发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动,得到了一种芒果叶提取物。本发明人惊奇地发现,所述芒果叶提取物具有良好的降血糖(α–糖苷酶的抑制活性或葡萄糖吸收抑制作用)以及降血脂的作用,并且申请人进一步发现,在一定的范围内(例如芒果苷含量小于90%时),随着提取物中芒果苷的含量的提高,芒果叶提取物的药理作用增强。但是,申请人还惊奇地发现,并非芒果苷的含量越高越好,纯品的芒果苷的葡萄糖吸收抑制作用或者降血脂的作用并不明显,明显不如本发明的芒果叶提取物。由此提供了下述发明:
本发明的一个方面涉及一种制备芒果叶提取物的方法,包括如下步骤:
1)将芒果叶进行有机溶剂提取,得到提取液;
2)将步骤1)中的提取液进行浓缩,取上清液;
3)将步骤2)中的上清液上大孔树脂,洗脱得到洗脱液;
4)将步骤3)中的洗脱液进行浓缩干燥,得到干燥物。
根据本发明任一项所述的方法,其还包括如下的步骤5):
5)将步骤4)中的干燥物用20%-80%乙醇进行重结晶。
根据本发明任一项所述的方法,其特征在于如下的(1)-(3)中的任一项或者多项:
(1)步骤1)中提取为1次或多次,优选为2-3次;提取时间为大于或等于1小时,优选1-3小时(例如1-2、2-3、1.5-2.5、1、2或3小时);
(2)步骤1)中的有机溶剂的用量为干芒果叶的5-20倍量;优选为5-15倍量;更优选为8-10倍量;
(3)步骤1)中的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮以及乙酸乙酯中的一种或多种;具体地,所述乙醇的浓度为20%-80%;优选为50%-70%;更优选为大于60%并且小于或等于70%、65%-70%。
芒果叶提取液的出膏率很高(>18%),以致有效成分之一的芒果苷的含量很低,药理活性降低。因此必须采取适当的方法对芒果叶提取液进行精制,已达到提高芒果苷含量的目的。本发明人通过研究发现,芒果叶提取液经大孔吸附树脂处理后在保留其有效成分的同时可以降低固形物含量,利于制剂成型。此外,大孔吸附树脂化学稳定性高具有较强的吸附能力、选择性好,可以重复使用,从而降低生产成本。
根据本发明任一项所述的方法,其特征在于如下的(1)-(6)中的任一项或者多项:
(1)步骤3)中的大孔树脂选自HPD100、D101、AB-8、D301、HPD400、DA201和NKA-9中的一种;优选为AB-8或D101;
(2)步骤3)中的上柱流速为大于10min/BV;优选为20-80min/BV;更优选为30-50min/BV;进一步优选为40min/BV;
(3)步骤3)中的上样液与大孔树脂的体积比为小于或等于2:1;优选为(1:1)至(2:1);更优选为1:1;
(4)步骤3)中的所述洗脱为1次或者多次,所用洗脱剂为浓度为小于或等于20%的乙醇、小于或等于15%的乙醇或者10%-20%;洗脱剂的用量为1-10倍柱体积,优选为3-5倍柱体积,更优选为5倍柱体积;
(5)步骤3)中的洗脱之前用水进行预洗脱,水的用量为1-10倍柱体积,优选为3-5倍柱体积,更优选为3倍柱体积;
(6)步骤5)中,优选地,用20%-50%、20%-45%或20%-40%的乙醇进行重结晶。优选地,用20%-50%的乙醇溶液洗涤沉淀。具体地,将步骤4)中的干燥物用上述浓度的乙醇溶解,达到过饱和,静置、放凉、离心、弃上层溶液,然后用上述浓度的乙醇溶液洗涤沉淀,充分搅拌混合均匀后再次离心,然后将得到的沉淀干燥。
本发明人惊奇地发现,相对于现有技术中常用的50%-90%的高浓度乙醇洗脱,小于或等于20%的乙醇的洗脱,得到的提取物具有更好的降血糖和降脂效果。
上述方法中,所述浓缩或(浓缩)干燥可以采用本领域人员知晓的方法进行。步骤2)中的上清液可以采用本领域人员知晓的方法得到,例如离心、过滤、超滤等;并且所述离心、过滤或超滤可以在浓缩之前进行,但优选在浓缩之后进行。所述干燥可以是真空干燥。
本发明的另一方面涉及一种芒果叶提取物,其由本发明中任一项所述的方法制得。
本发明的再一方面涉及一种芒果叶提取物,其芒果苷的含量为大于或等于50%、大于或等于55%、大于或等于60%或者大于或等于65%;具体选地,其芒果苷的含量小于90%或小于80%或小于70%;具体地,上述芒果叶提取物由本发明中任一项所述的方法制得。
本发明的实施例2显示,芒果苷标准品对小鼠的糖吸收并没有明显的抑制作用;实施例3-4显示,芒果苷标准品对细胞内TG蓄积并没有明显的抑制作用。不拘于理论的限制,推测可能是芒果叶提取物中除了芒果苷之外的其它某种或者某些成分发挥了作用。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物,其包含本发明任一项所述的芒果叶提取物,可选地,其还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
