CN101376676A - 聚乙二醇化红细胞生成素蛋白长效制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类聚乙二醇化红细胞生成素，由非糖基化的rhEPO(rhngEPO)或其点突变体(rhngEPOm)与单一、单链的、分子量大于20kDa的PEG分子以N－末端氨基或半胱氨酸突变点的巯基定点偶联而成；其中所述聚乙二醇化红细胞生成素的分子结构式为：CH₃－(CH₂CH₂－O)n－(CH₂)r－NH－rhngEPO或CH₃－(CH₂CH₂－O)n－X－S－rhngEPOm，式中n为100～2200，r为0～4，X为S或C；本发明所述PEG－rhngEPO或PEG－rhEPOm分子同时具备长效、高效和低免疫原性的长效制剂特征，为制备用于治疗慢性肾功能不全所致贫血、肿瘤及艾滋病化疗所致的贫血、脑脊髓神经损伤以及择期手术自体输血的胃肠外长效制剂奠定了基础。

Description

聚乙二醇化红细胞生成素蛋白长效制剂

技术领域

本发明涉及一类聚乙二醇化(PEG)红细胞生成素，尤其涉及一类具药学上长效、高效、低免疫原性特征的聚乙二醇化(PEG)红细胞生成素偶联化合物分子，其由单一、特定的PEG分子定点偶联非糖基化的重组红细胞生成素蛋白或其点突变体而成。本发明所述化合物分子与重组人红细胞生成素相比，在体外具有完全一致甚或更优的理化和生物学性质，如溶解性、热稳定性、抗酶解稳定性和比活，在体内具有半衰期延长、活性增加和免疫原性降低等药理学特征。本发明还涉及这类化合物分子的生产与应用，以及作为药物制剂的组成成分。

背景技术

人体内源性红细胞生成素(Human Erythropoietin，hEPO)是一种糖蛋白激素，由肾脏产生。hEPO的主要功能是刺激骨髓红细胞前体细胞的增殖与分化，以保持个体的红细胞比容。正常生理状态下，血浆hEPO的含量很低，仅用于刺激替代因老化而损失的红细胞；但当红细胞携氧减少时，血浆hEPO浓度明显升高，以加速红细胞的生成。hEPO由165个氨基酸组成，分子量为30KDa～34KDa；有3个N-连接的糖链即Asn24，38和83，和1个O-连接的寡糖链即Ser126构成hEPO的糖基，约占hEPO糖蛋白分子量的40％。hEPO结构与功能的研究表明：①rhEPO与受体结合的序列涉及A、B、C、D螺旋结构和rhEPO蛋白C末端的AB环；②去除hEPO分子的糖链明显降低hEPO的体外热稳定性；③增加hEPO的N-糖链和/或增加糖链中的唾液酸的含量，可明显增加hEPO的体内半衰期及活性；④无糖基化或去糖基化的hEPO，可保持甚或提高hEPO的体外活性，但却丧失hEPO的体内活性；故糖基对维持hEPO的体外稳定性、体内活性和血浆半衰期具重要作用。因此，目前开发的基因重组hEPO(Recombinant Human Erythropoietin，rhEPO)药物均是由真核细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，CHO细胞)生产的糖蛋白，如Epogen(由美国Amgen公司产品)和Epoetin(由美国Ortho Biotech公司产品)。

临床上，rhEPO主要用于治疗慢性肾功能不全所致的贫血(Eschbach，JW et al.〔1987〕NEJM 316：73-78)，也可治疗爱滋病和肿瘤化疗所致的贫血，均取得了较好的疗效与安全性。但rhEPO的血浆半衰期很短，生物利用度很低，需反复、长期应用才能达到和维持临床疗效；这同时导致相当数目的病人出现抗EPO中和抗体，甚至导致严重的红细胞再生障碍贫血(pure red cell aplasia)(见Bunn HF.N.Engl.J.Med.2002；346：522-523)；且rhEPO价格昂贵，不适合慢性贫血病人的长期治疗。因此，客观上需要开发更加安全、有效、方便的rhEPO长效剂型。

目前已经开发和正在开发的rhEPO长效制剂，几乎都是在rhEPO糖蛋白的基础上；其中包括：①通过增加N-糖链的数目及其唾液酸的含量，而获得一周注射一次的rhEPO长效制剂(如Darbepoetin新药)，该药由Amgen公司开发，是在rhEPO的基础上增加了2条N-糖链，唾液酸也由原来的14个增加至22个，从而使其血浆清除半衰期从8.5小时增加至25小时(约三倍)；②美国专利US6,340,742、US6,583,272、US6,586,398和US6,930.086分别描述了通过聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)与rhEPO糖蛋白分子、rhEPO糖蛋白分子的突变体以及高糖基化红细胞生成素蛋白(NovelErythropoietin Stimulating Protein，NESP)的偶联，而形成长效EPO制剂；③WO94/28024专利描述了PEG与rhEPO分子的糖基定点偶联即GlycoPEGylation，而使rhEPO的血浆半衰延长。上述rhEPO长效制剂的特点是：均在由CHO细胞生产的rhEPO糖蛋白的基础上制备其长效制剂，故产率低、成本高；高糖基化rhEPO和PEG化rhEPO糖蛋白均使rhEPO的体外活性及与EPO受体的结合力明显降低，影响长效制剂的疗效。

Francis，GE等(Int.J.Hem 68〔1998〕1-18)和WO 00/32772专利都描述了PEG分子与非糖基化hEPO(rhngEPO)的偶联，WO 00/32772专利还提出了许多可以与PEG分子偶联的rhngEPO突变体(rhngEPO muteins，rhEPOm)，但其所列举的各种PEG-rhngEPO和PEG-rhngEPOm均未表现出体内显著的促红细胞生成作用或具有rhEPO长效制剂的药代动力学特征。CN1680449A描述了一类由双链PEG分子偶联的PEG-rhngEPO，且证实该类分子具有体内促红细胞生成素的生理活性。近来公开的WO2004/009627A1专利采用链毒菌(Streptomyces)表达rhngEPO及rhngEPOm，并通过点突变方法，使rhngEPO蛋白中的赖氨酸残基(Lysine)转变为精氨酸(Arginine)，从而使PEG与某一个或多个特定“剩余”赖氨酸残基定点偶联，生成PEG-rhngEPOm偶联物，进而证实PEG-rhngEPOm偶联物具有体内、体外稳定性和生物活性，但其偶联的PEG分子量低于10KDa，与rhEPO相比可能更适合于缓释制剂配方，且rhngEPOm体内应用有可能会增加免疫原性，不适合反复应用或开发长效制剂。在WO 00/32772和US2007/0100133 A1专利中，Beals JM等证实20kDa PEG醛基与rhngEPO及其rhEPOm偶联化合物可显著改善rhngEPO蛋白物理稳定性；5kDa和20kDa分子量PEG偶联rhEPOm所获的混合化合物(偶联化合物含1～4个PEG分子数)体内半衰期明显延长，并具体内活性，且20kDa分子量PEG偶联rhEPOm较5kDa分子量PEG偶联rhEPOm在血浆半衰期和生物利用度上更优。但Beals JM等提供的PEG-rhngEPO和PEG-rhngEPOm混合物并不适用于药用制剂，至多说明这类混合物具体外稳定性和体内生物活性，远非本专利所提出的一类同时具备分子量和分子结构上的均一性的PEG-rhngEPO和PEG-rhngEPOm分子，更未涉及本专利公开的PEG-rhngEPO和PEG-rhngEPOm某些意外的、甚或异乎寻常的理化、生物、药学和药理学性质。

PEG与多肽或蛋白质的偶联技术与方法有很多。通常，PEG化可增加蛋白的溶解性、稳定性和血浆半衰期，降低蛋白质的免疫原性或抗原性；但对于特定的蛋白质，特别是开发其长效制剂----PEG化重组蛋白新药，偶联的位点及其数目、偶联反应的种类与条件、PEG的分子量与结构(单链或双链或多链)、PEG活化基团的种类与结构等等众多因素，均可影响PEG化重组蛋白新药的理化、生理、免疫、药学和药理学等性质；换句话讲，上述某一个因素的微小差别，对于特定的蛋白可能产生很大的性质改变。因此，既往许多PEG偶联多肽或蛋白质的专利，其意义、应用价值和范围有其专属性、特殊性或局限性。

PEG偶联rhngEPO而形成的PEG-rhngEPO新分子可有多种完全不同的性质。就PEG分子而言，不同的分子量、不同的分子结构(单链、双链、多链)、不同的活性基团、甚或相同活性基团不同的碳原子个数(如丙醛、戊醛等)等都会显著影响偶联化合物分子的某些性质；就rhngEPO分子而言，不同的偶联位点、偶联位点的数目(单一、两个、三个等)、是否有氨基酸的点突变等都会明显改变rhngEPO的理化和药学的性质；这些理化、药学和药理学性质的改变包括，但不限于，蛋白质的溶解性、稳定性、体内外活性、血浆半衰期、体内分布及免疫原性。此外，不同的偶联反应条件，如pH值和PEG与蛋白质的摩尔浓度比，也可能会影响rhngEPO的二级结构、生物活性和产物组成。因此，既往有许多涉及PEG偶联重组蛋白包括rhEPO或rhngEPO的专利(包括US2007/0100133 A1)，因要求的权利范围过于宽泛，使其中PEG偶联蛋白的性质差异很大甚或性质完全相反，大大影响了这些专利的实际应用价值与意义。

因此，根据发明人的理解是：这些资料和其他涉及PEG修饰rhngEPO的专利和科学文献更多描述与分析了可以与rhngEPO偶联的PEG分子结构特征、偶联反应方法和可能的偶联位点，故其所囊括的PEG-rhngEPO化合物种类繁多、性质各异；上述资料至多说明：PEG修饰可改善rhngEPO的某些理化和生物学性质，PEG化可使rhngEPO更接近于重组人红细胞生成素(rhEPO)和/或PEG-rhngEPO可在体内有较长的半衰期和/或生物利用度。这些资料均未从解决rhEPO临床应用的问题角度，提出或涉及为开发更优的rhEPO长效制剂，PEG化修饰rhngEPO分子需要实现的完整、明确的目标；也没有认识到、证实或确认PEG化(Pegylation)rhngEPO(PEG-rhngEPO)完全可以获得与天然糖基化(Glycosylation)EPO(rhEPO)一致甚或更优的理化和生物学性质，如溶解性、热稳定性、抗酶解稳定性和生物活性；更不能据此联想到按照本发明的方案以特异的、可控制的方式直接影响EPO的药学和药理学性质，并开发出与rhEPO相比，同时具备长效、高效和低免疫原性特征的EPO新型制剂。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一类具药学上长效、高效、低免疫原性特征的聚乙二醇化(PEG)红细胞生成素偶联化合物，以及这类化合物分子的生产与应用，以及作为药物制剂的组成成分。

