CN1857394A - 中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中医药防治慢性肾小球疾病领域，公开了一种治疗慢性肾炎的中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物及其制备方法。该药物组合物由下列按重量份计黄芪10～30份和三七3～9份或黄芪10～30份、三七3～9份和丹参12～15份或黄芪10～30份、三七3～9份、丹参12～15份和当归12～15份中提取有效部位复方多糖与复方皂甙配制而成，复方多糖与复方皂甙的配伍比为12～1∶1。本发明药物组合物具有益气活血作用，增强免疫稳定性，减轻免疫复合物对肾小球的直接损伤，降低肾小球滤过膜的通透性；改善体内微循环，降低血液高凝状态并抑制系膜细胞增生和系膜基质的分泌，缓解肾小球纤维、硬化的发生，并最终改善或稳定肾功能。

Description

中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及中医药防治慢性肾小球疾病领域，特别涉及一种治疗慢性肾炎的中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物及其制备方法。

背景技术

慢性肾小球肾炎是临床常见病、多发病，是由多种原因引起的原发于肾小球的一组临床表现相似，而病理改变不一，预后不尽相同的免疫性疾病。其临床特征为蛋白尿、血尿、水肿、高血压以及肾功能损害。病情容易反复，疾病后期肾功能不断恶化，最终可发展为尿毒症而必须行昂贵的肾替代治疗。目前统计，慢性肾小球肾炎是国内导致尿毒症发生的最主要的病因。西医对本病的治疗较为困难。中医药对本病的防治有一定优势。

中医认为慢性肾炎的发病多以气虚为本，以血瘀为标，即因气虚而发病，因血瘀而致疾病迁延难愈，虚与瘀均贯穿于疾病过程的始终。现代医学研究发现免疫反应是引起肾小球疾病的关键，由免疫反应介导的凝血启动则是病变持续发展和肾功能进行性减退的重要因素。所以通过补益气血来调节免疫功能，通过活血化瘀来改善肾小球内凝血状态从而达到防治慢性肾炎的目的。

目前市场上治疗慢性肾炎的有关中成药主要有两大类：其一具有补益类的虫草类制剂，如虫草胶囊、百令胶囊、金水宝等；其二为具有清热利湿作用的制剂，如雷公藤多甙片、火把花根片、黄蜀葵花胶囊等。虫草类制剂多偏补，以扶正固本为主；而具有清热利湿作用的中成药则以祛邪为主，有一定的免疫抑制作用，且其毒副反应较多见。故以上两种制剂在临床使用有一定的局限性。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种治疗慢性肾炎的中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物。

本发明的另一目的在于提供上述药物组合物的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物，由下列按重量份计中药原料：黄芪10～30份和三七3～9份，或黄芪10～30份、三七3～9份和丹参12～15份，或黄芪10～30份、三七3～9份、丹参12～15份和当归12～15份中提取有效部位复方多糖与复方皂甙配制而成，所述复方多糖与复方皂甙的配伍比为12～1∶1。特别优选复方多糖与复方皂甙的配伍比为4∶1。

为了更好地实现本发明，本发明中药原料中还可再加入按重量份计川芎5～15份。

本发明中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物可以制备成任何一种常用口服剂型，如胶囊剂、颗粒剂、口服液、片剂等。

一种中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物的制备方法，包括如下工艺步骤和工艺方法：从上述中药原料中提取有效部位复方多糖与复方皂甙配伍而成，所述复方多糖与复方皂甙的配伍比为12～1∶1。

所述复方多糖按下述方法提取而成：取按所述重量配比的中药原料黄芪和三七，或黄芪、三七和丹参，或黄芪、三七、丹参和当归，或黄芪、三七和川芎，或黄芪、三七、丹参和川芎，或黄芪、三七、丹参、当归和川芎，加8～18倍量水浸泡1～24小时，提取1～3次，每次提取1～3小时，过滤，将每次滤液相合并，然后浓缩至0.1～1.0g生药/ml，然后加无水乙醇至含醇量60～80％，静置，过夜，倾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干净，50～60℃恒温干燥至恒重。

