CN104231088A - 人血管钠肽与人血清蛋白的融合蛋白及其制备 - Google Patents

Abstract

人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，将hVNP和HSA cDNA进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的hVNP-HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主表达系统中进行表达。本发明的融合蛋白包括与人血管钠肽至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明的融合蛋白在保持了人血管钠肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。

Description

人血管钠肽与人血清蛋白的融合蛋白及其制备

技术领域

本发明属于长效融合蛋白药物技术领域，涉及一种人血管钠肽(hVNP)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

心脑血管疾病的高发病、高死亡率已经成为世界共识，心力衰竭(heart failure，HF)则是大多数器质性心脏病人心脏病病程的严重阶段。重组B-型利尿钠肽(B-typenatriuretic peptide，BNP)已经成为HF的常规治疗药物，但BNP是一种有效的血管扩张剂，其利尿作用尚存在疑问，同时在高剂量下，容易出现低血压症状。血管钠肽(vasonatrin peptide，VNP)是wei等在深入研究人钠尿肽家族各个成员的结构与生物学活性关系基础之上，在人CNP分子的C-末端加上ANP的C-末端的5个氨基酸残基，设计出的具有新型生物活性的嵌合体，在扩张动脉、静脉血管和排钠利尿方面均有显著疗效。已有研究表明，在治疗慢性心力衰竭、高血压等疾病中，与天然钠尿肽相比VNP更具有应用前景。

像临床上已广泛使用的其它重组多肽/蛋白类药物一样，重组VNP药物溶解度低、稳定性差、体内半衰期仅为3min，必须持续高剂量给药方能奏效。该类药物治疗费用高、药物利用度低，患者频繁注射，导致其实际用量远地低于需求量。提示有必要重视长效VNP药物的研发，满足临床应用的需要。

人血清蛋白(HSA)作为人体血浆的主要成分在体内具有无酶活性和免疫原性、分子量大、半衰期长(大约23天)等优点。以HSA为载体的融合蛋白技术(AlbuminFusion Technology)受到重视。将HSA基因和人干扰素α2b(IFNα2b)基因融合，表达的融合蛋白HSA-IFNα2b在体内的平均半衰期达140h，且有很好的抗病毒活性、安全性和耐受性。这种融合蛋白质一方面增加了药物分子量，降低了肾脏的排泄速率；另一方面，融合的蛋白分子表面产生空间位阻效应，减低血液中蛋白水解酶对普通IFNα2b的水解作用，从而有效地延长了蛋白分子药物在循环系统内的滁留时间。通过改变药物的药代动力学特性，使得药物的血浆浓度更加稳定，药物在体内维持的时间更长，从而达到提高药物疗效和降低副作用的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法。

本发明所述人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的第一种方案为：包括第一区和第二区，所述第一区与人血管钠肽至少85％序列同源，所述第二区与人血清白蛋白至少85％序列同源或为人血清白蛋白的部分氨基酸序列；所述第一区位于融合蛋白的N末端，所述第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述第二区位于融合蛋白的N末端，所述第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。

优选地，所述第一区与人血管钠肽至少95％序列同源，所述第二区与人血清白蛋白至少95％序列同源。

优选地，所述人血清白蛋白的部分氨基酸序列为人血清白蛋白部分结构域或经结构域重排后的人血清白蛋白；具体地，其除了包括所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述：名为HSA(1-n)，n为369-419。

本发明所述人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的第二种方案为：包括第一区和第二区，所述第一区与人血管钠肽氨基酸残基序列相同或为其功能等同物，所述第二区与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同或为其功能等同物；所述第一区位于融合蛋白的N末端，所述第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述第二区位于融合蛋白的N末端，所述第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。

所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。

本发明还提供了一种人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，包括步骤：

1)人工合成人血管钠肽hVNP cDNA；

2)通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；

3)利用重叠PCR技术，连接hVNP cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的hVNP-HSA cDNA融合基因；

4)将hVNP-HSA cDNA融合基因通过表达载体整合到宿主细胞的染色体中，在宿主细胞中进行表达。

进一步地，步骤3)获得的hVNP-HSA cDNA融合基因可插入到克隆载体中保存，优选的克隆载体为pBlu2KSP。

步骤4)中所述的宿主细胞可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞等，优选的宿主细胞是酵母，其中更优选的是毕赤酵母，最优选为毕赤酵母GS115。

优选地，步骤4)中所述表达载体选自：pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P6、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ和pGAPZα中的一种，最优选为毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K。

优选地，步骤4)中所述整合到宿主细胞的染色体中的方法为转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法。

由于hVNP基因较短，采用人工合成该基因。HSA cDNA可以通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得。利用重叠PCR技术，连接hVNP cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫原性方面的问题，得到的hVNP cDNA和HSA cDNA融合基因插入到克隆载体中保存。

hVNP cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多个宿主系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫等)等。在这些表达系统中目的基因被整合到宿主的染色体中或插入到质粒中。本发明优选的是酵母表达系统，该系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕氏酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕氏酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕氏酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。