发明概述(Summary of The Invention)

本发明提供了一类单链的聚乙二醇(分子量在20KDa-40KDa)经单一位点与重组人非糖基化红细胞生成素偶联而形成的新的聚乙二醇化红细胞生成素(PEG-rhngEPO)分子，该类PEG-rhngEPO具红细胞生成素的生物活性，且在体内应用时，与由CHO细胞生产的rhEPO相比，具血浆清除半衰期明显延长、体内活性显著增高、免疫原性降低等药理学特征。

本发明所述的一类PEG-rhngEPO或PEG-rhEPOm(聚乙二醇化重组人非糖基化红细胞生成素或其点突变体)分子的结构为：CH₃-(CH₂CH₂-O)n-(CH₂)r-NH-rhngEPO或CH₃-(CH₂CH₂-O)n-X-S-rhngEPOm，式中n为100～2200，n的更适范围为450～1000，n最佳值为700±100；r为0～4，最适2～3，X为S或C。该类PEG-rhngEPO或PEG-rhEPOm分子同时具备分子量和分子结构上的均一性，并在热稳定性、抗酶解稳定性和比活上与rhEPO相当，体内半衰期长于rhEPO二倍以上，且免疫原性明显降低。

本发明描述了各种PEG与rhngEPO或rhEPOm蛋白偶联反应条件，以及PEG-rhngEPO和PEG-rhEPOm分离、纯化的方法。采用本发明提供的方法所获得的PEG-rhngEPO和PEG-rhEPOm，单体纯度可达95％以上，与rhngEPO相比，PEG-rhngEPO和PEG-rhEPOm溶解性、热稳定性和抗酶解稳定性明显提高，圆二色谱图形几乎完全吻合，且体外活性高于rhEPO，或与其相当。

本发明明确提出rhngEPO的N-末端氨基酸位点是首选最适定点偶联PEG的位点。其他可用于PEG化定点偶联rhngEPO的位点包括N-末端1～5位、丝氨酸126位(为O-连接的寡糖链位点)和谷酰胺115位点～苏氨酸132位点；这些位点可经半胱氨酸(cys)点突变，如rhngEPO-K116C(氨基酸序列第116位Cys点突变体rhngEPO)，rhngEPO-R131C(氨基酸序列第131位Cys点突变体rhngEPO)，再进行PEG分子的定点偶联，如PE-K116C-30(在氨基酸序列第116位Cys点突变并偶联30kDaPEG的PEG-rhngEPOm分子)和PE-R131C-30(在氨基酸序列第131位Cys点突变并偶联30kDaPEG的PEG-rhngEPOm分子)。本发明所涉及的rhEPOm仅包含一个点突变位点，且这一位点同时用于定点偶联PEG分子。

本发明提供了用于与rhngEPO/rhEPOm偶联的PEG的特征为：单链(single chain)、分子量在20KDa-40kDa，且最适的PEG分子量为30kDa；偶联终产物PEG-rhngEPO或PEG-rhEPOm中，PEG分子与rhngEPO偶联的分子比列为1：1，并为定点偶联。

本发明所提供的PEG为甲氧基化PEG，即mPEG，其分子式为：CH3-(CH₂-CH₂-O)n-CH₂-CH₂-OH；其中，n为100～2200，n的更适范围为450～1000，n最佳值为700±100。

本发明所提供的用于N-末端PEG化修饰的mPEG为mPEG-醛(mPEG-ALD)，其分子式为：mPEG-(CH₂)r-CHO，其中r为1～3，r的更适范围为2～3，即mPEG-丙醛和mPEG-丁醛。

本发明所提供的用于与N-末端半胱氨酸(Cys)突变体偶联的mPEG为mPEG-邻位吡啶硫代酯(mPEG-ortho-pyridylthioeaster，mPEG-OPTE)。

本发明所提供的用于与点特异性半胱氨酸(cysteine，Cys)突变体偶联的mPEG为mPEG-马来酰亚胺(mPEG-maleimides，mPEG-MAL)和mPEG-邻位吡啶硫酯(mPEG-Ortho-pyridyldisulfide，mPEG-OPSS)。

本发明所述的重组人非糖基化红细胞生成素(rhngEPO)及其半胱氨酸点突变体(rhngEPOm)的氨基酸序列应符合SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列公式；其中：所述rhngEPOm同时具备仅包含一个点突变位点，且这一位点同时用于定点偶联PEG分子；进一步的rhngEPO或rhngEPOm蛋白同时具备经UT7细胞/MTT法体外活性测定比活大于或等于rhEPO的比活。

本发明还提供了一种采用原核细胞表达体系即大肠杆菌高效表达rhngEPO蛋白、构建工程菌株，以及rhngEPO点突变和突变株的建立方法。详细描述了rhngEPO工程菌高密度发酵、复性和纯化rhngEPO蛋白的方法。采用本发明提供的方法所获得的rhngEPO，与人体天然EPO蛋白或由CHO细胞生产的rhEPO的氨基酸序列完全一致，rhngEPO单体纯度可达98％以上，且rhngEPO的体外活性明显高于rhEPO。

本发明提供了生产这类PEG-rhngEPO和PEG-rhEPOm的技术、工艺与方法，其中包括PEG与rhngEPO和rhEPOm的偶联方法和PEG-rhngEPO的分离、纯化和检定方法。

本发明证实，PEG-rhEPO和PEG-rhEPOm可以获得与天然Glycosylation(糖基化)EPO(rhEPO)一致甚或更优的理化性质，如溶解性、热稳定性和抗酶解稳定性；这是此类PEG-rhEPO和PEG-rhEPOm分子具有体内外生物活性的基础之一。

本发明的实验结果显示：用UT7细胞/MTT法同时测定PE-N-30(蛋白N-末端、30kDaPEG单一修饰的PEG-rhngEPO)、PE-N-20(蛋白N-末端、20kDaPEG单一修饰的PEG-rhngEPO)和rhEPO体外活性，发现PE-N-30和PE-N-20的体外活性均明显高于rhEPO，特别是PE-N-30的体外活性也明显高于普通rhEPO，这一结果令人深感意外，因为，通常认为大分子PEG的偶联会显著降低rhngEPO的活性，而糖链对rhEPO分子结构与功能甚为重要。但本发明的实验结果表明，当单一、单链PEG分子与rhngEPO蛋白定点偶联时，PEG的分子量大于rhEPO分子糖链分子量2倍以上时，所获PEG-rhngEPO的体外活性仍然高于rhEPO，提示在hEPO分子的活性保持上，PEG化明显优于糖基化。

本发明公开了一类同一偶联位点、相同偶联方式、不同分子量的PEG-rhngEPO分子，即PE-N-10、PE-N-20、PE-N-30和PE-N-40，大鼠体内血浆清除半衰期的测定结果，发现随着PEG分子量的增加，PEG-rhngEPO血浆半衰期的增加幅度，在PE-N-30处出现“拐点”，即PE-N-40和PE-N-30相比半衰期仅增加了20％。进一步试验意外发现，大鼠尾静脉注射超大剂量PEG或PEG-rhngEPO ELISA法测定尿液中的PEG含量，注射PEG20和PE-N-20组可以测到相当数量的PEG经尿液排除，而注射PEG30，PEG40，PE-N-30和PE-N-40组可检测到的PEG含量明显降低。显然，这一发现对开发长效制剂尤其具有价值和意义。

正常小鼠注射PE-N-30 1.5ug/kg，3次/周使红细胞压积增加的速度和幅度均明显高于相同剂量、相同给药方式的Darbepoetin和5ug/kg，3次/周rhEPO，提示PE-N-30具较高的体内活性。

在正常小鼠每周给药一次的长效给药模式中，本发明提供的数据表明，注射同等剂量的(15ug/kg QW)PE-N-30使红细胞压积增加的速度和幅度均明显高于PE-N-20和PE-N-40；而且PE-N-30与每周给药三次、等剂量的rhEPO(5ug/kg TIW，相当于15ug/kgQW)的体内活性相当；这说明PE-N-30可能是更为有效的长效制剂，其临床用量有望进一步降低。

本发明提供的资料显示，PE-N-20、PE-N-30和PE-N-40的免疫原性明显低于Darbepoetin和rhEPO；而在半胱氨酸点突变位点偶联分子量为30kDa PEG，如PE-K161C-30，PE-R131C-30等，其免疫原性与PE-N-30相当。这些资料首次证实，大分子PEG长链在降低基因工程生产的EPO蛋白的免疫原性方面明显优于糖链。

本发明所述一类PEG-rhEPO和PEG-rhEPOm分子(如PE-N-30，PE-K116C-30，PE-R131C-30等)同时具有血浆半衰期明显延长、体内活性显著增高和免疫原性降低等药理学特征；这对rhEPO的多种临床适应症特别有益，作为rhEPO的长效制剂，将大大提高药物应用的方便性、疗效和安全性，并可扩大临床适应症。

本发明提供了含有PEG-rhngEPO和PEG-rhEPOm成分的制剂配方，包括皮下注射(sc)、静脉注射(iv)、肌肉注射(im)、肺吸入、透皮、口服等。

本发明提供的一类PEG-rhngEPO和PEG-rhEPOm分子，制备工艺易于放大，产率可大大突破CHO细胞生产rhEPO的限度与瓶颈，具突出的制造成本优势。

本发明所提供的资料和方法同样适用于其他细胞因子长效、高效、低免疫原性制剂的开发，如重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、干扰素alfa 2b/alfa-2a、干扰素beta等。

发明详述(Detailed Description of The Invention)

