CN102153653A - 肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白及其制备方法。涉及重组融合蛋白的表达与纯化，提供肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白及其制备方法与应用。制备方法包括：设计引物，PCR扩增EG3287-tTF重组基因，并将其导入载体，将重组载体导入宿主细胞，构建表达融合蛋白EG3287-tTF的重组工程菌，发酵培养，分离纯化发酵液，即得肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白。构建了靶向性抗肿瘤融合蛋白EG3287-tTF，获得一种既具有tTF抗肿瘤的优点，又具有靶向性的新型tTF衍生物，并增强tTF的抗肿瘤效果，为开发肿瘤血管靶向治疗的新药物奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及重组融合蛋白的表达与纯化，特别涉及肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白及其制备方法。
背景技术
神经菌毛素1(Neuropilin-1，简称NRP1)是细胞表面的I型跨膜糖蛋白，其相对分子质量为130KDa，由位于染色体10p12的基因编码。NRP1是血管生长因子165(Vascularendothelial growth factor，VEGF165)的共受体，VEGF165在血管生成中起着重要作用，能够诱导血管的增生。这种作用由血管生长因子受体-2(VEGF receptors 2，VEGFR-2)介导，并且依赖NRP1双倍体的存在，只有双倍体能够使VEGF165有效的与VEGFR-2结合(1、WestDC，Rees CG，Duchesne L，Patey SJ，Terry CJ，Turnbull JE，Delehedde M，Heegaard CW，Allain F，Vanpouille C，Ron D，Fernig DG.Interactions of multiple heparin binding growth factors withneuropilin-1 and potentiation of the activity of fibroblast growth factor-2[J].J B iol Chem，2005，280：13457-13464.)。NRP1的双倍体和VEGFR-2形成复合物，能显著增加VEGFR-2的活性，促进VEGF165与VEGFR-2的结合。
Haiyan Jia等(2、Haiyan Jia，Azadeh Bagherzadeh，Basil Hartzoulakis，Ashley Jarvis，Marianne Lo¨hr，Shaheda Shaikh，Rehan Aqil，Lili Cheng，Michelle Tickner，Diego Esposito，Richard Harris，Paul C.Driscoll，David L.Selwood，and Ian C.Zachary.Characterization of abicyclic peptide Neuropilin-1(NP-1)antagonist(EG3287)reveals importance of vascularendothelial growth factor exon8 for NP-1binding and role of NP-1in KDR signaling.Journal ofbiological chemistry，2006，281(19)：13493-13502.)基于VEGF165与NRP1结合的核心区域设计出短肽EG3287，其研究表明，EG3287可以很好地抑制VEGF165与表达NRP1的猪动脉内皮细胞(PAE/NP-1)，抑制率＞95％，说明EG3287与NRP1有较强的亲和力。
组织因子(tissue factor，简称TF)又称组织凝血活酶或组织凝血活酶因子，即凝血因子III，是唯一不存在于正常人血浆中的凝血因子。TF与肿瘤的侵袭、转移密切相关，具有促进肿瘤生长、侵袭、转移的作用，现已证实这主要是由于其引发胞内结构的改变造成的。截短的组织因子(truncated tissue factor，tTF)仅含有TF胞外区，能与凝血因子VII或活化的凝血因子VII结合，并活化凝血因子X和凝血因子IX的活性。但是在血液循环过程中，tTF不是一种有效的凝血剂，它对凝血因子X的活化能力要比完整的跨膜TF低5个数量级(3、Ruf W，Rehemtulla A，Morrissey JH，Edgington TS.Phospholipid-independent and-dependent interactionsrequired for tissue factor receptor and cofactor function[J]J Biol Chem，1991，266(4)：2158-2166.)。显然，缺少膜内组分的tTF与凝血因子VII结合尽管不需要磷脂膜表面，但它并不能有效活化凝血因子X，这是因为TF-活化的凝血因子VII复合物在带负电荷的磷脂膜表面能更有效地结合并活化凝血因子X(4、Krishnaswamy S，Field KA，Edgington TS，Morrissey JH，Mann KG.Role ofthe membrane surface in the activation of human coagulation factor X[J]J Biol Chem，1992，267(36)：26110-26120.)。但当融合蛋白的载体结合于肿瘤血管细胞膜表面后，tTF活化凝血因子X的功能得到完全恢复(5、Huang X，Molema G，King S，Watkins L，Edgington TS，Thorpe PE.Tumorinfarction in mice by antibody-directed targeting of tissue factor to tumorvasculature[J]Science，1997，275(5299)：547-550)，变成一种特异的有效凝血剂。因此，tTF融合蛋白中的载体不久提供特异的传递作用，而且在与膜抗原结合后发挥了TF膜内组分相似的作用。由于游离tTF融合蛋白对凝血因子X活化能力很低及体内的正常抗凝作用，治疗剂量的游离的tTF融合蛋白并不诱发正常组织血管栓塞。
相对于传统的药物靶向治疗，载体-tTF融合蛋白靶向治疗有以下优点：
1)靶向药物可以直接快速到达治疗部位，并允许药物在靶组织快速高比例分配。
2)基于肿瘤组织血管栓塞的肿瘤细胞杀伤具有放大作用。
3)血管内皮细胞属于基因稳定的正常细胞群，无抗原分子突变之忧。
4)同一靶向药物可适用不同的实体瘤。
5)人源序列的TF没有免疫原性。