毕氏酵母表达系统分泌型表达载体主要有pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα，pYAM75P6；胞内型表达载体主要有：pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZα(invitrogen)等，优选的是毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有His缺陷型的选择性标记基因HIS4、AOX1启动子、MFα分泌信号肽和G418抗性基因(可作为筛选重组子的标记)等元件。AOXl启动子是一个强启动子，可以高效的启动目的基因的表达。在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶AOXl和AOX2，细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOXl提供。在甲醇为唯一碳源培养的细胞中，该酶可占细胞总蛋白的30％以上。AOX2与AOXl的同源性虽然高达97％，但酶活很低。当AOX1基因缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，细胞利用甲醇能力降低，细胞在甲醇为唯一碳源的培养基上生长很慢。

带有融合cDNA的表达载体可以通过转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法转化宿主细胞。成功转化的细胞，即带有本发明构建的DNA的细胞，可以通过本领域熟知的方法加以鉴定，如收集细胞，裂解后提取DNA，然后进行Southern杂交和PCR鉴定，也可在诱导表达后用HSA抗体和/或BNP抗体检测培养液上清。

除上述制备方法以外，还可以通过培养带有本发明构建的DNA的宿主细胞，来生产本发明的融合蛋白。宿主细胞培养优选在生物反应器上进行，培养分两个阶段，第一阶段主要用于宿主细胞生长，第二阶段主要用于产物合成。可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如离心、盐析、超滤、层析、制备电泳等技术及这些技术的组合。

本发明具有以下的有益效果：

1.本发明利用重叠PCR技术，连接hVNP cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性(避免针对连接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的问题。

2.本发明优选酵母表达系统表达，除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。

3.更优选的毕氏酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕氏酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。

4.本发明的融合蛋白在保持了人血管钠肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。

以下将结合附图对本发明的构思、具体实施方式及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是质粒pBlue-hVNP-HSA的结构

图2是质粒pPIC9K-hVNP-HSA的构建过程

图3是pBluescriptⅡKS(+)-hsa-vnp的酶切产物电泳图.1:DNA marker ladder；2:pBluescriptⅡKS(+)-hsa-vnp酶切产物

图4是重组表达质粒pPIC9K-hsa-vnp的酶切鉴定.1:DNA marker ladder；2:质粒pPIC9K-hsa-vnp经EcoRI与NotI双酶切产物

图5是表达产物的SDS-PAGE分析。Line 1:低相对分子质量蛋白质marker；line2-5:分别诱导12h,24h,48h,72h蛋白表达情况；6:阴性对照(空质粒pPIC9K表达产物)

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。

实施例1：hVNP cDNA的克隆

由上海生工生物工程技术服务有限公司人工合成hVNP cDNA(195bp)，将其克隆到载体pBlu2KSP上，插入位点为Sma I，受体菌为大肠杆菌DH5a菌株。

实施例2：HSA cDNA的克隆

利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：

PH1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’

PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’

PCR反应体系：10μmol/L的PH1和PH2引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环30次；72℃延伸10分钟。

琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目的片断。纯化好的目的片断和载体pBlu2KSP分别经SalI和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR片段胶回收试剂盒回收目的片断。T4DNA连接酶连接经双酶切的HSA cDNA和载体pBlu2KSP，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，Sal I和Hind III双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒Sal I和Hind III双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA，阳性重组子命名为DH5α-pBlu2KSP-HSA。

实施例3：hVNP cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆

(1)hVNP cDNA的PCR扩增，所用引物如下：

PB1：5’-CAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAG-3’

PB2：5’-GTATCTAAAAGAGTTACAACCCAAACC-3’

PCR反应体系：10μmol/L的PB1和PB2引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，质粒模板pBlu2KSP-hVNP 1ng，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸10分钟。

(2)HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下：

PH3：5’-GCAAGGTCCTGAGACGTCACGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’

PH4：5’-CATAAGGCGGCCGCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’

PCR反应体系：10μmol/L的PH3和PH4引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，质粒模板pBlu2KSP-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环30次；72℃延伸10分钟。

(3)重叠PCR技术融合hVNP cDNA和HSA cDNA

将hVNP的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释10倍，再以1:10比例混合后作为模板，于50μl反应体系中加入2×Pfu PCR MasterMix 25μl，混合好的模板25μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，循环15次；72℃延伸10分钟。

以该PCR产物为模板，50μl的反应体系中加入10μmol/L的引物PB1和PH4各1.5μl，2×Pfu PCR MasterMix 25μl，模板4μl，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，循环35次；72℃延伸10分钟。

琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2kb的目的片段。纯化的重叠PCR产物和载体pBlu2KSP，分别经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，用PCR片段胶回收试剂盒回收hVNP-HSA基因片段和载体pBlu2KSP。用T4DNA连接酶连接两回收片段，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定阳性克隆(其酶切产物电泳结果如图3所示)，并对重组质粒EcoRⅠ和NotⅠ双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlu2KSP-hVNP-HSA(其结构如图1所示)，阳性重组子命名为DH5α/pBlu2KSP-hVNP-HSA。

