CN102796201A - 一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促红细胞生成素模拟肽（EMP）与人血清白蛋白HSA的融合蛋白及其制备方法。所述融合蛋白由1个HSA和1个EMP二联体（dEMP）构成，其中HSA位于融合蛋白的N-末端，EMP二联体位于融合蛋白的C-末端，或EMP二联体位于融合蛋白的N-末端，HSA位于融合蛋白的C-末端；在HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间均设有由柔性氨基酸组成的连接肽。所述融合蛋白不仅具有显著促红细胞生成活性，而且具有较长的体内半衰期。

Description

一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术与基因工程制药领域，具体涉及一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

红细胞以及由其所产生的血红蛋白在机体生命活动中发挥着重要作用。促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）是体内红细胞生成过程中最重要的调控因子，在正常成年人中EPO主要由肾脏产生。慢性肾衰时，肾脏产生EPO相对不足或不能分泌EPO，从而导致贫血。因此，应用重组人促红细胞生成素（rh-EPO）可以有效治疗肾性贫血。此外，rh-EPO还可用于实体瘤放/化疗所致贫血、外科手术红细胞动员、自体输血等的辅助治疗。

现有的重组EPO类药物，其生产都需要采用哺乳动物细胞系统进行表达和制备，原因是EPO分子必需经过翻译后的糖基化修饰才具有生物活性。与大肠杆菌和酵母表达系统相比，采用哺乳动物细胞表达系统生产目的蛋白的周期相对较长，成本也相对较高。

EPO模拟肽（Erythropoietin mimetic peptide, EMP）是1996年Wrighton等采用噬菌体展示技术从肽库中筛选出来的一种含有20个氨基酸的多肽，其氨基酸序列与EPO完全不同源，但却能特异性结合EPO受体，尤其是该多肽的二联体能够有效激活EPO受体及相应的细胞内信号通路，从而产生与EPO相似的生物学功能（Wrighton, et al., Science, 1996, 273: 458-463）。由于不需要糖基化修饰，所以无论是化学合成，还是通过细菌或酵母表达系统所制备出的EMP二联体都具有较高的生物活性。然而，EMP的分子量较小，难以通过基因工程技术进行表达与制备，而且由于半衰期短，其体内应用效果也较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白可显著延长EMP二联体半衰期，具有长效促红细胞生成的特性。

本发明所述的促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白HSA的融合蛋白，包含1个人血清白蛋白HSA和1个由两个头尾串联的促红细胞生成素模拟肽EMP组成的EMP二联体（dEMP）。

人血清白蛋白HSA存在天然多态性，本发明融合蛋白中的人血清白蛋白HSA也包括这些多态型。

优选地，所述促红细胞生成素模拟肽EMP具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述促红细胞生成素模拟肽EMP活性的氨基酸序列。

优选地，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA活性的氨基酸序列。

优选地，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端， EMP二联体位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为HSA-dEMP，具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。

优选地，所述EMP二联体位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为 dEMP- HSA，具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间的连接肽均由1-30个氨基酸残基组成。

更优选地，所述人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间的连接肽由13个氨基酸残基组成，两个EMP之间的连接肽由4个氨基酸残基组成。

更优选地，组成连接肽的氨基酸主要为Gly与Ser 、Pro的组合。

本发明还提供上述融合蛋白的制备方法，主要包含步骤：

1）获取编码EMP二联体和连接肽的基因序列，通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将该基因序列克隆至载体质粒1中，获得质粒2；

2）以含有HSA的质粒DNA为模版， 通过PCR扩增获得两端带有合适限制性内切酶识别位点的HSA 的cDNA 片段；

3）通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA的cDNA 片段插入含有EMP二联体的基因的质粒2中，获得含编码HSA与EMP二联体的融合蛋白的基因的质粒3；

4）通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA与EMP二联体的融合蛋白的基因从质粒3亚克隆至表达载体质粒4中，获得含编码HSA与EMP二联体的融合蛋白的基因的重组表达质粒5；

5）将步骤4）所述的重组表达质粒5转化感受态细胞，再转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白。

其中步骤1）的质粒1为可用于基因克隆的常见质粒载体，优选的是pUC57质粒。

其中步骤4）的质粒4为可用于重组基因表达的常见质粒载体，优选酵母表达质粒载体，更优选的是pPICZα质粒。

其中步骤5）所述宿主是酵母。

本发明还涉及含有上述融合蛋白的编码基因的重组表达载体。可用于携带编码本发明融合蛋白的基因的表达载体包括但不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。

