CN103467591A

CN103467591A - 一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法

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Publication number: CN103467591A
Application number: CN2013103941816A
Authority: CN
Inventors: 刘芃实; 贺永山; 卡特琳娜·阿尔瓦斯; 刘长春
Original assignee: CHANGCHUN HAIBOER BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHANGCHUN HAIBOER BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-09-03
Filing date: 2013-09-03
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-03
Also published as: CN103467591B

Abstract

本发明公开了一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，其包括以下步骤：将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH值为4.5的10mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液；将所述偶联反应液通过离子交换层析分离得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤系统进行置换缓冲系统的处理，将其置于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白。大幅度增加了修饰效率，实现了蛋白质药物性能的改善，本发明通过特定的偶联反应工艺，有利于偶联产物的后续提纯，提高了目标产品回收率，降低了聚乙二醇干扰素的制造成本。

Description

一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法。

背景技术

干扰素（英文名称为interferon，简称为IFN）是一种由人体细胞分泌的在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性,其活性发挥受细胞基因组的调节和控制并涉及RNA和蛋白质的合成。

目前，干扰素是应用广泛且临床效果显著的治疗性药物，其广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能，在病毒性疾病治疗中有不可取代的作用，但普通干扰素用于临床治疗时，通常为胃肠外给药，体内药物代谢的半衰期短,免疫原性强，导致给药间隔短，给药频度高，人体内产生抗体也导致药效降低，难以达到较理想的临床效果。近年来，聚乙二醇修饰技术有效地解决了蛋白质药物的此类缺陷。聚乙二醇（英文名称为interferon，简称为PEG)是一种惰性无毒、可生物降解的有机多聚物，在生物技术和制药领域有着广泛的用途，聚乙二醇修饰技术就是通过共价结合将聚乙二醇连接到活性蛋白质上，蛋白质药物经聚乙二醇化后，空间结构发生改变。聚乙二醇具有空间位阻，将蛋白质表面的抗原决定簇掩盖起来，使蛋白质分子不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，抑制相应的免疫反应。另外，蛋白质化学修饰之后，修饰剂与蛋白质分子偶联，使得蛋白质的分子量增大，空间结构发生改变。当修饰后的蛋白质分子量达到或超出肾小球滤过作用的阈值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球滤过作用，因而可以在血液循环中停留更长的时间。

蛋白质药物的聚乙二醇化已经成为蛋白类药物的发展方向，虽然通过聚乙二醇对蛋白质药物进行修饰可以获得种种优点，但是蛋白质药物修饰是一个复杂的过程，很多因素对蛋白质的化学修饰反应会造成较大的影响。包括修饰剂的选择、修饰反应的条件、修饰后是否易于分离、纯化等等。因此对某一种药物而言, 有必要建立其聚乙二醇修饰的最优化方法。现有技术中对干扰素的聚乙二醇修饰，反应后目标产物的回收率较低，成本较高，很难广泛地进行临床应用。

因此，现有技术还有待于更进一步的改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，通过优化聚乙二醇修饰蛋白质的偶联条件,包括pH、温度、反应介质、反应物配比等,提高偶联效率，易于后续产物的分离纯化，降低生产成本。

本发明的技术方案如下：

一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，其包括以下步骤：

A、将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH值为4.5的10 mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液；

B、将所述偶联反应液通过离子交换层析分离得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤进行置换缓冲系统的处理，将其置换于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白。

所述的偶联方法，其中，在所述步骤A之前还包括：将重组人干扰素原液通过切向流超滤系统浓缩至蛋白浓度为2.0 -10.0 mg/ml，再用50mM的硼酸盐缓冲液渗滤，得到所述重组人干扰素浓缩液。

所述的偶联方法，其中，所述步骤A具体的包括：

将所述活化聚乙二醇溶解于冷却至2℃-8℃的乙腈溶液中，使其终浓度为40-80 mg/ml，使所述活化聚乙二醇的量为所述重组人干扰素浓缩液蛋白总量的2-8倍；所述偶联反应在碱性条件下进行。

