CN104721294A - 一种甘木通总黄酮的制备方法及其在抗心肌缺血药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药领域，具体涉及一种甘木通总黄酮的制备方法，及其在抗心肌缺血药物中的应用。其主要技术方案：中药甘木通地上部分干燥全草经提取、层析分离和纯化等流程，制得纯度85％以上的甘木通总黄酮。经体内外药理实验证实，所制备的甘木通总黄酮可抵抗心肌缺氧，对缺血心肌细胞有一定的保护作用，可降低血液黏度，减少血小板聚集，具有显著抗心肌缺血的功效。本发明以甘木通药材为原料，利用大孔树脂-硅胶层析耦合分离，制得高纯度的甘木通总黄酮，加药用辅料可制备成片剂、胶囊、滴丸、粉针剂等制剂，可应用于治疗隐匿性冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病等心肌缺血性疾病。本发明的制备方法工艺简单、稳定，易于批量生产。

Description

一种甘木通总黄酮的制备方法及其在抗心肌缺血药物中的应用

技术领域：

本发明属于中药领域，涉及一种抗心肌缺血的药物，用于隐匿性冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病等心肌缺血性疾病的防治，具体地说是一种甘木通总黄酮的制备方法及其在抗心肌缺血药物中的应用。 

背景技术：

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery disease，CAD)多为因冠状动脉病变引起冠脉血流量减少与心肌需求不平衡，即心肌缺血，从而导致的心肌损害，临床表现为心绞痛、心肌梗死(myocardial infarction，MI)、心律失常、猝死或心力衰竭，由此引起的心脏病就是常说的“冠心病”。冠心病不仅发病率高，还将导致的高致残率和高病死率，是美国死亡的头号病因，在中国也是第三位致死性疾病。据世界卫生组织统计，全球死于心血管疾病的人数将从2004年的1180万增加到2030年的1710万，而冠心病占所有疾病死因的第一位，预计到2030年仍将占第一位，大约占14.2％。 

冠心病的治疗在某种程度上取决于存活心肌细胞的多少，及缺血心肌血供的改善。近年来，动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、体外循环心脏外科手术和心肺脑复苏术等手段的建立和推广应用，使得缺血心脏能在短时间内重新获得血液灌注并恢复氧供应。多数情况下，缺血后再灌注可使损伤的结构得到修复，心功能恢复，病情好转；但有时不仅不能使心功能恢复，反而会加重心脏功能障碍和结构损伤。这种在心肌缺血基础上恢复血流后组织损伤加重、甚至发生不可逆性损伤的现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。目前，如何减少MIRI已经成为心脏血运重建治疗领域的一个新的挑战，研发抗心肌缺血药物也成为冠心病治疗的研究热点。 

甘木通Clematis filamentosa Dunn又名丝铁线莲，民间俗称“眼蛇药”，为毛茛科丝铁线莲属植物。甘木通喜生于海拔500-1600m的溪边、山谷的灌木丛中或密林，常攀缘于其他植物之上，主要分布在广东、广西、福建、台湾、云南、海南等地。 

甘木通以叶、茎入药，味甘、性微寒，归肝经，具清肝火、宁心神、降血压、通络止痛之功效。关于甘木通在心血管方面的药理作用，已有相关报道：一、甘木通乙醇提取物不仅能防止家兔实验性高脂血症的形成，还能抑制动脉粥样硬化的形成；二、甘木通水煎剂对麻醉狗急性降压率为25.6～40.2％，麻醉大鼠降压率21.85％，增加离体兔心冠脉灌流量、提高 小鼠减压缺氧耐力，对正常大鼠有显著降甘油三酯作用；三、甘木通提取物通过提高自由基清除能力对结扎家兔冠脉致心肌缺血发挥保护作用，通过提高抗氧化能力和抑制细胞凋亡发挥抗心肌缺血作用等。甘木通广泛分布于我国南方地区，在防治心血管方面的作用确切，被认为是一种无毒性，安全度大，及药源丰富的防治冠心病和高血压的植物药。 

