CN112341523A - Dleu2编码的小肽及其在制备免疫调节药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种DLEU2编码的小肽PEP17及其在制备免疫调节药物中的应用。所述PEP17具有诱导个体内外Treg细胞(Regulatory T cell)分化的功能，能够降低实验性变态反应性脑脊髓炎个体的脾脏和中枢神经系统(CNS)中的Th17细胞，增加Treg细胞的比例，并能明显减轻个体的发病。本发明的PEP17能够特异性靶向Treg细胞，分子量小，容易进入细胞发挥作用；本发明的PEP17可通过化学方法合成，易于大量制备，稳定性好，相对于现有的治疗银屑病有效的抗体价格更低。本发明为人类免疫失调相关疾病如银屑病等的治疗提供了有效的途径。

Description

DLEU2编码的小肽及其在制备免疫调节药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地说，本发明涉及一种DLEU2编码的小肽及其在制备免疫调节药物中的应用。

背景技术

调节性T细胞(Regulatory T cells，简称Treg细胞)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群。调节性T细胞可分为天然产生的自然调节性T细胞(nTreg细胞)和诱导产生的适应性调节性T细胞(iTreg细胞)等。Treg细胞常具有免疫抑制功能，分泌包括IL-10、TGF-β等多种细胞因子，对于维持体内正常的免疫活动至关重要。Treg细胞与自身免疫性疾病的发生关系密切，其异常表达可导致自身免疫性疾病。

Treg细胞是维持机体免疫耐受的重要因素之一，它由胸腺产生后输出至外周，并通过主动调节的方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而调节机体的免疫力，如防止自身免疫性疾病的发生。Treg细胞的数量减少或功能异常均有可能导致自身免疫病的发生，一些自身免疫性疾病如多发性硬化症、活动性类风湿关节炎、I型糖尿病等Treg细胞的数量和功能均会发生变化。因此，Treg细胞对于自身免疫性疾病的预防和治疗都具有重要意义，对其进行深入研究将有助于了解自身免疫性疾病的发病机制，对疾病的治疗有着深远的意义。

银屑病是一种慢性炎症性疾病，其诱因主要包括：感染、免疫、遗传、精神及环境等因素。银屑病主要病理学变化包括：角质形成细胞角化不全或角化过度，真皮大量炎症细胞浸润，血管异常增生，常伴有糖尿病、冠心病、高血压、抑郁、代谢综合征等系统性疾病。银屑病在中国的发病人群以25-45岁的青壮年为多，近年来儿童银屑病发病率也逐渐增加，银屑病不易治愈且容易复发的特性不仅严重危害患者的身心健康，并且严重影响患者的生活质量。目前临床上治疗银屑病的方法，包括药物治疗、物理治疗、免疫生物学治疗和中医中药治疗等。中国每年用于进口治疗银屑病的药物，尤其是科技含量高、靶向性强的小分子生物类药物的花销庞大，但是，大部分基于抗体等生物制剂药物的银屑病治疗方法都易造成一定程度的毒副作用，并且机体可能对药物产生耐药性，有些银屑病患者在使用一些分子抗体药物停药后出现复发及反弹。

多肽类(peptide)药物习惯上常指多肽类激素。一般将50或50个以下氨基酸残基组成的化合物称为多肽。现已知生物体内含有和分泌很多种激素和活性多肽，仅脑中就存在近40种，而人们还在不断地发现、分离、纯化新的活性多肽物质。多肽随着长度的增加，其稳定性及体内的半衰期都相应变差或者缩短。生理情况的多肽也不一定全部序列都是发挥功能所必须的。通过探索其发挥功能的最短功能域，可以增加多肽药物的稳定性及半衰期，降低合成成本，减少生物毒性。

综上，开发全新的靶向性强、远期疗效好、安全性高、价格低廉的新一代治疗银屑病的新药势在必行；而找到适合于临床用药的多肽类药物，则是促进此类新药开发的优选途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离的小肽及其在制备免疫调节药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的小肽，所述小肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