目前已上市的重组人红细胞生成素(Recombinant Human Erythropoietin，rhEPO)有多种，均为糖蛋白，主要用于治疗慢性肾功能衰竭所致的贫血，常规给药方式为3次/周，连续使用数周甚或数月，病人常常需要终身rhEPO的补充性治疗。rhEPO的应用虽然减少了此类病人输血的需求，提高了病人的生活质量，但rhEPO长期应用的方便性和免疫原性的问题尤为突出。近年来上市的rhEPO的长效制剂Darbepoetin可实现1次/周(QW)或1次/2周的给药方式，增加了应用的方便性，但免疫原性问题仍未解决。rhEPO或Darbepoetin反复、长期应用使一定数目的病人出现抗EPO中和抗体，进一步导致更为严重的红细胞再生障碍性贫血，这种治疗并发症目前尚无有效的治疗方法，故预防发生成为首选。此外，Darbepoetin因高糖基化，使其与EPO受体的结合能力下降，体外活性降低，体内生物利用度较低。因此，临床治疗客观上需要低剂量、低免疫原性、低给药频率的、更为有效和安全的长效制剂。本发明正是发现了这样一类PEG偶联的非糖基化红细胞生成素分子。

本发明提供的一类聚乙二醇化红细胞生成素，由非糖基化的rhEPO(rhngEPO)或其点突变体(rhngEPOm)与单一、单链的、分子量大于20kDa的PEG分子以N-末端氨基或半胱氨酸突变点的巯基定点偶联而成；其特征在于：所述聚乙二醇化红细胞生成素的分子结构式为：CH₃-(CH₂CH₂-O)n-(CH₂)r-NH-rhngEPO或CH₃-(CH₂CH₂-O)n-X-S-rhngEPOm，式中n为100～2200，r为0～4，X为S或C；其中用于与rhngEPO或rhEPOm偶联的PEG为甲氧基化PEG，即mPEG，其分子式为：CH₃-(CH₂-CH₂-O)n-CH₂-CH₂-OH，n为100～2200，n的更适范围为450～1000，n最佳值为700±100；所述rhngEPO或rhngEPOm的氨基酸序列应符合SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列公式；其中所述rhngEPOm具备仅包含一个点突变位点且这一位点同时用于定点偶联PEG分子，并rhngEPO或rhngEPOm蛋白同时具备经UT7细胞/MTT法体外活性测定比活大于或等于rhEPO的比活；同时所述聚乙二醇化红细胞生成素还应具备下列特征：

1)mPEG的分子量大于20kDa；

2)mPEG是单链PEG，与rhngEPO或rhngEPOm偶联的分子比列为1：1，且为单一位点偶联；

3)在体外热稳定性中，以50℃恒温处理PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm15分钟，取样测体外细胞活性，活性应保持不变；

4)在体外抗酶解试验中：将胰蛋白酶与PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm在37℃共同孵育4小时，取样经SDS-PAGE法测定，PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm的酶解百分比应低于50％；

5)在比活性测定中，以Lowry法测定待测PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm的蛋白浓度，UT7细胞/MTT法测体外活性，计算出每mg(毫克)蛋白的活性即得比活性，PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm的比活性应大于或等于1.5X10E6U/mg蛋白；

6)PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm的血浆半衰期应比rhEPO的血浆清除半衰期大2倍以上；

7)在免疫原性测定中，PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm在第12周EPO抗体阳性率应小于20％。

上述的聚乙二醇化红细胞生成素，所述mPEG的分子量优选20kDa～40kDa；进一步的，所述mPEG的分子量最优选30kDa。

上述聚乙二醇化红细胞生成素，所述用于N-末端PEG化修饰的mPEG为mPEG-醛，即mPEG-ALD，其分子式为：mPEG-(CH₂)r-CHO，其中r为1～3，r的更适范围为2～3，即mPEG-丙醛和mPEG-丁醛。mPEG-丁醛的分子结构式为：

mPEG-ButyrALD

mPEG-ALD与rhngEPO偶联后的产物为PEG-rhngEPO，其分子式为：CH₃-(CH₂-CH₂-O)n-(CH₂)r-NH-rhngEPO；其中，n为100～2200，n的更适范围为450～1000，n最佳值为700±100；r为1～3，r的更适范围为2～3。

上述聚乙二醇化红细胞生成素，所述用于与N-末端半胱氨酸(Cys)突变体偶联的mPEG为mPEG-邻位吡啶硫代酯，即mPEG-OPTE(mPEG-ortho-pyridylthioeaster)；具有如下的分子式，

mPEG-OPTE

mPEG-OPTE与rhngEPO-M162-166C(N-末端敲除5～1个氨基酸后N-末端再进行Cys点突变的rhngEPO突变体)偶联后的产物为PEG-rhngEPOm，其分子式为：CH₃-(CH₂-CH₂-O)n-(CH₂)r-CO-SS-rhngEPOm，其中，n为100～2200，n的更适范围为450～1000，n的最佳值为700±100；r为0～2。

上述聚乙二醇化红细胞生成素，所述用于与点特异性半胱氨酸(cysteine，Cys)突变体偶联的mPEG为mPEG-马来酰亚胺，即mPEG-MAL(mPEG-maleimides)；或mPEG-邻位吡啶硫酯，即mPEG-OPSS(mPEG-Ortho-pyridyldisulfide)；其分子式分别为：

mPEG-MAL：

       mPEG-OPSS          

mPEG-MAL或mPEG-OPSS与rhngEPOm偶联后产物为PEG-rhngEPOm，其分子式为：CH₃-(CH₂-CH₂-O)n-X-S-rhngEPOm，其中X为S或C，n为100～2200，n的更适范围为450～1000，n最佳值为700±100。mPEG-MAL和mPEG-OPSS的偶联反应详见RobertMJ，Bentley MD and Harris JM.Chemistry for peptide and protein PEGylation.Advanced Drug Delivery Reviews 54(2002)459-476。

上述聚乙二醇化红细胞生成素，所述SEQ ID NO.1所示的rhngEPO或rhngEPOm的氨基酸序列公式的序列如下：

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

-5  -4  -3  -2  -1

Met Ala Pro Pro Arg LeuIle Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr

1              5                10                15

Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu

           20                25                30

His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn

        35                40                45

Phe Tyr AlaTrp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val

    50                55                60

Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala

65                70                75                80

Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val

               85                90                95

Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala

           100               105                110

Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala

        115               120               125

Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg

   130                135               140

Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu

145               150                155               160

Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg＊

               165

上述的rhngEPO或rhngEPOm的氨基酸序列公式中，-5 Xaa缺失或是Met或Cys，即rhngEPO-162或rhngEPO-M162C；-4 Xaa缺失或是Met或Cys，即rhngEPO-163或rhngEPO-M163C；-3 Xaa缺失或是Met或Cys，即rhngEPO-164或rhngEPO-M164C；-2 Xaa缺失或是Met或Cys，即rhngEPO-165或rhngEPO-M165C；-1 Xaa缺失或是Met或Cys，即rhngEPO-166或rhngEPO-M166C；115～132位均能分别是目前的氨基酸序列或者在任何一位点上氨基酸突变为Cys，即rhngEPO-X115～132C，其中X为Gln、Gln、Lys、Glu、Ala、Ile、Ser、Pro、Pro、Asp、Ala、Ala、Ser、Ala、Ala、Pro、Leu或Arg；如rhngEPO-K116C或rhngEPO-R131C是分别在第116或131位点进行Cys点突变的突变体。

本发明所述重组人非糖基化红细胞生成素优先采用原核细胞表达体系即大肠杆菌高效表达制备。

本发明所述聚乙二醇化红细胞生成素首选PE-N-30、PE-N-20、PE-166-N-30、PE-165-N-30、PE-166-N-20、PE-165-N-20、PE-K116C-30或PE-R131C-30分子。

本发明所述聚乙二醇化红细胞生成素同时具备分子量和分子结构上的均一性，是单链、单一分子、定点偶联的大分子PEG的偶联产物；在体外热稳定性、抗酶解性和体外细胞活性上与由CHO细胞生产的rhEPO相当或更优；在体内应用时，与rhEPO相比，具有血浆半衰期明显延长和免疫原性降低等长效制剂药代动力学与药效学特征。基于此，本发明所述PEG-rhngEPO或PEG-rhEPOm分子同时具备长效、高效和低免疫原性的长效制剂特征。

用于治疗慢性肾功能不全所致贫血、肿瘤及艾滋病化疗所致的贫血、脑脊髓神经损伤以及择期手术自体输血的胃肠外长效制剂，其中含有治疗有效量的本发明所述聚乙二醇化红细胞生成素和药学上可接受的载体。

由PEG-rhngEPO或PEG-rhEPOm分子组成的胃肠外制剂，作为rhEPO的长效制剂可实现1-2周注射一次，对某些适应症甚或可实现一个治疗周期(疗程)用药一次的临床应用模式。适用于治疗慢性肾功能不全所致贫血、肿瘤及艾滋病化疗所致的贫血、脑脊髓神经损伤以及择期手术自体输血的病人。根据应用指征与治疗目的，一次应用PEG-rhngEPO或PEG-rhEPOm的剂量在0.5ug～100ug/kg体重/1～2周。

rhngEPO和rhEPOm基因克隆与高效表达

本发明所述构建高效表达重组人促红细胞生成素(rhngEPO)的大肠杆菌重组菌株的方法，由下述步骤组成；

1.重组人促红细胞生成素基因的合成

基本方法是以已知的hEPO蛋白氨基酸序列(Genebank[gi：4503588])为基础，对hEPO碱基序列进行重新设计，将密码子全部换为大肠杆菌喜好的密码子，同时考虑到DNA二级结构及GC含量做适当的修改，使整个基因不含有稀有密码子。将基因命名为rhEPO。合成的基因构建在pMD18-T载体上，载体转化到Top10菌株中保存。

2.rhEPO表达重组质粒的构建

基本方法是以合成的rhEPO基因为模板，通过设计引物PCR体外扩增，克隆到大肠杆菌表达质粒上，获得rhEPO表达重组质粒。

3.高效表达rhEPO重组大肠杆菌的构建

基本方法是将重组质粒vector-rhEPO从活化后的DH5α菌株中提取出来转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。筛选高效表达菌株。

将表达重组质粒vector-rhEPO按照2中的方法转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。挑取LB平板中筛选后的阳性克隆，保存。

在上述方法中，所述的大肠杆菌载体优选具有强启动子的载体，如T7或T5之一。优选是具有Nde I，Nco I酶切位点的大肠杆菌表达质粒，如pET22b、pET15b、pET28a之一。