以甘木通的水提取醇沉物为原料，生产的纯中药制剂冠心康片，是临床应用较广的心血管治疗药物。冠心康片具有清热平肝，活血通脉之功效，用于肝经有热、肝阳上亢、脉络瘀阻所致之头痛眩晕、胸痹心痛，肢体麻木等症，临床多用于治疗冠心病心绞痛、高血压等症。临床研究显示，冠心康片治疗冠心病心绞痛安全，临床总有效率达78.3％，能有效减少减轻心肌缺血发作和改善缺血性心电图改变。 

目前，关于甘木通在心血管方面作用的研究和临床应用，均为其提取物，其确切的有效成分尚不清楚。甘木通的水提取物和醇提物，经盐酸镁粉反应、硝酸铝反应均呈阳性，提示甘木通含有黄酮类成分。大量研究证实黄酮类化合物具有抗心肌缺血、降血压、抗心律失常等功效，结合甘木通及其制剂的临床应用，甘木通中黄酮类化合物是其有效成分之一。 

检索中国期刊网，文献报道的主要集中在甘木通提取物的药理作用、提取方法及提取物中黄酮的含量测定三方面。中国专利检索有两项报道。专利CN102389468A描述了一种含甘木通冠心康制剂及其制备方法，以甘木通水提取醇沉的稠膏，或乙醇提取的稠膏为原料，加辅料制备成药物制剂，并采用高效液相法建立了制剂中山奈素的含量测定方法。专利CN102426207A描述了一种甘木通黄酮类成分的检测方法及应用，以含山柰素为对照品溶液，采用高效液相色谱法对甘木通黄酮类成分进行定性和／或定量分析。而市售的甘木通单方制剂“冠心康片”，执行《卫生部药品标准中药成方制剂第十四册》WS3-B-2759-97标准，采用甘木通的水提取醇沉物为原料。 

甘木通在治疗冠心病、高血压等方面有着良好的药效作用，但目前关于甘木通的研究和临床应用，均停留在其粗提取物上，其重要的药效成分甘木通总黄酮，在提取物中含量也不超过1.0％，含量低，既不利于其药效的充分发挥，也不利益于其新药新剂型的开发。本发明采用乙醇提取、层析分离、纯化等工序，从甘木通药材中制备高纯度的甘木通总黄酮，药理实验证实其具有良好的抗心肌缺血作用，可用于缺血性心血管药物的开发。 

发明内容：

本发明的目的在于解决现有技术的不足，经过大量实验研究，提供一种甘木通总黄酮的制备方法及其在抗心肌缺血药物中的应用。 

本发明针对当前甘木通在的研究和临床应用中，均为其粗提取物的现状，以甘木通药材 为原料，利用大孔树脂-硅胶层析耦合法富集作用，制得高纯度的甘木通总黄酮。为实现研究目的，本发明采用如下技术方案： 