所述的偶联方法，其中，所述步骤B具体的包括：以2-6倍的醋酸钠缓冲液平衡上样后的离子交换层析柱，再以含20 mM -80mM氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，根据紫外检测仪分段收集洗脱峰，以SDS-PAGE电泳法检测纯度，得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素。

本发明提供了一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，以乙腈代替了传统工艺中的盐酸作为活化聚乙二醇的溶解剂，活化聚乙二醇在有机溶剂中更为稳定，可增加活化基团与蛋白质氨基的作用，提高偶联效率与目标产物回收效率；其二，偶联反应的PH环境采用碱性条件反应，在不同pH条件下，蛋白的电荷性质不同，导致亲核反应的能力有差别，使得聚乙二醇修饰的特异性发生变化，在碱性条件下反应，大幅度增加了修饰效率，实现了蛋白质药物性能的改善，其三，反应温度2-8℃，低温条件下反应，有利于保留蛋白活性，其四，PEG用量的选择，PEG用量越大，修饰率和修饰多态性越高，一般增加PEG分子量可延长药物的循环半衰期，但除个别蛋白的PEG修饰对蛋白质活性影响不大外，大多数蛋白质的活性随着修饰PEG数目和分子量的增加而降低，因此在修饰率、修饰多态性、活性保留率和成本之间需寻求平衡点;本发明通过特定的偶联反应工艺，有利于偶联产物的后续提纯，提高了目标产品回收率，降低了聚乙二醇干扰素的制造成本。

附图说明

图1为本发明中偶联方法的流程示意图；

图2为本发明中实施例1、实施例2、实施例3与实施例4各自得到之聚乙二醇干扰素的电泳检测图谱；

图3为本发明中得到之聚乙二醇干扰素的同分异构体分析图谱。

图4为本发明中实施例1、实施例2、实施例3与实施例4各自得到之聚乙二醇干扰素的偶联率对比图，其中，图中第1-4道分别是：实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、 PEG IFN对照及分子量标准；

图5 为聚乙二醇干扰素a2b原液检测结果；

图6 为聚乙二醇干扰素a2b的偶联率检测结果；

图7 为聚乙二醇干扰素a2b的收获率检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，如图1所示的，其包括以下步骤：

步骤101：将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH值为4.5的10 mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液；

步骤102：将所述偶联反应液通过离子交换层析分离得到纯度≥95%的单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤进行置换缓冲系统的处理，将其置换于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白。

更进一步的，在所述步骤101之前还包括：将重组人干扰素原液通过切向流超滤系统浓缩至蛋白浓度为2.0 -10.0 mg/ml，再用50mM的硼酸盐缓冲液渗滤，得到所述重组人干扰素浓缩液。

在本发明的另一较佳实施例中，所述步骤101具体的包括：

将所述活化聚乙二醇溶解于冷却至2℃-8℃的乙腈溶液中，使其终浓度为40-80 mg/ml，使所述活化聚乙二醇的量为所述重组人干扰素浓缩液蛋白总量的2-8倍；所述偶联反应在碱性条件下进行。以乙腈代替了传统工艺中的盐酸作为活化聚乙二醇的溶解剂，活化聚乙二醇在有机溶剂中更为稳定，可增加活化基团与蛋白质氨基的作用，提高偶联效率与目标产物回收效率，尤其是在2℃-8℃的低温条件下反应，有利于保留蛋白活性，实现了修饰率、修饰多态性、活性保留率和低生产成本之间的平衡。

更进一步的，所述步骤102具体的包括：以2-6倍的醋酸钠缓冲液平衡上样后的离子交换层析柱，再以含20 mM -80mM氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，根据紫外检测仪分段收集洗脱峰，以SDS-PAGE电泳法检测纯度，得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素。