本发明还涉及含有上述重组表达载体的宿主表达系统。宿主可以是细菌、酵母及哺乳动物细胞等，其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母；对于重组表达的本发明融合蛋白可以通过多种方法从相应的细胞培养物中进行提取、纯化，这些方法包括离心、超滤及液相层析等技术，其中液相层析又包括了离子交换、疏水和分子筛等层析技术。

人血清白蛋白（HSA）是血浆中的主要蛋白成分，是一种稳定的惰性蛋白，并且具有长达两周以上的血浆半衰期，因此，常被用做药物的载体。HSA由585个氨基酸残基组成，分子量为66.5kDa，属于非糖基化单链蛋白（A.Dugaiczyk et al., PNAS, 1982, 79: 71-75）。HSA已被成功地在多种宿主中进行表达（EP330451和EP361991），尤其是人们已经实现了HSA在酵母细胞中的高水平稳定表达。HSA在宿主细胞中是以一种原肽形式合成，其中由24个氨基酸残基组成的信号肽和前肽在转运和分泌过程中能够被自动切除。当目的多肽与HSA融合表达时不仅可以提高多肽药物的稳定性，而且还可以增加多肽药物在体内的半衰期。通过与HSA进行融合表达，一些造血生长因子包括EPO、G-CSF、GM-CSF以及干扰素等其它活性因子，都实现了药物作用的长效性（CN1727488A、CN1405181A、CN1405182A）。

申请人通过生物活性测定和代谢动力学分析实验表明，HSA-dEMP可以显著促进红细胞的增殖，而且在体内具有较长的半衰期，说明本发明所述融合蛋白保留了EMP二联肽的促红细胞增殖活性，并能在体内维持较长时间的发挥作用。因此，本发明所述的融合蛋白可用于制备治疗慢性肾功能衰竭导致的贫血、肿瘤化疗导致的贫血、失血后贫血等的药物。

本发明所述融合蛋白可以与药物载体一起组成药物制剂使用，这些药物载体包括水、盐水、糖类、醇类及氨基酸等。

由本发明融合蛋白制成的药物制剂优选的是含水量低于3%或不含水的冻干制剂。这些药物制剂可以用于肾性贫血和其它原因所致贫血的治疗，给药方式包括静脉输注、注射（包括皮下和肌肉注射）、鼻内、呼吸道等，其中优选的是皮下或肌肉注射。

本发明的优越性：本发明采用基因重组技术，将两个头尾串联的促红细胞生成素模拟肽EMP序列与人血清白蛋白HSA进行融合，HSA和EMP二联体之间及两个EMP之间设置有合适长度的连接肽，通过与HSA融合不仅可以使EMP二联体能够采用基因工程技术进行表达与制备，而且还可以达到显著延长EMP二联体半衰期的目的。本发明在保持EMP二联体较高生物活性的基础上，同时解决EMP二联体的基因工程制备和半衰期短的难题。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为pPICZα/ HSA-dEMP重组质粒的构建流程；

图2为HSA-dEMP编码序列的5’端和3’端测序结果，其中A为5’端的测定序列：包含了部分载体序列以及编码HSA信号肽、前肽和N端成熟肽的序列；B、C为3’端的测定序列，其中B显示的是编码HSA的C末端数个氨基酸及连接肽的序列，C显示的是编码EMP二联体的序列；

图3为HSA-dEMP融合蛋白的Western blot 鉴定分析，其中1为HSA标准品，2为纯化后的HSA-dEMP融合蛋白；

图4为纯化所得HSA-dEMP融合蛋白的SDS-PAGE纯度分析结果，其中M为蛋白Marker，1为纯化后的HSA-dEMP融合蛋白；

图5为HSA-dEMP融合蛋白的体外促EPO依赖细胞株UT-7/Epo增殖分化活性分析，其中1为空白对照组，2为化学合成的EMP二联体多肽处理组，3为HSA处理组，4为HSA-dEMP融合蛋白处理组。

图6为HSA-dEMP融合蛋白在大鼠体内的药代动力学分析。

图7位HSA-dEMP融合蛋白对大鼠慢性肾性贫血的治疗作用分析。

具体实施方式

 主要实验材料

1.          限制性核酸内切酶EcoR I、Asu II、Not I、BamH I、Hind III，T4 DNA 连接酶试剂盒为TaKara公司产品（中国大连）；