一种采用醇提水沉提取，或协同超声波、微波、酶解提取，经大孔树脂-硅胶层析二级分离技术，制得甘木通总黄酮的方法，其步骤如下： 

(1)取甘木通地上部分，阴干，粉碎成粗粉，加入60％～90％乙醇，加热回流提取1～3次，过滤，合并滤液，浓缩至比重1.13～1.17，得甘木通浸膏； 

(2)将甘木通浸膏以10～20倍量水分散均匀，放置沉淀1h～12h，滤过，滤液浓缩至比重1.10～1.15，得甘木通醇提水沉液； 

(3)将所得甘木通醇提水沉液上大孔树脂吸附柱，用水洗杂质，再用5％～20％乙醇洗杂质，然后用50％～80％乙醇洗脱，得甘木通总黄酮半成品洗脱液； 

(4)将所得甘木通总黄酮半成品洗脱液上硅胶层析柱，用丙酮与甲醇的体积比为1～3∶1的混合物洗杂质，再用丙酮与甲醇的体积比为5～7∶1洗脱，得甘木通总黄酮洗脱液； 

(5)将所得总黄酮洗脱液经纯化处理，浓缩，减压干燥，得甘木通总黄酮成品。 

所述的加热回流提取为直接加热回流提取，或协同超声波、微波、酶解提取中的一种，优选协同提取法。所述的大孔树脂选自HPD400、HPD100、DM-13、AB-8或D101等广谱型大孔树脂中的一种，优选D101型。树脂吸附步骤采用湿法装柱，保留液面，将甘木通醇提水沉液通过吸附柱，收集洗脱液。所述的硅胶层析步骤采用湿法装柱，保留液面，将半成品按重量1∶1拌活化后硅胶，并将拌好的混合物移入硅胶柱，加洗脱机，收集洗脱液。硅胶活化条件为110℃持续30min。所述的纯化处理采用活性炭脱色、重结晶等步骤，按4g/100mL总黄酮洗脱液加入活性炭，于25～40℃搅拌10～60分钟，滤过；滤液回收混合溶剂后，浓缩干燥得中间体；中间体用5～10倍乙醇热溶，滤过；滤液放凉析出结晶，抽滤得甘木通总黄酮成品。 

本发明提供的甘木通总黄酮，经体内外药理实验证实，具有良好的抗心肌缺血作用。甘木通总黄酮可增加心脏对缺氧状态下的耐受性，改善心功能，显著抵抗心肌缺氧，明显延长常压缺氧状态下小鼠的存活时间。实验采用多点注射异丙肾上腺素复制大鼠心肌缺血模型，发现本发明提供的甘木通总黄酮可明显降低减少ST段偏移，降低模型大鼠血清中LDH、CPK含量。说明甘木通总黄酮可对抗异丙肾上腺素所致大鼠急性心肌缺血，对缺血心肌细胞有一定的保护作用，具有较强的抗自由基、抗脂质过氧化、提高心肌细胞膜稳定性的作用。本实验还观察了甘木通总黄酮对异丙肾上腺素所致大鼠心肌缺血模型血黏度的影响以及其对血小板聚集率的影响，发现甘木通总黄酮能降低大鼠的血黏度，改善其血液流变性，降低了血小板的聚集率，提示甘木通总黄酮通过提高红细胞、血小板的表面电荷，增加血液有形细 胞之间斥力使电泳减少，加快红细胞及血小板在血中流速，促进轴流，减少边流和聚集粘附，从而达到活血化瘀，降低血液黏度，减少聚集的作用。 

本发明提供的甘木通总黄酮含量在85％以上，可与药用辅料制备成药物制剂，如片剂、胶囊、滴丸与粉针剂，具体应用方法如下： 

在制备成片剂或胶囊时，将甘木通总黄酮与2～5倍量的淀粉、糖粉、糊精、微晶纤维素、乳糖等稀释剂混匀，以水、80％～60％的乙醇为润湿剂，或以1％～20％的淀粉糊、聚维酮、羧甲基纤维素钠等为粘合剂，必要时加入5％～10％的羧甲基淀粉钠、交联聚维酮等崩解剂，按湿法制粒，干燥后整粒，再加入0.5％～3％的硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶等为润滑剂，经压片制成片剂，或灌装入空胶囊制成胶囊剂。 

在制备成滴丸时，将甘木通总黄酮与聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000等基质加热熔融，以0℃～10℃的液体石蜡、二甲基硅油为冷凝剂，滴制成丸，干燥，制成滴丸剂。 

在制备成粉针剂时，将甘木通总黄酮与甘露醇、乳糖为支撑剂混匀，以2～5倍量的注射用水溶解，分装，冷冻干燥，或喷雾干燥，制成粉针剂。 

本发明以甘木通药材为原料，经现代提取分离纯化技术，制得高纯度的甘木通总黄酮。相比于目前甘木通研究和临床应用其粗提取物，本发明提供的甘木通总黄酮，纯度高(85％以上)，具有良好的抗心肌缺血作用。本发明提供的甘木通总黄酮可与药用辅料制备成药物制剂，如片剂、胶囊、滴丸与粉针剂，以口服和注射给药方式应用于隐匿性冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病等心肌缺血性疾病的防治。本发明公开的的甘木通总黄酮制备方法，选用环保的乙醇为溶剂，无残留，无污染；操作简单易推广，生产成本低，适合批量大生产。 

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，使本领域技术人员能更全面的理解本发明，实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及结果仅用于说明本发明，而不应当也不以任何方式限制本发明。 