在一个优选例中，所述的小肽由ncRNA Dleu2编码。

在另一优选例中，所述的小肽由核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第103～156位的核苷酸序列或其简并序列所翻译。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码所述的小肽。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体(包括病毒载体或非病毒载体)，其含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组细胞，其中含有所述的表达载体或其基因组中包含所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供所述的小肽或编码其的多核苷酸，或所述的表达载体或所述的重组细胞在制备免疫调节药物中的应用。

在一个优选例中，所述的免疫调节药物是预防、缓解或治疗自身免疫性疾病的药物。

在另一优选例中，所述自身免疫性疾病包括：Treg细胞的数量减少或功能异常相关的自身免疫性疾病。

在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病包括(但不限于)：银屑病、多发性硬化症、白癜风、皮炎、实验性自身免疫性脑炎、哮喘、类风湿性关节炎或阿瑟氏反应。

在另一优选例中，所述的免疫调节药物是诱导Treg细胞分化的药物(通过诱导Treg细胞的分化，进行免疫调节)。

在另一优选例中，所述的免疫调节药物为促进调节性T细胞(Treg)分化的药物。

在另一优选例中，所述的免疫调节药物为减少CD4阳性T细胞进入中枢神经系统、增加Treg细胞进入中枢神经系统的药物。

在另一优选例中，所述的免疫调节药物为减少中枢神经系统中Th17的药物。

在另一优选例中，所述的免疫调节药物为抑制表皮角质形成细胞增殖的药物。

在另一优选例中，所述的免疫调节药物为缓解银屑病导致的脾脏肿大或脾脏增重的药物。

在另一优选例中，所述的免疫调节药物为减少皮肤炎症细胞浸润的药物。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的小肽的方法，所述方法包括：培养所述的重组细胞，从而重组表达所述的小肽。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的小肽的方法，所述方法包括：通过体外人工合成的方法制备所述的小肽。

在本发明的另一方面，提供一种用于免疫调节的药物组合物，所述的药物组合物包括：前面任一所述的小肽或编码其的多核苷酸，或所述的表达载体或所述的重组细胞；以及药学上或生理学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于免疫调节的药盒，所述药盒中包括：前面任一所述的小肽或编码其的多核苷酸；或所述的表达载体；或所述的重组细胞；或所述的药物组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、PEP17的获得；

图1A、质谱分析确定PEP17氨基酸正确性，质谱检测的分子量为2078.00。

图1B、HPLC的纯度分析，其纯度为95.17％。

图2、外源合成的PEP17可以促进iTreg细胞的分化；

A、外源合成的PEP17加入到小鼠

T细胞诱导的iTreg细胞分化体系中，流式细胞术检测，在不同的TGF-β浓度的诱导体系中，PEP17都可以促进iTreg细胞的分化。

B、不同浓度的PEP17(5μΜ，10μΜ，20μΜ)加入到小鼠

T细胞诱导的iTreg细胞分化体系中，流式细胞术检测，发现不同浓度的外源合成的PEP17都可以促进iTreg细胞的分化。

图3、外源合成的PEP17(17aa)治疗处理可以减轻EAE模型鼠的疾病指标。尾静脉注射PEP17(50μg/只/次)治疗EAE模型鼠，第9天开始，每3天治疗一次，一共治疗7次。疾病评分为全周期30天观察评分。中枢神经系统免疫细胞检测为第16天处死小鼠后分离染色，流式细胞仪检测；

A、外源合成的PEP17治疗处理可以减少EAE模型鼠的疾病评分。

B、外源合成的PEP17治疗处理可以减少CD4阳性T细胞进入中枢神经系统(CNS)。

C、外源合成的PEP17治疗处理可以增加Treg细胞在CNS中的比例。

D、外源合成的PEP17治疗处理可以减少CNS中Th17的比例。

图4、外源合成的PEP17(17aa)治疗处理可以减轻类银屑病模型鼠的疾病指标。尾静脉注射PEP17(50μg/只)治疗IMQ诱导的类银屑病模型鼠，7天后，处死小鼠，取背部皮肤及脾脏进行固定，染色和拍照，并进行疾病指标分析；