所述复方皂苷按下述方法提取而成：取按所述重量配比的中药原料黄芪和三七，或黄芪、三七和丹参，或黄芪、三七、丹参和当归，或黄芪、三七和川芎，或黄芪、三七、丹参和川芎，或黄芪、三七、丹参、当归和川芎，加8～18倍量水浸泡1～24小时，提取1～3次，每次提取1～3小时，将每次提取液相合并，提取液以纱布夹棉花过滤，冷存(0～4℃)，离心10～15min，3000～6000r/min，取上清液，浓缩至0.1～1.0g生药/ml，加入75～95％乙醇至含醇量达60～80％，边加边搅拌，静置冷藏(0～4℃)过夜，离心，倾出上清液，浓缩至0.1～1.0g生药/ml，浓缩液上大孔树脂柱，流出液水浴蒸干，于50～60℃烘干至恒重。

所述大孔树脂柱为D101型大孔树脂柱。所述浓缩液上大孔树脂柱吸附2～3次，每次1～2小时，流出速度为0.5～0.6mL/min。

本发明中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物主要由黄芪、三七等中药组成。黄芪具有补气生阳、益卫固表等功效，为重要的补气药。其对机体免疫系统影响广泛，具有调节免疫的作用。三七、丹参、当归、川芎等具有散瘀止血，消肿定痛、补虚的功效。现代药理研究表明黄芪和三七都具有调节免疫的作用。多糖类成分是本发明中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物的主要有效部位之一。试验结果表明，复方多糖提取工艺稳定、可行，所得多糖平均得率为7.43％，提取物中多糖的平均含量为46.12％，本发明对研究和生产过程中中药复方有效部位的提取提供一定的实验基础。

本发明中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物所含化学成分复杂，含有多糖、氨基酸、蛋白质及黄酮等，而主要有效成分皂苷含量约为10％，该中药复方中复方皂苷的分离、富集、纯化均有一定的难度，采用大孔树脂吸附法，纯化醇沉以后溶液中的复方皂苷，并对部分影响得率和含量的工艺参数进行考察，从结果看来，复方皂苷平均得率为2.35％，该粗提物中皂苷含量均在70％以上。使用D101型大孔树脂，具有吸附快、吸附容量大、洗脱工艺简单等特点，适合本发明通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位制剂开发的使用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)本发明中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物具有益气活血作用，扶正祛邪兼顾，用之治疗慢性肾炎，其机制表现为：通过益气活血法达到调节机体的免疫能力，增强免疫稳定性，抑制已发生的免疫反应，减轻免疫复合物对肾小球的直接损伤，降低肾小球滤过膜的通透性；改善体内微循环，降低血液高凝状态，并抑制系膜细胞增生和系膜基质的分泌，缓解肾小球纤维、硬化的发生，并最终改善或稳定肾功能的目的。

(2)由本发明提取的药效部位配伍组成药物组合物，更好提高临床疗效，疗效显著，无明显毒副作用。

(3)本发明为开发中药5类新药打下良好基础；本发明对有效中药制剂的深入研究开发、对中医药现代化、中医药走上国际均有很大的现实意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

复方多糖按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪10份、三七3份，加8倍量水浸泡24小时，提取2次，每次提取3小时，过滤，将每次滤液相合并，然后浓缩至0.5g生药/ml，然后加无水乙醇至含醇量60％，静置，过夜，倾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干净，50℃恒温干燥至恒重。

复方皂苷按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪10份、三七3份，加8倍量水浸泡24小时，提取2次，每次提取3小时，将每次提取液相合并，提取液以纱布夹棉花过滤，置冰箱冷存(0～4℃)，离心10min，6000r/min，分取上清液，浓缩至1.0g生药/ml，加入95％乙醇至含醇量达80％，边加边搅拌，静置冷藏(0～4℃)过夜，离心，倾出上清液，浓缩至0.5g生药/ml，上D101型大孔树脂柱，吸附2次，每次2小时，流出速度为0.6mL/min，置蒸发皿中，水浴蒸于，置于恒温干燥箱中，50℃烘干至恒重。

该通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位为复方多糖与复方皂甙，复方多糖与复方皂甙的配伍比为3∶1。

实施例2

复方多糖按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪30份、三七9份、丹参12份，加18倍量水浸泡1小时，提取3次，每次提取1小时，过滤，将每次滤液相合并，然后浓缩至0.1g生药/ml，然后加无水乙醇至含醇量80％，静置，过夜，倾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干净，60℃恒温干燥至恒重。