2.          质粒DNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品（美国）；

3.          DNA胶回收试剂盒为Omega公司产品（美国）；

4.          质粒载体pPICZα、毕赤酵母菌株X-33为Invitrogen公司产品（美国）；

5.          大肠杆菌DH5α感受态细胞为Invitrogen公司产品（美国）；

6.          pUC57/HSA质粒由本室构建并保存（发明专利201110420870.0）；

7.          UT-7/Epo细胞购自协和医学大学基础医学细胞中心（北京）；

8.          Zeocin购自Invitrogen公司（美国）；

9.          SP阳离子层介质、Q阴离子层析介质、疏水和分子筛等层析介质及层析柱为GE公司产品（美国）；

10.      酵母提取物、胰蛋白胨购自Oxford公司（美国）；

11.      磷酸盐缓冲液

NaCl                   8g

KCl                    0.2g

Na₂HPO₄                    1.44g

KH₂PO₄                       0.24g

溶于1000ml去离子水中，并用浓HCl调节pH值至7.4，高压蒸气灭菌。

12.      LB培养基

酵母提取物      5g

胰蛋白胨          10g

NaCl                   10g

溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸气灭菌。

13.      YPD培养基

酵母提取物      10g

胰蛋白胨          20g

Agar          20g

溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却后加入100ml经滤器除菌后的20%的右旋糖和适当浓度的Zeocin。

14.      YPDS培养基

酵母提取物        10g

胰蛋白胨            20g

山梨糖醇             182.2g

溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却后加入100ml经滤器除菌后的20%的右旋糖和适当浓度的Zeocin。

15.      BMGY液体培养基

酵母提取物         10g

胰蛋白胨              20g

无氨基酸酵母氮源     13.4g

甘油                     10g

磷酸钾                    26.631g

溶于1000ml双蒸水中高压灭菌，冷至室温，调节pH至6.0，4℃保存备用。

实施例1：编码EMP二联体及连接肽的cDNA序列的人工合成

1、首先根据EMP二联体及连接肽的氨基酸序列推导出其对应的编码核苷酸序列，并根据毕赤酵母偏爱密码子对编码序列进行优化，为了便于与HSA基因进行融合，选择将紧临HSA的两个氨基酸（Gly、Ser）的编码序列设计为限制性内切酶BamH I的识别位点（gga tcc）；同时，为了便于克隆，在该编码核苷酸序列的5’端引入EcoR I酶切识别位点和保护性碱基，在3’端引入Not I和Hind III的酶切识别位点及保护性碱基，最终所得核苷酸序列如下（SEQ ID NO:7）： 

agcgaa ttc gga tccggc gga ggt gga tct gga ggc ggt gga tct ggt  ggt ggaact tat tcc tgc cat ttt ggt cct ctg aca tgg gtg tgt aaa cct cag gga ggt  cca tctgga cca  gga ggt aca tac tct tgt cac ttt gga cca tta act tgg gtt tgc aaa cca caa ggt gga taa gcg gcc gcg aag ctt tgc 

其中，5’端和3’端最外侧3个碱基为保护性碱基序列，带下划线的碱基序列分别为EcoR I和Hind III酶切识别位点，带阴影的碱基序列分别为BamH I和Not I酶切识别位点，斜体部分的碱基序列为编码连接肽的序列，加粗部分的碱基序列为编码EMP的序列。

2、委托上海生工生物工程公司合成上述序列并将其装载到pUC57质粒中的EcoR I和Hind III酶切位点之间（pUC57质粒载体由上海生工生物公司提供），获得质粒pUC57/dEMP。

实施例2：编码HSA的cDNA片段的获得

1、设计合成HSA基因的PCR引物

P1（SEQ ID NO:8）：5′-agc gaa ttc ttc gaa acg atg aag tgg gta acc ttt att tcc ctt c -3′

P2（SEQ ID NO:9）：5′-gat gga tcc taa gcc taa ggc agc ttg ac- 3′

其中P1中下划线部分碱基为限制性内切酶EcoR I 识别位点序列，阴影部分碱基为限制性内切酶Asu II识别位点序列，加框部分碱基为翻译起始密码子序列；P2中阴影部分为限制性内切酶BamH I的识别位点序列。

