CN103936847B

CN103936847B - Peg-sa及其药物组合物

Info

Publication number: CN103936847B
Application number: CN201410119240.3A
Authority: CN
Inventors: 冯静; 杨柳
Original assignee: BEIJING KAWIN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING KAWIN TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-03-27
Also published as: CN103936847A

Abstract

本发明提供了聚乙二醇（PEG）化的干扰素衍生物（PEG-SA）及其药物组合物和制备方法。其中，该药物组合物能充分利用干扰素衍生物（IFN-SA）PEG化制备获得的多种产物，包括PEG-SA二聚体。另外，本发明也提供了该药物组合物的原料（如，PEG-SA二聚体）和应用等。

Description

PEG-SA及其药物组合物

技术领域

本发明属于蛋白质（尤其是干扰素）技术领域，具体而言，本发明涉及聚乙二醇（PEG）化的干扰素衍生物（PEG-SA）及其药物组合物和制备方法。其中，该药物组合物能充分利用干扰素衍生物（IFN-SA）PEG化制备获得的多种产物，包括PEG-SA二聚体，简化了产物分离纯化过程和/或提高了产物分离纯化操作的宽容度，而且药效也不差于、甚至略高于由纯化的PEG-SA单体组成的药物。

背景技术

早在本世纪初，我们就研究开发了一种具有强抗病毒活性的人α干扰素衍生物，其被命名为IFN-SA，其氨基酸序列等情况可以参见中国专利第01102915.3号（《抗病毒活性的人α干扰素衍生物》，CN1281623C）。

为了降低干扰素自身的免疫原性并为了提高在体液中的半衰期，我们开发了IFN-SA的N末端α氨基上单PEG化的产物（即PEG-IFN-SA，本文中简称为PEG-SA）及其制备工艺，通过分子筛层析柱进行细致的分离纯化，去除了修饰2个PEG的IFN-SA等副产物，最终获得了在RP-HPLC上仅表现为单一吸收峰的PEG-SA，其以纯的单体形式存在，药效确切，无论是纯度上还是药效上都非常适合药物应用（可以参见中国专利申请第201010516710.1号（《重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物的制备和应用》，CN102453089A））。

本领域属于西方医药技术领域，在西方医药的核心——还原论这一基本理论的指导下（目前中医药现代化也有许多开始接受西药化这种还原论的思路了，可以参见郭志军，等.天津中医药，2003，20（1）：55），本领域技术人员应该去进行该药物临床方面的研究，而对该药物本身结构和纯化的研究会在此止步，至少没有动机将纯的PEG-SA单体去混用其他未知功效的物质。

然而，我们跳出了西方医学的限制，根据自身令人意外的发现，即在纯的PEG-SA单体中加入少量PEG-SA二聚体，不但基本不影响药效，某些配比还能提高药效，由此开发新的PEG-SA及其药物组合物，其中包括PEG-SA二聚体，在基本不影响药效的前提下，更充分地利用了IFN-SA PEG化过程中产生的约10-15%的PEG-SA多聚体（大部分是二聚体，可以直接利用约一半），降低了IFN-SA的损耗，节约了成本，并且简化了产物分离纯化过程、提高了生产效率（如可用高浓度的IFN-SA溶液作为起始原料）和/或提高了产物分离纯化操作的宽容度。

另外，我们还开发了新的PEG-SA的制备方法，没有受现有技术优化的结果阻碍，使得产生的副产物与现有技术的不同，更易于利用，即尽管会产生较多新的PEG-SA多聚体（如，二聚体）副产物，但是利用还原条件即可恢复成单体加以回收，更重要的是，这样的少量PEG-SA多聚体（尤其是二聚体）也可以直接与PEG-SA单体配制（或一步收集）成上述药物组合物。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的IFN衍生物、其药物组合物、药物制剂及制备和应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了PEG-IFN的制备方法，所述方法包括：

（1）摩尔比为1：3.5～4.5的IFN和PEG醛在pH5～6缓冲液中以硼氢化物催化反应，获得PEG-SA反应液；和

（2）用色谱柱纯化步骤（1）获得的PEG-IFN反应液，收集PEG-SA；

其特征在于，

（a）在步骤（1）中，IFN的浓度为8～12mg/ml，反应的温度为23-27℃，和反应的时间为43～53；

（b）任选在步骤（2）中，仅仅用一步体积排阻色谱柱来纯化；和

（c）任选在步骤（2）中，收集PEG-IFN单体和/或多聚体。

在本文中，“PEG”和聚乙二醇可以互换使用，在与活性反应基团连用的时候（如PEG醛），指的是活性反应基团（如醛）活化的PEG分子；在与蛋白质（如IFN）连用的时候（如PEG-IFN），指的是PEG化的蛋白质。目前，PEG和带有活性反应基团的PEG基本已经商品化。

