>
<221>CDS
<222>
<400>1
GGTCTGTTTG CGGTTATCAA AAAGGTGGCT AAAGTAATTA AAAAGGCA 48
<210>SEQ ID NO.3
<211>27
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>
<222>
<400>
Lys Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn
1 5 10 15
Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser
20 25
<210>SEQ ID NO.4
<211>81
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>
<400>1
AAACAGCGTT TCACGACCAT GCCGTTTCTG TTCTGCAACG TTAATGACGT GTGCAACTTT 60
GCGTCTCGCA ATGATTACTC T 81
<210>SEQ ID NO.5
<211>48
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MOD RES
<222>(48)
<223>酰胺化的Leu
<400>
Lys Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn
1 5 10 15
Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Leu Phe Ala Val Ile Lys Lys Val Ala Lys Val Ile
35 40 45
Lys Lys Xaa
48
<210>SEQ ID NO.6
<211>162
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<400>1
GGATCCAAAC AGCGTTTCAC GACCATGCCG TTTCTGTTCT GCAACGTTAA TGACGTGTGC 60
AACTTTGCGT CTCGCAATGA TTACTCTGGT GGCGGTGGCT CTGGTCTGTT TGCGGTTATC 120
AAAAAGGTGG CTAAAGTAAT TAAAAAGGCA TGATAACTCG AG 162
Claims (8)
1.一种抗菌肽citropin 1.18融合蛋白,其特征在于其含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述抗菌肽citropin 1.18和氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述tumstatin肽,所述抗菌肽citropin 1.18位于所述融合蛋白的C端,且所述融合蛋白的C末端酰胺化。
2.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于所述抗菌肽citropin1.18和所述tumstatin肽之间包括接头肽。
3.如权利要求2所述的融合蛋白,其特征在于所述接头肽的氨基酸序列为(GGGGS)N、(GGGS)N或(GGS)N中之一,其中N是大于或等于1的整数,G表示甘氨酸残基,S表示丝氨酸残基。
4.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于所述的融合蛋白为SEQID NO.5所述的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的融合蛋白,其特征在于所述融合蛋白的C末端亮氨酸酰胺化为亮氨酸与精胺酰胺交换。
6.一种药物组合物,其特征在于含有权利要求1-5任一项所述的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白和药学可接受的载体。
7.权利要求1所述的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白在制备预防、治疗或改善由血管生成引起的相关疾病或失调的药物中应用。
8.权利要求7所述的血管生成引起的相关疾病为肿瘤、心血管疾病、糖尿病性视网膜病变、银屑病或风湿性关节炎中之一。
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马丽等.Citrostatin的构建与活性分析.第二军医大学学报27 11.2006,27(11),全文,着重见第1250页1材料和方法1.3 Citrostatin肽合成. * |
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