为了更进一步的描述本发明的方法，以下列举更为详尽的实施例进行说明。

实施例1

重组人干扰素α2b浓缩液的制备

取重组人干扰素α2b原液4500ml，蛋白浓度1.02mg/ml，通过切向流超滤（过滤膜包截留分子量10KD）浓缩至蛋白浓度3.0 mg/mL，再用0.05M的硼酸缓冲液(Ph 8.00)渗滤，最后将浓缩后的重组人干扰素α2b蛋白等体积置换于0.05M的硼酸缓冲液中，得到所述重组人干扰素α2b浓缩液。

偶联反应液的制备：

按1：5的质量比将重组人干扰素α2b浓缩液加入溶解于乙腈溶液中的PEG中，在2℃-8℃条件下充分反应6小时，以10倍体积的pH为4.5的10 mM的醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液。

聚乙二醇干扰素a2b的制备

将偶联反应液上离子交换层析柱（ EMD COO^-- 650 (M)），以10 mM醋酸钠缓冲

液(pH 4.5)流洗平衡至基线平稳，分别以含0.05-0.1M NaCl的10 mM,醋酸钠缓冲液(pH 4.5)洗脱，根据紫外检测仪分段收集洗脱峰，以SDS-PAGE电泳法检测纯度，纯度≥95%的单体聚乙二醇干扰素a2b混合后以通过切向流超滤（过滤膜包截留分子量30KD），将蛋白置换于0.1M磷酸钠缓冲液中。最终得到聚乙二醇干扰素a2b。

实施例2

重组人干扰素α2b浓缩液的制备

取重组人干扰素α2b原液4820ml，蛋白浓度0.95mg/ml，通过切向流超滤（过滤膜包截留分子量10KD）浓缩至蛋白浓度5.0 mg/mL，再用0.05M的硼酸缓冲液(pH 8.00)渗滤。最后将浓缩后的重组人干扰素α2b蛋白等体积置换于0.05M的硼酸缓冲液中，得到所述重组人干扰素α2b浓缩液。

偶联反应液的制备：

按1：4的质量比将重组人干扰素α2b浓缩液加入溶解于乙腈溶液中的PEG中，，在2℃-8℃条件下充分反应6小时，以20倍体积的pH为4.5的10 mM的醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液。

聚乙二醇干扰素a2b的制备

将所述偶联反应液通过（ EMD COO^-- 650 (M)）离子交换层析柱，以10 mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)流洗平衡至基线平稳，再以含0.05-0.1M氯化钠的醋酸钠缓冲液在pH 4.5的条件下洗脱，根据紫外检测仪分段收集洗脱峰，以SDS-PAGE电泳法检测纯度，纯度≥95%的单体聚乙二醇干扰素a2b混合后以通过切向流超滤（过滤膜包截留分子量30KD），将蛋白置换于0.1M磷酸钠缓冲液中。最终得到聚乙二醇干扰素a2b。

实施例3

重组人干扰素α2b浓缩液的制备

取重组人干扰素α2b原液5000ml，蛋白浓度0.92mg/ml，通过切向流超滤（过滤膜包截留分子量10KD）浓缩至蛋白浓度5.0 mg/mL，再用0.05M的硼酸缓冲液(Ph 8.00)渗滤，最后将浓缩后的重组人干扰素α2b蛋白等体积置换于0.05M的硼酸缓冲液中渗滤，得到所述重组人干扰素α2b浓缩液。

偶联反应液的制备：

按1：3的质量比将重组人干扰素α2b浓缩液加入溶解于乙腈溶液中的PEG中，在2℃-8℃条件下充分反应6小时，以10倍体积的pH为4.5的10 mM的醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液。

