CN101434657A - 重组mtVEGF121/MAP30KDEL融合毒素的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有选择性杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素与应用。该融合毒素是通过连接肽在苦瓜籽的核糖体失活蛋白MAP30的氨基端连接mtVEGF₁₂₁得到的融合蛋白。mtVEGF₁₂₁作为运载工具，可使该融合毒素与血管内皮细胞生长因子受体F1k1/KDR特异结合并内化进入血管内皮细胞，然后MAP30发挥其毒素效应，杀伤新生血管内皮细胞，进而破坏新生血管。该融合毒素的表达条件简单，易于纯化，可进行大规模工业化生产，因而，可以该融合毒素为活性成分制备成抗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等多种涉及新生血管形成疾病的药物。本发明将在医学及生物制药领域发挥重要作用。

Description

重组mtVEGF121/MAP30KDEL融合毒素的制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的新生血管抑制剂，特别是涉及一种具有抑制新生血管形成作用的mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合毒素及其编码基因，与其在制备抗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等多种涉及新生血管形成的疾病药物中的应用。

背景技术

近年来，新生血管抑制剂已受到人们的普遍关注。研究表明，只要抑制了新生血管形成或者破坏已有的血管网络，就能有效控制并治疗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等多种疾病。在新生血管形成过程中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR1和VEGFR2)发挥了关键作用，与肿瘤等多种疾病关系密切，尤其是VEGFR2在新生血管内皮细胞表面过度表达，而正常组织几乎无法检测到。因此，以VEGFR2为靶点设计的融合毒素将能有效破坏新生血管而不损伤正常组织，具有良好的临床应用前景和市场开发潜力。

迄今为止，新生血管抑制剂的主要应用领域为肿瘤血管靶向药物。在竞争激烈的世界抗癌药市场中，针对VEGFR2设计的肿瘤血管靶向药物近年来发展非常迅速，除了Avastin和Iressa已成功上市外，目前仍有几十种药物进入了临床试验阶段。这些药物按作用机理可分为作两类：一类是抑制肿瘤血管生成，如Avastin和Iressa，这类药物在肿瘤生长初期具有抑制效果，但对于发展到一定程度的肿瘤，只能阻止其进一步增大，不能达到缩小肿瘤的目的；另一类则是以VEGFR2为靶点的融和毒素，这类药物主要通过直接破坏肿瘤血管来控制肿瘤生长，是前者的重要补充。

发明内容

本发明提供了一种具有II型VEGF受体(Flk1/KDR)特异性，可特异性杀伤新生血管内皮细胞的融合毒素。

本发明所提供的具有选择性杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素，名称为mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL，是通过连接肽在苦瓜籽的核糖体失活蛋白MAP30的氨基端(N端)连接mtVEGF₁₂₁得到的融合蛋白。

所述苦瓜籽核糖体失活蛋白MAP30是本发明的发明人从苦瓜籽中获得的一种分子量为30kD的核糖体失活蛋白，其氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，其编码序列可如序列表中SEQ ID NO：4所示。

所述人血管内皮细胞生长因子突变体mtVEGF₁₂₁基因是通过全基因合成获得的，其氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码序列可如序列表中SEQ ID NO：2所示。

所述连接肽的选择是多种多样的，其氨基酸残基序列可如序列表中的SEQ ID NO：7所示的多肽，其编码序列可如序列表中的SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

为获得更好的粗面内质网定位效果，所述融合毒素的C-末端还可携带有内质网定位信号KDEL，所述内质网定位信号的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，其编码序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

所述连接肽也可替换为其类似物，这些类似物与所述连接肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。

具体来讲，所述融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：5；

2)将序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有杀伤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：5由393个氨基酸残基组成，自氨基端第1-121位氨基酸残基为mtVEGF₁₂₁；自氨基端第122-126位氨基酸残基为连接肽序列，自氨基端第127-389(263aa)位氨基酸残基为苦瓜籽核糖体失活蛋白MAP30；自氨基端第390-393(4aa)位氨基酸残基为粗面内质网定位信号KDEL。