其中，上述用于质粒扩增的宿主菌优选Top10、DH5α、JM109之一。

其中，上述用于表达的宿主菌优选BL21、BL21(DE3)pLysS之一。

rhngEPO和rhEPOm的制备与鉴定

rhngEPO大肠杆菌工程菌株经高密度发酵培养、发酵后处理、rhngEPO蛋白包涵体洗涤、复性及分离纯化等工艺(详见实施例1)，获得高纯度的rhngEPO或rhngEPOm蛋白。经体外细胞学活性测定，rhngEPO或rhngEPOm的体外生物活性大于或等于rhEPO(见表4)。rhngEPO经还原型SDS-PAGE测定其分子量为20kDa(如图4)，高压液相色谱、高效凝胶色谱和荧光发射光谱扫描如图5，6，7所示。

在严格无菌操作下，将rhngEPO大肠杆菌工程菌接种于LB/Amp平板培养，倒置于细菌培养箱中37℃培养12-15小时；选取单一菌落，转接在12ml LB/Amp培养试管中，37℃ 250rpm振荡培养12小时；取10ml发酵液转接在1000ml LB/Amp发酵液中摇瓶培养(37℃，250rpm振荡)，当菌液浓度达OD600 1.5～2.5时；再接种于15升发酵罐中培养(每升发酵液含胰蛋白胨12克、酵母浸膏24克、磷酸二氢钾3.8克、磷酸氢二钾12.5克、硫酸镁0.5克、甘油6.3克、纯水0.9升、葡萄糖20克和氨苄青霉素0.1克)；设发酵参数为温度37℃、pH7.0、溶氧35％及搅拌转速与溶氧联动。当OD₆₀₀值达20时，为工程菌对数增长的中期，加入IPTG诱导，持续2小时后终止发酵。冷却发酵液，使其降温至4-8℃。用大容量低温冷冻低速离心机4000rpm离心菌液30分钟，收集菌体。

向收集的工程菌菌体沉淀中加入工程菌破碎缓冲液(50mM Tris，1mM EDTA，pH7.5缓冲液)。经高压匀浆机在10000psi压力下破碎菌体两遍。破菌后液体经高速冷冻离心机于4℃，10000g下离心20分钟获得工程菌包涵体(IB)粗品。用包涵体洗涤液(50mMTris，1mM EDTA，pH7.5，2.5％曲拉通×100，0.15M NaCl)反复洗涤三遍，即将包涵体洗涤液与包涵体经高速液体搅拌机充分混合，再在4℃ 10000g高速离心50分钟收集包涵体，如此反复三遍完成包涵体洗涤与纯化。将已纯化的包涵体按10克湿重比500毫升的比例溶解于包涵体溶解变性液中(50mM Tris，1mM EDTA，8M盐酸胍，1mM二巯基赤藓醇)，置4℃下12小时，获得包涵体溶解变性液，在经4℃ 10000g高速离心40分钟，收取上清。

按1：100体积比将包涵体溶解变性液缓慢加入20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)，150mM氯化钠，3M尿素，0.005％聚山利醇酯80(polysorbate 80)复性溶液中，4℃静置24小时，经0.45μm孔径滤膜过滤后，进行蛋白质提纯。

rhngEPO蛋白复性液经过Sepharose Fast Flow离子交换层析，平衡缓冲液为20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)，150mM氯化钠，0.005％聚山梨醇酯80；60ml/分钟上样，用0～1M氯化钠梯度洗脱，收集A280d蛋白洗脱峰液。再用上述平衡缓冲液平衡Superdex75 prep grade凝胶层析柱，按30ml/分钟的流速上样，上样120分钟后，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为rhngEPO原液。

同样的方法处理可获rhngEPOm原液。

PEG化rhngEPO和rhEPOm及其制备工艺

本发明公布了可采用半胱氨酸(cys)点突变的rhngEPO的位点，其中包括N-末端氨基酸1-5位、丝氨酸126位(为O-连接的寡糖链位点)和谷酰胺115位点～苏氨酸132位点。实施例3中提供的数据显示，在谷酰胺115位点～苏氨酸132位点之间进行的半胱氨酸(cys)点突变，如rhngEPO-K116C和rhngEPO-R131C，几乎不影响rhngEPO的体外活性的证据，见表4。

本发明提供了一种PEG-ALD与rhngEPO N-末端单一定点偶联的技术、方法与工艺。具体方法如下：

取上述rhngEPO原液经超滤浓缩使蛋白浓度达2mg/ml。按8～40mol:1mol比例将分子量为30kDa的PEG丙醛(PEG-propionaldehyde)溶解于2～5mg/ml的rhngEPO原液；较适的比例是30kDa的PEG-ALD与rhngEPO原液摩尔比例为12～24mol:1mol；反应液为20mM～50mM醋酸钠缓冲液，pH3.5～9.0，150mM～500mM氯化钠；再按1:10～5(w/w)比例加入浓度为7.5mg/ml的硼氰化钠(NaCNBH₃)，反应液于4℃～25℃下，静置24～48小时，按1：100(v/v)比例加入1mM稀盐酸溶液(pH3.5)终止反应。

用缓冲液20mM～50mM醋酸钠缓冲液，pH3.5～9.0，150mM～500mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯80溶液，平衡Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，按50ml/分钟流速连续上样PEG-rhngEPO反应液，经0～1M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰；再用上述平衡缓冲液平衡Superdex 75 prep grade凝胶层析柱，按30ml/分钟的流速上样，每次上样量为1/10～20柱体积，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为蛋白N-末端、30kDaPEG单一修饰的PEG-rhngEPO(简称PE-N-30)原液。同法可获得PE-N-20、PE-N-40、di-PE-40和rhngEPO-162～166-N-30/20/40等。

本发明提供了一种mPEG-NHS与rhngEPOm N-末端单一定点偶联的技术、方法与工艺。具体方法如下：

取上述rhngEPOm原液经超滤浓缩使蛋白浓度达0.5-5mg/ml。按8～40mol:1mol比例将分子量为30kDa的PEG-OPTE(PEG-ortho-pyridylthioester)溶解于0.5～5mg/ml的rhngEPO原液；反应液为20mM～50mM PBS缓冲液，pH6.0～9.0，150mM～500mM氯化钠；反应液于4℃～25℃下，静置15～180分钟。

用缓冲液20mM～50mM PBS缓冲液，pH3.5～9.0，150mM～500mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯80溶液，平衡Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，按50ml/分钟流速连续上样PEG-rhngEPOm反应液，经0～1M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰；再用上述平衡缓冲液平衡Superdex 75 prep grade凝胶层析柱，按30ml/分钟的流速上样，每次上样量为1/10～20柱体积，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为蛋白N-末端半胱氨酸、30kDaPEG单一修饰的PEG-rhngEPOm(简称PE-M162～166C-30)原液，如PE-M162～166C-30原液，其中PE-M162C-30是N-末端敲除5个氨基酸后N-末端再进行Cys点突变并偶联30kDa PEG的PEG-rhngEPOm分子。

本发明提供了一种PEG-MAL与rhngEPOm Cys突变点单一定点偶联的技术、方法与工艺。具体方法如下：

取上述rhngEPOm原液经超滤浓缩使蛋白浓度达0.5-5mg/ml。按8～40mol:1mol比例将分子量为30kDa的PEG-MAL(PEG-maleimide)溶解于0.5～5mg/ml的rhngEPOm原液；反应液为20mM～50mM PBS缓冲液，pH6.0～9.0，150mM～500mM氯化钠；反应液于4℃～25℃下，静置2～8小时。

用缓冲液20mM～50mM PBS缓冲液，pH3.5～9.0，150mM～500mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯80溶液，平衡Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，按50ml/分钟流速连续上样PEG-rhngEPOm反应液，经0～1M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰；再用上述平衡缓冲液平衡Superdex 75 prep grade凝胶层析柱，按30ml/分钟的流速上样，每次上样量为1/10～20柱体积，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为Cys点突变位点、30kDaPEG单一修饰的PEG-rhngEPOm原液，如PE-K116C-30或PE-R131C-30原液，其中PE-K116C-30是在氨基酸序列第116位Cys点突变并偶联30kDaPEG的PEG-rhngEPOm分子，PE-R131C-30是在第131位Cys点突变并偶联30kDaPEG的PEG-rhngEPOm分子。同法可获得PE-K116C-20或PE-K116C-40等。

本发明提供了一种PEG-OPSS与rhngEPOm Cys突变点单一定点偶联的技术、方法与工艺。具体方法如下：

取上述rhngEPOm原液经超滤浓缩使蛋白浓度达0.5-5mg/ml。按8～40mol:1mol比例将分子量为30kDa的PEG-OPSS(PEG-ortho-pyridyl disulfide)溶解于0.5～5mg/ml的rhngEPOm原液；反应液为20mM～50mM PBS缓冲液，pH6.0～9.0，150mM～500mM氯化钠；反应液于4℃～25℃下，静置1-9小时。

用缓冲液20mM～50mM PBS缓冲液，pH3.5～9.0，150mM～500mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯80溶液，平衡Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，按50ml/分钟流速连续上样PEG-rhngEPOm反应液，经0～1M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰；再用上述平衡缓冲液平衡Superdex 75 prep grade凝胶层析柱，按30ml/分钟的流速上样，每次上样量为1/10～20柱体积，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为蛋白Cys点突变位点、30kDaPEG单一修饰的PEG-rhngEPOm原液，如PE-K116C-30或PE-R131C-30原液。同法可获得PE-K116C-20或PE-K116C-40等。。

本发明的实验显示，大分子量PEG-ALD在pH值较低的条件下，可特异性偶联rhngEPO的N-末端氨基，且偶联反应的收率较高；在适宜rhngEPO二级结构正确与稳定的条件下，所形成的PEG-rhngEPO的体外活性也较高。

PEG-rhngEPO/PEG-rhEPOm的理化性质和生物活性

本发明首次公开了PEG-rhEPO和PEG-rhEPOm的体外理化性质和生物活性数据，详见实施例3。

本发明发现，分子量为30kDa的大分子PEG与rhngEPO N-末端偶联后可以获得与天然Glycosylation(糖基化)EPO(rhEPO)完全一致甚或更优的理化性质，包括溶解性、热稳定性和抗酶解稳定性，这是此类PEG-rhEPO和PEG-rhEPOm分子具有体内外生物活性的基础之一。