A、HE染色结果显示外源合成的PEP17能够有效抑制IMQ诱导的类银屑病模型鼠表皮中角质形成细胞的增殖。

B、外源合成的PEP17能够有效减轻类银屑病模型鼠的皮损症状和脾脏肿大。

C、统计结果显示，相比于对照组模型鼠，PEP17处理组的模型鼠的表皮厚度，皮肤炎症细胞浸润和脾脏重量都有显著的减少。

具体实施方式

本发明人经过广泛研究后发现，ncRNA Dleu2(deleted in lymphocyticleukemia 2)的部分核苷酸序列能够编码产生一小肽，并将之称为PEP17。所述的PEP17小肽能增加Treg细胞的比例，具有免疫调节功能，可用于预防或治疗自身免疫性疾病，如银屑病与多发性硬化症。

术语

如本文所用，所述的“Dlue2编码的小肽”、“PEP17小肽”、“PEP17多肽”、“PEP17肽”、“17aa”可以互换使用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

如本文所用，“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。

PEP17小肽

本发明提供了一种新型的由ncRNA编码的小肽，其是由Dlue2的部分核苷酸序列能够编码产生的一段小肽，本发明人将之命名为PEP17。

本发明的PEP17小肽可以是重组多肽、合成多肽。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。化学合成的方法对于本领域技术人员而言是熟悉的，例如固相多肽合成方法。

本发明的PEP17多肽的序列为：MLGRRARRRGRGRRRPA(SEQ ID NO:2)。

本发明还包括PEP17多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的PEP17多肽相同的生物学功能或活性的多肽。PEP17多肽的片段、衍生物或类似物可以是：

(i)有一个或多个(如1-10个、1-5个、1-3个或1-2个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或

(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或

(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或

(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，PEP17多肽可以指具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽。该术语还包括具有与PEP17多肽相同功能的、在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括PEP17多肽的活性片段和活性衍生物。

本发明中，也包括为了增加多肽的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的多肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的多肽。例如，在所述截短体中，对于部分氨基酸进行修饰形成的新的、保留原有功能的多肽。

本发明公开的PEP17合成简易、成本低、不具免疫排斥性、能够在炎症环境中特异性促进Treg细胞的分化、疗效好、治疗后疾病不易复发并且副作用小，治疗效果极为显著。

本发明还提供了编码本发明PEP17多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或PEP17肽的编码序列经基因工程产生的宿主细胞(重组细胞)，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

PEP17多肽的应用

本发明的主要贡献不仅在于获得了所述PEP17多肽，同时也在于验证了该多肽的功能功能。

本发明所述的PEP17可在炎症环境中特异性靶向Treg细胞，诱导Treg细胞的分化，在动物活体实验能够有效减轻IMQ诱导的类银屑病模型动物的病症。在反应性脑脊髓炎(EAE)动物模型中，降低中枢神经系统和脾脏中的Th17细胞的同时能够上调Treg细胞的比例，最终大幅改善EAE模型动物的疾病症状。

在本发明的具体实施例中，确定了PEP17能够促进Treg细胞体外分化。PEP17治疗处理能够减少EAE模型动物的疾病指标，减少CD4阳性T细胞进入中枢神经系统，在中枢神经系统中减少的Th17细胞，增加Treg细胞。并且，PEP17治疗处理还能够减少IMQ诱导的类银屑病模型动物的疾病指标。上述的研究结果表明，PEP17多肽可应用于促进Treg细胞的分化，可用于制备免疫调节药物。