编码上述具有破坏新生血管内皮细胞作用的融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的基因(mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：6限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有选择性杀伤新生血管内皮细胞作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：6由1179个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1179位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-363位碱基为mtVEGF₁₂₁的编码序列，自5’端第364-378位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第379-1167位碱基为苦瓜籽核糖体失活蛋白MAP30的编码序列，自5’端第1168-1179位碱基为内质网定位信号KDEL的编码序列。

所述融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的片段、衍生物和类似物也是本发明要保护的，是指保持本发明的mtVEGF₁₂₁/MAP30相同生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可定义为：1)由一个或多个保守或非保守氨基酸残基(优选为保守性氨基酸残基)所取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是，也可以不是由遗传密码编码的；2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；3)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽；4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如用来纯化此多肽的序列，或是抗体片段或其它抗原配体序列的融合毒素)，或是将编码另一个多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合就可以获得融合多肽的编码序列，再使该融合多肽的编码序列获得表达，就可产生融合多肽。所述产生融合多肽的技术为本领域内公知的，包括连接编码多肽的编码序列，从而使它们在同一个读码框中，并且使融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。

所述mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的类似物与mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。应理解，本发明融合毒素的氨基酸残基序列并不限于上述例举的具有代表性的序列。

所述mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合毒素还可为经过修饰的，或经修饰提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：1)体内或体外的多肽的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化；2)糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽，这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；3)具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。

编码本发明mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合毒素的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA或人工合成DNA，可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。

本发明还提供了所述融合毒素多核苷酸的变异体，其编码与mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL有相同的氨基酸序列的多肽或多肽片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，还可包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

含有本发明基因mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的方法。

本发明所提供的融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的表达方法，是将所述融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL基因、该基因变异体或含有融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL。

所述具有选择性杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL基因可插入到重组表达载体中。构建所述重组表达载体的出发载体，可为任意一种指本领域熟知的可进行外源基因表达的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒(如腺病毒、逆转录病毒或其它载体)。所述载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(AH Rosenberg，et al.Vectors for selectiveexpression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase.Gene.1987，56(1)：125-135)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(SJ Lee and D Nathans.Proliferinsecreted by cultured cells binds to mannose 6-phosphate receptors.J.Biol.Chem.1988；263：3521-3527)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定表达，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

构建所述重组表达载体的出发载体还可为包含有Thioredoxin(Trx)突变体编码序列的融合表达载体，可将该载体命名为pET32a载体，其中Trx突变体在蛋白表达过程中能更有效促进细菌胞浆中目的蛋白二硫键的形成进而促进蛋白的可溶性表达。

其中，以pET32a为出发载体，构建的含有所述具有抑制新生血管作用的融合毒素基因mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的重组表达载体为pET32a-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL。

可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有所述具有选择性杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的重组表达载体，如体外重组DNA技术，DNA合成技术和体内重组技术等(Sambrook，et al Molecular cloing，a LaboratoryManual.Cold spring harbor laboratory.New York，1989)。所述具有选择性杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因mtVEGF₁₂₁/MAP30基因的DNA序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。所述启动子可为：大肠杆菌的lac或trp启动子、噬菌体启动子、反转录病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。所述表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，所述表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型形状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白(GFP)基因或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因等。

所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；低等真核细胞，如酵母细胞；高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真核细胞如酵母、植物细胞；果蝇S2或Sf9等昆虫细胞；CHO、COS、293细胞或Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，长度通常为10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。如在复制起始点晚期一侧的长度约为100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子或腺病毒增强子等。

可用本领域技术人员熟知的常规技术，将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子，诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进分离纯化。

培养含有本发明具有抑制新生血管作用的融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

所述融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL及其编码基因可用于制备抗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等多种涉及新生血管形成疾病的药物，因而本发明还提供了一种抗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等疾病的药物。

本发明所提供的抗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等疾病的药物，其活性成分为融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL或其编码基因。