表1  PE-N-30原液理化性质

本发明证实：用UT7细胞/MTT法同时测定PE-N-30、PE-N-20和rhEPO体外活性，发现PE-N-30和PE-N-20的体外活性均明显高于rhEPO，特别是PE-N-30的体外活性也明显高于普通rhEPO，这一结果令人意外、甚或异乎寻常，因为，通常认为大分子PEG的偶联会显著降低rhngEPO的活性，而糖链对rhEPO分子结构与功能甚为重要。但本发明的实验结果表明，单一、单链PEG分子与rhngEPO蛋白N-末端定点偶联时，在PEG的分子量大于rhEPO分子糖链分子量2倍以上时，所获PEG-rhngEPO的比活为2.94×10E6U/mg，明显高于rhEPO的比活1.92×10E6U/mg，提示在hEPO分子活性的保持上，PEG化明显优于糖基化。这意味着PEG单链对rhngEPO与hEPO受体结合的影响明显低于rhEPO分子上多位点糖链的影响。这也与通常认为的hEPO受体受正电荷分子介导的观点不一致(详见Elliott S，et al Mapping the active site of recombinant humanerythropoietin.Blood 1997；89：493-502)。

本发明的实验数据显示(详见表4)，EPO蛋白氮末端偶联PEG丙醛所获得的PE-N-10，PE-N-20，PE-N-30和PE-N-40其体外活性随着偶联PEG分子量的增大，体外活性具降低趋势；但与PE-N-30相比，PE-N-40的分子量增加了约30％，其体外活性却降低了2倍以上，出现明显的活性“拐点”。这同时提示，双链PEG(如40kDa PEG)对体外活性的影响大于单连PEG(如30kDa PEG)。因此，本发明确认，单链PEG-ALD偶联rhngEPO的N-末端氨基是首选的PEG偶联反应与位点。

PEG-rhngEPO和PEG-rhEPOm的药代动力学

本发明公开了一类同一偶联位点、相同偶联方式、不同分子量的PEG-rhngEPO分子，即PE-N-10、PE-N-20、PE-N-30和PE-N-40，大鼠体内血浆清除半衰期的测定结果，发现随着PEG分子量的增加，PEG-rhngEPO血浆半衰期的增加幅度，但在PE-N-30处出现“拐点”，即PE-N-40和PE-N-30相比半衰期仅增加了20％。进一步试验意外发现，大鼠尾静脉注射超大剂量PEG或PEG-rhngEPO ELISA法测定尿液中的PEG含量，注射PEG20和PE-N-20组可以测到相当数量的PEG经尿液排除，而注射PEG30，PEG40，PE-N-30和PE-N-40组可检测到的PEG含量明显降低。这样的结果超出了人们以往的认识和实验结果，通常认为：肾小球毛细血管壁分子过滤孔径为60-70kDa或3-5nm，而PEG分子拥有较球蛋白大得多的流体动力体积(hydrodynamic volume)，20kDa分子量的PEG的分子尺度(molecular size)可达7nm，远大于前述肾小球毛细血管壁分子过滤孔径，理论上注射PEG20和PE-N-20不应从肾脏清除，但采用敏感的抗PEG抗体ELISA法测定PEG的含量，却可检测到相当量的PEG从尿液排除；这同时可能是上述血浆清除半衰期在PE-N-30处出现“拐点”现象的解释。显然，这一发现对于开发长效制剂尤其具有意义和价值。

PEG-rhngEPO和PEG-rhEPOm的药效学与免疫原性

本发明公布实验结果显示(详见图18)，正常小鼠体内注射PE-N-301.5ug/kg×3次/周使红细胞压积增加的速度和幅度均明显高于相同剂量、相同给药方式的Darbepoetin，同时也高于注射较高剂量rhEPO(5ug/kg，3次/周)的体内活性数据，提示PE-N-30具较高的体内活性。

在正常小鼠每周给药一次的长效给药模式中，本发明提供的数据表明，注射同等剂量的(15ug/kg QW)PE-N-30使红细胞压积增加的速度和幅度均明显高于PE-N-20和PE-N-40；而且PE-N-30与每周给药三次、等剂量的rhEPO(5ug/kg TIW，相当于15ug/kgQW)的体内活性相当，这一结果出乎意料，因为目前已上市的PEG化长效制剂如Neulasta(PEG-rhG-CSF)和Pegasys(PEG-IFN alfa-2a)，其给药剂量均明显高于相应普通制剂如Filgrastim(rhG-CSF)和IFN alfa-2a连续应用的剂量，如Neulasta实现每化疗周期注射一次的长效给药模式用量为6mg/次，这一给药剂量相当于连续应用大剂量(5ug/kg/日，300ug/日/人)普通rhG-CSF十天之和的两倍(300ugX10＝3mgX2＝6mg)，这说明PE-N-30可能是更为有效的长效制剂，其临床用量有望进一步降低；同时提示上述PE-N-30在体外活性和体内药代动力学参数上所表现出的“拐点”现象，最终体现在PE-N-30动物体内活性的优势。

本发明还公开了上述PEG-rhngEPO和PEG-rhEPOm免疫原性的试验资料，在大鼠双肾2/3切除致慢性肾功能衰竭、肾性贫血的动物模型上，PE-N-20、PE-N-30和PE-N-40的免疫原性均明显低于Darbepoetin和rhEPO；而在半胱氨酸点突变位点偶联分子量为30kDa的单链PEG，如PE-K161C-30，PE-R131C-30等，其免疫原性也与PE-N-30相当。这些资料首次证实，大分子PEG长链在降低基因工程生产的EPO蛋白的免疫原性方面也明显优于糖链。

本发明中的rhngEPO/rhngEPOm还可有多种来源，除上述特别列举的大肠杆菌表达体系外，尚包括人工合成和各种其他原核细胞、真核细胞、昆虫、植物或动物表达体系；同时rhngEPO/rhngEPOm可以是全部的氨基酸序列组成的蛋白，也可以是经过突变的rhngEPO序列组成的rhngEPO变异体，甚或是部分氨基酸序列组成的rhngEPO类似物；但其唯一的特征是：体外活性等于或大于rhEPO；上述各种rhngEPO蛋白均在本发明所涉及的范围之内。

本发明所涉及的PEG-rhngEPO/PEG-rhngEPOm分子为临床药用制剂的有效成分，该制剂中还可能包括：稀释剂(diluents)、稳定剂(stabilizers)、防腐剂(preservatives)、溶解剂(solubilizers)、乳化剂(emulsifiers)、佐剂(adjuvants)和载体(carriers)等。例如：1)稀释液：Tris-HCL、磷酸、醋酸等缓冲液；2)pH值和离子强度；3)去污剂和溶解剂：聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80；4)充填剂(bulkingsubstances)：乳糖、甘露醇。详见Remington’s Pharmaceutical Science，18^thEd(1990，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.18042)Pages1435：1712。有效成分的有效剂量是指考虑体重、年龄等因素的有效的治疗或预防剂量。本发明所涉及的PEG-rhngEPO/PEG-rhngEPOm其有效剂量范围在0.1ug-100ug/kg体重/剂，较适合的有效剂量范围在0.5ug-50ug/kg/dose。

本发明所涉及的PEG-rhngEPO/PEG-rhngEPOm临床药用制剂，为长效、高效、低免疫原性制剂，通常每1-2周注射一针，或一个疗程应用一次；甚或可达3-4周的长效效果；PEG-rhngEPO/PEG-rhngEPOm临床药用制剂的应用间隔设计，还与应用的指征和病人的实际情况有关。PEG-rhngEPO/PEG-rhngEPOm临床药用制剂，可皮下、肌肉、静脉和腹腔内注射；也可经吸入、舌下或透皮给药。

本发明可应用于刺激红细胞的生成及纠正贫血，常见的指正包括：慢性肾功能不全所致的贫血、肿瘤化疗所致的贫血以及艾滋病化疗药如AZT所致的贫血，以及择期手术的自体输血、脑神经损伤的恢复等。

本发明所提供的资料和方法同样适用于其他细胞因子和抗体片段Fab’的长效、高效、低免疫原性制剂的开发，如重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、干扰素alfas和干扰素betas等等。

附图说明

图1：rhEPO表达重组质粒图谱。

图2：rhEPO含量检测SDS-PAGE结果。

图3rhngEPO蛋白复性液离子交换层析。

图4还原型SDS-PAGE法测定rhngEPO蛋白的分子量；其中：泳道1为标准蛋白分子量，泳道2，3为变性rhngEPO，泳道4，5为rhngEPO原液。

图5：rhngEPO原液反相HPLC分析结果；其中：色谱柱：Capcell Pak C18「4.6mmX250mm」。

图6：rhngEPO原液高效凝胶色谱分析结果；其中：色谱柱：Superdex 75「10mmX300mm」。

图7：rhngEPO原液荧光发射图谱分析结果。

图8：PEG-rhngEPO修饰反应混合物离子交换层析分离图谱。

图9：PE-N-30原液高效凝胶色谱分析结果；其中：色谱柱：Superdex 75「10mmX300mm」。

图10-A：2mg/ml PEG-rhngEPO 4℃下静置3月SEC测定结果。

图10-B：2mg/ml rhEPO 4℃下静置3月SEC测定结果；其中：图中“峰1”为rhEPO，所占峰面积的89.4％；“峰2”rhEPO聚集体，所占峰面积的10.6％。

图10-C：0.5mg/ml rhngEPO 4℃下静置2周SEC测定结果；其中：图中“峰1”为rhngEPO，所占峰面积的38.4％；“峰2”rhngEPO聚集体，所占峰面积的61.6％。

