KR102410556B1 - 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 - Google Patents

미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 상세하게는 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드, 상기 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 및 약리학적 활성 물질이 결합된 복합체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 등을 제공한다.
상기 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드는 미토콘드리아를 정확하게 타겟함으로써, 목적 단백질이나 약물 등을 미토콘드리아로의 효과적으로 이동 또는 분포시킬 수 있고, 이를 이용하여 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드{PEPTIDE FOR TARGETING TO MITOCHONDRIA}
본 발명은 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
미토콘드리아(mitochondria)는 진핵 생물에서 산소 호흡의 과정이 진행되는 세포 속의 중요한 세포 내 소기관으로, 여러 유기물질에 저장된 에너지를 산화적 인산화 과정을 통해 생명활동에 필요한 아데노신삼인산(ATP)의 형태로 전환시키는 에너지 대사를 하기 때문에 세포의 발전소 역할을 한다. 또한, 시토크롬c와 다른 세포사멸 유도(proapoptosis) 요소의 방출을 조절함으로써 세포사멸을 조절하며, 이 외에도 신호전달, 세포분화, 칼슘의 농도조절, 활성 산소종(ROS) 형성 및 이용 등과 관련된다.
최근 미토콘드리아의 기능 장애, 예를 들어, 해당 과정의 붕괴, 미토콘드리아 효소의 감소, 활성 산소종 증가, 미토콘드리아 수 또는 크기의 변화 등에 의해 발병되는 것으로 알려진 알츠하이머와 같은 신경 퇴행성 질환, 헌팅턴병, 파킨슨병, 당뇨병, 암 및 노화관련 질환 등의 다양한 질병들이 보고되어짐에 따라, 미토콘드리아에 대한 관심과 이에 대한 연구가 증가하고 있다.
이러한 질병들을 치료하기 위한 방법으로, 약물 또는 유전자와 같은 치료 생리활성 물질을 미토콘드리아로 전달함으로써 상기 질병의 치료 효과를 증진시킬 수 있는 방법이 있다. 이에 따라, 선택적이며 효율적으로 미토콘드리아를 타겟팅할 수 있는 시스템에 대한 연구의 필요성이 높아졌다.
대한민국 공개특허 제10-2012-0125980호 (2012.11.19. 공개)
본 발명의 목적은 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 또는 재조합 벡터를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 목적 단백질을 미토콘드리아로 이동 또는 분포시키는 방법, 상기 목적 단백질의 미토콘드리아로 이동 또는 분포를 확인하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드를 함유하는 미토콘드리아 약물 전달용 담체를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 및 약리학적 활성 물질이 결합된 복합체를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 벡터를 세포 내 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 미토콘드리아로 이동 또는 분포시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 프로모터, 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 세포 내 도입하는 단계; 및 상기 유전자를 발현시켜 형광 영상을 통해 상기 발현되는 목적 단백질의 이동 또는 분포를 확인하는 단계;를 포함하는 세포 내 목적 단백질의 미토콘드리아로 이동 또는 분포를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 미토콘드리아 약물 전달용 담체를 제공한다.
본 발명은 상기 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 및 약리학적 활성 물질이 결합된 복합체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로모터, 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드는 미토콘드리아를 정확하게 타겟함으로써, 목적 단백질이나 약물 등을 미토콘드리아로의 효과적으로 이동 또는 분포시킬 수 있고, 이를 이용하여 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 활용할 수 있다.