复方皂苷按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪30份、三七9份、丹参12份，加18倍量水浸泡1小时，提取3次，每次提取1小时，将每次提取液相合并，提取液以纱布夹棉花过滤，置冰箱冷存(0～4℃)，离心15min，5000r/min，取上清液，浓缩至0.1g生药/ml，加入75％乙醇至含醇量达60％，边加边搅拌，静置冷藏(0～4℃)过夜，离心，倾出上清液，浓缩至0.1g生药/ml，上D101型大孔树脂柱，吸附3次，每次1小时，流出速度为0.5mL/min，置蒸发皿中，水浴蒸干，置于恒温干燥箱中，60℃烘干至恒重。

该通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位为复方多糖与复方皂甙，复方多糖与复方皂甙的配伍比为12∶1。

实施例3

复方多糖按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪20份、三七5份、丹参15份、当归12份、川芎5份，加10倍量水浸泡24小时，提取1次，每次提取2小时，过滤，将每次滤液相合并，然后浓缩至0.6g生药/ml，然后加无水乙醇至含醇量70％，静置，过夜，倾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干净，60℃恒温干燥至恒重。

复方皂苷按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪20份、三七5份、丹参15份、当归12份、川芎5份，加10倍量水浸泡24小时，提取1次，每次提取2小时，将每次提取液相合并，提取液以纱布夹棉花过滤，置冰箱冷存(0～4℃)，离心12min，3000r/min，分取上清液，浓缩至0.5g生药/ml，加入95％乙醇至含醇量达80％，边加边搅拌，静置冷藏(0～4℃)过夜，离心，倾出上清液，浓缩至0.5g生药/ml，上大孔树脂柱，吸附3次，每次2小时，流出速度为0.5mL/min，置蒸发皿中，水浴蒸干，置于恒温干燥箱中，60℃烘干至恒重。

该通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位为复方多糖与复方皂甙，复方多糖与复方皂甙的配伍比为1∶1。

实施例4

复方多糖按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪30份、三七3份、丹参12份、川芎15份，加8倍量水浸泡24小时，提取2次，每次提取3小时，过滤，将每次滤液相合并，然后浓缩至0.5g生药/ml，然后加无水乙醇至含醇量60％，静置，过夜，倾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干净，55℃恒温干燥至恒重。

复方皂苷按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪30份、三七3份、丹参12份、川芎15份，加8倍量水浸泡24小时，提取2次，每次提取3小时，将每次提取液相合并，提取液以纱布夹棉花过滤，置冰箱冷存(0～4℃)，离心10min，6000r/min，分取上清液，浓缩至1.0g生药/ml，加入85％乙醇至含醇量达70％，边加边搅拌，静置冷藏(0～4℃)过夜，离心，倾出上清液，浓缩至0.5g生药/ml，上D101型大孔树脂柱，吸附2次，每次2小时，流出速度为0.6mL/min，置蒸发皿中，水浴蒸干，置于恒温干燥箱中，55℃烘干至恒重。

该通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位为复方多糖与复方皂甙，复方多糖与复方皂甙的配伍比为4∶1。

实施例5

复方多糖按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪10份、三七9份、川芎10份，加16倍量水浸泡12小时，提取2次，每次提取3小时，过滤，将每次滤液相合并，然后浓缩至1.0g生药/ml，然后加无水乙醇至含醇量60％，静置，过夜，倾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干净，60℃恒温干燥至恒重。

复方皂苷按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪10份、三七9份、川芎10份，加16倍量水浸泡12小时，提取2次，每次提取3小时，将每次提取液相合并，提取液以纱布夹棉花过滤，置冰箱冷存(0～4℃)，离心12min，4000r/min，分取上清液，浓缩至1.0g生药/ml，加入95％乙醇至含醇量达80％，边加边搅拌，静置冷藏(0～4℃)过夜，离心，倾出上清液，浓缩至0.5g生药/ml，上D101型大孔树脂柱，吸附2次，每次2小时，流出速度为0.6mL/min，置蒸发皿中，水浴蒸干，置于恒温干燥箱中，60℃烘干至恒重。

该通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位为复方多糖与复方皂甙，复方多糖与复方皂甙的配伍比为6∶1。

实施例6

复方多糖按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪20份、三七5份、丹参15份、当归12份，加10倍量水浸泡24小时，提取1次，每次提取2小时，过滤，将每次滤液相合并，然后浓缩至0.6g生药/ml，然后加无水乙醇至含醇量70％，静置，过夜，倾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干净，60℃恒温干燥至恒重。