图11：PE-N-30，rhEPO和rhngEPO体外热稳定试验结果。

图12PE-N-30，rhEPO和rhngEPO体外酶解试验；其中：

▲PE-N-30；○rhEPO；●rhngEPO。

图13：rhngEPO与PE-N-30的圆二色谱图分析。

图14：UT7细胞/MTT法测定rhngEPO，PE-N-30和rhEPO活性比较；其中：

▲rhngEPO，●PE-N-30，○rhEPO。

图15CFU-E集落形成法测定rhngEPO，PE-N-30和rhEPO活性比较；其中：

▲rhngEPO，●PE-N-30，○rhEPO。

图16：PEG-rhngEPO分子量与大鼠血浆半衰期的关系。

图17：正常BLAB/C小鼠的体内活性比较；其中：

▲PE-N-30，

 Darbepoetin，□ rhEPO。

图18：不同分子量的PEG-rhngEPO在正常小鼠的体内活性比较。

具体实施方式

下面的实施范例有助于进一步阐述本发明，但本发明所涉及的内容与范围不仅限于这些范例所述。

实施例1 表达与制备rhngEPO及rhngEPOm

构建原核表达系统pET15b-rhngEPO高效表达rhngEPO：

1.菌株和质粒

大肠杆菌DH5α(E.coli DH5α LacZΔM15 hsdR recA)

大肠杆菌BL21(DE3)(E.coli BL21(DE3))

大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS(E.coli BL21(DE3)/pLys)

质粒pET15b

以上菌株和质粒均购自Novagen公司。

2.分子克隆用酶和试剂

限制性内切酶Nco I、Xho I；Pfu DNA聚合酶购自上海博亚生物试剂公司。

Agarose Gel DNA Purification Kit，T4连接酶，DNA Fragment Purification Kit购自OMEGA Ltd.。

核酸分子量标准1Kb Marker购自BioLab。

蛋白分子量标准(14.4-97.0kDa)购自上海生化所。

3.方法：

1)人促红细胞生成素(rhEPO)基因的合成

人EPO是一种对热和酸稳定的酸性糖蛋白，其前体由193个氨基酸组成。成熟的人EPO有166个氨基酸，2个二硫键，相对分子量18kDa。hEPO的cDNA序列如SEQID NO.2，其蛋白质一级结构的氨基酸序列如SEQID NO.3。天然人促红细胞生成素基因是哺乳动物基因，含有很多(约有25％)大肠杆菌的稀有密码子。从人组织中得到的天然EPO基因直接克隆于大肠杆菌，表达量很低，不能达到生产要求。在不改变hEPO蛋白序列的前提下，以已知的hEPO蛋白氨基酸序列(Genebank[gi：4503588])为基础，对hEPO碱基序列进行重新设计，将密码子全部换为大肠杆菌喜好的密码子，同时考虑到DNA二级结构及GC含量做适当的修改，使整个基因不含有稀有密码子。密码替换前后对照如表2中所示，替换后合成的编码序列如SEQID NO.4。由于大肠杆菌基因表达以甲硫氨酸起始，故SEQID NO.4比SEQID NO.3在N-端多一个甲硫氨酸，共167个氨基酸，蛋白的一级结构没有其他变化。合成的基因构建在pMD18-T载体上，载体转化到Top10菌株中保存。

表2h  EPO基因密码替换前后对照表

替换前

替换后    CATATG

替换前1   GCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAG

替换后1   GCCCCGCCGCGCCTGATCTGTGACAGCCGTGTCCTGGAGCGTTACCTGCTGGAGGCCAAG

替换前61  GAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAATATCACT

替换后61  GAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCGGAACACTGCAGCCTGAATGAGAATATTACT

替换前121 GTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCC

替换后121 GTCCCGGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGCGTATGGAGGTGGGTCAGCAGGCC

替换前181 GTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTG

替换后181 GTGGAAGTCTGGCAAGGTCTGGCCCTGCTGAGCGAAGCGGTCCTGCGTGGCCAGGCCTTA

替换前241 TTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAGCTGCATGTGGATAAAGCCGTCAGT

替换后241 CTGGTCAATAGCAGCCAGCCGTGGGAGCCGCTGCAGCTGCATGTGGATAAAGCCGTCAGC

替换前301 GGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCC

替换后301 GGCCTGCGTAGCCTGACCACCCTGTTACGTGCGCTGGGCGCCCAGAAGGAAGCCATCAGC

替换前361 CCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAA

替换后361 CCACCAGACGCCGCGAGTGCCGCCCCGCTGCGTACCATCACCGCGGACACCTTTCGCAAA

替换前421 CTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCC

替换后421 CTGTTCCGTGTCTACAGCAATTTCCTGCGTGGCAAGCTGAAGCTGTATACGGGCGAAGCG

替换前481 TGCAGGACAGGGGACAGATGA

替换后481 TGCCGTACCGGCGACCGTTAATAATAA

2)rhEPO基因的克隆

根据合成基因(rhEPO)的序列设计引物：

EPOsNcoIF：5’-ATTAATCCATGGCACCGCCGCGTCTGATTTGTGATAGC-3’(酶切位点NcoI)

EPOsXhoIR：5’-ACTTGCCTCGAGTTAACGGTCGCCGGTACGGC-3’(酶切位点Xho I)

以EPOsNcoIF为前引物，EPOsXhoIR为后引物，以pMD18-T/rhEPO为模板，利用PCR(聚合酶链式反应)体外扩增rhEPO序列。

PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)

10×缓冲液    5μl；

25mmol/L      MgCl₂ 4μl；

10mmol/L      四种dNTP混合液 1μl；

上下游引物各  1μl；

TaqDNA聚合酶  0.5μl；

模板DNA1μl，加水补至50μl；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60秒，54℃退火30秒，72℃延伸60秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。

电泳检测片段的大小。琼脂糖浓度为0.8％。

3)rhEPO表达重组质粒的构建

(1)酶切反应

将PCR得到片断和pET15b质粒利用Nco I、Xho I核酸内切酶进行双酶切消化。然后利用PCR产物回收试剂盒(购自OMEGA公司)回收纯化酶切的片段。

(2)连接反应

利用T4连接酶(购买于MBI公司)连接，反应组成体系为：

rhEPO基因片段：6μl

pET15b片断：2μl

连接液缓冲液(10X)：1μl

T4连接酶：1μl

连接反应在22℃下进行，反应时间为4小时，反应体系为10μl。经连接后得到重组环境诱导型表达质粒pET15b-rhEPO。

(3)感受态细胞的制备

取LB平板中的大肠杆菌DH5α，培养过夜；将培养过夜的大肠杆菌DH5α按照1％的接种量转入装有50ml LB的300ml的三角瓶中培养，于37℃、225转/分钟下培养至OD₆₀₀为0.4。停止培养，置冰上20分钟，4℃，4000转/分钟，离心10分钟，弃上清，加入冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液悬浮，冰上静置30分钟。离心浓缩。获得感受态细胞。放于-70℃保存。

(4)rhEPO表达重组质粒的验证扩增

将含有重组质粒pET15b-rhEPO的10μl的连接液加入100μl的DH5α感受态细胞中，混匀；置冰上30分钟；42℃热激90s，冰上静置2分钟，加入900μl的LB培养基，37℃，100转/分钟，培养1小时。将转化液涂布于含有质量体积比为1.5％的琼脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养16小时，挑取单菌落筛选转化子。

将单菌落挑取转入含有100微克/毫升的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，225转/分钟下培养过夜。利用质粒试剂盒提取重组质粒pET15b-rhEPO，验证质粒的大小。并用Nco I、Xho I核酸内切酶双酶切分析，筛选含有rhEPO基因片段的重组质粒转化子。

重组质粒图谱见图1。

4)rhEPO基因在大肠杆菌中表达。

将重组质粒pET15b-rhEPO按照常规方法转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。挑取LB平板中筛选后的阳性克隆，在无菌条件下用接种环接1～2环于5ml并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的发酵培养基中，37℃条件下，250转/分钟摇床振荡培养12小时，制得种子液；以1％～5％的接种量转接入装有50ml培养基的300ml三角瓶中。37℃剧烈振荡培养3h，使细菌处于对数生长中期，OD₆₀₀值约为0.8。从50ml对数生长期菌液中取1mL做对照，向其余菌液中加入1mol/L IPTG溶液，使其最终浓度为1mmol/L。加入IPTG后菌液继续培养1～4h，12000rpm离心10min，取上清与沉淀分别保存待用，最后离心收获细菌，检测目的蛋白的表达。

目的蛋白检测：

取1.5mL诱导的培养物，12000rpm离心30秒，弃上清；沉淀用PBS洗一次，加50μL灭菌双蒸水和50μL 2×SDS加样缓冲液，重悬沉淀，煮沸5-10分钟，10000rpm离心10min，取上清备用。

在浓缩胶进行8V/cm稳压电泳，当溴酚兰指示剂进入分离胶后改为15V/cm稳压电泳至溴酚兰带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色4小时以上，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。

SDS-PAGE结果见图2，EPO含量占菌体总蛋白的25％左右。

在严格无菌操作下，将rhngEPO大肠杆菌工程菌接种于LB/Amp(配方组成为100ml中含胰蛋白胨1克、酵母浸膏0.5克、氯化钠0.5克、氢氧化钠4毫克、琼脂粉1.5克和氨苄青霉素5毫克)，置37℃培养箱(SANYO MCO-17AIC)培养12-15小时，选取单一菌落，转接在12ml LB/Amp(配方组成为100ml中含胰蛋白胨1克、酵母浸膏0.5克、氯化钠0.5克、氢氧化钠4毫克和氨苄青霉素5毫克)培养管中，37℃ 250rpm振荡培养(HWY 111恒温摇床)12小时；取10ml发酵液转接在1000ml LB/Amp发酵液中摇瓶培养(37℃，250rpm振荡)8小时；再接种于15升发酵罐(B.Braun BIOSTAT C)中培养，每升发酵液含胰蛋白胨12克、酵母浸膏24克、磷酸二氢钾3.8克、磷酸氢二钾12.5克、硫酸镁0.5克、甘油6.3克、纯水0.9升、葡萄糖20克和氨苄青霉素0.1克；设发酵参数为温度37℃、pH7.0、溶氧35％及搅拌转速与溶氧联动。当OD₆₀₀值达20时，为工程菌对数增长的中期，加入IPTG诱导，持续2小时后终止发酵。冷却发酵液，使其降温至4-8℃。采用Sorvall大容量低温冷冻低速离心机(Sorvall RC3B)离心(4000rpm，30分钟)收集细菌。