由此可见，tTF是一种靶向于肿瘤血管表达的标志物，可选择性诱发肿瘤组织血管栓塞，阻断肿瘤组织血管营养物质和氧气的供给，引发肿瘤坏死。因此，利用tTF开发靶向抗肿瘤药物是一种很有前景的肿瘤治疗策略。
发明内容
本发明的第一目的在于提供肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白。
本发明的第二目的在于提供肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白的制备方法。
本发明的第三目的在于提供肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白命名为EG3287-tTF，简称为融合蛋白EG3287-tTF，其氨基酸序列为：
Met Gly Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp
1 5 10 15
Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val
20 25 30
Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys
35 40 45
Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu
50 55 60
Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr
65 70 75 80
Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr
85 90 95
Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr
115 120 125
Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser
130 135 140
Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp
145 150 155 160
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu
165 170 175
Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln
180 185 190
Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro
195 200 205
Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ala Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His
225 230 235 240
His His His Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln
245 250 255
Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
260 265 270
所述肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白的基因序列为：
ccatgggctc tggcactaca aatactgtgg cagcatataa tttaacttgg aaatcaacta 60
atttcaagac aattttggag tgggaaccca aacccgtcaa tcaagtctac actgttcaaa 120
taagcactaa gtcaggagat tggaaaagca aatgctttta cacaacagac acagagtgtg 180
acctcaccga cgagattgtg aaggatgtga agcagacgta cttggcacgg gtcttctcct 240
acccggcagg gaatgtggag agcaccggtt ctgctgggga gcctctgtat gagaactccc 300
cagagttcac accttacctg gagacaaacc tcggacagcc aacaattcag agttttgaac 360
aggtgggaac aaaagtgaat gtgaccgtag aagatgaacg gactttagtc agaaggaaca 420
acactttcct aagcctccgg gatgtttttg gcaaggactt aatttataca ctttattatt 480
ggaaatcttc aagttcagga aagaaaacag ccaaaacaaa cactaatgag tttttgattg 540
atgtggataa aggagaaaac tactgtttca gtgttcaagc agtgattccc tcccgaacag 600
ttaaccggaa gagtacagac agcccggtag agtgtatggg ccaggagaaa ggggaattca 660
gagaagcggg cggcggtgga tccggaggcg gtggttctgg aggcggtggt tctcaccacc 720
accaccacca cagctgcaaa aacaccgata gccgttgcaa agcgcgtcag ctggaactga 780
acgaacgtac ctgccgttgc gataaaccgc gtcgttaact cgag 824
所述肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)设计引物，PCR扩增EG3287-tTF重组基因，并将EG3287-tTF重组基因导入载体，构建重组载体；
2)将重组载体导入宿主细胞，构建表达融合蛋白EG3287-tTF的重组工程菌；
3)将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白。
在步骤1)中，所述引物可为：
P1：5’CCGCTCGAGTTAACGACGCGGTTTATC 3’
P6：5’CATGCCATGGGCTCTGGCACTACAAATACTG 3’；
所述载体可为pET32b(+)。
在步骤2)中，所述宿主细胞可为大肠杆菌BL21(DE3)。
在步骤3)中，所述分离纯化可采用镍柱蛋白纯化。
融合蛋白EG3287-tTF能有效抑制肿瘤的生长，在制备抗肿瘤药物中具有广泛的应用。