本发明的小肽能够通过人工合成或生物学合成大量获得，可应用于制备免疫调节药物。

本发明还提供了所述的PEP17多肽制备免疫调节药物，或用于制备促进Treg细胞分化的药物。较佳地，所述的免疫调节药物是：预防或治疗多发性硬化症和银屑病的药物。

例如，所述的自身免疫性疾病包括：多发性硬化症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和银屑病等。此外，对其它一些与Treg细胞免疫调节功能失调相关的疾病或症状也具有潜在的预防或治疗作用。

目前，已知与Treg细胞的免疫调节功能失调相关的疾病或症状选自：炎症反应、类风湿关节炎、器官移植、系统性红斑狼疮、银屑病、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎等。

例如，所述炎症反应包括：过敏性炎症、毛囊炎、扁桃体炎、肺炎、肝炎、肾炎、痤疮、哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、炎性肠道疾病、盆腔炎、再灌注损伤、类风湿关节炎、移植排斥反应、血管炎或间质性膀胱炎等。

小肽在生物体内的浓度很低，对生物体的影响较小，但生理活性很强，在调节生理功能时起着非常重要的作用。肽类药物具有毒性低，特异性高，分子量小等自身独特的优势，且可以通过体外合成及生物学合成大量获得。因此，针对自身免疫性疾病的多肽类药物具有重要的临床应用价值。

本发明的小肽还能与其它的功能性分子构成复合体，所述的复合体包括：本发明所述的小肽，以及与所述的小肽操作性连接的功能性分子。所述的功能性分子包括但不限于：功能性生物大分子、功能性小分子、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体；较佳地，所述的功能性生物大分子包括但不限于：功能性多肽、功能性核酸。

作为本发明的一种实施方式，所述的功能性分子可以是具有示踪功能的标志物，包括但不限于荧光染料、MRI造影剂、放射性显影剂、磁性粒子或具有着色功能的化学试剂。例如，所述的具有示踪功能的标志物或功能性小分子可以为FITC。

作为本发明的一种实施方式，所述的功能性分子可以是功能性小分子，包括无机小分子和有机小分子，其分子量小于1000道尔顿。

作为本发明的一种实施方式，所述的功能性分子可以是功能性大分子，例如，可以是功能性多肽(如抗体)、功能性核酸。

作为本发明的另一种方式，所述的功能性分子为功能性核酸片段，包括但不限于质粒、siRNA、DNA、寡核苷酸、miRNA、反义核酸等。

作为本发明的优选方式，所述的功能性分子可以是一种穿膜肽，本发明的小肽与之连接后，有利于其进入到细胞中。所述的穿膜肽是引导所述的小肽进入到细胞内的肽，穿膜肽可以采用本领域已知的可引导肽或其编码基因进入到细胞内的任何分子，或采用提高肽穿透细胞能力的任何分子。

一些具有穿膜功能的肽包括：

①蛋白衍生肽(protein derived CPPs)，如penetratin、TAT和pVEC等；

②模型肽(model peptides)如MAP和(Arg)7等；③设计肽(designed CPPs)如MPG和Transportan等。

从穿膜肽的两亲性性质也可将其分为3类：

①两亲性CPPs(PaCPPs)，如MPG、transportan、TP10、Pep-1；

②中等两亲性CPPs(SaCPPs)，如penetratin，RL16；

③非两亲性CPPs(NaCPPs)，如R9。

作为本发明的一种实施方式，所述功能性分子为具有分子包装载物功能的制剂，包括但不限于脂质体、多聚体、树突状分子、纳米包装制剂等。

作为本发明的一种实施方式，所述的功能性分子为可携带遗传物质的病毒载体，包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体等。

本发明所述的小肽与功能性分子的连接方式可以为共价连接或非共价连接。应理解，只要能够保留小肽及功能性分子的功能，任何连接方式均可包含在本发明中。共价连接通常以形成共价键的方式将两个分子进行连接。而一些非共价连接(不形成共价键)例如偶联、吸附、结合等也可应用。

