CN101280018A - 突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备 - Google Patents
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Abstract
突变型人白介素－2(IL－2m)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，连接IL－2m cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA－IL2m cDNA融合体在毕赤酵母宿主系统中进行表达，HSA－IL2m cDNA融合体被整合到宿主的染色体中；本发明的融合蛋白包括与突变型人白介素－2至少85％序列同源的第二区和人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区，两区直接连接，中间不加入任何连接肽，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主表达系统可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明的融合蛋白在保持了人白介素－2的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
Description
技术领域
突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。
背景技术
白介素-2(Interleukin-2，IL-2)是机体免疫应答和免疫调节的核心物质，具有抗肿瘤、抗病毒和增强机体免疫能力的作用。它也是一类造血因子，重组的白介素-2在临床上用于因化疗而造成的血小板减少症状。同时，他对T细胞的免疫活性和强度都起到至关重要的调控作用。白细胞介素-2是1976年Morgan等首先在外周血淋巴细胞中发现的。其分子量是14.5KD。由133个氨基酸残基组成；含有1对二硫键(C58-C105)，但是在125位同样有一个半胱氨酸，所以有错配的可能，如果错配，白介素-2的活性就会有非常大的损失。通常的白介素-2在体内的半衰期非常短，只有10分钟左右，且易被肾小球滤过。为了达到治疗效果，一般需要频繁大剂量用药，频繁大剂量用药不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且容易产生毒副作用。为了克服上述缺点，可以对白介素-2加以修饰，以延长其半衰期。主要方法有做成缓释剂型、利用化学手段修饰(如用PEG，葡聚糖修饰)、利用基因工程手段，对其氨基酸序列进行突变增加其生物稳定性(突变型人白介素-2，IL2m)或将其与其它大分子蛋白融合。所以本发明将突变型人白介素-2(IL2m)与人血清白蛋白(HSA)融合。
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分在血浆中的浓度为40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 261：6747-6757)，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合这些配体，HSA可以调节激素活性、内源性和/或外源性物质的毒性和药物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et Biophysica Acta，2003 640：119-128)。David S.Park等构建的Half HSA(截取HSA的前297个氨基酸残基)具有野生型HSA相应区类似的二级结构，同时保留了野生型HSA结合甲状腺素和甲状腺素类似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，1999 48：169-174)，细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein结构，包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N-连接糖基化(见Uniprot中的proteinALBU_HUMAN)。Peters的观点认为进化出大分子蛋白的优点是减小其在内循环时经肾排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，1985 37：161-245)。HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。
发明内容
本发明的目的是提供一种突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品。本发明的融合蛋白在保持了人白介素-2的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
本发明的技术方案：人工合成IL2m cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接IL2m cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-IL2m cDNA融合基因插入到克隆载体pBlu2KSP中保存。HSA-IL2m cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主细胞中进行表达。
IL2m cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，HSA-IL2m cDNA融合基因的克隆，融合蛋白HSA-IL2m重组酵母构建和融合蛋白HSA-IL2m的表达的步骤详见具体实施方法。
用上述方法制备的优化突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与优化突变型人白介素-2至少85％序列同源的第二区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第一区；所述与优化突变型人白介素-2同源的第二区位于融合蛋白的C末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与优化突变型人白介素-2同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
优选的是所述融合蛋白包括与优化突变型人白介素-2至少95％序列同源的第二区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区。
所述融合蛋白的第二区可以由人血清白蛋白部分结构域组成、经结构域重排后的人血清白蛋白组成，包括所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述【名为HSA(1-n)，n为369-419】。
所述融合蛋白包括与优化突变型人白介素-2氨基酸残基序列相同的第二区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区，或上述二区的功能等同物。
所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
宿主细胞是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞等。优选的宿主细胞是酵母。优选的酵母是毕赤酵母。优选的毕赤酵母是毕赤酵母GS115。
IL2m cDNA和HSA cDNA可以通过人工合成的方法获得。该法可以人为地选择宿主偏好的密码子，以使目的基因高效表达。利用重叠PCR技术，连接IL2m cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫原性方面的问题，得到的IL2m cDNA和HSA cDNA融合体插入到克隆载体中保存。