向收集的工程菌菌体沉淀中加入工程菌破碎缓冲液(50mM Tris，1mM EDTA，pH7.5缓冲液)。经APV高压匀浆机(APV 2000)10000psi压力下破碎菌体。破菌后液体经高速冷冻离心机(Sorvall RC5B)SLA-3000转头11000rpm转速离心(4℃，20分钟)获得包涵体(IB)粗品。使用包涵体洗涤液(50mM Tris，1mM EDTA，pH7.5，2.5％曲拉通×100，0.15M NaCl)三遍，与包涵体充分混合，再经低温(4℃)高速离心(SorvallRC5B，11000rpm，50分钟)收集包涵体，完成包涵体洗涤与纯化。将已纯化的包涵体按10克湿重比500毫升的比例溶解于包涵体溶解变性液中(50mM Tris，1mM EDTA，8M盐酸胍，1mM二巯基赤藓醇)，4℃，12小时，获得包涵体溶解变性液，离心40分钟(SorvallRC5B，11,000rpm)，收取上清。

按1：100体积比将包涵体溶解变性液缓慢加入20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)，150mM氯化钠，3M尿素，0.005％聚山利醇酯80(polysorbate 80)复性溶液中，4℃静置24小时，经0.45μm孔径滤膜过滤后，进行蛋白质提纯。

rhngEPO蛋白复性液经过离子交换层析(层析设备AKTA purifier，层析住INdEX200/500，层析介质Sepharose Fast Flow/XL)，平衡缓冲液为20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)，150mM氯化钠，0.005％聚山梨醇酯80；用0～1M氯化钠梯度洗脱，分离结果如图3所示，收集A280蛋白洗脱峰液。用上述平衡缓冲液平衡凝胶层析柱(层析柱BPG100，层析介质Superdex 75 prep grade)，按30ml/分钟的流速上样，每次上样持续5分钟(上样量约150ml)，上样120分钟后，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为rhngEPO原液。

rhngEPO原液经检定，其理化性质如表3所示。

表3  rhngEPO原液理化性质

还原型SDS-PAGE测定rhngEPO分子量(如图4)，以及高效液相色谱(HPLC)法、高效凝胶色谱法(SEC)和荧光发射图谱分析法测定rhngEPO原液，结果如图5，图6和图7所示，方法同实施例3所述方法相同。结果表明rhngEPO的分子量约为20kDa；而rhngEPO原液HPLC和SEC纯度均大于98％；荧光发射图谱分析表明rhngEPO原液与复性前包含体rhngEPO蛋白峰型完全不同，提示两者二级结构上的明显改变。

实施例2 制备单一定点的PEG-rhngEPO及PEG-rhngEPOm

上述rhngEPO原液经超滤浓缩(Satorius，Vivaflow/200切向流超滤器膜包)，使蛋白浓度达2mg/ml。

将750mg分子量为30kDa的PEG丙醛(PEG-ALD)(购自日本油脂公司，SUNBRIGHTME-300AL)溶解于30ml、2mg/ml的rhngEPO原液(20mM醋酸钠缓冲液，pH6.0，150mM氯化钠)中，再加入浓度为7.5mg/ml的硼氰化钠(NaCNBH₃)1.4ml，反应液于4℃下，搅拌1小时后，静置24小时，加入1mM稀盐酸溶液(pH3.5)300ml。用缓冲液，即20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)，150mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯80溶液，平衡阳离子交换层析柱(AKTA purifier，层析住INdEX 200/500，层析介质Sepharose Fast Flow/XL)，按50ml/分钟流速连续上样PEG-rhngEPO反应液，经0～1M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280d蛋白洗脱峰液，分离结果如图8所示；用上述平衡缓冲液平衡凝胶层析柱(层析柱BPG100，层析介质Superdex 75 prep grade)，按30ml/分钟的流速上样，每次上样持续5分钟(上样量约150ml)，上样约100分钟后，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为蛋白N-末端、30kDaPEG单一修饰的PEG-rhngEPO(简称PE-N-30)原液，其高效凝胶色谱纯度分析结果如下图9。

实施例3 PEG-rhngEPO的理化性质与体外活性

1)PE-N-30的溶解性

实验表明，在20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)，150mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯80溶液中PE-N-30和rhEPO的蛋白浓度可达2mg/ml，并在4℃下保持3个月，经SEC测定：PE-N-30在此条件下未发现蛋白聚集或降解(如图10-A所示)，rhEPO在此条件下出现少量蛋白聚集，为可溶性聚集体(如图10-B所示)；而在上述同样的缓冲液条件下，rhngEPO蛋白的浓度为0.5mg/ml时，置4℃下静放2周，经SEC测定即发现蛋白聚集(如图10-C所示)，说明PEG化rhngEPO明显增加了蛋白的溶解性或在水中的稳定性。

2)PE-N-30的体外热稳定性

将浓度为100ug/ml的PE-N-30，rhEPO和rhngEPO溶液(20mM醋酸钠缓冲液，pH6.0，150mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯80)置于50℃水浴池内持续15分钟后，取样测体外活性，方法如下“5)”所述，结果表明：PE-N-30和rhEPO体外活性没有改变，而rhngEPO的体外活性明显下降，仅为原活性的11％，如图11所示。

3)PE-N-30体外抗酶解稳定性

用超纯水透析待测样品24小时，冻干(冷冻干燥机，Alphal-2，Matin Christ，USA)待测样品后，用1％碳酸氢铵水溶液溶解致1.5mg/ml，按1：25(w/w)加入TPCK处理过的胰蛋白酶(TPCK treated TRYPSIN，Sigma，USA)与待测样品PE-N-30，rhEPO和rhngEPO在37℃恒温下共同孵育，分别在30、60、120和240分钟取样，SDS-PAGE法测原蛋白酶解百分比，结果如图12所示，结果表明，酶解4小时后，PE-N-30，rhEPO和rhngEPO分别尚有80％，35％和20％的蛋白残留，说明PE-N-30抗酶解能力最强。

4)PE-N-30的二级结构圆分析

待测样品经G-25凝胶层析柱(GE Healthcare，USA)脱盐置换到20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.5)，调节蛋白浓度致0.2mg/ml。按规程操作圆二色光谱仪(Jasco-810Spectropolarimeter，Jasco，Tokyo，Japan)，设置参数：sensitivity：100mdeg，bandwidth：1.0nm，rosolution：0.5nm，response：0.5sec，accumulation：4，scanspeed：500nm/min。测定结果如图13所示。结果表明，PE-N-30与rhngEPO的圆二色谱图形几乎完全吻合，提示rhngEPO蛋白分子的氮末端偶联30kDa分子量的PEG可以很好地保持其二级结构。

5)PE-N-30的体外细胞活性

采用两种体外细胞学EPO活性测定方法，即UT7细胞/MTT法和骨髓红系集落形成单位活性测定法(CFU-E colony-forming activity)，测定并比较了rhEPO，rhngEPO和各种PEG-rhngEPO的体外活性，结果如表4和图14，图15所示。

UT7细胞/MTT法：详细方法见Boissel JP et al.J Biol Chem.1993；268：15983-15993。UT7细胞购自美国ATCC，测活前用PBS缓冲液清洗UT7细胞三遍，在含10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺的IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)培养基中培养24小时。清洗细胞，用含10％FBS、50U/mL青霉素、50ug/mL链霉素和2mM谷氨酰胺的IMDM调整细胞浓度达1 X 10⁵个/mL，待测样品用上述培养基溶液稀释，进行三倍系列稀释，每一稀释浓度做三孔，每孔加入50uL，取50uL细胞悬液(5X 10³个细胞)加入各孔中，置37℃、5％二氧化碳培养45-48小时，每孔加入20uL噻唑蓝试剂(MTT试剂，Sigma，USA)，继续培养3-6小时，离心弃上清；每孔加入100uL裂解液(由盐酸14ml、Triton X-100溶液50mL加异丙醇致500mL制成)，混匀后，放入酶标仪(Bio-Tek公司，USA)，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度值。

CFU-E集落形成活性测定法：详细方法见Higuchi M，et al.J Biol Chem1992；267(11)：7703-7709。在严格无菌操作下，取BLAB/C小鼠后肢股骨骨髓，经一系列处理与洗涤获骨髓细胞，将1mL基础培养基(含30％FBS、0.9％甲基纤维素、1％牛血清白蛋白和0.1mM 2-巯基乙醇，购自美国Sigma)中10⁵细胞加入35mm直径的细胞培养皿中，待测样品稀释后，进行2倍系列稀释，每一稀释浓度做2个平皿，每个平皿加入100uL，充分混合后置37℃、5％二氧化碳培养48小时。在倒置显微镜下计数骨髓红系集落形成单位(CFU-E集落)个数(每个集落需含8个以上细胞，并符合CFU-E集落特征)。

表4  EPO体外活性测定结果

从表4中可以看到：rhngEPO比rhEPO的体外活性高近三倍；EPO蛋白氮末端偶联PEG丙醛所获得的PE-N-10，PE-N-20，PE-N-30和PE-N-40其体外活性随着偶联PEG分子量的增大，体外活性具降低趋势，且PE-N-40的体外活性的降低尤为显著，较PE-N-30体外活性降低2倍以上，出现明显的活性“拐点”，而PE-N-10、PE-N-20和PE-N-30的体外活性相差在30％之内，且均较高糖基化的EPO Darbepoetin体外活性为高。偶联两个20kDa PEG的di-PE-40其体外活性显著低于同等分子量的PE-N-40；而PE-K116C-30和PE-R131C-30的体外活性与PE-N-30相差不大。

从图14和15中结果表明：rhEPO、rhngEPO和PE-N-30的比活分别为1.92 X10E6U/mg，3.50 X10E6U/mg和2.90 X10E6U/mg。rhngEPO的活性较普通糖基化的EPO(rhEPO)活性高近3倍，PE-N-30的活性也明显高于普通rhEPO。

实施例4 PEG-rhng-EPO药代动力学试验

选健康SD大鼠进行药代动力学试验，经尾静脉注射10ug/kg的rhEPO、Darbepoetin和各种PEG-rhngEPO，在0，15min，30min，1，3，5，8，24，48，72，96小时取血，每种化合物每一取血时间点同时取三只动物，ELISA法(DEP00，美国R&D公司)测定血药浓度，每种待测样品在动物试验前均应行敏感度、精确性和线性范围的体外测试，并作出相应的标准曲线，测定结果经计算获得血浆清除半衰期值，如下表5所示。