复方皂苷按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪20份、三七5份、丹参15份、当归12份，加10倍量水浸泡24小时，提取1次，每次提取2小时，将每次提取液相合并，提取液以纱布夹棉花过滤，置冰箱冷存(0～4℃)，离心15min，3000r/min，分取上清液，浓缩至0.5g生药/ml，加入95％乙醇至含醇量达80％，边加边搅拌，静置冷藏(0～4℃)过夜，离心，倾出上清液，浓缩至0.5g生药/ml，上大孔树脂柱，吸附3次，每次2小时，流出速度为0.5mL/min，置蒸发皿中，水浴蒸干，置于恒温干燥箱中，60℃烘干至恒重。

该通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位为复方多糖与复方皂甙，复方多糖与复方皂甙的配伍比为8∶1。

实施例7

复方多糖按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪10份、三七3份、丹参12份、当归15份、川芎15份，加16倍量水浸泡12小时，提取2次，每次提取3小时，过滤，将每次滤液相合并，然后浓缩至0.8g生药/ml，然后加无水乙醇至含醇量60％，静置，过夜，倾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干净，50℃恒温干燥至恒重。

复方皂苷按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪10份、三七3份、丹参12份、当归15份、川芎15份，加16倍量水浸泡12小时，提取2次，每次提取3小时，将每次提取液相合并，提取液以纱布夹棉花过滤，置冰箱冷存(0～4℃)，离心10min，6000r/min，分取上清液，浓缩至0.8g生药/ml，加入95％乙醇至含醇量达80％，边加边搅拌，静置冷藏(0～4℃)过夜，离心，倾出上清液，浓缩至0.5g生药/ml，上D101型大孔树脂柱，吸附2次，每次2小时，流出速度为0.6mL/min，置蒸发皿中，水浴蒸干，置于恒温干燥箱中，50℃烘干至恒重。

该通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位为复方多糖与复方皂甙，复方多糖与复方皂甙的配伍比为3∶1。

实施例8

复方多糖按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪30份、三七9份、丹参13份、当归13份、川芎10份，加12倍量水浸泡12小时，提取2次，每次提取3小时，过滤，将每次滤液相合并，然后浓缩至0.5g生药/ml，然后加无水乙醇至含醇量60％，静置，过夜，倾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干净，50℃恒温干燥至恒重。

复方皂苷按下述方法提取而成：取按重量份计药材黄芪30份、三七9份、丹参13份、当归13份、川芎10份，加12倍量水浸泡12小时，提取2次，每次提取3小时，将每次提取液相合并，提取液以纱布夹棉花过滤，置冰箱冷存(0～4℃)，离心10min，5000r/min，分取上清液，浓缩至1.0g生药/ml，加入95％乙醇至含醇量达80％，边加边搅拌，静置冷藏(0～4℃)过夜，离心，倾出上清液，浓缩至0.5g生药/ml，上D101型大孔树脂柱，吸附2次，每次2小时，流出速度为0.6mL/min，置蒸发皿中，水浴蒸干，置于恒温干燥箱中，50℃烘干至恒重。

该通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位为复方多糖与复方皂甙，复方多糖与复方皂甙的配伍比为4∶1。

实施例9

本发明通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位复方皂苷部位的指纹图谱研究：

以薄层层析法和HPLC法对药效组分复方皂苷部位的指纹图谱进行初步研究；以柱层析法、结晶法等对复方化学成分进行分离纯化，结合IR、MS、¹HNMR、¹³CNMR、HPLC等方法对中药复方主要化学成分进行结构鉴定。本发明通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位化学指纹图谱研究结果：薄层色谱研究结果显示，本发明通脉口服液有效部位的药物组合物复方皂苷共有斑点有10个，其R_f值分别为：0.11，0.17，0.19，0.23，0.30，0.33，0.47，0.50，0.58，0.63，其中R_f0.17为人参皂苷Rb1、R_f0.33为人参皂苷Rg1，在与黄芪甲苷R_f0.40的位置上，未发现复方皂苷中与其相应的斑点。高效液相色谱研究结果表明，本发明通脉口服液有效部位的药物组合物复方皂苷共有峰有12个，其保留时间平均值分别为：10.075，21.269，24.163，29.399，31.283，38.291，40.149，41.148，42.927，52.400，53.538，62.632其中RT为24.163为人参皂苷Rg1、38.291为人参皂苷Rb1，两者积分面积之和占总面积的百分含量大于30％。