본 발명에 따른 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드를 통해 미토콘드리아를 표적으로 하는 여러 물질을 효과적으로 전달하면서 그의 이동 또는 분포를 쉽고 명확하게 관찰 또는 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드는 인간 외 다른 종(species)의 미토콘드리아에서도 확인되는 바, 이와 관련하여 동물 실험 등을 통해 다양한 연구를 할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 human STAT6 단백질을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 human U373-MG(malignant glioma) 세포주에서 human STAT6 N-말단 서열의 위치를 관찰한 현미경 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 mouse B16F10 세포주에서 human STAT6 N-말단 서열의 위치를 관찰한 현미경 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명자는 STAT6 단백질이 미토콘드리아에 위치함을 발견하여, STAT6 단백질 N-말단 서열의 특정 아미노산 서열이 미토콘드리아 타겟팅 시퀀스임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, human STAT6 내부 서열 중, human STAT6 N-말단 1-30번째 서열이 미토콘드리아 타겟팅 효과를 가짐을 확인할 수 있었고, 이를 서열번호 3으로 표시하였다.
서열번호 3 : MSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLL
본 발명에 따른 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 또는 이의 기능적 동등물은 천연으로부터 유래될 수 있고, 당 분야에 공지된 화학적 합성 방법 또는 유전 공학적 방법을 이용하여 화학적으로 합성하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 획득될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)의 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989), 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전공학적 방법은 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 DNA 서열을 제작할 수 있다. 상기 DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수 있다. 합성된 DNA 서열은 이에 작동가능하게 연결되어 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환체를 생성한다.
상기 "형질전환체"는 "숙주세포" 등과 호환성 있게 사용될 수 있으며, 임의의 수단, 예를 들어, 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다.
생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된, 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수할 수 있다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다.
상기에서 "실질적으로 순수한 펩타이드"라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 천연형 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다.
상기 "아미노산 서열 변이체"란, 본 발명에 따른 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 펩타이드를 의미하나, 상기의 변이에 의해 분자의 활성은 전체적으로 변경되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다.
본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 아미노선 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 재조합 벡터는 상기 유전자를 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터(plasmid vector), 코스미드 벡터(cosmid vector), 박테리오파지 벡터(bacteriophage vector) 등 공지의 발현 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 프로모터, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
상기 "작동 가능하게 연결된"이란, 발현 조절 서열이 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 전사 및 해독을 조절하도록 연결된 것을 말하며, 발현 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서 등)의 조절 하에 상기 유전자가 발현되어 이에 의해 코딩되는 본 발명에 따른 펩타이드가 생성되도록 정확한 해독 프레임을 유지시키는 것을 포함한다.
상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 미토콘드리아 타겟팅에 효과적이므로, 미토콘드리아로 타겟팅 하고자 하는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 본 발명의 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 작동 가능하게 연결하여 벡터에 삽입하고 이를 발현시키는 경우, 목적 단백질을 미토콘드리아로 타겟팅할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 형광 단백질(fluorescent protein, FP) 유전자를 더 연결하여 상기 형광 단백질을 발현시킴으로써, 상기 목적 단백질의 이동 또는 분포 여부를 관찰할 수 있다.
상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent probe, GFP), 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP) 또는 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP) 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 재조합 벡터를 세포 내 도입하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 미토콘드리아로 이동 또는 분포시키는 방법을 제공한다.
상기 세포 내 도입은 재조합 벡터를 이용하여 세포를 형질전환시키는 것을 의미하며, 이에 따른 형질전환 방법은 당업자에게 잘 알려진 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 프로모터, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 세포 내 도입하는 단계; 및 상기 유전자를 발현시켜 형광 영상을 통해 상기 발현되는 목적 단백질의 이동 또는 분포를 확인하는 단계;를 포함하는 세포 내 목적 단백질의 미토콘드리아로 이동 또는 분포를 확인하는 방법을 제공한다.
상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent probe, GFP), 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP) 또는 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP) 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 즉 형질전환된 세포에서 발현되는 단백질로부터 방출되는 특정 파장의 형광을 형광 현미경을 사용하여 상기 세포가 살아있는 상태에서 계속하여 영상화할 수 있게 함으로써, 세포 내에서의 목적 단백질의 발현 과정 및 미토콘드리아로의 이동 과정을 단계별로 세밀하게 가시화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, STAT6 N-말단서열 (1-50번째 아미노산 서열) 중에서, 1-30번째 서열, 31-50번째 서열 및 1-20번째 서열의 C-말단에 각각 녹색 형광 단백질(GFP)을 결합시켜 1-30-GFP, 31-50-GFP, 1-20-GFP 플라스미드를 제조하였고, 이를 세포 내로 형질주입한 뒤 현미경으로 관찰함으로써, 미토콘드리아로의 이동을 확인할 수 있었다.