实施例1：一种采用加热回流提取法，经大孔树脂-硅胶层析二级分离，制备甘木通总黄酮的方法，其步骤如下： 

取甘木通地上部分5kg，粉碎成粗粉，加入18倍量的70％乙醇，加热回流提取2次，分别提取2h和1h，过滤，合并2次滤液，减压回收乙醇，浓缩至比重1.15，得甘木通浸膏；将甘木通浸膏用12倍量水分散均匀，放置沉淀12h，滤过，滤液减压浓缩至比重1.12，得甘木通醇提水沉液；将甘木通醇提水沉液上D101大孔树脂吸附柱，用水洗杂质，再用15％乙醇洗杂质，然后用60％乙醇洗脱，得甘木通总黄酮半成品洗脱液；总黄酮半成品洗脱液减压 回收乙醇，浓缩干燥，得甘木通总黄酮半成品；将所得总黄酮半成品上硅胶层析柱，用丙酮与甲醇的体积比为2∶1的混合溶剂洗杂质，再用丙酮与甲醇的体积比为6∶1洗脱，得总黄酮洗脱液1L；加入40g活性炭，40℃搅拌30min，滤过，滤液，减压回收混合溶剂，浓缩干燥的中间体21g；中间体以8倍量乙醇40℃热溶，趁热滤过，滤液静置放凉，析出结晶，抽滤，滤饼于50℃减压干燥，得甘木通总黄酮成品12g，总黄酮含量为85.6％。 

实施例2：一种采用超声波-回流协同提取法，经大孔树脂-硅胶层析二级分离，制备甘木通总黄酮的方法，其步骤如下： 

取甘木通地上部分5kg，粉碎成粗粉，加入12倍量的70％乙醇，加入1.0％的十二烷基硫酸钠，超声波加热回流提取45min，超声功率200W，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩至比重1.15，得甘木通浸膏；将甘木通浸膏用10倍量水分散均匀，放置沉淀12h，滤过，滤液减压浓缩至比重1.12，得甘木通醇提水沉液；将甘木通醇提水沉液上AB-8大孔树脂吸附柱，用水洗杂质，再用16％乙醇洗杂质，然后用60％乙醇洗脱，得甘木通总黄酮半成品洗脱液，总黄酮半成品洗脱液减压回收乙醇，浓缩干燥，得甘木通总黄酮半成品；将所得总黄酮半成品上硅胶层析柱，用丙酮与甲醇的体积比为1∶1的混合溶剂洗杂质，再用丙酮与甲醇的体积比为5∶1洗脱，得总黄酮洗脱液0.5L；加入20g活性炭，30℃搅拌30min，滤过，滤液，减压回收混合溶剂，浓缩干燥的中间体18g；中间体以10倍量乙醇40℃热溶，趁热滤过，滤液静置放凉，析出结晶，抽滤，滤饼于50℃减压干燥，得甘木通总黄酮成品10g，总黄酮含量为89.2％。 

实施例3：一种采用酶解-回流提取法，经大孔树脂-硅胶层析二级分离，制备甘木通总黄酮的方法，其步骤如下： 

取甘木通地上部分5kg，粉碎成粗粉，加入12倍量的60％乙醇，加入2.0％的纤维素酶，调节pH值为5.5，加热60℃回流提取2次，分别提取2h和1h，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩至比重1.14，得甘木通浸膏；将甘木通浸膏用10倍量水分散均匀，放置12h沉淀，滤过，滤液减压浓缩至比重1.13，得甘木通醇提水沉液；将甘木通醇提水沉液上HPD400大孔树脂吸附柱，用水洗杂质，再用17％乙醇洗杂质，然后用55％乙醇洗脱，得总黄酮半成品洗脱液，总黄酮半成品洗脱液减压回收乙醇，浓缩干燥，得甘木通总黄酮半成品；将所得总黄酮半成品上硅胶层析柱，用丙酮与甲醇的体积比为3∶1的混合溶剂洗杂质，再用丙酮与甲醇的体积比为6∶1洗脱，得总黄酮洗脱液1.5L；加入60g活性炭，40℃搅拌40min，滤过，滤液，减压回收混合溶剂，浓缩干燥的中间体26g；中间体以9倍量乙醇40℃热溶，趁热滤过，滤液 静置放凉，析出结晶，抽滤，滤饼于50℃减压干燥，得甘木通总黄酮成品13g，总黄酮含量为87.7％。 