对比配伍前后单体有效物质结构，发现配伍后人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1结构基本保持不变，但配伍后人参皂苷Rb1旋光度发生了显著变化，原值为[α]D²⁶+11.5，现中药复方药物组合物分离成分测得值[α]_D ²⁰0，但其UV、IR、NMR、MS谱数据基本一致，配伍后原三七药材中的人参皂苷Rb₁形成了人参皂苷Rb₁消旋体。

本发明通脉口服液有效部位的药物组合物化学成分研究结果：从复方提取液中共分离得到3个单体化合物TM-1、TM-77、TM-92(TM-1为蔗糖类成分、TM-77即为人参皂苷Rg1、TM-92即为人参皂苷Rb1)，经初步鉴定为糖类及皂苷类成分。并通过UV、IR、NMR、LC-MS及旋光谱等方法对单体化合物进行了结构鉴定，确定了其中的2个皂苷类成分，即人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1。本发明通脉口服液有效部位的药物组合物治疗慢性肾炎的主要药效部位主要为复方多糖与复方皂甙，而皂苷跟多糖合用，实验效果优于单用；经多批次样品比较试验，本发明通脉口服液有效部位的药物组合物复方皂苷中所有共有峰峰高和峰面积基本一致，其TLC及HPLC指纹图谱均具有专属、稳定、重复性强的特点，但其主要成分含量均大于单味药材中的含量，合煎有助溶或增溶的作用，且合煎后原单味药材中的主要有效成分结构基本稳定。

实施例10本发明有效部位复方多糖、复方皂苷按最佳配伍比(4∶1)组成的药物组合物与原通脉口服液在抑制系膜细胞增殖作用的比较

采用MTT法(四唑盐比色法)，比较两者在抑制系膜细胞增殖方面的作用，结果表明本发明有效部位复方多糖、复方皂苷按最佳配伍比(4∶1)组成的药物组合物在抑制系膜细胞增殖方面的作用优于原通脉口服液组(按重量份计黄芪10份、三七3份、丹参12份、当归12份)。复方多糖与复方皂甙为本发明的有效组分。

组别	n	OD值( x±s)
			通脉口服液组有效部位药物组合物	66	0.683±0.0460.471±0.027**

注：^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例11通脉口服液有效部位复方多糖、复方皂苷按最佳配伍比(4∶1)组成的药物组合物防治系膜增生性肾炎(MsPGN)的药效学评价

高剂量组(复方多糖、复方皂苷各为960mg/kg、240mg/kg)；中剂量组(复方多糖、复方皂苷各为480mg/kg、120mg/kg)；低剂量组(复方多糖、复方皂苷各为240mg/kg、60mg/kg)；金水宝组(1320mg/kg)；模型对照组(系膜增生性肾炎大鼠以2ml生理盐水灌胃)；空白对照组(正常大鼠以2ml生理盐水灌胃)。

1对24h尿蛋白定量的影响

采用大鼠抗胸腺抗血清(AST)制备大鼠MsPGN肾炎模型。模型对照组第2、4周大鼠24h尿蛋白量明显增加，与空白对照组相比，有非常显著性差异(P＜0.01)；高、中、低剂量组及金水宝组大鼠尿蛋白均有显著减低，与模型对照组相比，有非常显著性差异(P＜0.05～0.01)，低剂量组与金水宝组相比，无显著性差异(P＞0.05)；高、中剂量组与金水宝组相比，有非常显著性差异(P＜0.01)

2血尿及尿红细胞计数

尿红细胞检查：空白对照组镜下无血尿，模型对照组及各给药组镜下均可见数量不等的红细胞(+～++++)。

模型对照组第2周、第4周尿中红细胞数明显增加，与空白对照组比较，有非常显著性差异(P＜0.01)；金水宝组红细胞计数与模型对照组相比，差异无显著性意义(P＞0.05)；高、中、低剂量组均能使尿中红细胞数明显减少，与模型对照组相比，有显著或非显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，与金水宝组相比，亦有显著或非常显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。

3对血肌酐(CSCr)和血尿素氮(CBUN)的影响

模型对照组2、4周血尿素氮明显升高，与空白对照组相比，有非常显著性差异(P＜0.01)；高、中、低剂量组及金水宝组血尿素氮均有所下降，与模型对照组相比，有显著或非常显著性差异(P＜0.05或0.01)；高、中、低剂量组与金水宝组相比，均无显著性差异(P＞0.05)。模型对照组2、4周血肌酐明显增加，与空白对照组相对，有显著性差异(P＜0.05)；高、中、低剂量组及金水宝组降血肌酐作用不明显，与模型对照组相比，均无显著性差异(P＞0.05)。

4对血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的影响

模型对照组2、4周血清总蛋白有所降低，与空白对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)；高、中剂量组及金水宝组均使血清总蛋白升高，与模型对照组相比，有非常显著性差异(P＜0.01)；而低剂量组对血清总蛋白的影响不明显，与模型对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)；高、中、低剂量组与金水宝组相比，均无显著性差异(P＞0.05)。模型对照组2、4周血清白蛋白有所降低，与空白对照组比较，有显著性或非常显著性差异(P＜0.05或0.01)；高、中剂量组及金水宝组均使血清总蛋白升高，与模型对照组相比，有非常显著性差异(P＜0.01)；而低剂量组对血清总蛋白的影响不明显，与模型对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)；高、中、低剂量组与金水宝组相比，均无显著性差异(P＞0.05)。

5对血液流学的影响

模型对照组全血比粘度(高切、低切)、全血还原粘度(高切、低切)、血浆比粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数均增加，与空白对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)；高、中、低剂量均能使全血比粘度(高切、低切)、全血还原粘度(高切、低切)、血浆比粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数降低，与模型对照组比较，有显著或非常显著性差异(P＜0.05或0.01)；金水宝组对全血比粘度(高切、低切)、全血还原粘度(高切、低切)、血浆比粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数基本上无明显影响，与模型对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)。

6对T细胞亚群CD3、CD4、CD8的影响

模型对照组CD3、CD4降低，CD8升高，CD4/CD8降低，与空白对照组比较，有非常显著性差异(P＜0.01)；高、中、低剂量组与金水宝组均能使CD3、CD4升高，CD8降低，CD4/CD8升高，与模型对照组比较，有显著或非常显著性差异(P＜0.05或0.01)；高、中剂量组作用与金水宝相比，无显著性差异(P＞0.05)，而低剂量组与金水宝组相比，有显著性差异(P＜0.05)。

7肾脏病理改变及图像分析

(1)HE染色

空白对照组肾小球形态基本正常，肾小球基底膜正常，毛细血管形态无异常改变，细胞及系膜基质无增多。模型对照组呈重度系膜增生，可见肾小球内系膜细胞弥漫性增多，肾小球基底膜基本正常，毛细血管明显压迫，血管腔内大量血栓形成，表明此时血液呈现高凝状态，系膜区基质明显增加，未见肾小球纤维化及硬化。高、中低剂组系膜呈低度增生，血管腔内血栓明显减少，低剂量组及金水宝组肾小球系膜呈中度增生，血管腔内仍见有血栓形成

(2)PAS染色及图像分析结果

模型对照组系膜区基质占整个毛细血管丛面积的百分比明显高于空白对照组，统计学处理有非常显著性差异(P＜0.01)；高剂量组能显著降低系膜区基质占毛细血管丛面积的百分比，与模型对照组相比，有非常显著性差异(P＜0.01)；中剂量组与金水宝亦能均降低系膜区基质占毛细血管丛面积的百分比，与模型组对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)；而低剂量组作用不明显，与模型对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)。高剂量组与金水宝组相比，有非常显著性差异(P＜0.01)。

8免疫荧光：

空白对照组可见IgG+，沿肾小球系膜区呈点状分布，模型对照组IgG++++，沿肾小球系膜区呈团块状沉积，低剂量组、金水宝组IgG++～+++，沿肾小球系膜区呈团状分布，中剂量、高剂量组IgG+～++，沿肾小球系膜区呈点状分布。

9肾小球内细胞核增殖抗原(PCNA)表达影响

模型对照组肾小球细胞数及细胞核增殖抗原(PCNA)阳性细胞数明显高于空白对照组，经统计学处理有非常显著性差异(P＜0.01)；高、中、低剂量均能显著降低肾小球细胞数及细胞核增殖抗原(PCNA)阳性细胞数，与模型对照组相比，有非常显著性差异(P＜0.01)；金水宝组能显著降低降低肾小球细胞数及细胞核增殖抗原(PCNA)阳性细胞数，与模型对照组相比，有显著或非常显著性差异(P＜0.01或0.05)；高剂量组与金水宝组相比，有显著性差异(P＜0.05)。

本发明通脉口服液有效部位的药物组合物有效部位按最佳配伍比组成的可以有效地减少模型大鼠的24h尿蛋白量，减少尿红细胞数、降低血肌酐及血尿素氮水平、改善血液流变学、提高血清总蛋白及白蛋白水平、增强细胞免疫功能、减轻肾组织的病理损害。

实施例12本发明通脉口服液有效部位的药物组合物作用机制的研究

一、本发明通脉口服液有效部位的药物组合物对大鼠肾小球系膜细胞IL-1β、IL-10的影响

(1)含药血清制备：

按临床成人用量的20倍即8g(生药)/kg，灌胃给药，连续7天，第7天重复给药2次，间隔时间2h，并于末次给药后1h，无菌操作，眼眶静脉取血，静置1h，待血凝固后离心(1500rpm，10min)，分离血清，并将含药血清置于56℃水浴箱中，水浴30min灭活处理。置于-20℃冰箱保存备用。

(2)实验分组与给药：

取第3代MC，用含10％FCS(胎牛血清)的DMEM调整细胞浓度到5×10⁴～10⁵/ml，转种于6孔培养板中，1ml/孔，则每孔细胞数为5×10⁴～10⁵/ml。37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养24h，各孔均换液，加入不含FCS的DMEM培养液1ml以同步各组细胞于G₀期。然后分①空白对照组(加10％FBS)；②LPS组(LPS10ug/ml)③LPS+有效部位药物组合物(10％复方多糖/复方皂苷3∶3含药血清+10uG/ml LPS)，共3组，每组设复孔4个。5％CO₂，饱和湿度条件下继续培养。于培养3h，6h，12h，24h时分别取出相应的培养板，收集各组上清液，-20℃保存。

(3)IL-1β、IL-10测定：

检测IL-1β、IL-10，采用酶联免疫吸附法(ELISA)。

(4)统计方法：

应用SPSS 12.0统计软件进行统计分析。数据结果以均数土标准差( x±s)表示，组间均数比较用单因素方差分析。

各组分在不同时段对大鼠系膜细胞产生的IL-1β的影响，结果表明：LPS组在不同时间段比空白对照组IL-1β产生量均明显增加，且有非常显著差异(P＜0.01)，并在加入LPS12小时时分泌量最多，但与其它时间点比较差异无显著性(P＞0.05)。LPS+有效部位药物组合物与LPS组在6h、12h、24h比较IL-1β分泌量均下降，在6h、12h二个时间点有非常显著性差异(P＜0.01)，而24h时间点有显著性差异(P＜0.05)。在3h时间点LPS+有效部位药物组合物与LPS组比较IL-1β无明显差异。

各组分在不同时段对大鼠系膜细胞产生的IL-10的影响，结果表明：大鼠肾小球系膜细胞经加入LPS刺激后IL-10表达量在不同时间点均无明显增加，与空白对照组相比均无显著性差异(P＞0.05)。而LPS+有效部位药物组合物与空白对照组比较，LPS+有效部位药物组合物在6h时间点IL-10分泌量有明显增加，有非常显著性差异(P＜0.01)。LPS+有效部位药物组合物与LPS组比较，LPS+有效部位药物组合物仅在6h时间点IL-10分泌量较LPS组有明显增加，差异有显著性(P＜0.05)，而在其它时间点无明显变化。

二、本发明通脉口服液有效部位的药物组合物对大鼠肾小球系膜细胞IL-1β、IL-10mRNA表达的影响

(1)含药血清制备：方法同前。

(2)IL-1β、IL-10mRNA的检测：

1.实验分组与给药

取第3代MC，用含10％FCS的DMEM调整细胞浓度到1×10⁶/ml，转种于75cm²培养瓶中，加入10％FCS的DMEM培养液，37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养24h，各瓶均换液，加入不含FCS的DMEM培养液以同步各组细胞于G0期。然后分①空白对照组(加10％FBS(胎牛血清))；②LPS组(LPS10uG/ml)③LPS+有效部位药物组合物(10％复方多糖/复方皂苷3∶3含药血清+10uG/ml LPS)，共3组。5％CO₂，饱和湿度条件下继续培养。于培养6h、24h时分别取出相应的培养瓶，提取系膜细胞总RNA，总RNA产物进行逆转录-聚核酶链反应(RT-PCR)，应用凝胶图像分析系统(ImagemasterSoftware)进行条带光密度分析，得到mRNA的光密度值。

