CN101036684B - 一种板蓝根提取物及其提纯方法和药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种板蓝根的提纯方法，其包括将按常规方法制得的板蓝根水提醇沉液进行阳离子树脂柱层析，分别收集滤过液及洗脱液A，将该滤过液再进行大孔树脂柱层析处理，收集洗脱液B，然后将洗脱液A和B分别除去溶剂后合并；其中上述阳离子树脂柱层析和大孔树脂柱层析的先后顺序可以互换。本发明也公开了一种由该法制得的板蓝根提取物及其药物组合物。采用本发明的提纯方法，大大提高了板蓝根提取物中有效成分结合氨基酸类和核苷类成分的百分含量，在50％以上(以干燥固形物计)。

Description

一种板蓝根提取物及其提纯方法和药物组合物

技术领域

本发明涉及板蓝根的提纯领域，特别涉及一种板蓝根提取物及其提纯方法和包括该提取物的药物组合物。

背景技术

板蓝根为来源于十字花科菘蓝属植物菘蓝(Isatis indigoticafort.)的干燥根，是中国的传统中药，具有清热解毒、凉血利咽的功效，始载于《神农本草经》，临床上广泛用于治疗腮腺炎，肝炎，流感，丹毒、扁桃体炎等病毒、细菌性疾病。

目前公开的板蓝根抗微生物有效成分主要包括结合氨基酸、核苷成分等(刘思贞等.板蓝根抗流感病毒有效部位的筛选.中草药1999，30(9)：650-651；公开号为CN 1528384A的中国专利申请)，其中氨基酸是药典(2005版)鉴别板蓝根药材、颗粒剂的标准，也是原部颁标准(第二十册)板蓝根注射液的成分指标；多糖成分据文献报导有增强免疫的作用，但这方面的文献很少；也有个别人认为板蓝根中的板蓝根凝集素(属蛋白类)具有抗病毒作用；而原认为是有效成分的靛蓝、靛玉红现在基本不作为抗菌有效成分。目前临床上使用的板蓝根制剂如颗粒剂等大多有效成分含量较低，服用剂量大，不方便患者的服用，药效作用慢。原临床上使用的板蓝根注射液，由于有效成分含量较低，并含有较多杂质或非活性成分，故稳定性较差，易产生过敏等副反应。公开号为CN1453033A的中国专利申请公开了一种板蓝根粉针剂及其制备方法，但其有效成分的百分含量较低，杂质的含量较多，使用剂量大，又如公开号为CN1318399A的中国专利申请，虽然使用的阴阳离子树脂分离，但有效成分的含量仍然较低，限制了板蓝根在临床上的进一步应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题即是克服现有技术的缺陷，提供一种可提高板蓝根有效成分的板蓝根的提纯方法。

本发明通过下列技术方案来解决上述问题：一种板蓝根的提纯方法，其包括将按常规方法制得的板蓝根水提醇沉液进行阳离子树脂柱层析，分别收集滤过液及洗脱液A，将该滤过液再进行大孔树脂柱层析处理，收集洗脱液B，然后将洗脱液A和B分别除去溶剂后合并；其中上述阳离子树脂柱层析和大孔树脂柱层析的先后顺序可以互换。

其中，所说的“按常规方法制得的板蓝根水提醇沉液”是指按照原部颁标准板蓝根注射液的水提醇沉工艺制得的含有多种成分的板蓝根粗提取液，其通常采用板蓝根药材(普通药材或饮片等)用水煎煮1～3次，过滤，滤液浓缩到流浸膏，加入乙醇，使含醇量为50～70％，析出沉淀，取上清液浓缩至无醇味制得。

本发明中所采用的阳离子树脂优选强酸型阳离子树脂，如强酸性苯乙烯系阳离子树脂，例如732或JK006型。

该强酸型阳离子树脂柱层析的洗脱液为2mol/l～4mol/l的氨水溶液。

本发明采用上述阳离子树脂柱层析和氨洗可得到较高含量的板蓝根有效成分结合氨基酸。

而本发明选用的大孔树脂可为中极性或极性大孔树脂。

所谓中极性大孔树脂是指含酯基的吸附树脂，其表面兼有疏水和亲水两部分，如HPD400或HPD450型大孔树脂等。

而极性大孔树脂是指含酰胺基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫不同极性功能基的吸附树脂，例如HPD500或HPD600型大孔树脂等。

该大孔树脂柱层析的洗脱液为30％～80％(v/v)的乙醇溶液。该浓度太低，则对核苷类成分洗脱不完全，反之，太高，则造成生产成本较高。

本发明首次选用大孔树脂柱层析和乙醇洗脱，可得到较高含量的板蓝根另一有效成分——核苷类成分。

在本发明的较佳实施例中，本发明的提纯方法包括下列步骤：

①取上述板蓝根水提醇沉液，调pH为2～5，通过强酸型阳离子交换树脂，通过速度为0.5～2个柱体积/小时，收集通过树脂柱的滤出液为溶液L，用去离子水冲洗、再用2～4mol/L的氨水5～10倍柱体积洗脱树脂柱，洗脱速度为0.5～2个柱体积/小时，收集洗脱液A，将洗脱液A加热除去氨，得到溶液A。