聚乙二醇干扰素a2b的制备

将所述偶联反应液通过（ EMD COO^-- 650 (M)）离子交换层析柱，以pH为4.5的10 mM的醋酸钠缓冲液流洗平衡至基线平稳，再以含0.05-0.1M氯化钠的醋酸钠缓冲液在pH值为4.5的条件下洗脱，根据紫外检测仪分段收集洗脱峰，以SDS-PAGE电泳法检测纯度，纯度≥95%的单体聚乙二醇干扰素a2b混合后以通过切向流超滤（过滤膜包截留分子量30KD），将蛋白置换于0.1M磷酸钠缓冲液中。最终得到聚乙二醇干扰素a2b。

实施例4

实施例4为现有技术中聚乙二醇干扰素α2b的制备流程。

取重组人干扰素α2b原液5000ml，蛋白浓度0.95mg/ml，加入10倍体积的pH9.0的50mM硼酸盐缓冲液。通过切向流超滤（过滤膜包截留分子量10KD）浓缩至蛋白浓度10.0 mg/mL，

按重组人干扰素α2b与活化聚乙二醇摩尔比为1：3的比例称取适量的活化聚乙二醇，溶解于2mM 的HCl中，加入重组人干扰素α2b浓缩液，反应2小时，用冰醋酸调节pH至pH4.5终止该反应。用灭菌注射用水稀释10倍。

将上述反应液通过离子交换层析柱（CM SePharose FF）以20 mM醋酸钠缓冲液(pH 4.4)流洗平衡至基线平稳；分别以含0.2-0.8M氯化钠的20 mM,醋酸钠缓冲液(pH 5.0)洗脱，根据紫外检测仪收集0.75MNaCl洗脱峰，以SuperdexS-300对聚乙二醇干扰素α2b进一步纯化，洗脱液为0.2 M醋酸钠缓冲液(pH 6.0)，收集聚乙二醇干扰素α2b洗脱峰，SDS-PAGE电泳法检测纯度，得到聚乙二醇干扰素a2b。

将实施例1、实施例2、实施例3获得之聚乙二醇干扰素蛋白及实施例4获得之现有技术中聚乙二醇干扰素α2b蛋白进行检测，对终产品分别进行蛋白含量、电泳纯度、生物活性、同分异构体、游离PEG含量的检测，其具体的如图2、图3所示的。同时再取偶联后样品进行偶联率的测定，根据中国药典三部，蛋白含量以微量法(Lowry法)进行，生物活性以细胞病变抑制法（Wish-VSV系统）进行，以 SDS-PAGE电泳法检测纯度，浓缩胶5%、分离胶10%，并以SDS-PAGE电泳碘染法检测游离PEG含量，HPLC法检测同分异构体。将检测结果列于图5、图6以及图7，图5 为聚乙二醇干扰素a2b原液检测结果，图6 为聚乙二醇干扰素a2b的偶联率检测结果，图7 为聚乙二醇干扰素a2b的收获率检测结果。

从图5中可见实施例1、实施例2、实施例3的聚乙二醇干扰素a2b电泳纯度均值可达97.2 %，干扰素生物活性7.82 x 10⁵IU/ml，明显优于对照组实施例4的结果。从图6中可看出，偶联后的电泳检测结果从原有技术的30%提高至50%左右，可见发明的修饰效果比现有技术有较大提高，从图7中可看出实施例1、实施例2、实施例3的蛋白收获率平均可达到29.96%，与传统方法的23.12%相比提高了近30%，有较显著的提高。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，其包括以下步骤：

A、将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH4.5的10 mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液；

2.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，在所述步骤A之前还包括：将重组干扰素原液通过切向流超滤系统浓缩至蛋白浓度为2.0 -10.0 mg/ml，再用50mM的硼酸盐缓冲液渗滤，得到所述重组人干扰素浓缩液。

3.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述步骤A具体的包括：

4.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述步骤B具体的包括：以2-6倍的醋酸钠缓冲液平衡上样后的离子交换层析柱，再以含20 mM -80mM氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，根据紫外检测仪分段收集洗脱峰，以SDS-PAGE电泳法检测纯度，得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰。