CN1730015A - 金银花提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种金银花提取物,以及该提取物的制备方法,该方法能够提高活性成分含量,去除大量杂质,同时重复性、稳定性好,并且原料的得率高,成本低,适合工业化生产。该金银花提取物中主要活性成分绿原酸的重量百分含量至少为25%。该金银花提取物的制备过程如下:取金银花药材,加8~20倍体积的水提取2~4次,每次0.5~1.5小时,调节提取液的pH为1~6,上大孔吸附树脂柱,先用水洗脱杂质,再用10~70%的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,调节浓缩液pH为1~6,加乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,浓缩、干燥。该不但提取物中的活性成分的含量提高,提高了疗效,而且去除了大量杂质,既解决了中成药常有的吸潮性大的问题,又减少了副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种金银花提取物,以及从中药金银花中提取该金银花提取物的方法,和该提取物的片剂、胶囊或注射剂等剂型以及在制备抗病毒感染药物上的应用,属医药领域。
背景技术
近年来新的抗病毒药物不断出现,但是病毒性感染的发病率仍然持久不衰,特别是20世纪80年代艾滋病及其病原病毒的出现,21世纪SARS病毒的出现,对抗病毒药物的开发提出了紧迫性要求。据调查,对于流感的治疗,65%的消费者会选择中成药治疗。在PPA事件后,因康泰克和康得等药品禁用将腾出约64亿元的市场空间。而消费者纷纷偏向服用中药或中成药。据国家药品监督管理局南方医药经济研究所的一份研究报告显示,今年第二季度,上海、成都等城市中药、中成药的销售金额上升了4.4%至8.8%。目前已知的流感病毒有甲、乙、丙型,已知的西药金刚烷胺和金刚乙胺易产生耐药性,同时也出现眩晕、失眠等不良反应。由于以上等原因,仍然需要不断开发新的高效低毒的治疗药物来满足广大人民群众的健康需要。
金银花,本品为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山银花Lonicera confusa DC.或毛花柱忍冬Loniceradasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花。夏初花开放前采收,干燥;或用硫磺熏后干燥。多产于山东、河南,多为栽培。主要功效为清热解毒。主治温病发热,热毒血痢,痈肿疔疮,喉痹及多种感染性疾病。近年来国内外学者,应用现代理论知识进行了全面分析和研究,作了大量的药理临床工作,从科学的角度,证实了金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、及解热抗炎、利胆、保肝、降脂等多种药理作用。由于它的特殊药效,在2003年抗击SARS的斗争中,很受专家青睐,在国家中医管理局推荐防治SARS的中药处方中,大多数都有金银花,它为抗击SARS力下了汗马功劳。目前含金银花的产品大多为传统中药产品,组方复杂,虽具一定的疗效,但也存在着服用量大、起效慢、使用不方便、药效有限及质量控制难等缺点。
金银花的主要活性成分为绿原酸,我们的提取物中正是以绿原酸为主。文献报道的传统的金银花提取物的制备方法有水提法、醇提法、水提醇沉法、醇提水沉法,由于金银花药材的成分复杂,含有很多绿原酸以外的成分,所以传统的制法得到的绿原酸的含量一般较低。
发明内容
本发明针对目前的技术状况,提供一种金银花提取物,该提取物中有效成分的含量高。
本发明的另一目的是提供种金银花提取物的制备方法,该方法能够提高活性成分含量,去除大量杂质,同时重复性、稳定性好,并且原料的得率高,成本低,适合工业化生产。
本发明还提供该金银花提取物的应用。
为解决上述技术问题,本发明研究制订了如下技术方案。
一种金银花提取物,其特征在于金银花提取物中主要活性成分绿原酸的重量百分含量至少为25%。
上述金银花提取物中绿原酸的重量百分含量为25~95%。
本发明的金银花提取物与药学上可接受的载体和/或赋形剂制成的任何一种制剂,如胶囊、片剂或注射剂等。
本发明金银花提取物的制备方法,其制备过程如下:
取金银花药材,加8~20倍体积的水提取2~4次,每次0.5~1.5小时,调节提取液的pH为1~6,上大孔吸附树脂柱,先用水洗脱杂质,再用10~70%的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,调节浓缩液pH为1~6,加乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,浓缩、干燥。
上述方法中所用大孔树脂型号为D-101、D-201、D-301或AB-8。
上述方法中调节提取液的pH值的范围为2~3;调节浓缩液的pH值的范围为2~3。
本发金银花提取物在制备治疗病毒感染药物中的应用。
本发明相比现有技术具有如下优点:
本发明运用大孔树脂分离技术,采用水提液调pH上大孔吸附树脂柱,水洗脱后再用10~70%的乙醇洗脱,最后再用乙酸乙酯精制的方法,取得良好的效果,此方法不但操作简便,降低了成本,而且非常适合工业化生产。大量研究表明,D-101、D-201、D-301或AB-8型大孔树脂对绿原酸的吸附分离效果最好。
上述方法制得的金银花提取物,与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合,按常规方法制成含有上述金银花提取物为主要活性成分的口服制剂,如片剂、胶囊、滴丸、软胶囊等,以及胃肠道外途径给药的制剂,如粉针、注射液等。
采用本发明制得的金银花提取物中,其主要活性成分绿原酸,通过高效液相法测定,绿原酸的含量可占金银花提取物的25~95%。药效学试验证明本发明的金银花提取物总体上有很好的抗病毒的功效,与传统的制剂相比,本发明治疗病毒感染的有效剂量小,毒副作用小。
本发明由于采用了中药现代化技术中的大孔吸附树脂技术,不但使提取物中的活性成分的含量提高,提高了疗效,而且去除了大量杂质,既解决了中成药常有的吸潮性大的问题,又减少了副作用。
本发明对金银花提取物的制备方法在现有技术的基础上作了改进,针对现有的水提法、醇提法、水提醇沉及大孔树脂吸附分离方法的不足,运用大孔吸附树脂分离技术,采用水提液调pH上大孔吸附树脂柱,水洗脱后再用10~70%的乙醇洗脱,最后再用乙酸乙酯精制的方法,取得良好的效果,此方法不但操作简便,降低了成本,而且非常适合工业化生产。大量研究表明,D-101、D-201、D-301或AB-8型大孔树脂对绿原酸的吸附分离效果最好。
本发明制备的金银花提取物的药效试验:
采用多种动物模型研究本发明(实施例6所制备)金银花注射液的药效,并和目前市场上主要的抗感冒药双黄连注射液对照,其方法和结果如下:
1对流感病毒感染小鼠的保护作用
1.1对流感病毒鼠肺适应株感染小鼠死亡的保护作用
1.1.1方法
取ICR小鼠114只,体重13~16g,♂♀各半,随机分为6组,每组19只。(1)空白对照组:等量NS 10ml/kg;(2)模型组:等量NS 10ml/kg;(3)双黄连组:6g/kg;(4)金银花注射液I组:6.6g/kg;(5)金银花注射液II组:13.2g/kg;(6)金银花注射液III组:26.4g/kg。以上各组小鼠均腹腔注射给药。各组每日给药1次,连续给药5日。末次给药1h后除空白对照组外,其余各组在乙醚浅麻醉下,以病毒尿囊液给小鼠滴鼻感染,每鼠50μl(3个LD50致死量),观察14天内动物感染后发病及死亡情况。
1.1.2结果
实验结果显示:金银花注射液三个剂量组均可显著降低流感病毒感染小鼠死亡数,26.4g/kg剂量组可明显延长流感病毒感染小鼠的存活天数(P<0.05)。表明金银花注射液对流感病毒感染小鼠具有明显的保护作用。见表1。
表1 金银花注射液对流感病毒感染小鼠死亡的保护作用
组别 | 动物数(只) | 剂量(g/kg) | 死亡数(只) | 死亡率(%) | 保护率(%) | 存活天数( x±s) |
空白对照组模型组双黄连组金银花I组金银花II组金银花III组 | 191919191919 | --66.613.226.4 | 01711131110 | 089.557.968.457.952.6 | 100.010.542.131.642.147.4 | 14±08.37±2.39##10.42±3.29*8.95±3.5510.16±3.36710.79±3.31* |
##p<0.01与空白对照组比较;*p<0.05与模型组比较
1.2对流感病毒感染小鼠肺指数及肺病变的影响
1.2.1方法
取ICR小鼠72只,体重18~22g,♂♀兼用。随机分6组,每组12只。(1)空白对照组:等量NS 10ml/kg;(2)模型组:等量NS 10ml/kg;(3)双黄连组:6g/kg;(4)金银花注射液I组:6.6g/kg;(5)金银花注射液II组:13.2g/kg;(6)金银花注射液III组:26.4g/kg。以上各组小鼠均腹腔注射给药,给药容量10ml/kg。各组每日给药1次,连续给药5日。除空白对照组外,其余各组于给药第1天,在乙醚浅麻醉下以病毒尿囊液滴鼻感染小鼠,每鼠50μl(20个LD50致死量)。然后继续给药4天。末次给药后将小鼠禁食(不禁水),次日进行下列实验:①小鼠称重后脱颈处死,解剖,取全肺称重,计算各鼠肺指数值(g/10g体重)和肺指数抑制率[(药物组-模型组)/模型组×100%];②取肺,用1%甲醛溶液固定后,常规取材,脱水,石蜡包埋,制片,HE染色后作病理组织学检查,观察肺部病变程度。
1.2.2结果
1.2.2.1对流感病毒感染小鼠肺指数的影响
实验结果显示:金银花注射液13.2g/kg和26.4g/kg剂量组均可明显降低流感病毒感染小鼠的肺指数值,肺指数抑制率分别为15.60%和24.67%。表明金银花注射液具有减轻流感病毒感染小鼠肺部病变的作用。见表2。
表2 金银花注射液对流感病毒感染小鼠肺指数的影响(
x±s)
组别 | 剂量(g/kg) | 动物数(只) | 肺指数(g/g) | 肺指数抑制率(%) |
空白对照组模型组双黄连组金银花I组金银花II组金银花III组 | --66.613.226.4 | 121212121212 | 0.7138±0.12191.5293±0.2326##1.2566±0.2294**1.3381±0.32011.2907±0.2932*1.1520±0.1288** | 17.8312.5015.6024.67 |
##p<0.01与空白对照组比较;*p<0.05**p<0.01与模型组比较
1.2.2.2对流感病毒感染小鼠肺病变的影响
用流感病毒复制的肺部炎性病变,主要表现为肺部炎症性病变,包括急性支气管炎及其周围炎、小叶性肺炎及间质性肺炎。本发明的金银花注射液能减轻肺部炎症的病变,各剂量组相比,以大剂量组减轻肺部炎症的效果最好,其次为中剂量组,与模型组比较具有显著性差异(p<0.05,0.01)。表明金银花注射液能减轻流感病毒所致小鼠的肺部感染,具有抗流感病毒的作用。
表3 金银花注射液对流感病毒感染小鼠肺病变的影响
组别 | 剂量(g/kg) | 例数 | 平均积分值( x±s) |
空白对照组模型组双黄连组金银花注射液I组金银花注射液II组金银花注射液III组 | --66.613.226.4 | 101010101010 | 2.1±1.56.6±1.9##4.8±1.8*5.7±1.45.0±1.3**4.0±1.3** |
##p<0.01与空白对照组比较;*p<0.05,**p<0.01与模型组比较
注:病变积分根据病变程度不同,依次标记为“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”。
“-”为无明显改变,记为0分;“+”为轻度病变改变,记为1分;
“++”为中度病理改变,记为2分;“+++”为重度病理改变,记为3分;
“++++”为极重度病理改变,记为4分。积分值越高,表示病变程度越重。
2对金黄色葡萄球菌感染小鼠的保护作用
2.1方法
2.1.1菌液制备
取临床分离金黄色葡萄球菌接种于营养肉汤培养基中,置37℃孵箱培养18h。取出,划线于血平板上(10%羊红细胞营养琼脂平板),37℃孵箱培养20h。取出,用6ml 5%的胃膜素(pH 7.2)洗脱菌落,并用4ml生理盐水溶液将血平板冲洗干净,合并后吹打,使菌落分散并分别用生理盐水配成0.33ml/ml、0.20ml/ml、0.11ml/ml、0.06ml/ml浓度菌液备用。
2.1.2选择合适的菌液浓度
取ICR小鼠40只,♀♂各半,体重18~22g。随机分组,每组1个浓度,腹腔注射金黄色葡萄球菌菌液,每鼠0.5ml,观察感染小鼠死亡数,结果感染小鼠死亡率分别为100%、90%、80%、40%。故实验选用0.11ml/ml浓度菌液。
2.1.3对金黄色葡萄球菌感染小鼠的保护作用
取18~22g ICR小鼠133只,随机分组,每组19只,♀♂兼用。(1)正常对照组:等量NS 10ml/kg;(2)模型组:等量NS 10ml/kg;(3)双黄连组:6g/kg;(4)金银花注射液I组:6.6g/kg;(5)金银花注射液II组13.2g/kg;(6)金银花注射液III组26.4g/kg。以上各组小鼠均腹腔注射给药,给药容量10ml/kg。各组每日给药1次,连续给药5日。第3日给药后1h,除空白对照组以外,其余各组均腹腔注射金黄色葡萄球菌培养液0.5ml/鼠(菌液浓度0.11ml/ml)。然后继续给药2日。观察各组动物7日内死亡情况。
2.2结果
实验结果显示:本发明金银花注射液三个剂量组对金黄色葡萄球菌感染小鼠可降低其死亡率,13.2g/kg和26.4g/kg组可延长感染小鼠的存活天数,与模型组比较具有显著性差异(P<0.05),表明本发明金银花注射液对金黄色葡萄球菌感染小鼠具有明显的保护作用。见表4。
表4 金银花注射液对金黄色葡萄球菌感染小数死亡的保护作用
组别 | 动物数(只) | 剂量(g/kg) | 死亡数(只) | 存活率(%) | 存活天数( x±S) |
正常对照组模型组双黄连组金银花I组金银花II组金银花III组 | 191919191919 | --66.613.226.4 | 0141010910 | 100.026.3247.3747.3752.6347.37 | 7±02.89±2.62##4.47±2.784.37±2.895.00±2.47*4.89±2.45* |
##p<0.01与正常对照组比较;*p<0.05**p<0.01与模型组比较
3、本申请人其他研究结果表明:
金银花2、4、8g/kg耳缘静脉给药对内毒素所致家兔发热具有退热作用,金银花3.3、6.6、13.2g/kg腹腔注射对干酵母所致大鼠发热也具有退热作用,表明金银花具有较明显的解热作用。金银花6.6、13.2、26.4g/kg静脉注射给药,剂量依赖性抑制醋酸所致小鼠扭体反应,且大剂量组能显著提高电刺激致痛小鼠的痛阈,表明金银花具有较明显的镇痛作用。金银花6.6、13.2、26.4g/kg静脉注射给药,明显抑制巴豆油所致小鼠耳肿胀反应,且对乙酸致小鼠毛细血管通透性增加有一定的抑制作用,表明金银花注射液具有较明显的抗炎作用。金银花6.6、13.2、26.4g/kg腹腔注射给药,连续7天,可明显升高环磷酰胺免疫抑制小鼠单核巨噬细胞系统的吞噬功能;26.4g/kg组也显著增强环磷酰胺免疫抑制小鼠的迟发型超敏反应;13.2、26.4g/kg对环磷酰胺免疫抑制小鼠的血清溶血素水平呈回升趋势,表明金银花对机体的免疫功能具有增强作用。
综上,本发明的金银花注射液具有较好的抗菌抗病毒、解热、镇痛、抗炎、镇咳和增强免疫功能的作用,对于流行性感冒有显著的治疗作用。
此外,本发明克服了中药传统工艺的缺陷,运用中药现代化技术中的大孔树脂吸附技术,提供了了一种含量高、成分明确、质量可控、疗效确却、副作用小的金银花提取物及其制备方法,为一种高效、低毒的现代化中药。本发明的制备工艺重现性、稳定性都好,原料的得率高,适合工业化生产。
附图说明
图1为金银花提取物中绿原酸对照品HPLC图谱。
图2为本发明金银花提取物中供试品HPLC图谱。
具体实施方法
实施例中,金银花药材分别购自山东平邑县,均符合《中国药典》2005版一部中“金银花”项下的规定。
提取物中绿原酸测定方法:照高效液相色谱法HPLC(《中国药典》2005版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适应性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87)为流动相;检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000。
对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品适量,置棕色瓶中,加50%甲醇制成每1ml含40μg的溶液,即得(10℃以下保存)。
提取物供试品溶液的制备:精密称取提取物0.1g,置100ml棕色量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取2ml,置25ml棕色量瓶中,加50%乙醇至刻度,摇匀,即得。
测定方法:分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得图1、图2。
下列实施例旨在进一步描述本发明,而不是以任何方式限制本发明。
实施例1:
取金银花药材(产地:山东平邑)100kg,分别加水1000L、800L提取2次,每次1.5小时,将提取液调pH1,上D101大孔吸附树脂柱,用水充分洗脱至流出液为澄清且无还原糖反应后,再用10%的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,浓缩液调pH3,加乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,浓缩、干燥,得金银花提取物2.24kg。
经HPLC法测定:上述实验所得金银花提取物中绿原酸含量为72%。
实施例2:
取金银花药材(产地:山东平邑)100kg,分别加水1500L、1000L、1000L提取3次,每次1小时,将提取液调pH至3,上D201大孔吸附树脂柱,用水充分洗脱至流出液为澄清且无还原糖反应后,再用30%的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,浓缩液调pH至1,加乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,浓缩、干燥,得金银花提取物2.30kg。
经HPLC法测定:上述实验所得金银花提取物中绿原酸含量为80%。
实施例3:
取金银花药材(产地:山东平邑)100kg,分别加水2000L、800L、800L、800L提取4次,每次0.5小时,将提取液调pH至6,上D301大孔吸附树脂柱,用水充分洗脱至流出液为澄清且无还原糖反应后,再用70%的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,浓缩液调pH至6,加乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,浓缩、干燥,得金银花提取物2.42kg。
经HPLC法测定:上述实验所得金银花提取物中绿原酸含量为76%。
实施例4:
取金银花药材(产地:山东平邑)100kg,分别加水2000L、1000L、1000L、1000L提取4次,每次0.5小时,将提取液调pH至2,上AB-8大孔吸附树脂柱,用水充分洗脱至流出液为澄清且无还原糖反应后,再用20%的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,浓缩液调pH至3,加乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,浓缩、干燥,得金银花提取物2.28kg。
经HPLC法测定:上述实验所得金银花提取物中绿原酸含量为84%。
实施例5:
金银花冻干的制备:
取实施例1所得金银花提取物1.12kg,加适量注射用水,再加入活性炭0.02g,加热煮沸15分钟,滤过,加水至9L,用1%的NaOH调pH至5.5,静置,冷藏,过夜,滤过,滤液加入NHSO3 0.02g.加注射用水至10L,分装成5000瓶,冷冻干燥,压盖密封即得。用法用量为每日1次,静脉注射或加入生理盐水或5%~10%的葡萄糖溶液中静脉滴注。
实施例6:
金银花注射液的制备:
取实施例2所得金银花提取物1.15kg,加适量注射用水,再加入活性炭0.02g,加热煮沸15分钟,滤过,加水至9L,用1%的NaOH调pH至6,静置,冷藏,过夜,滤过,滤液加入NHSO3 0.02g,加注射用水至10L,精滤,罐装(10ml/支),灭菌,即得。用法用量为每日1次,静脉注射或加入生理盐水或5%~10%的葡萄糖溶液中静脉滴注。
实施例7:
金银花胶囊的制备:
取实施例3的金银花提取物900g,淀粉225g,β-环糊精225g混匀,制粒,过筛,干燥后装成5000粒胶囊(0.27g/粒),即得。用法用量:口服,每次2粒,每日1次。
实施例8:
金银花片的制备方法:
取实施例3的金银花提取物900g,淀粉225g,β-环糊精225g混匀,制粒,过筛,干燥后压成5000片(0.27g/片),即得。用法用量:口服,每次2片,每日1次。
Claims (8)
1、一种金银花提取物,其特征在于金银花提取物中主要活性成分绿原酸的重量百分含量至少为25%。
2、根据权利要求1所述的金银花提取物,其特征在于所述金银花提取物中绿原酸的重量百分含量为25~95%。
3、根据权利要求1所述的金银花提取物,其特征在于该金银花提取物与药学上可接受的载体和/或赋形剂制成的任何一种制剂。
4、根据权利要求3所述的金银花提取物,其特征在于所述制剂为胶囊、片剂或注射剂。
5、权利要求1所述的金银花提取物的制备方法,其制备过程如下:
取金银花药材,加8~20倍体积的水提取2~4次,每次0.5~1.5小时,调节提取液的pH为1~6,上大孔吸附树脂柱,先用水洗脱杂质,再用10~70%的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,调节浓缩液pH为1~6,加乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,浓缩、干燥。
6、根据权利要求5所述的金银花提取物的制备方法,其特征在于:大孔树脂型号为D-101、D-201、D-301或AB-8。
7、根据权利要求5所述的金银花提取物的制备方法,其特征在于:调节提取液的pH值的范围为2~3;调节浓缩液的pH值的范围为2~3。
8、权利要求1所述的金银花提取物在制备治疗病毒感染药物中的应用。
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