通常本发明药物组合物含有0.1-90重量%的芒果叶提取物。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时,如果需要,可将芒果叶提取物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合,制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
芒果叶提取物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药,给药途径可为肠道或非肠道,如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等;湿润剂与粘合剂,如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等;崩解剂,例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等;崩解抑制剂,例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等;吸收促进剂,例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等;润滑剂,例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片,例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片,或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等;粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等;崩解剂,如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊,将芒果叶提取物与上述的各种载体混合,并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将芒果叶提取物制成微囊剂,混悬于水性介质中形成混悬剂,亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂,如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂,可以使用本领域常用的所有稀释剂,例如,水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外,为了制备等渗注射液,可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油,此外,还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。
此外,如需要,也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
芒果叶提取物或者本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素,例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度,患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应,所用的具体提取物,给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个,例如二、三或四个剂量形式给药。
本文所用的术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品,以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。
可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平,以便能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体提取物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是,本领域的做法是,提取物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始,逐渐增加剂量,直到得到所需的效果。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的芒果叶提取物或者药物组合物在制备降血糖或降血脂(特别是甘油三酯)的药物或者在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗糖尿病或高血脂的药物中的用途。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的芒果叶提取物或者药物组合物在制备抑制葡萄糖吸收、抑制α–糖苷酶或者抑制甘油三酯蓄积的药物或者试剂中的用途。