作为本发明的优选方式，所述的小肽与功能性分子之间通过化学键相连；更佳的，所述的化学键是肽键。

所述的小肽与功能性分子之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸；例如15、10、8、6、5、4、3、2、1个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响小肽与功能性分子各自的功能。所述的连接肽上还可包含至少一个特异性酶切位点。所述的酶切位点选自(但不限于)：肠激酶酶切位点，凝血酶酶切位点，或胰蛋白酶酶切位点。酶切位点的设置便于后续将小肽与功能性分子进行分离。小肽与功能性分子之间的连接，若以肽键进行连接，则根据需要，功能性分子可以位于小肽的氨基端，也可以位于小肽的羧基端。

作为本发明的一种实施方式，所述的小肽可以通过氨基、羧基或巯基等化学反应实现与功能性分子的连接，包括但不限于所述多肽与多聚物之间的连接，所述多肽在脂质体或纳米粒子表面的共价修饰、酯化反应、硫化反应等。

药物组合物及药盒

本发明还提供一种用于免疫调节的药物组合物，所述的药物组合物包括：本发明所述的多肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞；以及药学上或生理学上可接受的载体。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的多肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

本发明还提供了一种药盒或试剂盒，其中包括：本发明所述的多肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞；或所述的药物组合物。

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、PEP17序列分析和体外合成

1、PEP17序列分析

Dleu2的序列如下(SEQ ID NO:1)：

AATGTTGACGCAATCTATAAATAGTGGAACAAAAGGACCAACTTCCTCGGAGCTTTGCTGAAACTGCACAAAAAATCGAGCTGGGGGGTTCCCTGGTCCCCGATGTTGGGGCGGAGAGCGCGGCGCCGAGGGAGGGGGCGGCGCAG ACCGGCCTAGGGGACACCTGGTCGAGCGCAGCCGCCGCTCCGCTCGAGCCCTGCGCTCCAGTGCCCCCACTGGCTGGAGAGCTCGCCCAGACCGGGGGTCTTCCTCCGTCGCTGACAGATTTTAACCATTAGAAGAATACCAGTTCTGGAAAACAACCAAAGTTTCTTTGATTGAATGCCCATGTAATGCATTGGAATATGATAGGCGATTAAGGTTTAACAATGTTAAAATGAAGATATTACTAAAATGGCCCTCTAAATAGCCCAACAATTATTATTTTCTTTGTCCTATGGATTTGGCTTTGAAAGATGTGCTGCTCTTAATAAGCTTTTCATTCTGCCGGCCATACTTTTTCTCCCTACTCTGGACGCCTCTAGATGACTCCAGCTGTGCTCTCCTTCGTAATCTACACACCCTCCTCAACCATACCCTGGACCAGTCATGTCCTCATCTCAGACACGACTTTTCTGGTTTGCACCACAGTGTTTCAATAGCAAGGCTGATGACTTGAGTATGAAAGCTGTGAATCAGGATGCCAGGCAGACAGAATGGATAACATTCTAATTAAATGATCAGCATTAATTCTCTCTCTCGGGCAGAAACCTACGTGTTCCTCTTCCAGAGAGCTGGTGAAGCCAAAGGCATTCTCATAATGATGCGCTACACCGACTGACATTTACCAACTGTGTCAAAGCTACAGGAGCCAGGTAGACACTGCTGGAACTTTAACGGGAATCAAACAAGTCTATAAGAAGCACTGAGCTGTGCCACTACCCAATCAGTGTTCTTCCAGAGCACACAAACGAAAGTGGGAGGAGCCTTCCAATGAGAACTGTTGTGTGATTAATCAATGAGGCTGACTAAAGCACACACTTATAATCCCAATACTCAGAAAGACAGAGGAAGAAGGATATCAGCGCAAGGCCAACAAGGCTTCAAAGCAAGTACCAACCCAGTATGGACCATGAGACCCTATTTCAGAAACAAATAATAAAAGCTTGATGAAGCTGCAAAAATTACTCATTTTATCAATCCCTATTCTTGTATACTGAACTATACACAAAGGCACTTGTGTGGCCAGTGGGTGCGGTCAGAAAGGAGTACAGGCTCACGTGACTCAGCTACAAGCTGAGACAGCTGCTGCTATTAGGAAAACAATGGAAGCCAGCAGTATGTAGATTTAGGGAGCTGACAAATCCTGAAAATGAATAAAATGAGCTGGGTACTTCCAGAAACACGATACTTCTTGACCATGAAAAGGAAAAAGGCTGGGTTTTTATGTTAAAATTTGAATTTTTGCAAAATGTACTTATAATCTTCCCATTAAAGATGCTGATAAATAGTAAAGTTAACAAATGTGAGGGTTATTGGGGAATTATATAATGAAATATGTCAATGTTTGGAGGTCTCTGTAATAATGTTATAAATCATAGAAGACTTGTTTAAAATATAAGAAAGGGTTGGAGTGTGGCTCAGTGGGAGAGCACTTGCCAAGACCCTGAGTTCAATTCCCAATACTGCAGAAATAAAAAATAAGTATGATCTCAAAAAAAAAAAAAAA