2、PCR扩增

以pUC57/HSA质粒DNA为模版（pUC57/HSA质粒为本室保存，具体构建方法参见发明专利201110420870.0），以P1和P2分别作为上、下游引物，进行PCR扩增。反应条件如下：①变性：94℃，5min；②变性：94℃，1min；③复性：55℃，1min；④延伸：72℃，2min；⑤返回步骤“②”，35循环；⑥延伸：72℃，10min，总循环次数为35次。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出约1.9kb大小的DNA条带，该条带即为编码HSA 的cDNA片段，且其5’端带有EcoR I、Asu II的识别位点，3’端带有BamH I的识别位点。

实施例3：pPICZα/HSA-dEMP重组表达载体的构建

1、编码HSA-dEMP的cDNA片段的克隆与测序：

将实施例1所得pUC57/dEMP质粒DNA以及实施例2所得HSA 的PCR产物同时进行EcoR I + BamH I双酶切，胶回收酶切后的DNA片段，然后采用T4 DNA连接酶进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂于氨苄抗性LB板37℃培养过夜，筛选阳性克隆。所得克隆送上海生工生物工程公司测序，序列正确的克隆命名为pUC57/HSA-dEMP。

2、酵母表达载体pPICZα/HSA-dEMP的构建

提取上一步测序正确的pUC57/HSA-dEMP质粒DNA，Asu II和Not I双酶切质粒DNA，胶回收HSA-dEMP对应的DNA片段。同时，Asu II和Not I双酶切pPICZα-A（Invitrogen公司产品）质粒DNA，胶回收pPICZα-A载体片段。采用T4 DNA酶将HSA-dEMP和pPICZα-A载体进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并进行Zeocin抗性筛选，提取质粒DNA，再用Asu II和Not I双酶切鉴定，将能够切下约2.0kb大小DNA片段的质粒送上海生工生物工程公司进行测序验证。整个pPICZα/HSA-dEMP重组表达质粒的构建流程如图1所示，所得阳性克隆质粒的测序结果如图2所示，由于编码HSA-dEMP的序列较长，为了清楚显示测定序列的正确性，特别选择了关键部位的测序结果在图2中进行展示，其中A为5’端的测定序列：包含了pPICZα载体的部分序列，以及编码HSA信号肽、前肽（前24个氨基酸对应的DNA序列）和N端成熟肽的序列；B、C为3’端的测定序列，其中B显示的是编码HSA的C末端数个氨基酸及连接肽的序列，C显示的是编码部分连接肽及EMP二联体的序列。

采用限制性内切酶Sac I 对测序正确的pPICZα/HSA-dEMP质粒DNA进行线性化，胶回收DNA大片断，转化X-33感受态细胞，然后接种于Zeocin抗性YPDS平板，30℃培养3天后挑取克隆，并进行PCR扩增和测序鉴定。选取6个以上的阳性克隆分别接种BMGY液体培养基，30℃进行培养表达，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，并用抗人HSA的单抗（R&D公司产品，美国）进行Western blot分析，显色阳性且分子量约为71kD左右蛋白条带即为HSA-dEMP融合蛋白（图3），最后选择表达水平最高的菌株作为工程菌，并放置于-80℃进行保种冻存。

实施例4： HSA-dEMP融合蛋白的表达与纯化

将实施例3筛选出的高表达HSA-dEMP融合蛋白的酵母工程菌种接种于YPDS平板，30℃过夜培养活化，然后挑取单个菌落接种于BMGY培养基，30℃振荡培养20h，然后按1∶10转种并继续培养至OD₆₀₀≈4，并以此菌液为种子液移种于装有基础盐培养基的15L发酵罐中（瑞士比欧公司）进行高密度发酵培养。每1L基础培养基中含有甘油50g、浓磷酸12ml，KOH 2.6g，CaSO₄·2H₂O 0.6g，K₂SO₄ 9.5g，MgSO₄·7H₂O 7.8g，生物素0.32mg， YTB溶液（内含有65g/L的FeSO₄·7H₂O，6g/L 的CuSO₄·5H₂O，20g/L 的ZnSO₄·7H₂O，6g/L 的MnSO₄·5H₂O和0.5%的浓硫酸）2ml 。发酵条件选择如下：发酵温度控制在30℃，溶解氧控制在30%～40%之间，pH值控制在6.0以下，培养至甘油耗尽后开始流加甘油，继续培养至OD₆₀₀≈150时开始流加甲醇诱导，甲醇流加速率控制在1%左右。诱导表达72h后停止发酵，低温离心取上清，随后进行纯化。