在本发明中，PEG醛优选可以是PEG丙醛、PEG丁醛或PEG戊醛等。PEG可以是直链的，也可以是支链的。PEG可以有一个或多个（如两个）连接点，优选只有一个，另一个可以用惰性基团（如甲氧基）封闭。另外，PEG的分子量可以是任何合适的分子量，通常为5～80kDa，优选为10～40kDa，如为10kDa、20kDa或40可Da等，在本发明的具体实施方式中，优选为20kDa。在本文中，如无相反指示，PEG与数字的连用，表示PEG的分子量为相应数字的千Da，如PEG20表示20kDa的PEG。在本发明的具体实施方式中，PEG醛是分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丁醛。

在本文中，如无相反指示，“IFN”和干扰素可以互换使用，指的是天然的干扰素或者保留天然干扰素基本结构（如与天然干扰素序列同一性大于80%，优选大于90%，更优选大于95%，如大于97%、98%或99%）的干扰素衍生物。IFN的实例包括但不限于α干扰素（即IFNα），如IFNα-2a和IFNα-2b。

在本发明中，IFN优选是IFN-SA。IFN-SA，在本文中也可以简称为SA，是强抗病毒活性的人α干扰素衍生物，其结构（如氨基酸序列）记载于中国专利第01102915.3号和/或中国专利申请第201010516710.1号中。

因此，优选本发明第一方面的方法是PEG-SA的制备方法，所述方法包括：

（1）摩尔比为1：3.5～4.5的IFN-SA和PEG醛在pH5～6缓冲液中以硼氢化物催化反应，获得PEG-SA反应液；和

（2）用色谱柱纯化步骤（1）获得的PEG-SA反应液，收集PEG-SA；

其特征在于，

（a）在步骤（1）中，IFN-SA的浓度为8～12mg/ml，反应的温度为23-27℃，和反应的时间为43～53；

（c）任选在步骤（2）中，收集PEG-SA单体和/或多聚体。

中国专利申请第201010516710.1号公开了一种PEG-SA的制备方法并优化了各项制备参数。其中，摩尔比优选为1：4；优选pH5.3～5.8，如pH5.5；和/或，硼氢化物优选是氰基硼氢化钠。使用这些必要条件获得了高修饰率、活性/结构稳定的产物，副产物中存在一定的多个PEG修饰的多聚体（如2个PEG修饰在一个IFN上；这种副产物不方便回收利用，因为去除一个PEG的反应条件，往往也使得另一个PEG掉下来），通过SP Sepharose和Superdex75这两种色谱柱来分离纯化。当然，要获得这样的产物，还有些必要条件，如温度不可过高，明确要求设定在4℃；以及，IFN浓度不可过高，明确要求设定在3.0～4.0mg/ml。

我们没有被中国专利申请第201010516710.1号的内容所禁锢，发现采用并非该文献设定的优化条件（如，浓度、温度和时间），在保持N末端α氨基上连接PEG的性质的前提下，反而能产生非常有益的效果。采用我们重新优化的条件，副产物是PEG-SA多聚体，通过电泳和体积排阻色谱没有发现多个PEG聚合在一个IFN上的副产物。这样，经过还原反应即可使得多聚体还原成单体，从而方便回收；多聚体的分子量成倍上升，使得用体积排阻色谱纯化时，单体和多聚体的峰分得更开，可以进行一步分离纯化，而无需两种色谱柱；而且，通过一步色谱纯化，可以直接收集获得单体和多聚体等多种分离的产物，当然也可以直接收集获得包括单体和多聚体的混合物或者包括不同多聚体的混合物。

为了清楚起见，在本文中，PEG-SA多聚体指的是PEG-SA单体多聚而形成的多聚体，其分子量是PEG-SA单体的多倍；而并不是PEG修饰的多聚体（多个PEG修饰在同一蛋白质上的聚合体，其分子量的增加值仅与PEG个数相关）。这样的多聚体可以通过与分子量有关的分离鉴定技术来鉴定，如电泳、体积排阻色谱、质谱等。在本发明中，PEG-SA多聚体包括PEG-SA二聚体和PEG-SA三聚体等，优选为二聚体。这些多聚体可以通过与电泳相同的还原条件解聚成单体，从而方便直接制备单体。