上述序列中，下划线部分为PEP17预测序列。翻译为氨基酸的序列为:MLGRRARRRGRGRRRPA(SEQ ID NO:2)。

2、PEP17的体外合成。

使用常规的固相多肽合成方法，按照SEQ ID NO:2氨基酸序列合成多肽，质谱分析确定氨基酸正确如图1A(PEP17)。纯度为95.17％，如图1B。使用前溶于生理盐水或PBS待用。

实施例2、PEP17促进Treg细胞分化

实施例1中固相多肽合成方法得到的PEP17，测定其对Treg细胞分化的影响。

1、对Treg细胞的体外诱导体系的影响

获取小鼠的脾脏细胞，利用免疫磁珠分离小鼠

CD4+ T细胞，在37℃条件下培养于RPMI 1640培养基中，在培养基中加入anti-CD3(2.5μg/ml)、anti-CD28(2μg/ml)、TFG-β(0.3ng/ml或其他指定浓度)培养2-3天以得到iTreg细胞。

在37℃条件下、RPMI 1640培养基中培养Treg细胞，分为若干个培养组，分别加入0μM，5μM，10μM和20μM浓度的PEP17，流式细胞术观察PEP17对Treg细胞分化的影响。

如图2A所示，外源合成的PEP17加入到小鼠

T细胞诱导的iTreg细胞分化体系中，可见在不同的TGF-β浓度的诱导体系中，PEP17都可以促进iTreg细胞的分化。

如图2B所示，不同浓度的PEP17(5μΜ，10μΜ，20μΜ)加入到小鼠

T细胞诱导的iTreg细胞分化体系中，可见不同浓度的外源合成的PEP17都可以促进iTreg细胞的分化。

实施例3、外源合成的PEP17治疗处理能够减轻EAE模型鼠的疾病指标。

将10-13周龄的雌性SPF级小鼠随机分为Saline组(对照组)和PEP17治疗组，对小鼠进行EAE模型造模处理。将结核菌素(Mtb)粉末溶于不完全弗氏佐剂制成完全弗氏佐剂，混合MOG和完全弗氏佐剂混合，使用三通管使之乳化。EAE造模第一天，在小鼠背部皮下注射接种MOG弗氏佐剂乳化混合液，200μl/只小鼠。再腹腔注射百日咳毒素(PTX)，200ng/只小鼠。第三天时，再次腹腔注射百日咳毒素(PTX)，200ng/只小鼠。造模完成，一般9-12天开始发病。PEP17治疗处理从第9天开始，尾静脉注射PEP17(50μg/只/次)，每3天治疗一次，一共治疗7次。每日观察与记录模型鼠发病情况与评分，30天为评分完整周期。16天发病最为严重的时间，可处死小鼠，分离脾脏、脑和脊髓，进行单细胞化处理，染色和流式分析。