纯化按以下方法进行：收集发酵上清并进行超滤层析，以去除部分色素、降低盐离子浓度和更换缓冲液（20mmol/L磷酸盐缓冲液， pH=7.0）；随后样品过SP Sepharose Fast Flow柱进行阳离子交换层析，收集含有目的多肽的组分，然后再上Q Sepharose Fast Flow 柱进行阴离子交换层析，最后进行Sephadex G-75 凝胶层析，最终所得收集分离组分即为纯化的HSA-dEMP融合蛋白，分子量约为71KD（如图4所示），HPLC测定其纯度大于95%。

实施例5：HSA-dEMP融合蛋白的体外生物活性测性

以EPO依赖的细胞株UT-7/Epo为观察对象，采用CCK-8法（改良MTT法）检测HSA-dEMP融合蛋白对该细胞的促增殖活性，具体操作如下：取对数生长期的UT-7/Epo细胞，离心洗涤，再用仅含10%胎牛血清的1640培养液重新悬浮细胞，培养18-24h后收集进行细胞计数，并按5×10⁵/ml转接至96孔U型板中，每孔100ul。分别设立空白对照组（培养液中不含任何细胞因子）、HSA对照组（10nM）、EMP二联肽处理组（10nM）及等摩尔浓度的HSA-dEMP融合蛋白处理组（10nM），每组6个复孔，置于37℃、5%CO₂孵箱培养，培养72h后每孔加入CCK-8试剂10ul, 37℃、5%CO₂孵箱培养6h后于酶标仪490nm波长检测细胞光密度值并分析细胞的增殖情况。结果显示，HSA-dEMP可以显著促进红细胞的增殖（如图5所示），说明本发明融合蛋白保留了EMP二联肽的促红细胞增殖活性。

实施例6：HSA-dEMP融合蛋白在大鼠体内的代谢动力学分析

给Wistar大鼠体内皮下注射HSA-dEMP融合蛋白（150ug/kg），于处理后2、12、24、48、72、96、120、144时间点取样采血，应用美国R&D公司的人HSA特异性ELISA检测试剂盒，通过免疫吸附方法检测大鼠血清中HSA-dEMP融合蛋白的浓度，并计算药代动力学参数，从而推导出HSA-dEMP融合蛋白在受试大鼠血液中的半衰期约为96h（如图6所示）。

实施例7：HSA-dEMP融合蛋白对慢性肾衰大鼠贫血的治疗作用分析

   参照文献方法（Nephron, 1986, 44: 230-234；中国生物制品杂志，1999，12（1）：32-35），用含0.75%腺嘌呤饲料喂养Wistar大鼠7周，复制慢性肾性贫血大鼠实验动物模型。之后，给予模型大鼠单次皮下注射HSA-dEMP融合蛋白，剂量为150ug/kg，同时设置生理盐水阴性对照组和化学合成EMP二联肽（与HSA-dEMP融合蛋白等摩尔浓度剂量）处理组，分别于HSA-dEMP融合蛋白处理后的第7、14、21天尾静脉取血进行血常规测定。结果显示，单次给予HSA-dEMP融合蛋白治疗可以显著提升慢性肾衰大鼠外周血红细胞水平（如图7所示），而单次给予等摩尔浓度的EMP二联肽则无显著升红细胞作用，从而提示HSA-dEMP融合蛋白对慢性肾性贫血具有较好的救治效果。

结论： 本发明所公开的HSA-dEMP融合蛋白及其制备方法在保持EMP二联体较高生物活性的基础上，同时解决EMP二联体的基因工程制备和半衰期短的难题，为EMP二联体的临床应用奠定了基础。

序列表

 

 

<110>  中国人民解放军第三军医大学

<120>  一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法

<130>  11P99422-CN

<160>  10  

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 促红细胞生成素模拟肽（EMP）的氨基酸序列

 

<400> 1

Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys

1                5                  10                  15

Pro Gln Gly Gly 

            20

 

<210> 2

<211> 585

<212> PRT

<213>人血清白蛋白（HSA）的氨基酸序列

 

<400> 2

 

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

 1               5                  10                  15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu GLn

            20                  25                  30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

        35                   40                  45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

    50                  55                   60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65                  70                  75                  80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

                 85                  90                  95   

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100                 105                 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

        115                 120                 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