本发明以NRP1为肿瘤靶点，EG3287肽为靶向载体，tTF蛋白为抗肿瘤效应分子，构建靶向性抗肿瘤融合蛋白EG3287-tTF，获得一种既具有tTF抗肿瘤的优点，又具有靶向性的新型tTF衍生物，并增强tTF的抗肿瘤效果。体内实验显示融合蛋白EG3287-tTF能有效抑制鼠源性肉瘤S180的生长，在S180小鼠模型中，EG3287-tTF的抑瘤率可达到64.6％。组织学观察发现融合蛋白EG3287-tTF能选择性定位于肿瘤组织，并选择性诱发肿瘤组织血管栓塞，导致肿瘤细胞坏死，而对正常组织没有毒副作用。EG3287-tTF具有显著的选择性诱发肿瘤组织血管栓塞的活性与抑制肿瘤生长的作用，为开发肿瘤血管靶向治疗的新药物奠定了基础。
附图说明
图1为EG3287-tTF的PCR产物电泳图。在图1中，M为分子量标记，900、800、600、300、150为分子量标记大小；1为tTF的PCR产物，2为EG3287的PCR产物，3为EG3287-tTF的PCR产物。
图2为重组质粒pET32b(+)/EG3287-tTF酶切后的电泳图。在图2中，M为分子量标记，1500、600、100为分子量标记大小；1为未酶切的重组质粒pET32b(+)/EG3287-tTF，2～3为经Nco I和BamH I双酶切后的重组质粒pET32b(+)/EG3287-tTF，4～5为经Nco I和XhoI双酶切后的重组质粒pET-32b(+)-tTF-EG3287，6为质粒pET-32b(+)
图3为重组质粒pET32b(+)/EG3287-tTF表达产物的电泳图。在图3中，M为分子量标记，KDa为道尔顿，94.0、662、45.0、35.0、26.0、20.0为分子量大小，1为经IPTG诱导后的pET32b(+)/EG3287-tTF的表达产物，2为pET32b(+)/EG3287-tTF经IPTG诱导表达后的上清液，3为柱洗脱杂蛋白，4为柱洗脱目的蛋白，即EG3287-tTF。
图4为小鼠移植瘤S180生长曲线图。在图4中，横坐标为时间(d)，纵坐标为肿瘤体积(mm3)，●为PBS，■为tTF，▲为EG3287-tTF。
图5为融合蛋白在小鼠肿瘤组织中的荧光定位图。在图5中，A为tTF-RBITC组Hoechst，B为tTF-EG3287-RBITC组Hoechst，C为tTF-RBITC组tTF-RBITC，D为tTF-EG3287-RBITC组tTF-EG3287-RBITC，E为A与C的叠加，F为B与D的叠加，图中标尺均为20μm。
图6为融合蛋白EG3287-tTF在小鼠正常组织的荧光定位图。在图6中，A为肾，其标尺为20μm；B为肺，其标尺为20μm；C为脑，其标尺为20μm；D为肝，其标尺为20μm；E为脾，其标尺为100μm；F为心脏，其标尺为100μm。
具体实施方式
以下结合附图，通过具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
实施例1EG3287-tTF重组基因的构建
1)根据文献报道的肿瘤血管靶向多肽EG3287氨基酸序列(参见文献：Haiyan Jia，AzadehBagherzadeh，Basil Hartzoulakis，Ashley Jarvis，Marianne Lo¨hr，Shaheda Shaikh，Rehan Aqil，LiliCheng，Michelle Tickner，Diego Esposito，Richard Harris，Paul C.Driscoll，David L.Selwood，andIan C.Zachary.Characterization of a bicyclic peptide Neuropilin-1(NP-1)antagonist(EG3287)reveals importance of vascular endothelial growth factor exon8 for NP-1binding and role of NP-1in KDR signaling.Journal of biological chemistry，2006，281(19)：13493-13502.)，按照引物设计原则，根据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子喜好性原则，在不影响氨基酸序列的前提下，设计出EG3287的核苷酸序列。
2)以P1和P2为上、下游引物，质粒tTF-pET22b(+)为模板，常规PCR扩增tTF基因，其中引物P1含Nco I酶切位点，加下划线表示(参见表1)。
表1
3)用P3和P4温育获得基因EG3287模板，然后以P5和P6为引物，常规PCR扩增EG3287基因，其中P3包含3个Gly4Ser(下划线标出)和6个His(斜体标出)，引物P5含有Nco I酶切位点，加下划线表示；引物P6含有Xho I酶切位点，加下划线表示。
4)以步骤2)中的tTF基因的PCR扩增产物和步骤3)中的EG3287基因的PCR扩增产物为模板，以P1和P6为引物，PCR扩增完整的EG3287-tTF重组基因序列(参见图1)。所得EG3287-tTF重组基因序列为：
ccatgggctc tggcactaca aatactgtgg cagcatataa tttaacttgg aaatcaacta 60
atttcaagac aattttggag tgggaaccca aacccgtcaa tcaagtctac actgttcaaa 120
taagcactaa gtcaggagat tggaaaagca aatgctttta cacaacagac acagagtgtg 180
acctcaccga cgagattgtg aaggatgtga agcagacgta cttggcacgg gtcttctcct 240
acccggcagg gaatgtggag agcaccggtt ctgctgggga gcctctgtat gagaactccc 300
cagagttcac accttacctg gagacaaacc tcggacagcc aacaattcag agttttgaac 360
aggtgggaac aaaagtgaat gtgaccgtag aagatgaacg gactttagtc agaaggaaca 420
acactttcct aagcctccgg gatgtttttg gcaaggactt aatttataca ctttattatt 480
ggaaatcttc aagttcagga aagaaaacag ccaaaacaaa cactaatgag tttttgattg 540
atgtggataa aggagaaaac tactgtttca gtgttcaagc agtgattccc tcccgaacag 600
ttaaccggaa gagtacagac agcccggtag agtgtatggg ccaggagaaa ggggaattca 660
gagaagcggg cggcggtgga tccggaggcg gtggttctgg aggcggtggt tctcaccacc 720
accaccacca cagctgcaaa aacaccgata gccgttgcaa agcgcgtcag ctggaactga 780