②将上述溶液L通过中极性(HPD400、HPD450)或极性(HPD500、HPD600)大孔树脂，通过速度为0.5～1柱体积/小时，用水冲洗树脂柱，再用30％～80％的乙醇3～10倍柱体积洗脱，洗脱速度为常规的0.5～1.5个柱体积/小时，收集洗脱液B，将乙醇洗脱液减压浓缩除去乙醇，得到溶液B。

③将溶液A和溶液B混合，浓缩、干燥即得到该板蓝根提取物。

本发明提纯方法所用的试剂均为毒性小且常用的试剂，且大大提高了板蓝根提取物中有效成分结合氨基酸类和核苷类成分的重量百分比，在50％以上，其中总氨基酸的百分含量以精氨酸计在42％以上，精氨酸的百分含量在19％以上，总核苷类成分百分含量以腺苷计算在8.5％以上，腺苷的百分含量在0.8％以上，上述重量百分比均以提取物为干燥固形物计，该提取物是基于同一板蓝根药材原料制得的完全提取物，即所有溶液A和溶液B混合后得到的产物。

当然，根据本发明，由于采用两种不同树脂的分离纯化得到了不同的有效成分，故还可以根据实际需要，先分别制得两种分离物，即溶液A和溶液B，然后将两者按不同比例混合，可制得不同含量结合氨基酸类和核苷类成分的板蓝根提取物。

因此，本发明要解决的另一技术问题是提供一种结合氨基酸类和核苷类成分含量高的板蓝根提取物。其即为采用上述提纯方法制得的板蓝根提取物。

本发明还提供一种药物组合物，其包括本发明的板蓝根提取物作为活性成分，以及药学上可接受的载体。由于本发明板蓝根提取物中有效成分结合氨基酸类和核苷类成分含量高，杂质少，故由其组成的药物组合物较现有板蓝根制剂有更佳的抗病毒、抗菌等活性，且毒性及副反应更小。

在本发明一较佳实施例中，该药物组合物的剂型为冻干粉针剂。

本发明制得的板蓝根提取物及粉针剂，大大地提高了其中有效成分占固形物的百分含量，生产的板蓝根冻干粉针剂有很好的稳定性，能供注射用，经3个月的加速实验表明具有很好的稳定性，显著优于原板蓝根注射液；澄明度、溶解性、色泽、pH值、热源、刺激性等指标均符合《中国药典》有关注射剂的规定。本发明药物具有起效迅速、疗效确切，无过敏性反应等优点，经药理毒理实验证明具有很好的抗病毒、解热、抗菌等作用，毒性及不良反应小，对流感、腮腺炎、扁桃体炎以及肝炎等疾病具用良好的治疗效果。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

其中，下面实施例中所用的板蓝根水提醇沉液可按常规方法制得，本发明采用下列具体步骤：

取500g常规市售板蓝根饮片，加10倍重量的水煎煮沸腾后，持续煎煮2小时，得到滤出液，药渣再加8倍重量的水煎煮1小时，合并两次的煎煮液，滤过，减压浓缩至药材重量∶药液体积为1∶1.5，加无水乙醇使含醇量为70％(v/v)，搅拌均匀，冷藏24小时，过滤除去沉淀，将滤液减压浓缩除去乙醇，浓缩至药材重量∶药液体积为1∶1，过滤除去沉淀，得到板蓝根水提醇沉液。

实施例1

取上述板蓝根水提醇沉液65ml，用去离子水稀释至130ml，调pH值为2.0，通过50ml 732型阳离子交换树脂(上海亚东核级树脂有限公司，径高比1∶5)，收集过柱滤出液为溶液L1，用去离子水冲洗树脂柱，再用4mol/l的氨水洗脱树脂柱，将氨水洗脱液加热除去氨，浓缩至150ml，为溶液A1；将130ml溶液L1，通过60ml HPD450大孔树脂(沧州宝恩化工有限公司，径高比1∶9)，再用去离子水冲洗柱子，接着用60％乙醇常规流速洗脱树脂柱，收集洗脱液，将洗脱液减压除去乙醇，浓缩，得到溶液B1；将溶液A1和溶液B1混合，浓缩、干燥即得到该板蓝根提取物。该提取物总氨基酸类成分(以精氨酸计)和总核苷类成分(以腺苷计)占总固形物的百分含量为52.33％，其中总氨基酸的百分含量为43.13％，总核苷类成分的百分含量为9.20％。