表5  大鼠静脉注射各种rhEPO化合物的血浆半衰期

进一步比较静脉注射PE-N-10，PE-N-20，PE-N-30和PE-N-40在健康大鼠的血浆半衰期发现，在PE-N-30血浆半衰期出现“拐点”，即此点PEG分子量的增加带来的血浆半衰期的增长比例明显降低，如PEG的分子量从10kDa增到20kDa和从20kDa增到30kDa，PE-N-20或PE-N-30的血浆半衰期都增加了一倍左右，而PEG的分子量从30kDa增到40kDa，PE-N-40的血浆半衰期却仅增加了约20％。如图16所示。

选健康Wistar大鼠36只，随机分为6组，尾静脉分别注射PEG20，PEG30，PEG40，PE-N-20，PE-N-30和PE-N-40 40,000ug/kg，每隔6小时收取动物尿液，-20℃保存，使用抗PEG ELISA试剂盒(Epitomics公司，USA)测定尿液中的PEG含量，结果如下表6所示。抗PEG ELISA试剂对上述各种PEGs和PE-Ns的检测敏感度大于1ng/ml，在500ng/ml～1ng/ml之内，PEG浓度对数与吸光值对数呈直线相关。

表6  ELISA法动物尿液PEG含量测定结果(X±s，n＝6)(ng/ml)

*与PEG30，PEG40，PE-N-30和PE-N-40各组值相比差别显著(P<0.05或P<0.01)

表6的结果提示，当PEG的分子量大于30kDa以上后，PEGs和PEG-rhngEPO从肾小球毛细血管壁的通透性显著降低，因此PE-N-30出现药代动力学参数的“拐点”。

实施例5 PEG-rhng-EPO的药效学与免疫原性试验

药效学试验

正常BLAB/C小鼠32只，分别注射PE-N-30 1.25ug/kgX3次/周，Darbepoetin1.25ug/kgX3次/周、rhEPO 5.0ug/kgX3次/周和等体积制剂配方液(3次/周)，结果如图17所示。

结果表明，PE-N-30使红细胞压积增加的速度和幅度均明显高于darbepoetin和rhEPO；Darbepoetin 1.25ug/kgX3/周的药效与rhEPO 5.0ug/kgX3/周相当；PE-N-30具体内药效学长效性和高效性特征。

健康BLAB/C小鼠60只，随机分为5组，尾静脉分别注射rhEPO 5ug/kg3次/周(TIW)，或PE-N-20，PE-N-30和PE-N-40 15ug/kg/周(QW)，或PBS 3次/周(TIW)；分别在第0天(注射前)和注射后3，5，10，13，17，20，23，27，30，34，38，42天抽血测红细胞压积(Haematocrite％)，结果如图18所示

结果表明，注射同等剂量的(15ug/kg QW)PE-N-30使红细胞压积增加的速度和幅度均明显高于PE-N-20和PE-N-40，且与每周给药三次、等剂量的rhEPO(5ug/kg TIW)活性相当。提示上述PE-N-30在体外活性和体内药代动力学参数上所表现出的“拐点”现象，最终体现在PE-N-30动物体内活性的优势。

免疫原性试验

在SD大鼠双肾2/3切除(切除一侧肾脏及另一侧肾脏的上、下两级部分)致慢性肾功能衰竭、肾性贫血的动物模型上，受试化合物(每组15只大鼠)按每周注射一次、每次1ug/kg的给药模式，连续给药、观察12周，于第1周和第8，10，12周抽血测定RBC和抗EPO抗体(美国R&D公司)，结果如表7所示(详细方法见Tillmann HC，et al：Kidney International 2006；69：60-67)。

表7  大鼠连续应用各种PEG-rhng-EPO的免疫原性比较

表7的结果表明：

1)PE-N-20，PE-N-30，PE-N-40的免疫原性低于rhEPO和Darbepoetin；而PE-N-20，PE-N-30，PE-N-40的免疫原性相当；

2)点突变的EPO分子若其突变点氨基酸偶联30kDa的PEG，则其免疫原性与PE-N-30相当，PE-K116C-30和PE-R131C-30与PE-N-30的免疫原性无显著性差别。

序列表

<110>天津派格生物技术有限公司

<120>聚乙二醇化红细胞生成素蛋白长效制剂

<141>2008-10-7

<160>4

<210>1

<211>167

<212>PRT

<213>人促红细胞生成素

<221>rhngEPO或rhngEPOm的氨基酸序列公式

<222>(1)…(167)

<400>1

<210>2

<211>501

<212>DNA

<213>人促红细胞生成素

<221>天然编码人促红细胞生成素基因

<222>(1)…(501)

<400>2

<210>3

<211>166

<212>PRT

<213>人促红细胞生成素

<221>天然人促红细胞生成素氨基酸序列

<222>(1)…(166)

<400>3

<210>4

<211>504

<212>DNA

<213>人促红细胞生成素

<221>编码人促红细胞生成素基因

<222>(1)…(504)

<400>4

Claims (10)

1.一类聚乙二醇化红细胞生成素，由非糖基化的rhEPO(rhngEPO)或其点突变体(rhngEPOm)与单一、单链的、分子量大于20kDa的PEG分子以N-末端氨基或半胱氨酸突变点的巯基定点偶联而成；其特征在于：所述聚乙二醇化红细胞生成素的分子结构式为：CH₃-(CH₂CH₂-O)n-(CH₂)r-NH-rhngEPO或CH₃-(CH₂CH₂-O)n-X-S-rhngEPOm，式中n为100～2200，r为0～4，X为S或C；其中用于与rhngEPO或rhEPOm偶联的PEG为甲氧基化PEG，即mPEG，其分子式为：CH₃-(CH₂-CH₂-O)n-CH₂-CH₂-OH，n为100～2200；所述rhngEPO或rhngEPOm的氨基酸序列应符合SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列公式；其中所述rhngEPOm具备仅包含一个点突变位点且这一位点同时用于定点偶联PEG分子，并rhngEPO或rhngEPOm蛋白同时具备经UT7细胞/MTT法体外活性测定比活大于或等于rhEPO的比活；同时所述聚乙二醇化红细胞生成素还应具备下列特征：

1)mPEG的分子量大于20kDa；

2)mPEG是单链PEG，与rhngEPO或rhngEPOm偶联的分子比列为1：1，且为单一位点偶联；

3)在体外热稳定性中，以50℃恒温处理PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm 15分钟，取样测体外细胞活性，活性应保持不变；

4)在体外抗酶解试验中：将胰蛋白酶与PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm在37℃共同孵育4小时，取样经SDS-PAGE法测定，PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm的酶解百分比应低于50％；

5)PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm的比活性应大于或等于1.5X10E6U/mg蛋白；

6)PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm的血浆半衰期应比rhEPO的血浆清除半衰期大2倍以上；

7)在免疫原性测定中，PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm在第12周EPO抗体阳性率应小于20％。

2.如权利要求1所述的聚乙二醇化红细胞生成素，其特征在于：所述n为450～1000；所述mPEG的分子量为20kDa～40kDa。

3.如权利要求2所述的聚乙二醇化红细胞生成素，其特征在于：所述n为700±100；所述mPEG的分子量为30kDa。

4.如权利要求1所述的聚乙二醇化红细胞生成素，其特征在于：所述用于N-末端PEG化修饰的mPEG为mPEG-醛，即mPEG-ALD，其分子式为：mPEG-(CH₂)r-CHO，其中r为1～3；mPEG-ALD与rhngEPO偶联后的产物为PEG-rhngEPO，其分子式为：CH₃-(CH₂-CH₂-O)n-(CH₂)r-NH-rhngEPO；其中n为100～2200，r为1～3。

5.如权利要求4所述的聚乙二醇化红细胞生成素，其特征在于：所述n的范围为450～1000，r的范围为2～3。

6.如权利要求1所述的聚乙二醇化红细胞生成素，其特征在于：所述用于与N-末端半胱氨酸突变体偶联的mPEG为mPEG-邻位吡啶硫代酯，即mPEG-OPTE；mPEG-OPTE与rhngEPO-M162～166C偶联产物为PEG-rhngEPOm，其分子式为：

CH₃-(CH₂-CH₂-O)n-(CH₂)r-CO-SS-rhngEPOm，其中，n为100～2200，r为0～2。

7.如权利要求1所述的聚乙二醇化红细胞生成素，其特征在于：所述用于与点特异性半胱氨酸突变体偶联的mPEG为mPEG-马来酰亚胺，即mPEG-MAL；或mPEG-邻位吡啶硫酯，即mPEG-OPSS；mPEG-MAL或mPEG-OPSS与rhngEPOm偶联后产物为PEG-rhngEPOm，其分子式为：CH₃-(CH₂-CH₂-O)n-X-S-rhngEPOm，其中X为S或C，n为100～2200。

8.如权利要求1所述的聚乙二醇化红细胞生成素，其特征在于：所述SEQ ID NO.1所示的rhngEPO或rhngEPOm的氨基酸序列公式中，-5 Xaa缺失或是Met或Cys，即rhngEPO-162或rhngEPO-M162C；-4 Xaa缺失或是Met或Cys，即rhngEPO-163或rhngEPO-M163C；-3 Xaa缺失或是Met或Cys，即rhngEPO-164或rhngEPO-M164C；-2 Xaa缺失或是Met或Cys，即rhngEPO-165或rhngEPO-M165C；-1 Xaa缺失或是Met或Cys，即rhngEPO-166或rhngEPO-M166C；115～132位均能分别是目前的氨基酸序列或者在任何一位点上氨基酸突变为Cys，即rhngEPO-X115～132C，其中X为Gln、Gln、Lys、G1u、Ala、Ile、Ser、Pro、Pro、Asp、Ala、Ala、Ser、Ala、Ala、Pro、Leu或Arg；如rhngEPO-K116C或rhngEPO-R131C是分别在第116或131位点进行Cys点突变的突变体。

9.如权利要求1所述的聚乙二醇化红细胞生成素，其特征在于：所述聚乙二醇化红细胞生成素是PE-N-30、PE-N-20、PE-166-N-30、PE-165-N-30、PE-166-N-20、PE-165-N-20、PE-K116C-30或PE-R131C-30分子。

10.用于治疗慢性肾功能不全所致贫血、肿瘤及艾滋病化疗所致的贫血、脑脊髓神经损伤以及择期手术自体输血的胃肠外长效制剂，其中含有治疗有效量的权利要求1所述聚乙二醇化红细胞生成素和药学上可接受的载体。

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