    130                 135                 140                

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145                 150                 155                 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

                165                 170                 175 

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

            180                 185                 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

        195                 200                 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

    210                 215                 220               

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225                 230                 235                 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

                245                 250                 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

            260                 265                 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

    290                 295                 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305                 310                 315                 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

                325                 330                 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Cys Ala Ala Ala Asp Pro His

            340                 345                 350

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Glu

        355                 360                 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

    370                 375                 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385                 390                 395                 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

                405                 410                 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

            420                 425                 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

        435                 440                 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

    450                 455                 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465                 470                 475                 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

                485                 490                 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

            500                 505                 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

        515                 520                 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

    530                 535                 540

 

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545                 550                 555                 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

                565                 570                 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

            580                 585

 

<210> 3

<211> 642

<212> PRT

<213> HSA-dEMP融合蛋白的氨基酸序列

 

<400> 3

 

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

 1               5                  10                  15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu GLn

            20                 25                  30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

        35                 40                  45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

    50                 55                  60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65                 70                  75                    80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

                85                  90                  95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

            100                 105                 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

        115                 120                 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

    130                 135                 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145                 150                 155                 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

                165                 170                 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

            180                 185                 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

        195                 200                 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

    210                 215                 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225                 230                 235                 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

                245                 250                 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

            260                 265                 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

    290                 295                 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305                 310                 315                 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

                325                 330                 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

            340                 345                 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

        355                 360                 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

    370                 375                 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385                 390                 395                 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405                 410                 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

            420                 425                 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

        435                 440                 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

    450                 455                 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465                 470                 475                 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

                485                 490                 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

            500                 505                 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

        515                 520                 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

    530                 535                 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545                 550                 555                 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

                565                 570                 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

            580                 585                 590

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro

        595                 600                 605

Leu Thr Trp Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Pro Ser Gly Pro Gly Gly

    610                 615                 620

Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys Pro Gln

625                 630                 635                 640

Gly Gly

                                

<210> 4

<211> 642

<212> PRT

<213> dEMP-HSA融合蛋白的氨基酸序列

 

<400> 4

 

Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys

1                5                 10                  15

Pro Gln Gly Gly Pro Ser Gly Pro Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe

            20                 25                  30

Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly

        35                 40                  45

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val

    50                 55                  60

Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val

65                 70                  75                   80

Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu GLn Gln Cys Pro Phe Glu Asp His

                85                  90                  95

Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala

            100                 105                 110

Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly

        115                 120                 125

Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met

    130                 135                 140

Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu

145                 150                 155                 160

Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu

                165                 170                 175

Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu

            180                 185                 190

Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala

        195                 200                 205

Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu

    210                 215                 220

Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp

225                 230                 235                 240

Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys

                245                 250                 255

Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala

            260                 265                 270

Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val

        275                 280                 285

Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His

    290                 295                 300

Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr

305                 310                 315                 320

Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys

                325                 330                 335

Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn

            340                 345                 350

Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu

        355                 360                 365

Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu

    370                 375                 380

Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val

385                 390                 395                 400

Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys

                405                 410                 415

Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp

            420                 425                 430

Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn

        435                 440                 445

Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu

    450                 455                 460                

Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu

465                 470                 475                 480

Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys

                485                 490                 495

His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val

            500                 505                 510

Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp

        515                 520                 525

Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys

    530                 535                 540

Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn

545                 550                 555                 560

Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys

                565                 570                 575

Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His

            580                 585                 590

Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe

        595                 600                 605

Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys

    610                 615                 620

Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu

625                 630                 635                 640

Gly Leu

                       

 

<210> 5

<211> 1926

<212> DNA

<213> 编码HSA-dEMP（SEQ ID NO：3）的DNA序列

 

<400> 5

   

gatgctcaca agtctgaggt tgctcacaga tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa    60

 

gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta   120

 

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa   180

 

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt   240

 

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa   300

 

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctcccac gattggtgag accagaggtt   360

 

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat   420

 

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccagaac tccttttctt tgctaaaagg   480

 

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca   540

 

aagctcgatg aacttagaga tgaaggtaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt   600

 

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tagactgagc   660

 

cagagatttc caaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga ccttaccaaa   720

 

gtccacacgg aatgctgcca tggagacctg cttgaatgtg ctgatgacag ggctgacctt   780

 

gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa   840

 

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct   900

 

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct   960

 

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat  1020

 

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc  1080

 

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt  1140

 