본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 미토콘드리아 약물 전달용 담체를 제공한다.
상기 펩타이드는 미토콘드리아 타겟팅에 효과적이므로, 미토콘드리아를 표적으로 하는 여러 가지 질환과 관련된 약물을 미토콘드리아로 직접 전달할 수 있고, 이를 통해 미토콘드리아 내 약물 흡수율을 향상시킬 수 있다.
본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드 및 약리학적 활성 물질이 결합된 복합체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약리학적 활성 물질은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미한다. 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하는 예방 효과를 가지고, 질병의 결과로 생기는 고통 또는 감염을 완화시키며, 질병을 완전히 제거할 수 있는 역할을 수행할 수 있기에, 상기 약리학적 활성 물질은 “약물” 또는 “치료제”의 용어와도 혼용될 수 있다.
상기 복합체는 미토콘드리아로의 타겟팅을 이끌 수 있는 펩타이드를 포함함으로써, 미토콘드리아에 작용하여 직접적인 약리학적 활성을 나타낼 수 있는 물질을 미토콘드리아로 효과적으로 전달하고 이동시켜 머물게 할 수 있다. 따라서 미토콘드리아의 기능 장애와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 약리학적 활성 물질은 미토콘드리아에 작용하여 특정 활성을 나타낼 수 있는 천연물, 화합물, 단백질 또는 유전자(DNA, RNA 또는 PNA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화합물은 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 카바지탁셀(cabazitaxel), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 시스플라틴(cisplain)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항암제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화합물은 플라보노이드(flavonoid), 폴리페놀(polyphenol), 레스베라트롤(resveratrol), 카로티노이드(carotenoid), 알파리포산(alpha-lipoic acid), 토코페롤(tocopherol) 및 아스코르브산(ascorbic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항산화제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그 밖에 상기 화합물은 항생제, 항염증제 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 프로모터, 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환은 허혈성 뇌질환 또는 허혈성 심질환, 뇌졸증, 편두통, 빈혈증, 파킨슨병, 알츠하이머, 근위축성측색경화증(ALS), 미토콘드리아뇌근증, 간경변, 판코니 증후군, 비정형 페닐케톤뇨증, 천식, 당뇨병, 동맥경화, 고혈압, 고콜레스테롤증, 시신경 질환, 비만, 우울증 및 암 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 약물 전달용 담체 또는 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약물 전달용 담체 또는 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 제형 또는 필요에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 미토콘드리아 타겟팅용 펩타이드의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.
상기 약물 전달용 담체 또는 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약물 전달용 담체 또는 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 피하, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약물 전달용 담체 또는 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
상기 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.
상기 약물 전달용 담체 또는 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약물 전달용 담체 또는 약학 조성물은 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.
상기 약물 전달용 담체 또는 약학 조성물은 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> human STAT6 내부 서열 중, 미토콘드리아 표적서열의 위치 확인
1. 플라스미드(plasmid) 제작
STAT6 N-말단서열 (1-50번째 아미노산 서열) 중에서, 미토콘드리아 표적서열로 작용할 것이라고 예측되는 서열들 (1-30번째 서열, 31-50번째 서열, 1-20번째 서열) C-말단에 각각 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein; GFP)을 결합시켜, 1-30-GFP, 31-50-GFP, 1-20-GFP 플라스미드를 제조하였다. 각 플라스미드의 구체적인 제조방법은 다음과 같다.
1) human STAT6 1-30-GFP 플라스미드 제작
먼저, STAT6 wild type 플라스미드 (Origene)에서 하기 표 1의 서열번호 1, 2를 이용하여 PCR에 의해 증폭하여 human STAT6 N-말단 1-30번째 삽입서열 (서열번호 3)을 얻었다.