所述具有抗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等作用的融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL基因可存在于真核表达载体中。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液或冻干粉剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述蛋白药物和基因药物的用量可采用药学领域中蛋白药物和基因药物的常规剂量，并可根据实际情况调整。本发明的融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL(给予50μg/mL融合毒素20μl)能显著抑制鸡胚尿囊膜[CAM]新生血管形成；荷瘤裸鼠试验结果表明，在注射剂量为20mg/kg体重时，融合毒素可明显延缓肿瘤的生长。

本发明提供了一种具有抗新生血管作用的融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL及其编码基因。该蛋白是利用重组人血管内皮细胞生长因子mtVEGF₁₂₁突变体(mtVEGF₁₂₁)与来源于苦瓜籽的核糖体失活蛋白MAP30通过连接肽连接而成的融合毒素。其中，血管内皮细胞生长因子mtVEGF₁₂₁作为运载工具，可使该融合毒素与血管内皮细胞生长因子受体F1k1/KDR特异结合并内化进入血管内皮细胞，然后苦瓜籽核糖体失活蛋白MAP30发挥其毒素效应，杀伤新生血管内皮细胞，进而破坏新生血管内皮细胞。其中mtVEGF₁₂₁作为靶向分子，通过与VEGFR2特异结合，将融合毒素经过胞吞作用带入肿瘤血管内皮细胞内。与天然型人血管内皮细胞生长因子VEGF₁₂₁(wtVEGF₁₂₁)功能不同的是，mtVEGF₁₂₁只有VEGFR2特异性，而失去了与VEGFR1结合的能力，因此避免了癌症患者血液或者肿瘤组织中可溶性VEGFR1对融合毒素的中和作用以及融合毒素对于其它表达VEGFR1的正常细胞(如造血干细胞、单核细胞等)的杀伤作用，从而保证了融合毒素对于肿瘤血管内皮细胞的高度特异性，使其更加有效和安全。融合毒素C-末端内质网定位信号KDEL可增加游离MAP30毒素在粗面内质网的富集，进一步增强融合毒素的杀伤效果(MAP30毒素可使其中核糖体大亚基的28S rRNA发生脱腺嘌呤作用，抑制细胞蛋白质的翻译，进而杀死肿瘤血管内皮细胞，破坏新生血管)。此外，该融合毒素的表达条件简单，易于纯化，可进行大规模工业化生产，因而，可以该融合毒素为活性成分制备抗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等多种涉及新生血管形成的疾病药物。本发明将在医学及生物制药领域发挥重要作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为在大肠杆菌中表达以及经纯化的Trx-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合蛋白的12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图2为纯化的mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合蛋白的12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图3为融合毒素对鸡胚尿囊膜新生血管形成的影响(光镜观察)

图4为对照组和试验组给药后不同时间的肿瘤生长曲线

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物技术有限公司完成。

实施例1、融合蛋白Trx-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL表达载体的构建

用下述方法构建具有破坏新生血管内皮细胞作用的融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的编码基因及其原核表达载体，具体方法包括以下步骤：

一、mtVEGF₁₂₁G4S全基因合成

mtVEGF₁₂₁G4S全基因(见序列2)由北京奥科公司合成，序列的5’端包含限制性内切酶Kpn I酶切位点(GGTACC)和肠激酶识别位点DDDDK的编码序列(GACGACGACGACAAG)，3’包含限制性内切酶BamHI酶切位点(GGATCC)载体为pUC57(由北京奥科公司提供)。

二、MAP30KDEL基因的克隆

1、引物设计

设计PCR扩增MAP30与内质网定位信号KDEL融合基因(MAP30KDEL)的引物，并在上游引物添加限制性内切酶BamH I识别位点，在下游引物添加限制性内切酶Not I识别位点，引物序列如下：