如图3A，与对照组相比，外源合成的PEP17治疗处理可以显著地降低EAE模型鼠的疾病评分。

如图3B，与对照组相比，外源合成的PEP17治疗处理可以显著地减少CD4阳性T细胞进入中枢神经系统(CNS)。

如图3C，对照组相比，外源合成的PEP17治疗处理可以极为显著地增加Treg细胞在CNS中的比例(***p﹤0.001)。

如图3D，外源合成的PEP17治疗处理可以非常显著地减少CNS中Th17的比例(**p﹤0.01)。

上述EAE模型鼠的疾病评分和免疫细胞检测都显示，PEP17(17aa)治疗处理能够上调Treg细胞比例并减轻疾病症状。

实施例4、外源合成的PEP17治疗处理能够减轻IMQ诱导的类银屑病模型鼠的疾病指标

将8-12周龄的SPF级别小鼠随机分为Saline组和PEP17治疗组，用IMQ涂抹小鼠背部皮肤，65mg/只，共计涂抹一周，建立IMQ诱导的小鼠类银屑病模型，并于IMQ给药后第2天进行生理盐水及PEP17(溶解生理盐水)尾静脉给药，剂量为50μg/只鼠，每天一次。IMQ诱导7天时处理小鼠，取背部皮肤及脾脏进行分析。皮肤进行切片和HE染色后，能够进行表皮增厚、炎症细胞浸润等分析。

如图4A，对于模型鼠表皮的HE染色结果显示，外源合成的PEP17能够有效抑制IMQ诱导的类银屑病模型鼠表皮中角质形成细胞的增殖。

如图4B，观测模型鼠的表皮可见，外源合成的PEP17能够有效减轻类银屑病模型鼠的皮损症状。获取模型鼠的脾脏可见，外源合成的PEP17能够有效缓解疾病导致的脾脏肿大。

如图4C，统计结果显示，相比于对照组模型鼠，PEP17处理组的模型鼠的表皮厚度，皮肤炎症细胞浸润和脾脏重量都有极为显著的减少(**p﹤0.01，***p﹤0.001)。

这些结果显示，PEP17治疗处理能够明显减弱皮肤与脾脏的各种炎症表型。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学医学院