实施例4：一种采用湿法制粒法，制备甘木通总黄酮的片剂，其步骤如下： 

实施例2制备的甘木通总黄酮20g，与淀粉20g、糊精30g和乳糖30g于混合机中混合15min；在混合粉末中，分次加入5％聚维酮乙醇溶液，混合均匀制成软材；将软材过20目筛制湿颗粒，置烘箱50℃干燥4小时，干颗粒过16目筛整粒，筛除过60目的细粉。将1.0％硬脂酸镁加入到干颗粒中，混合5分钟；调节片重100mg，硬度6～10千克，脆碎度0.6％以下，将总混物进行压制，制成片剂1000片。压片过程中，对片重、硬度、脆碎度等跟踪测量，保证片剂要求的相应指标在可控范围内，将制得的甘木通总黄酮片薄膜包衣。 

实施例5：一种采用滴制法，制备甘木通总黄酮的滴丸，其步骤如下： 

实施例2制备的甘木通总黄酮6g，与聚乙二醇-400018g、聚乙二醇-60006g水浴加热至熔融，冷却剂为药用二甲基硅油，料液温度为80℃，冷却温度为6℃，滴距为4cm，滴头直径3mm，滴制成丸，干燥，制成滴丸剂。滴制过程中，对丸重、硬度、脆碎度等跟踪测量，保证丸剂要求的相应指标在可控范围内，将制得的甘木通总黄酮滴丸薄膜包衣。 

实施例6：一种采用冷冻干燥法，制备甘木通总黄酮的粉针剂，其步骤如下： 

实施例2制备的甘木通总黄酮10g，与乳糖10g混匀，加注射用水100mL，80℃加热成混悬液，备用；另称取甘露醇20g，加注射用水100mL，80℃搅拌条件下，将混悬液缓缓加入，加入0.05％注射用活性炭在80℃搅拌30min，微孔滤膜滤过，滤液定容至300mL，分装，装量3mL／支，冷冻干燥即得。 

为考察本发明提供的甘木通总黄酮的制备方法及其抗心肌缺血作用，按照实施例2制备样片三批。以芦丁为对照品，测定所制备的甘木通总黄酮中总黄酮含量；以银杏叶片组为阳性药物，采用体内外动物实验考察其抗心肌缺血的药理作用。 

1甘木通总黄酮的测定 

测定波长的选择以芦丁为标样，采用NaNO₂-A1(NO₃)₃-NaOH方法测定总黄酮含量。精密称取芦丁对照品10.8mg，以95％乙醇溶解定容至50mL，摇匀，得浓度为0.216mg／mL对照品液。分别吸取提取液和标准液，以95％7醇稀释后，准确移取一定量置25mL量瓶中，加入5％NaNO₂溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加10％Al（NO₃)₃溶液1.0mL，摇匀，放置 6min，再加入4％NaOH10.0mL，最后用95％乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15min。以95％乙醇为参比液，在波长300～700nm区间扫描。扫描结果显示，芦丁对照品液和供试品液在510nm处均有最大吸收，故选取510nm为测定波长。 

线性关系的考察准确移取芦丁对照品液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分别置25mL量瓶中，按“测定波长的选择”方法操作，于510nm处测定吸光度。以浓度(C)与吸光度(A)进行直线回归，得回归方程A=0.0116C+0.00357(r=0.9991)，在4.32～51.84μg／mL范围内线性关系良好。 

甘木通总黄酮成品中总黄酮含量的测定取甘木通总黄酮成品适量，以95％乙醇溶剂和稀释，于510nm处测定A值，计算总黄酮的量，分析成品中黄酮的含量。三批成品中总黄酮含量分别为86.23％、85.57％、85.38％，表明提取工艺稳定可靠，重现性好。 

2甘木通总黄酮对小鼠常压耐缺氧存活实验 

昆明小白鼠50只，体质量18～22g，雌雄各半，随机分为6组，分别为生理盐水组、银杏叶片组和甘木通总黄酮低、中、高剂量组。小鼠禁食12h，灌胃给药，每天给药1次，连续7d。于末次给药后1h，将小鼠分别放入250mL容积的密闭广口瓶内，瓶内放入10g钠石灰(吸收水分和二氧化碳)，钠石灰上垫以滤纸(吸收尿液)，瓶口涂凡士林。放入小鼠后，将瓶加盖密闭开始计时，记录小鼠的存活时间。 

表1甘木通总黄酮对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响

注：与生理盐水组比较。 

结果如表1所示，阳性药物银杏叶片能显著降低小鼠的心耗氧量，延长小鼠的存活时间(P<0.05)，验证了本实验系统的可行性。连续给药7天后，低、中、高剂量甘木通总黄酮均有延长小鼠的存活时间的作用趋势，尤其以中、高剂量组明显（P<0.05)。以上结果显示，中、高 剂量甘木通总黄酮能明显延长小鼠密闭耐缺氧的存活时间，效果接近甚至好于阳性药物。低剂量与生理盐水对照组比较虽然差异不显著，但延长小鼠密闭缺氧存活时间的趋势明显。 

3甘木通总黄酮对异丙肾上腺素所致大鼠急性心肌缺血实验 

经选肢体II导心电正常的W istar大鼠60只，体质量180～220g，雌雄各半，随机分为6组，分别为生理盐水组、模型组、银杏叶片组和甘木通总黄酮低、中、高剂量组。大鼠禁食12h后，灌胃给药，连续给药14d。给药第13d除生理盐水对照组外，其余各组大鼠皮下多点注射异丙肾上腺素(ISO)30mg／kg，复制急性心肌缺血模型，正常对照组大鼠皮下等体积多点注射生理盐水。给药第14d后45min(即造模后24h)，复测心电图，量取T波高度(mv)和ST段偏移(mv)。上述动物麻醉后腹主动脉取血，一部分血离心取血清，测CPK(肌酸磷酸激酶)、LDH(乳酸脱氢酶)的含量，另一部分血肝素抗凝后，测量全血黏度。 

表2甘木通总黄酮对心肌缺血大鼠T波高度、ST段位移的影响

注：与模型组比较，*P<0.05。 

结果如表2所示，模型对照组与正常对照组比较，在各个时间点均能极提高大鼠心电ST段偏移值，提示采用ISO所建立的大鼠心肌缺血模型成功。与模型对照组比较，阳性对照药银杏叶片均能在各时间点明显降低ISO致大鼠ST段的偏移，说明本实验体系具有科学性。连续给药14天后，甘木通总黄酮各剂量组均可不同程度地对抗冠脉结扎所致的心电图ST段的抬高，其中中、高剂量均能显著降低ISO致大鼠的ST段的偏移，效果接近甚至好于阳性对照药，具有明显的抗心肌缺血作用。 

表3甘木通总黄酮对心肌缺血大鼠CPK、LDH含量的影响

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。 

结果如表3所示，与生理盐水组比较，模型对照组大鼠血清CPK、LDH活力均有升高。甘木通总黄酮低、中、高剂量均可降低ISO所致的血清心肌酶活力的升高，其中中、高剂量具有显著作用。从上述数据变化规律看出，随着甘木通总黄酮剂量的增大，其降低心肌酶活力的作用增强，具有明显的剂量效应关系。 

表4甘木通总黄酮对心肌缺血大鼠全血黏度的影响

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。 

结果如表4所示，模型对照组与生理盐水组比较全血黏度明显升高，说明给予异丙肾上腺素后血液黏度增加。与模型对照组比较的结果表明：银杏叶、甘木通总黄酮大、中剂量组均能抑制异丙肾上腺素所致的大鼠血黏度的异常升高。 

4甘木通总黄酮对大鼠血小板聚集率实验 

取Wistar大鼠50只，体质量180～220g，雌雄各半，随机分为5组，分别为生理盐水组、银杏叶片组和甘木通总黄酮低、中、高剂量组。每天灌胃给药1次，连续5d，末次给药后禁食(不禁水)12～18h，腹腔注射水合氯醛350mg／kg麻醉，腹主动脉取血注入枸橼酸钠溶液的硅化离心管中(枸橼酸钠与血比例1∶9)抗凝，于血小板聚集仪上测定ADP诱导的血小板最大聚集率。 