优选在本发明第一方面的方法中，在步骤（1）中，IFN-SA的浓度优选为9～11mg/ml，在本发明的具体实施方式中，优选为10mg/ml。也优选在本发明第一方面的方法中，在步骤（1）中，反应的温度优选为24-26℃，在本发明的具体实施方式中，优选为25℃。还优选在本发明第一方面的方法中，在步骤（1）中，反应的时间优选为46～50，在本发明的具体实施方式中，优选为48小时。这些我们优化的条件与中国专利申请第201010516710.1号所启示的方向不同，是非显而易见的。

在本发明第一方面的方法中，步骤（2）可以采用中国专利申请第201010516710.1号记载的多步色谱纯化的过程，但是优选仅仅一步纯化。其中，所用的体积排阻色谱是本领域技术人员所熟知的色谱技术，许多体积排阻色谱柱已经商业化，但是没有现有技术教导仅仅通过一步体积排阻色谱就能分离纯化IFN单体和多聚体，更没有现有技术教导仅仅一步的体积排阻色谱适用于本发明第一方面步骤（1）的产物的分离纯化。

在第二方面，本发明提供了PEG化的干扰素衍生物，其为PEG-IFN多聚体，如PEG-IFN二聚体。在本文中，PEG-IFN多聚体指的是PEG-IFN单体多聚而形成的多聚体，其分子量是PEG-IFN单体的多倍。

优选本发明第二方面的PEG化的干扰素衍生物为PEG-SA多聚体。在本发明中，PEG-SA多聚体包括PEG-SA二聚体和PEG-SA三聚体等，优选为PEG-SA二聚体。我们首次发现了PEG-SA多聚体，并且研究了它们的功能。首先，它们能还原成单体而间接作为原料；其次，它们，尤其是PEG-SA二聚体，可以少量直接替代PEG-SA单体而基本不影响（甚至有时会提高）药效，而且这样的药用是安全的。

在第三方面，本发明提供了药物组合物，其包括PEG-IFN单体和PEG-IFN二聚体，其中PEG-IFN二聚体仅少量存在与大量PEG-IFN单体中。例如，其中PEG-SA单体含量为90～99.5%而且PEG-SA二聚体含量为0.5～10%，优选其中PEG-SA单体含量为91～99%而且PEG-SA二聚体含量为1～9%，更优选其中PEG-SA单体含量为92～98.5%而且PEG-SA二聚体含量为1.5～8%，最优选其中PEG-SA单体含量为95～98%（如95.5%、96%、96.5%、97%或97.5%）而且PEG-SA二聚体含量为2～5%（如2.5%、3%、3.5%、4%或4.5%）。

在本文中，如无相反指示，百分比（即“%”）指的是重量百分比。通过两个百分比数值，本领域技术人员能够轻易地计算出它们的比例，例如97.5%和2.5%的比例是97.5：2.5。显然，这样的比例是重量比例。

优选本发明第三方面的药物组合物是药物组合物，其包括PEG-SA单体和PEG-SA二聚体，其中PEG-SA二聚体仅少量存在与大量PEG-SA单体中。例如，其中PEG-SA单体含量为90～99.5%而且PEG-SA二聚体含量为0.5～10%，优选其中PEG-SA单体含量为91～99%而且PEG-SA二聚体含量为1～9%，更优选其中PEG-SA单体含量为92～98.5%而且PEG-SA二聚体含量为1.5～8%，最优选其中PEG-SA单体含量为95～98%（如95.5%、96%、96.5%、97%或97.5%）而且PEG-SA二聚体含量为2～5%（如2.5%、3%、3.5%、4%或4.5%）。

我们首次发现了PEG-SA多聚体，尤其是PEG-SA二聚体，可以少量替代PEG-SA单体，而这样的药用是安全的。因此，优选本发明第三方面的药物组合物具有低体内免疫原性。低体内免疫原性能产生非常有益的效果，如不容易引发免疫反应而用药更加安全；又如用药效率高，不容易产生中和抗体抵消部分用药量，所以用药量减少，而用药量减少又增强用药安全性。