上游引物BamH I_F：5’-ggATCCgATgTTAACTTCgATTTgTCg，

下游引物Not I_R：5’-gCggCCgCTCATTACAgTTCATCTTTATTCACAACAgATTCCCC。

2、苦瓜籽总RNA提取

取市售苦瓜籽于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，加入TRIzol试剂(Invitrogen公司)，4℃、12000rpm离心10分钟，取上清，每1mL TRIzol加入氯仿200μl，剧烈振摇30秒，室温放置3分钟，4℃、12000rpm离心15分钟，取上层水相溶液，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10分钟，4℃、12000rpm离心10分钟，弃上清，加入预冷的75％乙醇(DEPC水配置)洗涤，放置至沉淀透明后加入适量DEPC水溶解，-70℃保存备用。

3、反转录PCR扩增MAP30KDEL基因

用SuperscMAPt II(Introgen公司)试剂盒并按照说明书进行操作：取1ug苦瓜籽总RNA作模板进行反转录反应，然后取5ul反转录产物作模板参照下述PCR体系扩增MAP30KDEL基因：10×Pyrobest缓冲液5ul，上、下游引物(BamH I_F、Not I_R)各50pmol，10mM dNTPs 1ul，Pyrobest DNA聚合酶1μl，补水至50μl。PCR反应参数为：先94℃ 30sec，55℃ 40sec，72℃ 1min，共30个循环；然后72℃延伸7分钟。反应结束后，用天根公司的目的基因纯化、回收试剂盒回收、纯化PCR扩增产物，方法与步骤一相同。然后，对回收、纯化的目的基因进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道1为PCR扩增产物，泳道M为DNA分子量标准)，结果PCR扩增的MAP30KDEL基因的大小约为800bp，与预期大小一致。

4、MAP30KDEL基因与pEASY-B载体连接

向4μl纯化的MAP30KDEL基因的PCR扩增片段中加入1μl pEASY-B(购自北京全式金生物技术有限公司)连接混合物，室温放置5分钟，然后将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，得到携带有MAP30KDEL基因的重组载体，命名为pEASY-B-MAP30KDEL。常规方法提取质粒。

三、pET32a(+)-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合蛋白表达载体的构建

1、pET32a(+)-MAP30KDEL表达载体的构建

①将载体pET32a(+)(购自Novagen)和pEASY-B-MAP30KDEL质粒载体用限制性内切酶BamH I和Not I进行双酶切，20μl反应体系及反应条件为：5μl 10×Buffer1，10μl质粒，1μl BamH I，1μl Not I，水3μl，混匀，在37℃下酶切2小时。

②将pET32a(+)载体和pEASY-B-MAP30KDEL酶切片段切胶混合一起回收，方法参照天根公司说明书和步骤一。洗脱体积为30μl。

③pET32a(+)载体与MAP30KDEL片段的连接：取26μl步骤②的洗脱产物，加3μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液，1μl连接酶，混匀，16℃连接过夜。

④取5μl步骤③连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

⑤对转化的单菌落进行PCR和双酶切鉴定，方法为：取单菌落悬于50μl水中，99℃裂解10分钟；50μl反应体系为：于39μl H₂O中加入5μl 10×Taq缓冲液，1μl 10mMdNTPs，通用扩增引物T7promoter(5’-TAATACgACTCACTATAg)和T7 terminator(5’-：TgCTAgTTATTgCTCAgC)各1μl，1μl模板，1μl Taq酶；反应条件为：94℃ 3min，94℃ 30sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec，共30个循环。可扩增出约900bp DNA片段的为阳性克隆。反应结束后，对PCR鉴定为阳性克隆的进行扩大培养，小量法提质粒(方法与步骤一相同)，用限制性内切酶BamH I和Not I进行双酶切鉴定，方法同步骤①，经酶切得到约800bp DNA片段的为阳性克隆。

3、pET32-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL表达载体的构建

①对质粒载体pET32-MAP30KDEL和pUC57-mtVEGF₁₂₁G4S用限制性内切酶BamHI和Kpn I进行双酶切，20ul反应体系及反应条件为：5μl 10×Buffer 2，10μl质粒，1μl Kpn I，1μl BamH I，水3μl，混匀，在37℃下酶切2小时。