本发明的再一方面涉及一种降血糖、降血脂或者预防和/或治疗和/或辅助治疗糖尿病或高血脂的方法,包括给予受试者有效量的本发明任一项上述的芒果叶提取物或者本发明的药物组合物的步骤。
本发明的再一方面涉及一种抑制受试者的葡萄糖吸收、α–糖苷酶活性或者甘油三酯蓄积的方法,包括给予受试者有效量的本发明任一项上述的芒果叶提取物或者本发明的药物组合物的步骤。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制细胞中的葡萄糖吸收、抑制α–糖苷酶活性或者抑制甘油三酯蓄积的方法,包括使用有效量的本发明任一项上述的芒果叶提取物或者药物组合物的步骤。在本发明的一个实施方案中,所述细胞为3T3-L1脂肪前体细胞或HepG2细胞。
当用于上述治疗和/或预防或辅助治疗时,芒果叶提取物或者本发明的药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者,具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定,所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度;所采用的具体组合物;患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;给药时间、给药途径和排泄率;治疗持续时间;同时使用的药物;及医疗领域公知的类似因素。例如,本领域的做法是,剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始,逐渐增加剂量,直到得到所需的效果。一般说来,芒果叶提取物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001-1000mg/kg体重/天,例如介于0.01-100mg/kg体重/天,例如介于0.01-10mg/kg体重/天。
芒果叶提取物或者本发明的药物组合物可以有效地预防和/或治疗和/或辅助治疗本发明所述的各种疾病或病症。
本发明的再一方面涉及芒果叶在制备降血脂(特别是甘油三酯)或者预防和/或治疗和/或辅助治疗高血脂的药物中的用途。例如,可以将芒果叶制备成本发明的芒果叶提取物。
本发明中,
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受芒果叶提取物或者本发明任一项所述的药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物,特别是哺乳动物,例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态,该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
本发明中,所述甲醇或乙醇,如果没有特别说明,可以指100%的甲醇或者乙醇,也可以指甲醇或乙醇的水溶液,其浓度并不特别限定,包括但不限于:20%-90%、30%-90%、20%-80%、30%-80%、50%-70%、10%-20%、15%-20%、50%、55%、60%、65%、70%,等等。并且所述浓度为体积浓度(v/v)。
所述芒果叶,如果没有特别说明,可以是新鲜的或者干燥的,优选干燥的;其可以是芒果叶的全部或者部分。所述芒果叶的干燥程度并不特别限定,例如可以是晒干。优选地,将芒果叶进行切碎或者粉碎,并且切碎或者粉碎的程度并不特别限定。
所述倍量具有本领域人员知晓的一般含义,是指体积/重量(液体/固体),例如ml/g或者L/Kg。
发明的有益效果
本发明的芒果叶提取物具有良好的降血糖(α–糖苷酶的抑制活性或葡萄糖吸收抑制作用)以及降血脂的作用,并且随着提取物中芒果苷的含量的提高,芒果叶提取物的药理作用增强,甚至好于纯品的芒果苷。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:芒果叶提取物样品1的制备
参考图1所示的流程制备样品1。具体步骤如下:
准确称取芒果叶粉末100g,加入8倍量的70%乙醇溶剂,浸泡1小时,煮沸回流提取2小时,趁热过滤,滤渣继续加入8倍量的70%乙醇溶剂,继续回流2小时,合并2次滤液,静置放至室温,精密量取提取液的体积共计1.39L,取1mL,进行HPLC检测,以测定芒果叶提取液中芒果苷的含量。其余溶液回收乙醇并浓缩至尽,60℃真空干燥,得芒果叶提取物样品1。
实施例2:芒果叶提取物样品2的制备
参考图2所示的流程制备样品2。具体步骤如下:
准确称取芒果叶粉末100g,加入8倍量的70%乙醇溶剂,浸泡1小时,煮沸回流提取2小时,趁热过滤,滤渣继续加入8倍量的70%乙醇溶剂,继续回流2小时,合并2次滤液,静置放至室温,精密量取提取液的体积共计1.3L,按照生药(g):溶液体积(mL)=1:2的比例浓缩至200mL,加入等体积的乙酸乙酯混匀,萃取30min待萃取分层后放出乙酸乙酯层,向水层继续加入等体积的乙酸乙酯混匀,萃取30min待萃取分层后放出乙酸乙酯层,重复操作一次,合并乙酸乙酯层回收溶剂并浓缩至尽,60℃真空干燥,得芒果叶提取物样品2。
实施例3:芒果叶提取物样品3的制备
参考图3所示的流程制备样品3。具体步骤如下:
准确称取芒果叶粉末100g,加入8倍量的70%乙醇溶剂,浸泡1小时,煮沸回流提取2小时,趁热过滤,滤渣继续加入8倍量的70%乙醇溶剂,继续回流2小时,合并2次滤液,静置放至室温,精密量取提取液的体积共计1.7L,按照生药(g):溶液体积(mL)=1:2的比例浓缩至200mL,3000转/min,离心15min弃沉淀。精密量取预处理过的D101大孔吸附树脂200mL,湿法上柱。取处理好的浓缩液上样,流速为40min/BV,先用3BV的水预洗脱,5倍量15%乙醇洗脱,15%乙醇洗脱液回收乙醇并浓缩至尽,60℃真空干燥,得芒果叶提取物样品3。
实施例4:芒果叶提取物样品4的制备
参考图4所示的流程制备样品4。具体步骤如下:
准确称取芒果叶粉末400g,加入8倍量的70%乙醇溶剂,浸泡1小时,煮沸回流提取2小时,趁热过滤,滤渣继续加入8倍量的70%乙醇溶剂,继续回流2小时,合并2次滤液,静置放至室温,精密量取提取液的体积共计6.86L,按照生药(g):溶液体积(mL)=1:2的比例浓缩至800mL,3000转/min,离心15min弃沉淀。精密量取预处理过的D101大孔吸附树脂800mL,湿法上柱。取处理好的浓缩液上样,流速为40min/BV,先用3BV的水预洗脱,5倍量15%乙醇洗脱,15%乙醇洗脱液回收乙醇并浓缩至尽,称取芒果苷粗品10g,用50%乙醇溶液20mL加热溶解使溶液达到过饱和状态,静置、放凉、抽滤,然后刮下滤饼用50%乙醇溶液20mL洗沉淀,充分搅拌混合均匀,再次抽滤,把滤饼放入真空干燥箱60℃干燥,得芒果叶提取物样品4。
对照例1:对照组芒果叶提取物样品5的制备
按照现有技术,例如参考公开号为CN1844133A的中国专利申请(申请号为200610079234.5)的实施例1的方法,从芒果叶中制备得到对照组芒果叶提取物样品5。
对照例2:对照组芒果叶提取物样品6的制备
按照现有技术,例如参考公开号为CN1844133A的中国专利申请(申请号为200610079234.5)的实施例2的方法(除了将原料替换为芒果叶),从芒果叶中制备得到对照组芒果叶提取物样品6。
实施例5:转移率和纯度测定
以芒果叶的有效成分芒果苷含量和转移率为指标,对芒果叶提取物样品1-4和对照组芒果叶提取物样品5-6进行评价。
对照品溶液的制备:精密称取干燥24h的芒果苷对照品111.2mg,至于100mL的容量瓶中,用50%甲醇超声溶解,定容至刻度线,制成0.1112mg/mL的对照品溶液。
色谱条件:Cosmosil ODS(4.6mm*250mm,5μm)色谱柱,乙腈—1%冰醋酸溶液(15:85)为流动相,流速1.0mL*min-1,柱温25℃,检测波长254nm;进样量10μL。
样品处理:
芒果叶提取物样品1:取留样的70%乙醇提取液1mL,14000转/min离心15min,即得样品1溶液。
芒果叶提取物样品2:精密称取芒果叶提取物样品2 1.59mg至于离心管中,加入1mL50%甲醇超声溶解,14000转/min离心15min,即得样品2溶液。
芒果叶提取物样品3:精密称取芒果叶提取物样品3 6.45mg至于离心管中,加入6mL50%甲醇超声溶解,14000转/min离心15min,即得样品3溶液。
芒果叶提取物样品4:精密称取芒果叶提取物样品4 3.31mg至于离心管中,加入4mL50%甲醇超声溶解,14000转/min离心15min,即得样品4溶液。
对照组芒果叶提取物样品5:精密称取芒果叶提取物样品5 2.41mg至于离心管中,加入5mL50%甲醇超声溶解,14000转/min离心15min,即得样品5溶液。
对照组芒果叶提取物样品6:精密称取芒果叶提取物样品6 2.39mg至于离心管中,加入5mL50%甲醇超声溶解,14000转/min离心15min,即得样品6溶液。
测定过程:
分别取芒果苷对照品溶液、4个样品溶液、2个对照组样品进样,进样量均为10μL。记录各个峰的面积并对各个样品中芒果苷的含量及转移率进行计算。
计算公式:
结果见表1。
表1:芒果叶提取物样品1-4的测定结果
|
样品 |
转移率% |
纯度% |
实施例1 |
芒果叶提取物样品1 |
92.72 |
10.69 |
实施例2 |
芒果叶提取物样品2 |
74.31 |
15.37 |
实施例3 |
芒果叶提取物样品3 |
58.72 |
24.88 |
实施例4 |
芒果叶提取物样品4 |
36.12 |
62.94 |
对照例1 |
对照组芒果叶提取物样品5 |
12.31 |
92.49 |
对照例2 |
对照组芒果叶提取物样品6 |
14.56 |
93.28 |
实施例6:大孔吸附树脂富集工艺的优化
(1)不同树脂对芒果苷的吸附作用
准确称取粉碎好的芒果叶药材粉末150g,分别加入10倍量的70%乙醇,浸泡1小时,煮沸回流2小时,趁热过滤,滤渣继续加入10倍量的70%乙醇,继续回流2小时,合并2次滤液,减压浓缩至300mL,3000r*15min离心,弃沉淀。取各种预先处理好的树脂3mL放入锥形瓶中,分别加入15mL的上清液,摇匀,放置24℃的恒温水浴锅内震荡24h,过滤,经HPLC测定滤液中芒果苷的量。然后向各种大孔树脂中分别加入10mL的70%乙醇溶液,放置24℃的恒温水浴锅内震荡24h,过滤,用70%乙醇溶液洗大孔树脂,合并滤液,量取滤液的体积,经HPLC测定其中芒果苷的量。从而计算各种大孔树脂的吸附率和解析率。结果见表2。
表2:不同树脂对芒果苷的吸附作用
树脂型号 |
极性 |
吸附量mg/mL |
吸附率% |
解析率% |
HPD100 |
非极性 |
6.12 |
25.08 |
75.97 |
D101 |
非极性 |
9.50 |
38.90 |
56.22 |
AB-8 |
弱极性 |
9.98 |
40.87 |
69.56 |
D301 |
弱极性 |
23.68 |
96.99 |
6.51 |
HPD400 |
中极性 |
11.37 |
46.58 |
76.87 |
DA201 |
极性 |
5.46 |
22.36 |
88.88 |
NKA-9 |
极性 |
10.66 |
43.67 |
33.67 |
吸附量(mg/mL)=(C0V0-Ce*Ve)/V吸附率(%)=(C0V0-Ce*Ve)/C0*V0*100%
解析率(%)=Cp*Vp/(C0V0-Ce*Ve)*100%
式中:C0—原液浓度(mg/mL);Ce—吸附平衡浓度(mg/mL)Cp—解析平衡浓度(mg/mL);V0—原液体积(mL)Ve—吸附平衡溶液体积(mL)Vp—解析平衡溶液体积(mL);
V—处理后树脂体积(mL)
由表2可见,AB-8和D101两种型号的大孔树脂对芒果苷的吸附率和洗脱率是最好的。
(2)上样量
方法:精密量取预处理过的D101大孔吸附树脂15mL,湿法上柱。取大孔树脂静态吸附动力实验中处理好的上清液连续上样,进行动态吸附,控制流速40min/BV,分段收集流出液,每8mL收集一份,共收集8份流出液,HPLC分别测定每份流出液中芒果苷的含量以确定芒果叶提取液的上样量,结果见表3。
表3:动态吸附曲线的考察
上样体积mL |
流出液中芒果苷总量mg |
8 |
0.01 |
16 |
0.17 |
24 |
2.41 |
32 |
9.40 |
40 |
33.21 |
48 |
81.25 |
56 |
87.21 |
64 |
90.19 |
由表3可见,上样液体积达到大约30mL时,上样流出液中芒果苷的量约占上样液中芒果苷量的10%;随着上样液体积的增大芒果苷泄漏量也随之增大。因此适宜的上样液体积应小于或等于30mL。出于上样安全及树脂可以重复使用的考虑。拟定上样液体积与大孔树脂体积相当。
(3)上柱流速
准确称取粉碎好的芒果叶药材粉末40g,共3份,分别加入10倍量的70%乙醇,浸泡1小时,煮沸回流2小时,趁热过滤,滤渣继续加入10倍量的70%乙醇,继续回流2小时,合并2次滤液,减压浓缩至80mL,3000r*15min离心,弃沉淀。上清液按表4所示的上样流速上D101大孔吸附树脂柱,分别收集流出液,HPLC测定流出液中的芒果苷量,从而计算芒果苷损失量及芒果苷损失率。结果见表4。
表4:不同上样流速考察结果
从表4可以看出10min/BV的上样流速过快,不能达到较好的吸附平衡,损失较大的,40min/BV以上即可,为了提高效率选择40min/BV。
(4)洗脱浓度件
将预处理过的AB-8和D101大孔树脂分别装柱,柱床体积为80mL,取树脂型号的筛选实验中得到的芒果叶浓缩液80mL上样。依次用3倍柱床体积水(240mL)洗、6倍柱床体积(480mL)15%乙醇洗脱、3倍柱床体积(240mL)70%乙醇进行洗脱和2倍柱床体积(160mL)95%乙醇进行洗脱,收集各部分洗脱液。对不同洗脱液分别进行芒果苷含量的测定,结果见表5。
表5:不同类型大孔树脂的选择
由表5可见,较低浓度的乙醇(例如15%乙醇)的洗脱效果更好。
(5)预洗脱剂和洗脱剂
上柱完毕后,大孔树脂需用一定量的水或低浓度的醇洗涤除杂以降低出膏率提高芒果苷的含量进而提高药物的药理活性。前期预实验表明,水洗或低醇洗效果的好坏与量的大小有关系。因此,考察了不同水洗或低醇洗的量对芒果苷回收率的影响。
准确称取粉碎好的芒果叶药材粉末40g,共4份,分别加入10倍量的70%乙醇,浸泡1小时,煮沸回流2小时,趁热过滤,滤渣继续加入10倍量的70%乙醇,继续回流2小时,合并2次滤液,减压浓缩至80mL,3000r*15min离心,弃沉淀。
方法:精密量取预处理过的D101大孔吸附树脂80mL,共4份,湿法上柱。取处理好的40g生药的浓缩液80mL[生药:溶液=1:2(g生药/mL)]上样,流速为40min/BV,依次用不同的洗脱剂对D101大孔树脂柱进行洗脱。经HPLC对不同洗脱剂的溶液分别进行芒果苷含量的测定,结果见表6。
表6:不同洗脱方案所得结果
由表6可以看出,芒果苷在稀醇中的溶解度较好,并且低醇洗脱对芒果苷的损失量较大;因此选择水为预洗脱剂,芒果苷在15%和20%中的溶解效果相差不大,因此选用15%乙醇为洗脱剂。即选用水预洗脱,15%乙醇洗脱。
(6)预洗脱体积
准确称取粉碎好的芒果叶药材粉末40g,分别加入10倍量的70%乙醇,浸泡1小时,煮沸回流2小时,趁热过滤,滤渣继续加入10倍量的70%乙醇,继续回流2小时,合并2次滤液,减压浓缩至80mL,3000r*15min离心,弃沉淀。精密量取预处理过的D101大孔吸附树脂80mL,湿法上柱。取处理好的浓缩液80mL[生药:溶液=1:2(g生药/mL)]上样,流速为40min/BV,水作为预洗脱液,我们考察了水洗脱倍数的影响,经HPLC对不同预洗脱体积进行芒果苷含量的测定,结果见表7。
表7:预洗脱剂体积的确定
水洗倍数BV |
杂质质量g |
0 |
0 |
1 |
0.480 |
2 |
0.062 |
3 |
0.037 |
4 |
0.017 |
5 |
0.014 |
6 |
0.011 |
7 |
0.014 |
8 |
0.010 |
从表7可以看出,随着预洗脱剂体积的增加,流出液中杂质的质量稍有增加,但是当预洗脱剂的体积增加到3倍柱体积时,杂质的质量基本没有明显变化,因此我们最终确定用预洗脱剂洗脱3倍柱体积。
(8)洗脱体积
方法:准确称取粉碎好的芒果叶药材粉末40g,分别加入10倍量的70%乙醇,浸泡1小时,煮沸回流2小时,趁热过滤,滤渣继续加入10倍量的70%乙醇,继续回流2小时,合并2次滤液,减压浓缩至80mL,3000r*15min离心,弃沉淀。精密量取预处理过的D101大孔吸附树脂80mL,湿法上柱。取处理好的浓缩液80mL[生药:溶液=1:2(g生药/mL)]上样,流速为40min/BV,先3BV的水预洗脱再用15%乙醇洗脱芒果苷。每80mL为一份收集下口流出液,连续收集9倍柱体积的15%乙醇洗脱流出液,经HPLC分别测定每份体积中芒果苷的量以保证
芒果苷尽可能洗脱完全,结果见表8。
表8:洗脱体积的确定
由表8可见,用5倍量柱床体积的15%乙醇进行洗脱时大部分芒果苷已经被洗脱下来,如果继续用15%乙醇对芒果苷进行洗脱会大大提高生产成本,因此我们最终确定确定收集5倍量柱床体积的15%乙醇洗脱液。
实验例1:芒果叶各样品α–糖苷酶抑制作用的研究
设对照组、样品组和空白组,每组4个复孔。调节恒温摇床至37℃,按表9向各试管加入不同试剂,反应30min。然后放入90-100℃水浴中反应2min,放置至室温后,取50μL反应液加入96孔板中,用葡萄糖试剂盒测试反应溶液中葡萄糖含量。
表9:试剂添加方法
注:加入蒸馏水之后即刻沸水浴2min灭活处理。
按照以上方法测定各组反应生成的葡萄糖,对照组生成的葡萄糖与空白组生成的葡萄糖浓度差控制在5mg/dl(蔗糖底物)。结果如图5所示。
抑制率=(A-B)/(A-C)*100%
其中A为对照组生成葡萄糖量,B为样品组生成葡萄糖量,C为空白组生成葡萄糖量。利用Origin75软件计算出IC50。
芒果叶各有效部位对α–糖苷酶的IC50实验结果如表10。
表10:芒果叶各样品对α–糖苷酶的IC50
样品 |
IC50(μg/mL) |
芒果苷标准品 |
68.33 |
芒果叶提取物样品1 |
172.37 |
芒果叶提取物样品2 |
83.28 |
芒果叶提取物样品3 |
101.49 |
芒果叶提取物样品4 |
71.8 |
对照组芒果叶提取物样品5 |
74.2 |
对照组芒果叶提取物样品6 |
76.1 |
半数抑制率(IC50)通常被用来评价药物对酶抑制能力的大小,即酶抑制剂抑制酶一半的活性时所需抑制剂的浓度。IC50值越低,抑制剂对酶的抑制能力越强。小肠二糖水解酶抑制活性实验结果表明,一定范围内(芒果苷含量低于90%),芒果苷的含量越高对糖苷酶的抑制活性越强。
小结:芒果叶各样品中芒果苷标准品、芒果叶提取物样品1-4对α–糖苷酶均有抑制活性,但是芒果叶提取物样品4对小鼠小肠内的α–糖苷酶的抑制活性较强。对照组均具有α–糖苷酶的抑制活性。
实验例2:芒果叶提取物样品小鼠糖耐量实验
实验流程:昆明小鼠禁食不禁水14h,正常组、模型组小鼠灌胃5%的阿拉伯胶溶液,灌胃体积为10ml/kg体重;给药组小鼠灌胃100mg/kg的芒果叶有效部位,灌胃体积为10ml/kg体重。30min后正常组灌胃蒸馏水10ml/kg体重,其余各组灌胃质量分数为0.2g/ml的蔗糖溶液,此时间规定为零点。此后30min、60min、120min,眼眶取血,离心,测定血清葡萄糖水平。按照葡萄糖试剂盒说明书对不同组不同时间点血清中葡萄糖进行测定,结果见表11。
表11:芒果叶各样品对糖耐量小鼠血糖的影响
注:与模型组相比P*<0.05,P**<0.01
糖耐量实验,正常组小鼠血糖水平基本不变;模型组小鼠血糖在负荷蔗糖后30min达到高峰,以后缓慢下降。芒果叶提取物样品4在糖负荷后30min时与模型组比有显著性差异;芒果叶提取物样品1、芒果叶提取物样品2、芒果叶提取物样品3以及芒果叶提取物样品4在糖负荷60min时与模型组比有明显差异,芒果叶提取物样品4组差异更加显著。120min时小鼠血糖水平基本趋于稳定。
小结:糖耐量实验,随芒果叶提取物中芒果苷含量的增加更加有效抑制小鼠机体对葡萄糖的吸收。芒果叶提取物样品4抑制小鼠机体对葡萄糖的吸收作用更为明显,但是芒果苷标准品对小鼠的糖吸收并没有明显的抑制作用,对照组没有明显作用。
实验例3:3T3-L1脂肪前体细胞的培养、诱导分化及给药
1.13T3-L1脂肪前体细胞的培养
在超净台内配置DMEM低糖完全培养液40mL,水浴加热到37℃并分装入25cm2培养瓶中,每瓶约8mL。从超低温冰箱中取出冻藏的T3-L1脂肪前体细胞,在1-2分钟内于37℃水浴中振荡溶解冻藏细胞,将溶解后的细胞溶液倒入培养瓶中,吸取1mLDMEM低糖完全培养液清洗细胞冻存管两次,合并清洗液加入培养瓶,摇匀,放置37℃培养箱(5%CO2、95%空气)中培养8h,细胞基本贴壁,将培养瓶中培养液倒出加入新配制的DMEM低糖完全培养液继续培养。细胞长至约80%时,按1:6传代,一周换液2-3次,每天观察并记录细胞状态。
1.23T3-L1脂肪前体细胞的诱导分化
待细胞融合至约80%时,按1*106cells/mL接种细胞于48孔板,在37℃培养箱(5%CO2、95%空气)中培养,待细胞完全融合后开始诱导;将培养液换成含有0.5nmol/L IBMX,1μmol/L地塞米松,10μg/mL胰岛素的高糖DMEM完全培养液进行诱导分化;培养72h后,换为含5μg/mL胰岛素的高糖DMEM完全培养液进行培养,继续培养72h后,换高糖DMEM完全培养液维持培养,每两天换一次液。培养至第14天,约90%细胞分化为成熟脂肪细胞。
1.3分组给药
将细胞接种于48孔板后分成空白组(只加培养基)、模型组(加培养基和诱导剂,不加药)和加药组,按1.2方法诱导细胞分化,在诱导同时加入待测药品。临时用全培基将样品稀释为100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL,其中DMSO含量小于0.1%。前期实验结果表明该浓度DMSO对细胞形态、生长过程无显著影响。
2、细胞内甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)含量的测定
2.1细胞内甘油三酯(TG)含量的测定
吸除48孔板中细胞上清液,每孔加入200mL蒸馏水清洗48孔板,弃去清洗液并每孔加入200mL蒸馏水,超声破碎细胞,将100μL溶液转移至96孔板,应用多功能微孔板分析仪,按照试剂盒方法检测TG含量。测定样品对细胞中TG含量的影响。
2.2细胞内游离脂肪酸(FFA)含量的测定
吸除48孔板中细胞上清液,每孔加入200mL蒸馏水清洗48孔板,弃去清洗液并每孔加入200mL蒸馏水,超声破碎细胞,将80μL溶液转移至96孔板,应用多功能微孔板分析仪,按照试剂盒方法检测FFA含量。测定样品对细胞中FFA含量的影响。
3、统计方法
实验数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS11.5统计软件,运用单因素方差分析进行各组间比较,显著性水平以0.05和0.01为标准。
3.13T3-L1脂肪前体细胞诱导分化前及分化后形态学变化
诱导分化前,3T3-L1细胞呈不规则梭形成纤维细胞形态,细胞内无脂滴。第一次加入诱导液72h后,细胞呈网状纤维形态。诱导6天后细胞变大,细胞内有脂滴形成。细胞呈椭圆形、圆形。诱导14天时,90%细胞分化为成熟脂肪细胞,细胞内脂滴明显,分布于细胞核周围,形成“戒环状”结构。
3.2芒果叶提取物不同样品不同浓度对诱导后3T3-L1细胞内TG含量的影响
在3T3-L1诱导过程中,加入不同浓度(100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL)的芒果叶提取物不同部位,诱导14天后,测定细胞内甘油三酯的含量。结果见表12。
表12:芒果叶提取物各样品不同浓度对诱导后3T3-L1细胞内TG含量的影响
注:与模型组相比P*<0.05,P**<0.01。
3.3芒果叶提取物不同样品不同浓度对诱导后3T3-L1细胞内FFA含量的影响
在3T3-L1诱导过程中,加入不同浓度(100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL)的芒果叶提取物不同部位,诱导14天后,测定细胞内游离脂肪酸的含量。结果见表13。
表13:芒果叶提取物各样品不同浓度对诱导后3T3-L1细胞内FFA含量的影响
注:与模型组相比P*<0.05,P**<0.01。
小结:3T3-L1脂肪前体细胞的培养、诱导分化及给药实验,随芒果叶有效部位中芒果苷含量的增加更加有效抑制细胞内TG蓄积,说明有效活性成分有所保留。芒果叶提取物样品4更能有效的抑制3T3-L1脂肪前体细胞内甘油三酯的蓄积;但是芒果苷标准品对细胞内TG蓄积并没有明显的抑制作用,芒果苷含量高的对照组样品没有明显抑制作用。
实验例4:HepG2细胞的培养、诱导分化及给药
1.1HepG2细胞的培养
在超净台内配置MEM完全培养液40mL,水浴加热到37℃并分装入25cm2培养瓶中,每瓶约8mL。从超低温冰箱中取出冻藏的HepG2细胞,在1-2分钟内于37℃水浴中振荡溶解冻藏细胞,将溶解后的细胞溶液倒入培养瓶中,吸取1mLMEM完全培养液清洗细胞冻存管两次,合并清洗液加入培养瓶,摇匀,放置37℃培养箱(5%CO2、95%空气)中培养8h,细胞基本贴壁,将培养瓶中培养液倒出加入新配制的MEM完全培养液继续培养。细胞长至约80%时,按1:6传代,一周换液2-3次,每天观察并记录细胞状态。
1.2HepG2细胞的诱导分化
待细胞融合至约80%时,按4*104cells/mL接种细胞于48孔板,在37℃培养箱(5%CO2、95%空气)中培养,待细胞完全融合后开始诱导;将培养液换成含有0.2mM油酸钠的无酚红DMEM完全培养液进行诱导分化;培养48h约90%细胞分化为成熟脂肪细胞。
1.3分组给药
将细胞接种于48孔板后分成空白组(只加培养基)、模型组(加培养基和诱导剂,不加药)和加药组,按1.2方法诱导细胞分化,在诱导同时加入待测药品。临时用全培基将样品稀释为100μg/ml,其中DMSO含量小于0.1%。前期实验结果表明该浓度DMSO对细胞形态、生长过程无显著影响。
2、细胞内甘油三酯(TG)含量的测定
2.1细胞内甘油三酯(TG)含量的测定
吸除48孔板中细胞上清液,每孔加入200mL蒸馏水清洗48孔板,超声破碎细胞,将100μL溶液转移至96孔板,应用多功能微孔板分析仪,按照试剂盒方法检测TG含量。测定样品对细胞中TG含量的影响。
3、统计方法
实验数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS11.5统计软件,运用单因素方差分析进行各组间比较,显著性水平以0.05和0.01为标准。
3.1HepG2细胞诱导分化前及分化后形态学变化
诱导分化前,HepG2细胞呈不规则梭形成纤维细胞形态,细胞内无脂滴。诱导2天时,90%细胞分化为成熟脂肪细胞,细胞内脂滴明显,分布于细胞核周围,形成“戒环状”结构。
3.2芒果叶提取物不同样品不同浓度对诱导后HepG2细胞内TG含量的影响
在HepG2诱导过程中,加入100μg/ml的芒果叶提取物不同部位,诱导2天后,测定细胞内甘油三酯的含量。结果见表14。
表14:芒果叶提取物各样品不同浓度对诱导后HepG2细胞内TG含量的影响
小结:HepG2细胞的培养、诱导分化及给药实验,随芒果叶有效部位中芒果苷含量的增加更加有效抑制细胞内TG蓄积,说明有效活性成分有所保留。但是芒果苷标准品对细胞内TG蓄积并没有明显的抑制作用,芒果苷含量90%以上的对照组芒果叶提取物没有明显的抑制效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。