更优选本发明第三方面的药物组合物四周用药后的抗体滴度的几何均数小于20，更优选小于15，更加优选小于12，如小于10或8。通过本领域常规的检测方法，如本发明的具体实施方式的检测方法，可以测量出四周用药后的抗体滴度，计算出几何均数。

也更优选本发明第三方面的药物组合物停药四周后的抗体滴度的几何均数小于3，更优选小于2，更加优选小于1，如小于0.3或0.1。通过本领域常规的检测方法，如本发明的具体实施方式的检测方法，可以测量出停药四周后的抗体滴度，计算出几何均数。

我们首次发现了PEG-SA多聚体，尤其是PEG-SA二聚体，可以少量替代PEG-SA单体而基本不影响（甚至有时会提高）药效。因此，优选本发明第三方面的药物组合物抗病毒的效果不差于（甚至优于）PEG-IFN（尤其是PEG-SA）单体的抗病毒的效果。通过本领域常规的检测方法，如本发明的具体实施方式的检测方法，可以测量出抗病毒的效果，计算出结果判断是否不差于或优于，如通过统计学方法计算来判断是否没有显著差异或者显著提高了。

在本发明中，病毒指的是IFN所能抗的任何病毒，例如肝炎病毒、乳头状病毒、单纯性疱疹病毒、HIV、EB病毒、冠状病毒和/或流感病毒等，优选是肝炎病毒，如HBV或HCV。

在第四方面，本发明提供了本发明第三方面的药物组合物的制备方法。该制备方法可以包括将PEG-IFN（尤其是PEG-SA）单体和二聚体混合的过程。其中，单体和二聚体可以通过本发明的具体实施方式中的方法分离纯化，也可以按照现有技术记载的方法，如PEG-SA单体的制备可以参见中国专利申请第201010516710.1号。

根据本发明人的发现，只要在一定的保留时间段不换收集管（即，直接）收集单体和二聚体对应的峰或其中纯的部分，就可以获得单体和二聚体的混合物。所以，优选本发明第四方面的方法不包括单体和二聚体混合的过程，而是直接获得的。例如，本发明第四方面的方法包括本发明第一方面的方法，而且其中收集PEG-IFN（尤其是PEG-SA）是一次性收集PEG-IFN（尤其是PEG-SA）单体和PEG-IFN（尤其是PEG-SA）二聚体的混合物，并且其中PEG-IFN（尤其是PEG-SA）单体和PEG-IFN（尤其是PEG-SA）二聚体的比例是本发明第三方面中所述的含量比例。然后冷冻干燥弃去溶剂即可。

为了清楚起见，在本文中，PEG-IFN（尤其是PEG-SA）单体和PEG-IFN（尤其是PEG-SA）二聚体的比例为90～99.5：0.5～10，优选为91～99：1～9，更优选为92～98.5：1.5～8，最优选为95～98（如95.5、96、96.5、97或97.5）：2～5（如2.5、3、3.5、4或4.5）。

本发明第四方面的方法可以是有意的，这样可以充分利用产生的（一部分）二聚体，减少回收后还原的工作量；也可以是无意的，如生手操作换收集管时机掌握欠佳，使得单体中混入了少量二聚体，这样客观上提高了分离纯化操作的宽容度。所以，本发明第四方面的方法从多个角度看都是有益的。

在第五方面，本发明提供了药物制剂，其包括本发明第三方面的药物组合物和药学上可接受的辅料。

在本文中，药学上可接受的辅料指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、佐剂、包裹材料或其他制剂辅料。所用辅料可与相应的给药形式相适应，可使用本领域技术人员所知晓的载体配成注射剂、（注射用）冻干粉、喷雾剂、口服溶液、口服混悬液、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、持续释放或延迟释释放等制剂。在本发明的具体实施方式中，本发明第三方面的药物组合物通过注射方式给药，因此，本发明第五方面的药物制剂优选为注射剂，即适于配制成注射给药的辅料特别优选的。在本发明的具体实施方式中，药学上可接受的辅料可以是适合注射的溶液。

用药量可以根据临床实验或者动物实验来获得，根据的本领域普通技术人员所公知的实验动物与人的等效剂量换算关系（通常可参见FDA、SFDA等药品管理机构的指导意见，也可参见“黄继汉等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算.中国临床药理学与治疗学,2004Sep;9(9):1069-1072”）可从实验动物的剂量推导出人的有效剂量。