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag  1200

 

tacaaattcc agaatgctct attagttcgt tacaccaaga aagtaccaca agtgtcaact  1260

 

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat  1320

 

cctgaagcaa aaagaatgcc ttgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta  1380

 

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc  1440

 

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttccaaaa  1500

 

gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag  1560

 

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc aaaggcaaca  1620

 

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag  1680

 

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa  1740

 

gctgccttag gcttaggatc cggcggaggt ggatctggag gcggtggatc tggtggtgga  1800

 

acttattcct gccattttgg tcctctgaca tgggtgtgta aacctcaggg aggtccatct  1860

 

ggaccaggag gtacatactc ttgtcacttt ggaccattaa cttgggtttg caaaccacaa  1920

 

ggtggataa

 

<210> 6

<211> 1926

<212> DNA

<213> 编码 dEMP-HSA（SEQ ID NO：4）的DNA序列

 

<400> 6

 

ggtggaactt attcctgcca ttttggtcct ctgacatggg tgtgtaaacc tcagggaggt    60

 

ccatctggac caggaggtac atactcttgt cactttggac cattaacttg ggtttgcaaa   120

 

ccacaaggtg gaggatccgg cggaggtgga tctggaggcg gtggatctgg tgatgctcac   180

 

aagtctgagg ttgctcacag atttaaagat ttgggagaag aaaatttcaa agccttggtg   240

 

ttgattgcct ttgctcagta tcttcagcag tgtccatttg aagatcatgt aaaattagtg   300

 

aatgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt gttgctgatg agtcagctga aaattgtgac   360

 

aaatcacttc ataccctttt tggagacaaa ttatgcacag ttgcaactct tcgtgaaacc   420

 

tatggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa caagaacctg agagaaatga atgcttcttg   480

 

caacacaaag atgacaaccc aaacctccca cgattggtga gaccagaggt tgatgtgatg   540

 

tgcactgctt ttcatgacaa tgaagagaca tttttgaaaa aatacttata tgaaattgcc   600

 

agaagacatc cttactttta tgccccagaa ctccttttct ttgctaaaag gtataaagct   660

 

gcttttacag aatgttgcca agctgctgat aaagctgcct gcctgttgcc aaagctcgat   720

 

gaacttagag atgaaggtaa ggcttcgtct gccaaacaga gactcaagtg tgccagtctc   780

 

caaaaatttg gagaaagagc tttcaaagca tgggcagtag ctagactgag ccagagattt   840

 

ccaaaagctg agtttgcaga agtttccaag ttagtgacag accttaccaa agtccacacg   900

 

gaatgctgcc atggagacct gcttgaatgt gctgatgaca gggctgacct tgccaagtat   960

 

atctgtgaaa atcaagattc gatctccagt aaactgaagg aatgctgtga aaaacctctg  1020

 

ttggaaaaat cccactgcat tgccgaagtg gaaaatgatg agatgcctgc tgacttgcct  1080

 

tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag gatgtttgca aaaactatgc tgaggcaaag  1140

 

gatgtcttcc tgggcatgtt tttgtatgaa tatgcaagaa ggcatcctga ttactctgtc  1200

 

gtgctgctgc tgagacttgc caagacatat gaaaccactc tagagaagtg ctgtgccgct  1260

 

gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg ttcgatgaat ttaaacctct tgtggaagag  1320

 

cctcagaatt taatcaaaca aaattgtgag ctttttgagc agcttggaga gtacaaattc  1380

 

cagaatgctc tattagttcg ttacaccaag aaagtaccac aagtgtcaac tccaactctt  1440

 

gtagaggtct caagaaacct aggaaaagtg ggcagcaaat gttgtaaaca tcctgaagca  1500

 

aaaagaatgc cttgtgcaga agactatcta tccgtggtcc tgaaccagtt atgtgtgttg  1560

 

catgagaaaa cgccagtaag tgacagagtc accaaatgct gcacagaatc cttggtgaac  1620

 

aggcgaccat gcttttcagc tctggaagtc gatgaaacat acgttccaaa agagtttaat  1680

 

gctgaaacat tcaccttcca tgcagatata tgcacacttt ctgagaagga gagacaaatc  1740

 

aagaaacaaa ctgcacttgt tgagcttgtg aaacacaagc caaaggcaac aaaagagcaa  1800

 

ctgaaagctg ttatggatga tttcgcagct tttgtagaga agtgctgcaa ggctgacgat  1860

 

aaggagacct gctttgccga ggagggtaaa aaacttgttg ctgcaagtca agctgcctta  1920

 

ggcttataa

 