实施例4：hVNP-HSA酵母表达系统构建及融合蛋白的表达

(1)融合蛋白hVNP-HSA的酵母表达系统的构建

取一支冻存的DH5α/pBlu2KSP-hVNP-HSA，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。提取的质粒pBlu2KSP-hVNP-HSA和酵母表达载体pPIC9K，分别经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，用PCR片段胶回收试剂盒回收hVNP-HSA基因片段和载体pPIC9K。用T4DNA连接酶连接两回收片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取长出的菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。采用PCR扩增，EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定阳性克隆(其酶切产物电泳结果如图4所示)。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pPIC9K-hVNP-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pPIC9K-hVNP-HSA。

提取DH5α/pPIC9K-hVNP-HSA中的质粒，经SalI单酶切，DNA胶回收试剂盒回收后，电击转化毕赤酵母GS115，转化物涂布于含有1mol/L山梨醇的MD平板上，于30℃培养6天。每块平板上用2ml水洗涤，收集洗涤液。取部分收集到的洗涤液，分别涂布含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/mlG4l8的YPD平板，于30℃，培养3～6天。挑取在最高浓度G4l8YPD平板上长出的菌落，接种于20mlYPD培养基中，30℃培养24小时，用常规方法提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子。阳性重组子命名为GS115/pPIC9K-hVNP-HSA。

(2)融合蛋白hVNP-HSA的表达

将GS115/pPIC9K-hVNP-HSA接种至装有10ml BMGY(2％胰蛋白胨，1％酵母提取物，100mmol/L磷酸钾(pH 6.0)，1.34％无氨基酸的酵母氮基(YNB)，4×10^-5％生物素，1％甘油)的50ml三角瓶中，250rpm，30℃培养24小时，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有3ml BMMY(2％胰蛋白胨，1％酵母提取物，100mmol/L磷酸钾(pH 6.0)，1.34％无氨基酸的酵母氮基(YNB)，4×10^-5％生物素，2％甲醇)的50ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度2％，诱导3天，离心收集上清，进行SDS-PAGE验证，Western杂交鉴定融合蛋白hVNP-HSA分子的HVNP及HSA免疫源性(结果如图5所示)。

实施例5：融合蛋白hVNP-HSA的生物活性检测

离体动脉条测定法：取兔离体动脉条剪成约1.5cm长、2～3mm宽的螺旋环，悬挂于含10ml通氧的37℃台氏液(NaCl 8.0g、KCl 0.2g、CaCl₂ 0.2g、NaH₂PO₄0.05g、MgSO₄·7HxO 0.1g、NaHCO₃ 1.0g、Glucose 1.0g，用蒸馏水配成1000ml的溶液，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.4)的麦氏浴槽中，加负荷1g，稳定1h，期间每20min换一次台氏液。连接多导记录仪，调节灵敏度，记录血管的张力变化。待张力曲线基线稳定后，加入1.25mg/ml的盐酸去氧肾上腺素溶液0.05ml于麦氏浴槽中使其终浓度为6.25×10^-5mg/ml，曲线升高至最高并稳定后，开始按累计浓度给药法(曲线稳定后对倍增加样品浓度为：6.25×10^-4～8.0×10^-2RU/ml)加入重组人血管钠肽对照品，记录血管的张力变化。完成上述给药后，洗脱并稳定1h，期间每20min换一次台氏液，待基线稳定后，按测定对照品的方法测定待测样品，记录测定结果。计算对照品和各实验样品的半效稀释倍数，按下式计算样品效价：样品效价＝对照品效价×样品半效稀释倍数/对照品半效稀释倍数(RU/mL)。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于：包括第一区和第二区，所述第一区与人血管钠肽至少85％序列同源，所述第二区与人血清白蛋白至少85％序列同源或为人血清白蛋白的部分氨基酸序列；所述第一区位于融合蛋白的N末端，所述第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述第二区位于融合蛋白的N末端，所述第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述第一区与人血管钠肽至少95％序列同源，所述第二区与人血清白蛋白至少95％序列同源。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述人血清白蛋白的部分氨基酸序列为人血清白蛋白部分结构域或经结构域重排后的人血清白蛋白。

4.一种人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于：包括第一区和第二区，所述第一区与人血管钠肽氨基酸残基序列相同或为其功能等同物，所述第二区与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同或为其功能等同物；所述第一区位于融合蛋白的N末端，所述第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述第二区位于融合蛋白的N末端，所述第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。

5.一种人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，包括步骤：

1)人工合成人血管钠肽hVNP cDNA；

2)通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；

3)利用重叠PCR技术，连接hVNP cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的hVNP-HSA cDNA融合基因；

4)将hVNP-HSA cDNA融合基因通过表达载体整合到宿主细胞的染色体中，在宿主细胞中进行表达。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞为酵母。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞为毕赤酵母。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述表达载体为pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P6、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ或pGAPZα。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述的宿主细胞为GS115，所述表达载体为毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K。

10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述整合到宿主细胞的染色体中的方法为转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法。