2.统计学处理：所有数据以 X±S表示。通过SPSS11.0统计软件，采用单因数方差分析对各组均数进行显著性检验，P＜0.05具有显著性差异。

IL-1βmRNA表达在6小时LPS组及24小时LPS组均明显上调，而在空白对照组无表达。加入有效部位药物组合物后，不论在6小时，还是24小时均较LPS组表达下降，差异有显著性(P＜0.05)。而IL-10mRNA在空白对照组、及24小时间点无表达，在6小时时间点有表达，且加入本发明通脉口服液有效部位的药物组合物后，IL-10mRNA表达量较LPS组明显上调，有非常显著性差异(P＜0.01)。

实践证明，本发明通脉口服液有效部位的药物组合物能有效地防治慢性肾炎，其机制表现为：通过益气活血法达到调节机体的免疫能力，增强免疫稳定性，抑制已发生的免疫反应，减轻免疫复合物对肾小球的直接损伤，降低肾小球滤过膜的通透性；改善体内微循环，降低血液高凝状态，并抑制系膜细胞增生和系膜基质的分泌，缓解肾小球纤维、硬化的发生，并最终改善或稳定肾功能的目的。

Claims (7)

1、一种中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由下列按重量份计中药原料：黄芪10～30份和三七3～9份，或黄芪10～30份、三七3～9份和丹参12～15份，或黄芪10～30份、三七3～9份、丹参12～15份和当归12～15份中提取有效部位复方多糖与复方皂甙配制而成，所述复方多糖与复方皂甙的配伍比为12～1∶1。

2、根据权利要求1所述的中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物，其特征在于，所述复方多糖与复方皂甙的配伍比为4∶1。

3、根据权利要求1所述的中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物，其特征在于，所述中药原料中再加入按重量份计川芎5～15份。

4、一种权利要求1或2或3所述的中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物的应用，其特征在于，所述药物组合物制备成胶囊剂、颗粒剂、口服液或片剂。

5、一种权利要求1或2或3所述的中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤和工艺方法：从中药原料中提取有效部位复方多糖与复方皂甙配伍而成，所述复方多糖与复方皂甙的配伍比为12～1∶1；

所述复方多糖按下述方法提取而成：取按所述重量配比的中药原料黄芪和三七，或黄芪、三七和丹参，或黄芪、三七、丹参和当归，或黄芪、三七和川芎，或黄芪、三七、丹参和川芎，或黄芪、三七、丹参、当归和川芎，加8～18倍量水浸泡1～24小时，提取1～3次，每次提取1～3小时，过滤，将每次滤液相合并，然后浓缩至0.1～1.0g生药/ml，然后加无水乙醇至含醇量60～80％，静置，过夜，倾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干净，50～60℃恒温干燥至恒重；

所述复方皂苷按下述方法提取而成：取按所述重量配比的中药原料黄芪和三七，或黄芪、三七和丹参，或黄芪、三七、丹参和当归，或黄芪、三七和川芎，或黄芪、三七、丹参和川芎，或黄芪、三七、丹参、当归和川芎，加8～18倍量水浸泡1～24小时，提取1～3次，每次提取1～3小时，将每次提取液相合并，提取液以纱布夹棉花过滤，冷存，离心10～15min，3000～6000r/min，取上清液，浓缩至0.1～1.0g生药/ml，加入75～95％乙醇至含醇量达60～80％，边加边搅拌，静置冷藏过夜，离心，倾出上清液，浓缩至0.1～1.0g生药/ml，浓缩液上大孔树脂柱，流出液水浴蒸干，于50～60℃烘干至恒重。

6、根据权利要求5所述的中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂柱为D101型大孔树脂柱。

7、根据权利要求5所述的中药复方通脉口服液有效部位的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述浓缩液上大孔树脂柱吸附2～3次，每次1～2小时，流出速度为0.5～0.6mL/min。