②将经酶切的pET32-MAP30KDEL和mtVEGF₁₂₁G4S酶切片段切胶混合一起回收，方法参照天根公司说明书和步骤一。洗脱体积为30μl。

③pET32-MAP30KDEL和mtVEGF₁₂₁G4S片段的连接：取26μl步骤②的洗脱产物，加入3μl 10×T4DNA连接酶缓冲液，1μl连接酶，混匀，16℃连接过夜。

④取5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

⑤转化菌落的双酶切鉴定：分别取4个单菌落接种于5mL含有200μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、250rpm下培养过夜。培养结束后，提取质粒，用限制性内切酶Kpn I和Not I进行双酶切鉴定，从而获得携带融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL编码基因的原核表达载体，命名为pET32a-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL。

实施例2、融合蛋白mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的制备

一、融合蛋白Trx-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL在大肠杆菌中的表达

1.将pET32a-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL质粒转化大肠杆菌Origami B(DE3)pLysS，在37℃下培养30小时，筛选阳性克隆。

2.将阳性单菌落接种于10mL LB液体培养基(含羧苄青霉素200μg/mL，卡那霉素30μg/mL，四环素25μg/mL和氯霉素34μg/mL)中，在37℃、250rpm条件下培养过夜。

3.将10mL过夜培养物转接至1L LB液体培养基(含羧苄青霉素200μg/mL，卡那霉素30μg/mL，四环素25μg/mL和氯霉素34μg/mL)中，在37℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀≈0.6(约6小时)。

4.加入IPTG至终浓度为0.1mM(加入1M IPTG溶液100μl)，在23℃、250rpm条件下继续培养过夜；培养结束后，6000rmp离心5分钟收获细菌。

5.将细菌沉淀重悬于40mL 10mM Tris·HCl(pH8.0)中，冰浴中超声破碎(功率300W，每次5秒，间隔5秒，共50次)，在4℃、12000rpm下离心30分钟，收集上清。

二、融合蛋白Trx-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的纯化

1、用Ni-NTA亲和柱纯化Trx-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合蛋白

①用5倍柱床体积的结合缓冲液(10mM Tris·HCl，pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)平衡镍柱(购自Qiagen公司)。

②将细胞粗提液缓慢上柱，流速约0.5mL/min；用10倍柱床体积的洗液(10mMTris·HCl，pH8.0，300mM NaCl，20mM咪唑)洗脱杂蛋白。

③用含有300mM NaCl，250mM咪唑的10mM Tris·HCl(pH8.0)洗脱目的蛋白，收集3倍柱床体积的洗脱液。同时取样，进行12％ SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为低分子量蛋白质标准，泳道1为诱导前，泳道2为诱导后，泳道3为裂解上清，泳道4为裂解沉淀，泳道5为上样流出液，泳道6为纯化的融合蛋白)。

三、融合蛋白的切割及Trx标签的去除

按每50单位肠激酶(rEK)裂解10毫克步骤二纯化的Trx-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合蛋白，室温消化过夜。

四、mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的进一步纯化

用Blue Sepharose 6 FF亲和层析纯化mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL蛋白，具体方法包括以下步骤：

①上柱：用5倍柱床体积的20mM Tris·HCl(pH7.4)，50mM NaCl缓冲液平衡凝胶柱，将步骤4酶切产物缓慢上柱，流速约为0.5mL/min。

②洗柱：用10倍柱床体积的20mM Tris·HCl(pH7.4)，150mM NaCl缓冲液洗脱杂蛋白。

③洗脱：洗脱液为20mM Tris·HCl(pH7.4)，2M NaCl，收集2个柱床体积。

④透析或凝胶过滤置换缓冲液：10mM Tris·HCl(pH7.4)，150mM NaCl。

⑤用肠激酶消化去除组氨酸标签，并经Blue Sepharose 6 FF柱(购自GE公司)纯化。对纯化产物进行12％ SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示(泳道M为低分子量蛋白质标准，泳道1为经纯化的mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合蛋白)，得到了高纯度的分子量为43KD的目的蛋白mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL。