acgaacgtac ctgccgttgc gataaaccgc gtcgttaact cgag 824
PCR扩增的反应条件均为：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸1min，循环数10次；95℃变性45s，72℃退火并延伸90s，循环数25次；72℃延伸10min。
实施例2重组表达质粒的构建及鉴定
1)将EG3287-tTF重组基因的PCR产物及pET32b(+)质粒分别用限制性内切Nco I和Xho I进行酶切，并用常规酶切纯化试剂盒回收酶切产物(参见图2)。
2)用T4DNA连接酶将EG3287-tTF基因克隆连接至质粒pET32b(+)中，构建重组质粒pET32b(+)/EG3287-tTF。
3)将重组质粒pET32b(+)/EG3287-tTF转化到大肠杆菌BL21(DE3)，选取阳性克隆送上海英俊公司测序。
实施例3重组表达质粒pET32b(+)/EG3287-tTF的表达及其表达产物的纯化
1)挑取大肠杆菌BL21(DE3)单菌落，其中含有测序正确的重组质粒pET32b(+)/EG3287-tTF)，于37℃振荡培养过夜，按1∶100稀释到LB培养液中，37℃振荡培养至OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导表达6h。
2)纯化融合蛋白EG3287-tTF，融合蛋白EG3287-tTF的纯化参照Amersham PharmaciaBiotech公司提供的镍柱蛋白纯化操作手册进行。融合蛋白EG3287-tTF主要以包涵体形式存在，洗涤并溶解包涵体，离心取上清过镍柱纯化。融合蛋白EG3287-tTF的表达量占菌体总蛋白的30％以上。
3)融合蛋白EG3287-tTF的复性，将收集的洗脱流出液即所获蛋白装入透析袋，在0.01mol/L PBS pH8.0中透析48h，每6h更换一次PBS溶液。待梯度透析复性结束后，将复性蛋白分装保存在-80℃冰箱。
4)12％的SDS-PAGE及凝胶成像系统(购买自Bio-Rad)分析表达量与纯度。经SDS-PAGE分析，在分子量为55000附近有一特异条带，符合融合蛋白EG3287-tTF理论推算值(分子量约为55000)，扫描分析显示其纯度达85％以上(参见图3)。所得融合蛋白EG3287-tTF的氨基酸序列为：
Met Gly Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp
1 5 10 15
Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val
20 25 30
Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys
35 40 45
Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu
50 55 60
Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr
65 70 75 80
Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr
85 90 95
Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr
115 120 125
Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser
130 135 140
Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp
145 150 155 160
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu
165 170 175
Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln
180 185 190
Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro
195 200 205
Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ala Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His
225 230 235 240
His His His Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln
245 250 255
Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
260 265 270
实施例4融合蛋白EG3287-tTF的活性鉴定
1)选用RBITC(罗丹明)作为荧光素标记融合蛋白EG3287-tTF，分别将适量已知蛋白浓度的tTF和EG3287-tTF溶解在pH 9～9.5碳酸盐缓冲液中，根据准备标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白0.01mg荧光素制备荧光素二甲亚砜(DMSO)溶液；将荧光素二甲亚砜溶液逐滴加入到上述蛋白碳酸盐缓冲液中，搅拌均匀，置4℃冰箱中结合过夜；结合完毕后，将蛋白碳酸盐缓冲液以2500r/min离心20min，除去其中少量沉淀物，装入透析袋，用PBS(pH＝7.4)透析，置4℃冰箱中过夜。每4～6h更换透析液，以除去游离RBITC荧光素。标记后的蛋白用0.22μm滤膜过滤除菌，测定过滤除菌后的蛋白浓度，并用无菌的0.01mol/L PBS(pH＝7.2)稀释至0.2mg/mL。
2)选用背部皮下移植肿瘤(鼠源性肉瘤S180)的雌性小鼠作为肿瘤模型，根据肿瘤大小将小鼠平均分成3个实验组：PBS组、tTF-RBITC组和EG3287-tTF-RBITC组。通过尾静脉注射给药的方式，每天每只小鼠给药一次，每次100μL PBS或相应组别的蛋白溶液。
3)自给药日起，观察肿瘤生长及小鼠状况，5日后，处死小鼠，取肿瘤、心、肝、脾、肺、脑、肾等组织制作冰冻切片，然后用Hoechst 33258复染，并使用共聚焦显微镜观测药物在肿瘤及正常组织的定位。
体内实验显示：融合蛋白EG3287-tTF对小鼠移植瘤S180的生长具有明显的抑制作用，肿瘤抑制率达到64.6％(参见图4)。融合蛋白EG3287-tTF治疗组的肿瘤血管内有大量红细胞堆积、形成血栓，周围有不同程度的肿瘤细胞坏死。很明显，融合蛋白EG3287-tTF在体内可以选择性诱发S180肿瘤组织血管栓塞，由于对NRP1有较高的亲和力，因而可以有效地靶向于肿瘤血管，导致血栓形成(参见图5)，而tTF治疗组肿瘤则没观察到明显的血管栓塞，并且融合蛋白EG3287-tTF没有诱发正常组织器官内血栓形成(参见图6)。