IL2m cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多个宿主系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫等)等。在这些表达系统中目的基因被整合到宿主的染色体中或插入到质粒中。本发明优选的是酵母表达系统，该系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕氏酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕氏酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕氏酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
毕氏酵母表达系统分泌型表达载体主要有pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα，pYAM75P6；胞内型表达载体主要有：pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZα(invitrogen)等，优选的是毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有His缺陷型的选择性标记基因HIS4、AOX1启动子、MFα分泌信号肽和G418抗性基因(可作为筛选重组子的标记)等元件。AOX1启动子是一个强启动子，可以高效的启动目的基因的表达。在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶AOX1和AOX2，细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。在甲醇为唯一碳源培养的细胞中，该酶可占细胞总蛋白的30％以上。AOX2与AOX1的同源性虽然高达97％，但酶活很低。当AOX1基因缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，细胞利用甲醇能力降低，细胞在甲醇为唯一碳源的培养基上生长很慢。
带有融合cDNA的表达载体可以通过转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法转化宿主细胞。成功转化的细胞，即带有本发明构建的DNA的细胞，可以通过本领域熟知的方法加以鉴定，如收集细胞，裂解后提取DNA，然后进行Southern杂交和PCR鉴定，也可在诱导表达后用HSA抗体和/或IL-2抗体检测培养液上清。
本发明的有益效果：
利用重叠PCR技术，连接IL2m cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性(避免针对连接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的问题。
优选的酵母表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕赤酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕赤酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕赤酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
可以通过培养带有本发明构建的DNA的宿主细胞，来生产本发明的融合蛋白。宿主细胞培养优选在生物反应器上进行，培养分两个阶段，第一阶段主要用于宿主细胞生长，第二阶段主要用于产物合成。可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如离心、盐析、超滤、层析、制备电泳等技术及这些技术的组合。
附图说明
图1.pPHI2m的结构。
图2.pPHI2m的构建。
图3.质粒pPHI2m酶切验证；1，pPIC9K/EcoR I单切；2，pPHI2m/EcoR I单切；3，pPHI2m/EcoR I、Not I双切；M，Marker。
图4.融合蛋白的SDS-PAGE分析；1，样品，上样量7μl； M，Marker。
图5.融合蛋白的HSA抗体检测Western blot分析；1，样品与IL-2抗体杂交；2，样品与HSA抗体杂交；M，Marker。
具体实施方法
实施例1：IL2m cDNA的克隆
由上海生工生物工程技术服务有限公司人工合成IL2m cDNA(399bp)，将其克隆到载体PUC57上，插入位点为Sma I，受体菌为大肠杆菌DH5α菌株。
实施例2：HSA cDNA的克隆
利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：
P1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’
P2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’
PCR反应体系：10μmol/L的P1和P2引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环30次；72℃延伸10分钟。
琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目的片断。纯化好的目的片断和载体pBlu2KSP分别经Sal I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR片段胶回收试剂盒回收目的片断。T4 DNA连接酶连接经双酶切的HSA cDNA和载体pBlu2KSP，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，Sal I和Hind III双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒Sal I和Hind III双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA，阳性重组子命名为JM109/pBlu2KSP-HSA。
实施例3：IL2m cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆
(1)IL2m cDNA的PCR扩增，所用引物如下：
HI1：5’-CAAGCTGCCTTAGGCTTAGCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’
HI2：5’-AGCGGCCGCTTAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’
PCR反应体系：10μmol/L的HI1和HI2引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，质粒模板PUC57-IL2m 1ng，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸10分钟。
(2)HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下：
HI3：5’-GGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’
HI4：5’-GTAGAACTTGAAGTAGGTGCTAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’
PCR反应体系：10μmol/L的HI 3和HI 4引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，质粒模板pBlu2KSP-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环30次；72℃延伸10分钟。
(3)重叠PCR技术融合IL2m cDNA和HSA cDNA