서열번호 1 AGATCTGCCGCCGCGATCGCCATGTCTCTGTGGGGTCTGGTCT (Forward)
서열번호 2 GCGGCCGCGTACGCGTCAGAAGATGCCGCAGGTGT (Reverse)
pCMV6-AC-GFP (Origene) 또한 제한효소 Sgf1 과 Mlu1으로 절단한 뒤, 절단된 서열 사이에 상기 1-30번째 삽입서열을 서브클로닝(subcloning) 하였다.
완성된 1-30-GFP 플라스미드를 DH5α(RBC) 숙주세포로 형질전환시킨 뒤, 카나마이신(Kanamycin) 배지에 도말하여 37℃에서 17시간 배양하였다. 배양 후 자란 콜로니(colony)로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다.
* human STAT6 N-말단 1-30번째 삽입서열 : MSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLL (서열번호 3)
2) human STAT6 31-50-GFP 플라스미드 제작
STAT6 wild type 플라스미드 (Origene)에서 하기 표 2의 서열번호 4, 5를 이용하여 PCR에 의해 증폭하여 human STAT6 N-말단 31-50번째 삽입서열 (서열번호 6)을 얻었다.
서열번호 4 AGATCTGCCGCCGCGATCGCCGGTGACTGGCTGGAGAGC (Forward)
서열번호 5 GCGGCCGCGTACGCGTGCAGCAGAAGGCGTC (Reverse)
pCMV6-AC-GFP (Origene) 또한 제한효소 Sgf1 과 Mlu1으로 절단한 뒤, 절단된 서열 사이에 상기 31-50번째 삽입서열을 서브클로닝 하였다.
완성된 31-50-GFP 플라스미드를 DH5α (RBC) 숙주세포로 형질전환시킨 뒤, 카나마이신(Kanamycin) 배지에 도말하여 37℃에서 17시간 배양하였다. 배양 후 자란 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다.
* human STAT6 N-말단 31-50번째 삽입서열: GDWLESQPWEFLVGSDAFCC (서열번호 6)
3) human STAT6 1-20-GFP 플라스미드 제작
상기 1)의 human STAT6 1-30-GFP 플라스미드 제작 방법을 통해 얻은 1-30-GFP 플라스미드에서 하기 표 3의 서열번호 7, 8을 이용하여 human STAT6 N-말단 21-30번째 삽입서열 (서열번호 9)을 잘라내었다.
서열변호 7 ACGCGTACGCGGCCGCTCGAGATGGAGAGCGACGA (Forward)
서열번호 8 GACATAGAGCCGCTGCACTTTTTCTGGGGGCATCTTGG (Reverse)
완성된 1-20-GFP 플라스미드를 DH5α (RBC) 숙주세포로 형질전환시킨 뒤, 카나마이신(Kanamycin) 배지에 도말하여 37℃에서 17시간 배양하였다. 배양 후 자란 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다.
* human STAT6 N-말단 1-20번째 삽입서열: MSLWGLVSKMPPEKVQRLYV (서열번호 9)
2. human STAT6 1-30-GFP, 31-50-GFP, 1-20-GFP의 세포 내 분포 확인
상기 1의 방법으로 제작된 3종류의 플라스미드와 1종류의 대조군 GFP 플라스미드 (Origene)를 human U373-MG 악성 신경교종 (malignant glioma) 세포주와 mouse B16F10 흑색종 (melanoma) 세포주에 형질주입(transfection) 시켜서 각 GFP가 부착된 아미노산을 과발현 시켰다.
형질주입 방법은 하기와 같다.
OPTI-MEM에 리포펙타민 3000 (lipofectamine 3000)을 섞은 후, 5분간 배양(incubation) 시켰다(A). 대조군 GFP 플라스미드, 1-30-GFP, 31-50-GFP, 1-20-GFP 플라스미드를 각각 따로 OPTI-MEM에 섞은 후, P3000 reagent를 추가로 섞고, 여기에 리포펙타민 3000과 섞어 배양한 (A)와 다시 혼합하여 15분간 배양시켰다.