实施例2

取上述板蓝根水提醇沉液65ml，用去离子水稀释至130ml，调pH值为4.0，通过50ml JK006型阳离子交换树脂(上海亚东核级树脂有限公司，径高比1∶5)，收集过柱滤出液为溶液L2，用去离子水冲洗树脂柱，再用3.2mol/l的氨水洗脱树脂柱，将氨水洗脱液加热除去氨，浓缩至150ml，为溶液A2；将130ml溶液L1通过60ml HPD500大孔树脂(沧州宝恩化工有限公司，径高比1∶9)，再用去离子水冲洗柱子，然后用50％乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，将洗脱液减压除去乙醇，浓缩，得到溶液B2，将溶液A2和溶液B2混合，浓缩、干燥即得到该板蓝根提取物。该提取物总氨基酸类成分(以精氨酸计)和总核苷类成分(以腺苷计)占总固形物的百分含量为53.09％，其中总氨基酸类成分的百分含量为43.53％，总核苷类成分的百分含量为9.56％。

实施例3

取上述板蓝根水提醇沉液65ml，用去离子水稀释至130ml，调pH值为5.0，通过50ml 732型阳离子交换树脂(上海亚东核级树脂有限公司，径高比1∶5)，收集过柱滤出液为溶液L3，用去离子水冲洗树脂柱，再用2mol/l的氨水洗脱树脂柱，将氨水洗脱液加热除去氨，浓缩至150ml，为溶液A3；将130ml溶液L3通过60ml HPD600大孔树脂(沧州宝恩化工有限公司，径高比1∶9)，再用去离子水冲洗柱子，再用30％乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，将洗脱液减压除去乙醇，浓缩，得到溶液B3，将溶液A3和溶液B3混合，浓缩、干燥即得到该板蓝根提取物。该提取物总氨基酸类成分(以精氨酸计)和总核苷类成分(以腺苷计)占总固形物的百分含量为50.90％，其中总氨基酸类成分的百分含量为42.04％，总核苷类成分的百分含量为8.86％。

上述实施例中总氨基酸类成分的测定采用上述药典中的方法。总核苷的含量测定方法，则采用紫外分光光度法(在260nm紫外波长下)：将样品稀释适当的倍数在260nm波长下，测定吸光度，根据腺苷标准曲线y＝0.0549x-0.0072来计算得到，其中y为吸光度，x为总核苷浓度。

实施例4板蓝根粉针剂的制备

取本发明板蓝根提取1份，加入甘露醇5份，加入注射用水适量溶解，调pH值至6.8，加入0.5份活性碳，搅拌半小时，用G6垂镕滤器过滤，注射用水定容至100份(以上均为重量份)，灌装2ml/瓶(西林瓶)，冷冻干燥，压盖包装即得。

效果实施例1板蓝根提取物体外抗乙肝病毒实验及细胞毒性

用HBV-DNA转染的人肝细胞HepG2的2.2.15细胞作为模型，放射免疫法分别测定了本发明实施例3的板蓝根提取物组500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml、62.5ug/ml和现有板蓝根注射液(按照原部颁标准制得)组125ug/ml、62.5ug/ml作用8天后细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的量，计算其对HBsAg和HBeAg分泌的抑制率；并用MTT法检测细胞毒性，计算细胞存活率；其结果如下表1所示。

表1

结果表明：本发明板蓝根提取物在500～62.5ug/ml浓度范围内，能有效地减少细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg量，效果较现有板蓝根提取物更佳；并对细胞的毒性更小。

Claims (7)

1.一种板蓝根的提纯方法，其包括下列步骤：①取按常规方法制得的板蓝根水提醇沉液，调pH为2～5，通过强酸型阳离子交换树脂，通过速度为0.5～2个柱体积/小时，收集通过树脂柱的滤出液为溶液L，用去离子水冲洗、再用2～4mol/L的氨水5～10倍柱体积洗脱树脂柱，洗脱速度为0.5～2个柱体积/小时，收集洗脱液A，将洗脱液A加热除去氨，得到溶液A；

②将上述溶液L通过中极性或极性大孔树脂，通过速度为0.5～1柱体积/小时，用水冲洗树脂柱，再用30％～80％的乙醇3～10倍柱体积洗脱，洗脱速度为常规的0.5～1.5个柱体积/小时，收集洗脱液B，将乙醇洗脱液减压浓缩除去乙醇，得到溶液B；

③将溶液A和溶液B混合，浓缩、干燥即得到该板蓝根提取物。

2.如权利要求1所述的提纯方法，其特征在于该阳离子树脂为732或JK006强酸型阳离子树脂。

3.如权利要求1所述的提纯方法，其特征在于该中极性大孔树脂为HPD400或HPD450型大孔树脂。

4.如权利要求1所述的提纯方法，其特征在于该极性大孔树脂为HPD500或HPD600型大孔树脂。

5.如权利要求1～4任一项所述的提纯方法制得的板蓝根提取物。

6.一种药物组合物，其包括如权利要求5所述的板蓝根提取物作为活性成分，以及药学上可接受的载体。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于其剂型为冻干粉针剂。