Claims (8)
1.肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白，其特征在于，其命名为EG3287-tTF，简称为融合蛋白EG3287-tTF，氨基酸序列为：
Met Gly Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp
1 5 10 15
Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val
20 25 30
Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys
35 40 45
Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu
50 55 60
Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr
65 70 75 80
Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr
85 90 95
Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr
115 120 125
Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser
130 135 140
Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp
145 150 155 160
Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu
165 170 175
Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln
180 185 190
Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro
195 200 205
Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ala Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His
225 230 235 240
His His His Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln
245 250 255
Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
260 265 270。
2.如权利要求1所述的肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白的基因序列，其特征在于，所述基因序列为：
ccatgggctc tggcactaca aatactgtgg cagcatataa tttaacttgg aaatcaacta 60
atttcaagac aattttggag tgggaaccca aacccgtcaa tcaagtctac actgttcaaa 120
taagcactaa gtcaggagat tggaaaagca aatgctttta cacaacagac acagagtgtg 180
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acccggcagg gaatgtggag agcaccggtt ctgctgggga gcctctgtat gagaactccc 300
cagagttcac accttacctg gagacaaacc tcggacagcc aacaattcag agttttgaac 360
aggtgggaac aaaagtgaat gtgaccgtag aagatgaacg gactttagtc agaaggaaca 420
acactttcct aagcctccgg gatgtttttg gcaaggactt aatttataca ctttattatt 480
ggaaatcttc aagttcagga aagaaaacag ccaaaacaaa cactaatgag tttttgattg 540
atgtggataa aggagaaaac tactgtttca gtgttcaagc agtgattccc tcccgaacag 600
ttaaccggaa gagtacagac agcccggtag agtgtatggg ccaggagaaa ggggaattca 660
gagaagcggg cggcggtgga tccggaggcg gtggttctgg aggcggtggt tctcaccacc 720
accaccacca cagctgcaaa aacaccgata gccgttgcaa agcgcgtcag ctggaactga 780
acgaacgtac ctgccgttgc gataaaccgc gtcgttaact cgag 824。
3.如权利要求1所述的肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)设计引物，PCR扩增EG3287-tTF重组基因，并将EG3287-tTF重组基因导入载体，构建重组载体；
2)将重组载体导入宿主细胞，构建表达融合蛋白EG3287-tTF的重组工程菌；
3)将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白。
4.如权利要求3所述的肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述引物为：
P1：5’CCGCTCGAGTTAACGACGCGGTTTATC 3’
P6：5’CATGCCATGGGCTCTGGCACTACAAATACTG 3’。
5.如权利要求3所述的肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述载体为pET32b(+)。
6.如权利要求3所述的肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.如权利要求3所述的肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述分离纯化采用镍柱蛋白纯化。
8.如权利要求1所述的肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
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