实施例3、融合毒素对鸡胚尿囊膜[CAM]新生血管形成的影响

取繁殖场孵化的9天龄受精鸡卵，在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区(约胚头右下方0.5-1厘米处)，划定1厘米×1厘米开窗位置，在鸡胚气室端钻1毫米小孔并穿透壳膜。用75％乙醇消毒开窗部位，用手术剪轻轻揭去蛋壳及壳膜，暴露出鸡胚尿囊膜，将甲基纤维素碟轻轻放置于尿囊膜上血管较少的部位，用微量进样器将浓度分别为50μg/mL的融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL 20μl滴入甲基纤维素碟中，阳性对照组加入200ng bFGF，用无菌透明胶带封窗后放入孵化箱，37℃继续孵育，3天后揭去透明胶带，加入甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定15min，待绒毛尿囊膜血管中的血液凝固后，以纤维素小碟为中心剪下直径约3cm的尿囊膜，放入盛有水的平皿内展开，然后平铺于滤纸上，在解剖显微镜下观察用药区血管形成情况，结果如图3所示，与对照组相比，在本发明融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的作用下，鸡胚尿囊膜[CAM]新生血管的形成受到明显抑制。

实施例4、mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的抑瘤实验

取5周龄Balb/c裸鼠，雌性，体重为18-20g，随机分为2组，每组5只。体外培养A375M细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，每只裸鼠注射5×10⁵人黑色素瘤A375M癌细胞，把接种肿瘤细胞的当天定为第一天，分别在第5、7、9、10、11天经尾静脉注射给药，mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL剂量为20mg/kg体重，并以注射相同体积的生理盐水(saline)为对照。在不同时间测量对照组和试验组(mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL)小鼠肿瘤的大小，根据每组小鼠肿瘤大小的平均值绘出对照组(saline)和试验组(mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL)给药后不同时间的肿瘤生长曲线，生长曲线如图4所示，显示融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL对肿瘤的生长具有显著的抑制作用。

序列表

<160>10

<210>1

<211>133

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>399

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

<210>3

<211>265

<212>PRT

<213>葫芦科苦瓜(Momordica charantia)

<400>3

<210>4

<211>809

<212>DNA

<213>葫芦科苦瓜(Momordica charantia)

<400>4

<210>5

<211>430

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

<210>6

<211>1269

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

<210>7

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

<210>8

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

<210>9

<211>4

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>9

<210>10

<211>12

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>10

Claims (10)

1、具有杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素，是通过连接肽在苦瓜籽的核糖体失活蛋白MAP30的氨基端连接mtVEGF₁₂₁得到的融合蛋白。

2、根据权利要求1所述的融合毒素，其特征在于：所述连接肽的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示。

3、根据权利要求2所述的融合毒素，其特征在于：所述融合毒素是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：5；

2)将序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有选择性杀伤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。

4、根据权利要求1或2或3所述的融合毒素，其特征在于：所述融合毒素的C-末端还携带有内质网定位信号，所述内质网定位信号的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，其编码序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

5、编码权利要求1或2或3或4所述的具有杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素的基因。

6、根据权利要求5所述的基因，其特征在于：所述基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID N0：5的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：6限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有选择性杀伤新生血管内皮细胞作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

7、含有权利要求5或6所述具有杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

8、一种表达权利要求1所述具有杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素的表达方法，是将权利要求5或6所述具有杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因、该基因变异体或含有所述具有杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到具有杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素；所述含有具有杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因的表达载体为pET32-mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL。

9、权利要求1-4任一项所述的具有杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素在制备抗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等多种涉及新生血管形成的疾病药物中的应用。

10、权利要求5或6所述的具有杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素的编码基因在制备抗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等多种涉及新生血管形成的疾病药物中的应用。

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