表5甘木通总黄酮对大鼠血小板聚集率的影响 

注：与生理盐水组比较，*P<0.05，**P<0.01。 

结果如表5所示，与生理盐水组比较，银杏叶片组、甘木通总黄酮大、中剂量组均能有效抑制血小板的聚集。 

综合上述实验结果，本发明以甘木通药材为原料，应用大孔树脂-硅胶层析耦合分离纯化，制得高纯度的甘木通总黄酮。制备的三批样品中总黄酮含量高，工艺稳定可靠，重现性好，易于批量大生产。体内外药理实验证实，甘木通总黄酮可抵抗心肌缺氧，对缺血心肌细胞有一定的保护作用，可降低血液黏度，减少血小板聚集，具有显著抗心肌缺血的功效。 

以上所述实施例仅表达本发明的几种实施方式，但并不能由此理解为对本发明专利范围的限制。在不脱离本发明构思的前提下，还可以产生若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围，应以本发明权利要求书保护的范围为准。 

Claims (9)

1.一种甘木通总黄酮的制备方法及其在抗心肌缺血药物中的应用，所述的甘木通总黄酮的制备方法，其特征在于：以甘木通地上部分为原料，经过溶剂提取、大孔树脂-硅胶层析耦合分离和纯化制备而成，所得的总黄酮含量85％以上。

2.根据权利要求1所述的甘木通总黄酮的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)取甘木通地上部分，阴干，粉碎成粗粉，加入60％～90％乙醇，加热回流提取1～3次，过滤，合并滤液，浓缩至比重1.13～1.17，得甘木通浸膏；

(2)将甘木通浸膏以10～20倍量水分散均匀，放置沉淀1h～12h，滤过，滤液浓缩至比重1.10～1.15，得甘木通醇提水沉液；

(3)将所得甘木通醇提水沉液上大孔树脂吸附柱，用水洗杂质，再用5％～20％乙醇洗杂质，然后用50％～80％乙醇洗脱，得甘木通总黄酮半成品洗脱液；

(4)将所得甘木通总黄酮半成品洗脱液上硅胶层析柱，用丙酮与甲醇的体积比为1～3∶1的混合物洗杂质，再用丙酮与甲醇的体积比为5～7∶1洗脱，得甘木通总黄酮洗脱液；

(5)将所得总黄酮洗脱液经纯化处理，浓缩，减压干燥，得甘木通总黄酮成品。

3.根据权利要求2所述的甘木通总黄酮的制备方法，其特征在于所述的加热回流提取为直接加热回流提取，或协同超声波、微波、酶解提取中的一种，优选协同提取法。

4.根据权利要求2所述的甘木通总黄酮的制备方法，其特征在于所述的大孔树脂选自HPD400、HPD100、DM-13、AB-8或D101等广谱型大孔树脂中的一种，树脂吸附步骤采用湿法装柱，保留液面，将甘木通醇提水沉液通过吸附柱，收集洗脱液。

5.根据权利要求2所述的甘木通总黄酮的制备方法，其特征在于所述的硅胶层析步骤采用湿法装柱，保留液面，将半成品按重量1∶1拌活化后硅胶，并将拌好的混合物移入硅胶柱，加洗脱溶剂，收集洗脱液。

6.根据权利要求2所述的甘木通总黄酮的制备方法，其特征在于所述的纯化处理采用活性炭脱色、重结晶等步骤，按4g/100mL总黄酮洗脱液加入活性炭，于25～40℃搅拌10～60min，滤过；滤液回收混合溶剂后，浓缩干燥得中间体；中间体用5～10倍乙醇热溶，滤过；滤液放凉析出结晶，再抽滤，滤饼于40～60℃减压干燥，得甘木通总黄酮成品。

7.根据权利要求1所述的一种甘木通总黄酮的制备方法及其在抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于所述的甘木通总黄酮可延长常压缺氧状态下小鼠的存活时间，对抗异丙肾上腺素所致大鼠急性心肌缺血，降低血液黏度，减少血小板聚集等药理作用。

8.根据权利要求1所述的一种甘木通总黄酮的制备方法及其在抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于抗心肌缺血药物为甘木通总黄酮可与药用辅料制成的片剂、胶囊、滴丸、粉针剂等制剂。

9.根据权利要求8所述的抗心肌缺血药物可应用于隐匿性冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病等心肌缺血性疾病的防治。