将IL2m的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释10倍，再以1∶10比例混合后作为模板，于50ul反应体系中加入2×Pfu PCR MasterMix 25ul，混合好的模板25μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，循环15次；72℃延伸10分钟。
以该PCR产物为模板，50μl的反应体系中加入10μmol/L的引物HI2和HI3各1.5μl，2×Pfu PCRMasterMix 25ul，模板4ul，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，循环35次；72℃延伸10分钟。
琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.2kb的目的片段。纯化的重叠PCR产物和载体pBlu2KSP，分别经EcoR I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，用PCR片段胶回收试剂盒回收IL2m-HSA基因和载体pBlu2KSP。用T4 DNA连接酶连接两回收片段，连接产物转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，EcoR I和Not I双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoR I和Not I双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA-IL2m，阳性重组子命名为XL-1-Blue/pBlu2KSP-HSA-IL2m。
实施例4：融合蛋白HSA-IL2m的酵母表达系统的构建和表达
(1)融合蛋白HSA-IL2m的酵母表达系统的构建
取一支冻存的XL-1-Blue/pBlu2KSP-HSA-IL2m，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。提取的质粒pBlu2KSP-HSA-IL2m和酵母表达载体pPIC9K，分别经EcoR I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，用PCR片段胶回收试剂盒回收HSA-IL2m基因和载体pPIC9K。用T4 DNA连接酶连接两回收片段，连接产物转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取长出的菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。采用PCR扩增，EcoR I和Not I双酶切鉴定阳性克隆。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pPHI2m，阳性重组子命名为XL-1-Blue/pPHI2m。
提取XL-1-Blue/pPHI2m中的质粒，经Sal I单酶切，DNA胶回收试剂盒回收后，电击转化毕赤酵母GS115，提取重组毕赤酵母基因组DNA，PCR扩增鉴定，阳性重组子命名为GS115/pPHI2m。
(2)融合蛋白HSA-IL2m的表达
将GS115/pPHI2m接种至装有10ml BMGY的50ml三角瓶中，250rpm，30℃培养24小时，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有3ml BMMY的50ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度3％，诱导3天，离心收集上清，进行SDS-PAGE验证，Western杂交鉴定融合蛋白HSA-IL2m分子的IL-2及HSA免疫源性。
实施例5：融合蛋白HSA-IL2m的生物活性检测
CTLL-2细胞增殖法：CTLL-2细胞是一株IL-2依赖性T细胞株，在IL-2存在的条件下，CTLL-2可增殖分裂，加入MTT作为反应底物，增殖的细胞内线粒体氧化酶，可使淡黄色的MTT还原为紫黑色的甲臜颗粒。该颗粒溶解后，其液体的光密度值(A)与活细胞数及代谢活性呈正相关，根据A值可推测CTLL-2细胞的增殖状态，将A值进行直线回归计算，可求得IL-2活性单位值。计算对照品和各实验样品的半效稀释倍数，按下式计算样品效价：样品效价＝对照品效价×样品半效稀释倍数/对照品半效稀释倍数。
Claims (10)
1、突变型人白介素-2(IL2m)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。其特征是包括与优化突变型人白介素-2至少85％序列同源的第二区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第一区；所述与优化突变型人白介素-2同源的第二区位于融合蛋白的C末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与优化突变型人白介素-2同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
2、根据权利要求1所述的突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白包括与优化突变型人白介素-2至少95％序列同源的第二区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区。
3、根据权利要求1所述的突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白的第二区由人血清白蛋白部分结构域组成或经结构域重排后的人血清白蛋白组成。
4、根据权利要求1所述的突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白包括与突变型人白介素-2氨基酸残基序列相同的第二区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区，或上述二区的功能等同物。
5、根据权利要求4所述的突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
6、根据权利要求1所述的突变型人白介素-2(IL2m)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备。其特征是人工合成突变型人白介素-2(IL2m)cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA利用重叠PCR技术，连接IL2m cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-IL2m cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；利用毕赤酵母分泌型表达载体将HSA-IL2m cDNA融合基因整合到宿主的染色体中进行表达。
(1)IL2m cDNA的克隆
由上海生工生物工程技术服务有限公司人工合成IL2m cDNA(399bp)，将其克隆到载体PUC57上，插入位点为Sma I，受体菌为大肠杆菌DH5α菌株。
(2)HSA cDNA的克隆
利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：
P1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’
P2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’
PCR反应体系：10μmol/L的P1和P2引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环30次；72℃延伸10分钟。
琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目的片断。纯化好的目的片断和载体pBlu2KSP分别经Sal I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR片段胶回收试剂盒回收目的片断。T4 DNA连接酶连接经双酶切的HSA cDNA和载体pBlu2KSP，连接产物转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，Sal I和Hind III双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒Sal I和Hind III双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA，阳性重组子命名为XL-1-Blue/pBlu2KSP-HSA。
(3)IL2m cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆
①IL2m cDNA的PCR扩增，所用引物如下：
HI1：5’-CAAGCTGCCTTAGGCTTAGCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’
HI2：5’-AGCGGCCGCTTAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’
PCR反应体系：10μmol/L的HI1和HI2引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，质粒模板PUC57-IL2m 1ng，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸10分钟。
②HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下：
HI3：5’-GGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’
HI4：5’-GTAGAACTTGAAGTAGGTGCTAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’
PCR反应体系：10μmol/L的HI 3和HI 4引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，质粒模板pBlu2KSP-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环30次；72℃延伸10分钟。
③重叠PCR技术融合IL2m cDNA和HSA cDNA
将IL2m的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释10倍，再以1∶10比例混合后作为模板，于50ul反应体系中加入2×Pfu PCR MasterMix 25ul，混合好的模板25μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，循环15次；72℃延伸10分钟。
以该PCR产物为模板，50μl的反应体系中加入10μmol/L的引物HI2和HI3各1.5μl，2×Pfu PCRMasterMix 25ul，模板4ul，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，循环35次；72℃延伸10分钟。
琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.2kb的目的片段。纯化的重叠PCR产物和载体pBlu2KSP，分别经EcoR I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，用PCR片段胶回收试剂盒回收IL2m-HSA基因和载体pBlu2KSP。用T4 DNA连接酶连接两回收片段，连接产物转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，EcoR I和Not I双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoR I和Not I双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA-IL2m，阳性重组子命名为XL-1-Blue/pBlu2KSP-HSA-IL2m。
(4)融合蛋白IL2m-HSA的酵母表达系统的构建
取一支冻存的XL-1-Blue/pBlu2KSP-HSA-IL2m，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。提取的质粒pBlu2KSP-HSA-IL2m和酵母表达载体pPIC9K，分别经EcoR I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，用PCR片段胶回收试剂盒回收HSA-IL2m基因和载体pPIC9K。用T4 DNA连接酶连接两回收片段，连接产物转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取长出的菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。采用PCR扩增，EcoR I和Not I双酶切鉴定阳性克隆。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pPHI2m.阳性重组子命名为XL-1-Blue/pPHI2m。
提取XL-1-Blue/pPHI2m中的质粒，经Sal I单酶切，DNA胶回收试剂盒回收后，电击转化毕赤酵母GS115，提取重组毕赤酵母基因组DNA，PCR扩增鉴定，阳性重组子命名为GS115/pPHI2m。
(5)融合蛋白HSA-IL2m的表达
将GS115/pPHI2m接种至装有10ml BMGY的50ml三角瓶中，250rpm，30℃培养24小时，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有3ml BMMY的50ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度3％，诱导3天，离心收集上清，进行SDS-PAGE验证，Western杂交鉴定融合蛋白HSA-IL2m分子的IL-2及HSA免疫源性。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征是宿主细胞是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征是优选的宿主细胞是酵母。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征是优选的酵母是毕赤酵母。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征是优选的毕赤酵母是毕赤酵母GS115和KM71。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN102391376A (zh) * | 2011-03-15 | 2012-03-28 | 江苏省原子医学研究所 | 人生长抑素十四肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其编码基因和制备方法 |
| WO2022100741A1 (zh) * | 2020-11-16 | 2022-05-19 | 天津林达生物科技有限公司 | 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途 |
| WO2023024215A1 (zh) * | 2021-08-25 | 2023-03-02 | 北京伟德杰生物科技有限公司 | 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用 |
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2008
- 2008-05-23 CN CNA2008100249875A patent/CN101280018A/zh active Pending
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