<210> 7

<211> 201

<212> DNA

<213> 编码EMP二联体及连接肽的DNA序列，其中5’端加框的碱基序列为保护性碱基及EcoR I的识别位点序列，3’端加框的碱基序列为Not I和Hind III识别位点及保护性碱基序列。

 

<400> 7

agcgaattcg gatccggcgg aggtggatct ggaggcggtg gatctggtgg tggaacttat   60

 

tcctgccatt ttggtcctct gacatgggtg tgtaaacctc agggaggtcc atctggacca  120

 

ggaggtacat actcttgtca ctttggacca ttaacttggg tttgcaaacc acaaggtgga  180

 

taagcggccg cgaagctttg c                                            201

 

<210>  8

<211>  46

<212>  DNA

<213>  PCR引物

 

<400>  8

agcgaattct tcgaaacgat gaagtgggta acctttattt cccttc                 46

 

 

<210>  9

<211>  29

<212>  DNA

<213>  PCR引物

 

<400>  9

gatggatcct aagcctaagg cagcttgac                                    29

 

<210>  10

<211>  1830

<212>  DNA

<213>  优化后的HSA的全长基因序列,其中5’端加框的72个bp为编码HSA信号肽和前肽的碱基序列，信号肽和前肽在表达分泌过程中会自动切除。

 

<400>  10

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt     60

 

gtgtttcgtc gagatgctca caagtctgag gttgctcaca gatttaaaga tttgggagaa    120

 

gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt    180

 

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat    240

 

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca    300

 

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct    360

 

gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc acgattggtg    420

 

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa    480

 

aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccaga actccttttc    540

 

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc    600

 

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttaga gatgaaggta aggcttcgtc tgccaaacag    660

 

agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta    720

 

gctagactga gccagagatt tccaaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca    780

 

gaccttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagacc tgcttgaatg tgctgatgac    840

 

agggctgacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag    900

 

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat    960

 

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc   1020

 

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga   1080

 

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact   1140

 

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa   1200

 

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag   1260

 

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgct ctattagttc gttacaccaa gaaagtacca   1320

 

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa   1380

 

tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccttgtgcag aagactatct atccgtggtc   1440

 

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc   1500

 

tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca   1560

 

tacgttccaa aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt   1620

 

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagcttgt gaaacacaag   1680

 

ccaaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag   1740

 

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt   1800

 

gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa                                    1830

Claims (11)

1.一种促红细胞生成素模拟肽EMP与人血清白蛋白HSA的融合蛋白，其特征在于，包含1个人血清白蛋白HSA和1个由两个头尾串联的促红细胞生成素模拟肽EMP组成的EMP二联体（dEMP）。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述促红细胞生成素模拟肽EMP的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，所述EMP二联体位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为HSA-dEMP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述EMP二联体位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为 dEMP-HSA，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.根据权利要求4或5中所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间的连接肽均由1-30个氨基酸残基组成。

7.权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，有以下步骤：

1）获取编码EMP二联体和连接肽的基因序列，通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将该基因序列克隆至载体pUC57质粒中，获得质粒 pUC57/dEMP；

2）以含有HSA的pUC57/HSA质粒 的DNA为模版， 通过PCR扩增获得两端带有合适限制性内切酶识别位点的HSA 的cDNA 片段；

3）通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA的cDNA 片段插入含有EMP二联体的基因的质粒 pUC57/dEMP中，获得含编码HSA与EMP二联体的融合蛋白的基因的质粒pUC57/HSA-dEMP；

4）通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA与EMP二联体的融合蛋白的基因从质粒 pUC57/HSA-dEMP亚克隆至表达载体质粒 pPICZα中，获得含编码HSA与EMP二联体的融合蛋白的基因的重组表达质粒 pPICZα/HSA-dEMP；

5）将步骤4）所述的重组表达质粒 pPICZα/HSA-dEMP转化感受态细胞，再转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤5）所述宿主是酵母。

9.一种含有权利要求1所述的融合蛋白的编码基因的重组表达载体。

10.一种含有权利要求9所述的重组表达载体的宿主表达系统。

11.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗因慢性肾功能衰竭、肿瘤化疗及失血所导致贫血的药物中的应用。

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