<120> DLEU2编码的小肽及其在制备免疫调节药物中的应用

<130> 207607

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1708

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

aatgttgacg caatctataa atagtggaac aaaaggacca acttcctcgg agctttgctg 60

aaactgcaca aaaaatcgag ctggggggtt ccctggtccc cgatgttggg gcggagagcg 120

cggcgccgag ggagggggcg gcgcagaccg gcctagggga cacctggtcg agcgcagccg 180

ccgctccgct cgagccctgc gctccagtgc ccccactggc tggagagctc gcccagaccg 240

ggggtcttcc tccgtcgctg acagatttta accattagaa gaataccagt tctggaaaac 300

aaccaaagtt tctttgattg aatgcccatg taatgcattg gaatatgata ggcgattaag 360

gtttaacaat gttaaaatga agatattact aaaatggccc tctaaatagc ccaacaatta 420

ttattttctt tgtcctatgg atttggcttt gaaagatgtg ctgctcttaa taagcttttc 480

attctgccgg ccatactttt tctccctact ctggacgcct ctagatgact ccagctgtgc 540

tctccttcgt aatctacaca ccctcctcaa ccataccctg gaccagtcat gtcctcatct 600

cagacacgac ttttctggtt tgcaccacag tgtttcaata gcaaggctga tgacttgagt 660

atgaaagctg tgaatcagga tgccaggcag acagaatgga taacattcta attaaatgat 720

cagcattaat tctctctctc gggcagaaac ctacgtgttc ctcttccaga gagctggtga 780

agccaaaggc attctcataa tgatgcgcta caccgactga catttaccaa ctgtgtcaaa 840

gctacaggag ccaggtagac actgctggaa ctttaacggg aatcaaacaa gtctataaga 900

agcactgagc tgtgccacta cccaatcagt gttcttccag agcacacaaa cgaaagtggg 960

aggagccttc caatgagaac tgttgtgtga ttaatcaatg aggctgacta aagcacacac 1020

ttataatccc aatactcaga aagacagagg aagaaggata tcagcgcaag gccaacaagg 1080

cttcaaagca agtaccaacc cagtatggac catgagaccc tatttcagaa acaaataata 1140

aaagcttgat gaagctgcaa aaattactca ttttatcaat ccctattctt gtatactgaa 1200

ctatacacaa aggcacttgt gtggccagtg ggtgcggtca gaaaggagta caggctcacg 1260

tgactcagct acaagctgag acagctgctg ctattaggaa aacaatggaa gccagcagta 1320

tgtagattta gggagctgac aaatcctgaa aatgaataaa atgagctggg tacttccaga 1380

aacacgatac ttcttgacca tgaaaaggaa aaaggctggg tttttatgtt aaaatttgaa 1440

tttttgcaaa atgtacttat aatcttccca ttaaagatgc tgataaatag taaagttaac 1500

aaatgtgagg gttattgggg aattatataa tgaaatatgt caatgtttgg aggtctctgt 1560

aataatgtta taaatcatag aagacttgtt taaaatataa gaaagggttg gagtgtggct 1620

cagtgggaga gcacttgcca agaccctgag ttcaattccc aatactgcag aaataaaaaa 1680

taagtatgat ctcaaaaaaa aaaaaaaa 1708

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Leu Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Gly Arg Gly Arg Arg Arg Pro

1 5 10 15

Ala

Claims (10)

1.一种分离的小肽，其特征在于，所述小肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的小肽，其特征在于，该小肽由ncRNA Dleu2所编码；较佳地，该小肽由核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第103～156位的核苷酸序列或其简并序列所翻译。

3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的小肽；较佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第103～156位或其简并序列。

4.一种表达载体，其含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种重组细胞，其含有权利要求4所述的表达载体或其基因组中包含权利要求3所述的多核苷酸。

6.权利要求1所述的小肽或编码其的多核苷酸，或权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的重组细胞在制备免疫调节药物中的应用；较佳地，所述的免疫调节药物包括：

促进调节性T细胞(Treg)分化或增加调节性T细胞数量的药物；

减少CD4阳性T细胞进入中枢神经系统、增加Treg细胞进入中枢神经系统的药物；

减少中枢神经系统中Th17的药物；

抑制表皮角质形成细胞增殖的药物；

缓解银屑病导致的脾脏肿大或脾脏增重的药物；或

减少皮肤炎症细胞浸润的药物。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的免疫调节药物包括：预防、缓解或治疗自身免疫性疾病的药物；较佳地，所述自身免疫性疾病包括：Treg细胞的数量减少或功能异常相关的自身免疫性疾病；较佳地，所述自身免疫性疾病包括：银屑病、多发性硬化症、白癜风、皮炎、实验性自身免疫性脑炎、哮喘、类风湿性关节炎或阿瑟氏反应的药物。

8.一种制备权利要求1所述的小肽的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求5所述的重组细胞，从而重组表达权利要求1所述的小肽；或所述方法包括：通过体外人工合成的方法或生物学合成方法制备权利要求1所述的小肽。

9.一种用于免疫调节的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：权利要求1所述的小肽或编码其的多核苷酸，或权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的重组细胞；以及药学上或生理学上可接受的载体。

10.一种用于银屑病治疗的药盒，其特征在于，所述药盒中包括：

权利要求1所述的小肽或编码其的多核苷酸；

权利要求4所述的表达载体；

权利要求5所述的重组细胞；或

权利要求9所述的药物组合物。

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