在第六方面，本发明提供了本发明第二方面的PEG化的干扰素衍生物在制备抗病毒、抗癌或增强免疫功能的药物组合物或药物制剂中的应用。在本发明中，癌指的是IFN所能抗的任何癌，例如肝癌、乳腺癌、肾癌或白血病。

本发明第二方面的PEG化的干扰素衍生物（尤其是PEG-SA多聚体，如PEG-SA二聚体）可以作为药物原料而还原制备成PEG化的干扰素衍生物（尤其是PEG-SA）单体，再进一步制备成药物组合物或药物制剂。

本发明第二方面的PEG化的干扰素衍生物（尤其是PEG-SA多聚体，如PEG-SA二聚体）也可以直接作为药物组合物或药物制剂中的成分而制备成药物组合物或药物制剂。优选本发明第六方面的应用是IFN（尤其是PEG-SA）单体和本发明第二方面的PEG化的干扰素衍生物（尤其是PEG-SA多聚体，如PEG-SA二聚体）联合的应用，即IFN（尤其是PEG-SA）单体和本发明第二方面的PEG化的干扰素衍生物（尤其是PEG-SA多聚体，如PEG-SA二聚体）联合在制备抗病毒、抗癌或增强免疫功能的药物组合物或药物制剂中的应用。

更优选在本发明第六方面的应用中，PEG-SA单体和PEG多聚体的比例是是本发明第三方面中所述的含量比例。

在第七方面，本发明提供了PEG-SA单体的制备方法，其包括还原本发明第二方面的PEG化的干扰素衍生物（如PEG-SA二聚体和/或三聚体）的步骤。优选还原所用的还原剂是还原电泳所用的还原剂，如巯基乙醇和/或二硫苏糖醇（DDT）等。

在第八方面，本发明提供了鉴定药物制剂是否含有本发明第三方面的药物组合物的方法，其包括，测定该药物制剂中PEG-SA单体和PEG-SA二聚体含量，和计算PEG-SA单体和PEG多聚体的比例是否是本发明第三方面中所述的含量比例。测定方法包括电泳、色谱（尤其是体积排阻色谱）等分离和鉴定集于一身的技术，通常通过获得的电泳或者色谱（尤其是体积排阻色谱）图谱进行面积归一法分析，可以计算得出其中的含量。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

附图说明

图1是PEG-SA的体积排阻色谱的洗脱图谱。

具体实施方式

以下结合具体的实施例进行说明，其中试剂以及样品均可通过商业渠道获得，实验步骤如有未尽之处，均可参见医药管理部门的相关标准和指引，尤其是《中国药典》的规定，并可以按照商业化的原料、设备的厂商说明来进行。

实施例1IFN-SA的制备

IFN-SA的基因构建、重组表达载体构建、蛋白的融合表达以及发酵和纯化过程，均参照中国专利第01102915.3号（《抗病毒活性的人α干扰素衍生物》，CN1281623C）进行，由此获得IFN-SA。

实施例2PEG-SA的制备和纯化

基本参照中国专利申请第201010516710.1号（《重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物的制备和应用》，CN102453089A）所述的制备和纯化工艺，用实施例1获得的IFN-SA与mPEG-ButyrALD-20kD（纯度大于95%，相对分子量为2.0×10⁴Da，购自北京键凯科技有限公司）为原料（两者摩尔比为1：4）在pH5.5体系中以氰基硼氢化钠（购自Sigma公司）催化反应，以制备PEG20-SA反应液，其中所不同的地方在于：参与反应的IFN-SA溶液浓度为10mg/mL，于25℃下反应48小时。由此，制备得到PEG20-SA反应液。

将上述PEG20-SA反应液上样于TSKgel G3000SWXL体积排阻色谱柱上，用10mM PB（pH7.0）洗脱。洗脱图谱如图1所示，分别收集各洗脱峰，经电泳和元素分析，发现保留时间为10.962和11.370的峰为分子量约为128kDa（在非还原电泳条件下的；在还原（添加了巯基乙醇）电泳条件下，分子量约为43kDa）、IFN-SA：mPEG（摩尔比）为1：1的产物，经鉴定为PEG20-SA三聚体；保留时间为12.470的峰为分子量约为85kDa（在非还原电泳条件下的；在还原电泳条件下，分子量约为43kDa）、IFN-SA：mPEG（摩尔比）为1：1的产物，经鉴定为PEG20-SA二聚体，约占蛋白质产物的14%；保留时间为14.354的峰为分子量约为43kDa（非还原和还原电泳条件下均是）、IFN-SA：mPEG（摩尔比）为1：1的产物，经鉴定为PEG20-SA单体，约占蛋白质产物的48%；保留时间为21.032的峰为分子量约为22kDa、IFN-SA：mPEG（摩尔比）为1：0的产物，经鉴定为未反应的IFN-SA，约占蛋白质产物的36%；此后的峰均为溶剂中的小分子等。