한국세포주은행으로부터 분양받은 human U373-malignant glioma 세포주 및 mouse B16F10 melanoma 세포주의 배양액을 OPTI-MEM으로 교환하고 상기의 혼합액으로 처리하여 48시간 배양하였다.
48시간 후, PBS로 세척하고 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 고정한 후, TOM20 항체로 염색하여 밤새 배양하였다. 그 뒤, PBS로 3번 세척하고, Alexa 546-Rb 2차 항체 (invitrogen)로 추가 염색하여, 2시간 상온에서 배양하였다. 끝나면 다시 PBS로 세척하여, 마운팅(mounting) 한 후 공초점 현미경으로 관찰하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 human STAT6 단백질을 나타낸 것으로, 상기 단백질 내부의 대략적인 도메인 위치들과 실험에 이용한 N-말단 아미노산 서열들의 정보를 보여준다
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 human U373-MG(malignant glioma) 세포주에서 human STAT6 N-말단 서열의 위치를 관찰한 현미경 이미지이다.
도 2를 참조하면, human U373-MG 세포주의 미토콘드리아에서 human STAT6 1-30 아미노산 서열이 미토콘드리아에 존재함을 확인할 수 있다. 반면, human STAT6 31-50 아미노산 서열 또는 1-20 아미노산 서열은 미토콘드리아에 존재하지 못함을 확인할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 mouse B16F10 세포주에서 human STAT6 N-말단 서열의 위치를 관찰한 현미경 이미지이다.
도 3을 참조하면, mouse B16F10 세포주의 미토콘드리아에서 human STAT6 1-30 아미노산 서열이 미토콘드리아에 존재함을 확인할 수 있다. 반면, human STAT6 31-50 아미노산 서열 또는 1-20 아미노산 서열은 미토콘드리아에 존재하지 못함을 확인할 수 있다.
human STAT6 1-30 아미노산 서열이 인간 외 다른 종(species)의 미토콘드리아에도 위치한다는 사실은 마우스 등을 이용한 동물 실험에도 충분히 사용될 수 있다는 장점을 가진다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> PEPTIDE FOR TARGETING TO MITOCHONDRIA <130> ADP-2019-0599 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-30 primer-f <400> 1 agatctgccg ccgcgatcgc catgtctctg tggggtctgg tct 43 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-30 primer-r <400> 2 gcggccgcgt acgcgtcaga agatgccgca ggtgt 35 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT6 1-30 : mitochondria targeting peptide <400> 3 Met Ser Leu Trp Gly Leu Val Ser Lys Met Pro Pro Glu Lys Val Gln 1 5 10 15 Arg Leu Tyr Val Asp Phe Pro Gln His Leu Arg His Leu Leu 20 25 30 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 31-50 primer-f <400> 4 agatctgccg ccgcgatcgc cggtgactgg ctggagagc 39 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 31-50 primer-r <400> 5 gcggccgcgt acgcgtgcag cagaaggcgt c 31 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT6 31-50 <400> 6 Gly Asp Trp Leu Glu Ser Gln Pro Trp Glu Phe Leu Val Gly Ser Asp 1 5 10 15 Ala Phe Cys Cys 20 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-20 primer-f <400> 7 acgcgtacgc ggccgctcga gatggagagc gacga 35 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-20 primer-r <400> 8 gacatagagc cgctgcactt tttctggggg catcttgg 38 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT6 1-20 <400> 9 Met Ser Leu Trp Gly Leu Val Ser Lys Met Pro Pro Glu Lys Val Gln 1 5 10 15 Arg Leu Tyr Val 20

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 검출용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 펩타이드는,
    형광 단백질(fluorescent protein, FP)로 표지된 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 검출용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
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