由于不包括约60kDa的产物，PEG20-SA单体的峰与其他峰分离得较开，因此PEG20-SA单体纯品可以通过体积排阻色谱一步就分离纯化出，未反应的IFN-SA也可以由此直接回收；PEG20-SA二聚体和三聚体的峰比较紧密，但是收集保留时间在12.3之后的PEG20-SA二聚体的峰，仍旧可以获得可供直接利用的PEG20-SA二聚体纯品；由于PEG20-SA三聚体较少，而且与二聚体的峰分离效果一般，所以可以和PEG20-SA二聚体的峰一起收集，获得PEG20-SA多聚体混合物。以上纯化的PEG20-SA单体和二聚体以及多聚体混合物分别冷冻干燥，备用。另外，PEG20-SA多聚体（含二聚体）可以用于还原为单体。

实施例3PEG-SA及其组合物的安全性及药效研究

取按照实施例2制备的纯化的各种PEG20-SA单体和二聚体等，溶于生理盐水中进行以下安全性和药效实验。

（1）皮下注射食蟹猴的血清抗药抗体的酶联免疫吸附分析

研究目的在于考察各种PEG-SA注射后是否会引起针对IFN-SA的免疫反应。实验作用动物为食蟹猴，雌雄各半，随机分组：组1：空白对照组，给药生理盐水；组2：单体实验组，给药PEG20-SA单体，剂量为50μg/kg；组3：二聚体实验组，给药PEG20-SA二聚体，剂量为50μg/kg；组4：多聚体实验组，给药PEG20-SA多聚体，剂量为30μg/kg；组5：5%二聚体的单体混合组，给药PEG20-SA单体（剂量为47.5μg/kg）和二聚体（剂量为2.5μg/kg）；组6：2%二聚体的单体混合组，给药PEG20-SA单体（剂量为49μg/kg）和二聚体（剂量为1μg/kg）。每周注射给药一次，连续给药四周，给药期间每两周和停药后四周分别采血约500μL，离心分离血清后用间接ELISA法检测该血清中抗IFN-SA的抗体滴度，并计算抗体滴度的几何均数（为抗体滴度倒数的反对数平均值），考察PEG-SA引起的免疫原性。

结果如表1所示，各种PEG-SA的给药都会产生一定量的抗IFN-SA抗体，其中，PEG-SA单体的给药只会引发少量的抗IFN-SA抗体，而且停药4周后即可恢复；而PEG-SA多聚体（主要是二聚体，也含三聚体）的中剂量直接给药和纯化的PEG-SA二聚体大剂量直接给药，都会显著大幅提高抗IFN-SA抗体的量，即使停药4周后也没能够恢复，但是纯化的PEG-SA二聚体比多聚体要小得多，标明多聚体中的少量三聚体更容易引起免疫反应；令人意外的是，在PEG-SA单体中替代混入少量PEG-SA二聚体，并不影响抗IFN-SA抗体的量，与单独给药PEG-SA单体没有显著的区别，在给药期间产生少量的抗IFN-SA抗体，而且停药4周后即可恢复。这表明，PEG-SA多聚体的直接用药会提高体内免疫原性，降低长期用药的药效，并且带来用药安全性隐患，因此不建议直接使用PEG-SA多聚体；纯化的PEG-SA单体及其中混入少量（不超过8%，优选不超过5%）的PEG-SA二聚体，具有安全限度以内的低体内免疫原性，而且能够很快恢复，都可以直接用药。

表1皮下注射PEG-SA后食蟹猴血清中抗IFN-SA的抗体滴度

注：ND，未检出

（2）抗丙型肝炎病毒（HCV）活性的研究

供试药物分别采用纯化的PEG-SA单体（单体组）、2%PEG-SA二聚体和98%PEG-SA单体混合物（2%组）、4%PEG-SA二聚体和96%PEG-SA单体混合物（4%组）、和8%PEG-SA二聚体和92%PEG-SA单体混合物（8%组），总PEG-SA（包括二聚体）分别梯度稀释后，分别加入到如下三种国际标准HCV病毒学模型中来观察各药物对HCV的抑制效率，以PEG-SA（包括二聚体）的半数抑制率浓度（IC50）和90%抑制率浓度（IC90）来表示：

I，基因1a（H77）型复制子系统；

II，基因1b（Con1）型HCV复制子系统；

III，基因2a（JFH-1）型全病毒HCVcc培养系统。

其中，对模型I/II的基因1a型/1b型的检测方法采用实时荧光RT-PCR法，对III的基因2a型的检测方法采用荧光素酶报告基因定量法（Luciferase assay）。

结果如表2所示，2%PEG-SA二聚体和98%PEG-SA单体混合物的效果整体上基本与纯化的PEG-SA单体的相当，由于该混合物基本就可以看作纯化的PEG-SA单体，所以这很好解释；令人意外的是，4%PEG-SA二聚体和96%PEG-SA单体混合物的效果整体上略微优于纯化的PEG-SA单体；而8%PEG-SA二聚体和92%PEG-SA单体混合物则明显效果开始低于纯化的PEG-SA单体。这表明，低浓度的PEG-SA二聚体替代混入PEG-SA单体中基本不会影响抗HCV的药效，甚至约4%PEG-SA二聚体替代混入PEG-SA单体中还能略微提高其药效，而较高浓度（8%及以上）的PEG-SA二聚体则会在一定程度上影响药效，但仍旧在相同的数量级上。

表2PEG-SA的抗HCV活性

（3）抗乙型肝炎病毒（HBV）活性的研究

基本参照中国专利申请第201010516710.1号（《重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物的制备和应用》，CN102453089A）所述的体外抗乙型肝炎病毒的活性的实验方法，所不同的是：供试药物分别采用纯化的PEG-SA单体（单体组）、2%PEG-SA二聚体和98%PEG-SA单体混合物（2%组）、4%PEG-SA二聚体和96%PEG-SA单体混合物（4%组）、和8%PEG-SA二聚体和92%PEG-SA单体混合物（8%组）。

结果如表3所示，各药物组之间的治疗指数没有显著的差异，仅仅是10%组相对于其他组的平均TI有所下降，其他三组的TI基本相同。低浓度（如10%以下，尤其是5%以下）的PEG-SA二聚体替代混入PEG-SA单体中基本不会影响抗HBV的药效。

表3PEG-SA的抗HBV活性

Claims

1.PEG-SA的制备方法，所述方法包括：

(1)摩尔比为1：3.5～4.5的IFN-SA和PEG醛在pH5～6缓冲液中以硼氢化物催化反应，获得PEG-SA反应液；和

(2)用色谱柱纯化步骤(1)获得的PEG-SA反应液，收集PEG-SA；

其特征在于，

(a)在步骤(1)中，IFN-SA的浓度为8～12mg/ml，反应的温度为23-27℃，和反应的时间为43～53小时；

(b)任选在步骤(2)中，仅仅用一步体积排阻色谱柱来纯化；和

(c)在步骤(2)中，收集PEG-SA单体和多聚体。

2.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(1)中的摩尔比为1：4。

3.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(1)中的PEG醛是PEG丙醛、PEG丁醛或PEG戊醛。

4.权利要求3所述的制备方法，其中PEG的分子量为10～40kDa。

5.权利要求4所述的制备方法，其中PEG的分子量为20kDa。

6.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(1)中的pH为5.3～5.8。

7.权利要求6所述的制备方法，其中步骤(1)中的pH为pH5.5。

8.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(1)中的硼氢化物是氰基硼氢化钠。

9.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(a)中的浓度为9～11mg/ml。

10.权利要求9所述的制备方法，其中步骤(a)中的浓度为10mg/ml。

11.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(a)中的温度为24-26℃。

12.权利要求11所述的制备方法，其中步骤(a)中的温度为25℃。

13.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(a)中的时间为46～50小时。

14.权利要求13所述的制备方法，其中步骤(a)中的时间为48小时。

15.权利要求1所述的制备方法，其中步骤(c)中的多聚体是二聚体。

16.PEG化的干扰素衍生物，其为PEG-SA多聚体。

17.权利要求16所述的干扰素衍生物，其为PEG-SA二聚体。

18.药物组合物，其包括PEG-SA单体和PEG-SA二聚体，其中PEG-SA单体含量为90～99.5％而且PEG-SA二聚体含量为0.5～10％。

19.权利要求18所述的药物组合物，其中PEG-SA单体含量为91～99％而且PEG-SA二聚体含量为1～9％。

20.权利要求19所述的药物组合物，其中PEG-SA单体含量为92～98.5％而且PEG-SA二聚体含量为1.5～8％。

21.权利要求20所述的药物组合物，其中PEG-SA单体含量为95～98％而且PEG-SA二聚体含量为2～5％。

22.权利要求21所述的药物组合物，其中PEG-SA单体含量为95.5％、96％、96.5％、97％或97.5％，而且PEG-SA二聚体含量为2.5％、3％、3.5％、4％或4.5％。

23.权利要求18所述的药物组合物，其具有低体内免疫原性。

24.权利要求23所述的药物组合物，其四周用药后的抗体滴度的几何均数小于20。

25.权利要求24所述的药物组合物，其四周用药后的抗体滴度的几何均数小于15。

26.权利要求25所述的药物组合物，其四周用药后的抗体滴度的几何均数小于12。

27.权利要求26所述的药物组合物，其四周用药后的抗体滴度的几何均数小于10。

28.权利要求26所述的药物组合物，其四周用药后的抗体滴度的几何均数小于8。

29.权利要求23所述的药物组合物，其停药四周后的抗体滴度的几何均数小于3。

30.权利要求29所述的药物组合物，其停药四周后的抗体滴度的几何均数小于2。

31.权利要求30所述的药物组合物，其停药四周后的抗体滴度的几何均数小于1。

32.权利要求31所述的药物组合物，其停药四周后的抗体滴度的几何均数小于0.3。

33.权利要求31所述的药物组合物，其停药四周后的抗体滴度的几何均数小于0.1。

34.权利要求18所述的药物组合物，其抗病毒的效果不差于PEG-SA单体的抗病毒的效果。

35.权利要求34所述的药物组合物，其中病毒是HBV或HCV。

36.权利要求18～35之任一所述的药物组合物的制备方法，其包括权利要求1所述的方法，而且其中收集PEG-SA是一次性收集PEG-SA单体和PEG-SA二聚体的混合物，并且其中PEG-SA单体和PEG-SA二聚体的比例为90～99.5：0.5～10。

37.权利要求36所述的制备方法，其中PEG-SA单体和PEG-SA二聚体的比例为91～99：1～9。

38.权利要求37所述的制备方法，其中PEG-SA单体和PEG-SA二聚体的比例为92～98.5：1.5～8。

39.权利要求38所述的制备方法，其中PEG-SA单体和PEG-SA二聚体的比例为95～98：2～5。

40.药物制剂，其包括权利要求18～35之任一所述的药物组合物和药学上可接受的辅料。

41.权利要求16或17所述的干扰素衍生物在制备抗病毒、抗癌或增强免疫功能的药物组合物或药物制剂中的应用。

42.权利要求41所述的应用，其中病毒是HBV或HCV。

43.权利要求41所述的应用，其中癌是肝癌、乳腺癌、肾癌或白血病。

44.权利要求41所述的应用，其是PEG-SA单体和权利要求16或17所述的干扰素衍生物联合的应用。

45.权利要求44所述的应用，其中PEG-SA单体和PEG多聚体的比例为90～99.5：0.5～10。

46.权利要求45所述的应用，其中PEG-SA单体和PEG多聚体的比例为91～99：1～9。

47.权利要求46所述的应用，其中PEG-SA单体和PEG多聚体的比例为92～98.5：1.5～8。

48.权利要求47所述的应用，其中PEG-SA单体和PEG多聚体的比例为95～98：2～5。

49.权利要求48所述的应用，其中PEG-SA单体和PEG多聚体的比例为95.5：4.5、96：4、96.5：3.5、97：3或97.5：2.5。

50.鉴定药物制剂是否含有权利要求18～35之任一所述的药物组合物的方法，其包括，测定该药物制剂中PEG-SA单体和PEG-SA二聚体含量，和计算PEG-SA单体和PEG二聚体的比例是否是90～99.5：0.5～10。

51.权利要求50所述的方法，其中计算PEG-SA单体和PEG二聚体的比例是否是91～99：1～9。

52.权利要求51所述的方法，其中计算PEG-SA单体和PEG二聚体的比例是否是92～98.5：1.5～8。

53.权利要求52所述的方法，其中计算PEG-SA单体和PEG二聚体的比例是否是95～98：2～5。