CN103142695B - 防治慢性肾小球疾病的药物组合物及其制法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治系膜增生性肾小球肾炎、局灶性肾小球硬化症的药物组合物及其制法，是黄芪、三七和丹参的提取物配伍而成，有效成分为黄酮类、皂苷类和酚酸类，所用的药材重量份数为：黄芪9~30份、三七3～10份和丹参3～20份；各类化学成分重量百分比含量为：以毛蕊异黄酮为对照品，总黄酮含量为30.0～0.50%；以三七总皂苷为对照品，总皂苷含量为18.0～97.0%；以咖啡酸为对照品，总酚酸含量为52.0～2.5%。本发明的发明人在长期的临床治疗中，将辩病施治与辨证施治相结合，本发明的药物组合物的药效，优于其中任何一种药用组分单用或其中两种药用组分合用。而且毒性较小，适合长期服用。

Description

防治慢性肾小球疾病的药物组合物及其制法

技术领域

本发明涉及一种防治系膜增生性肾小球肾炎、局灶性肾小球硬化症的中药有效组分组合物。具体为中药黄芪、三七和丹参的有效组分配伍的药物组合物。

背景技术

慢性肾小球肾炎（Chronic Glomerulonephritis）简称慢性肾炎，是由多种原因引起的原发于肾小球的一组临床表现相似、而病理改变不一，预后不尽相同的免疫性疾病，患者多有不同程度的蛋白尿、血尿、水肿及高血压，大多数最终出现不同程度的肾功能损害。慢性肾脏病临床起病隐匿、病程绵长，具有进行性发展的倾向，患者多于2-3年或20-30年后出现肾衰竭。其发病起始于免疫反应，免疫反应产生的免疫沉积物沉积在肾小球基底膜，激活补给系统，产生炎症反应。同时又触发凝血系统产生肾小球免疫损伤和肾小球毛细血管内凝血，纤维蛋白的沉积，基底膜增厚，影响管腔血流。【陈奇主编.中药药效研究思路与方法,北京:人民卫生出版社,2005,第1版：539.】。肾小球毛细管内压的增高，使毛细管壁对蛋白质的通透性增加，加速了肾小球结构损害，促使肾小球硬化。【戴自英主编.实用内科学,北京:人民卫生出版社,1993,第九版：1555-1556.】。蛋白尿是慢性肾炎的主要临床表现之一。蛋白尿不仅反映肾小球基底膜的损伤，也可引起肾小管上皮细胞的损伤，并与肾小管间质纤维化或硬化的发生发展密切相关。而肾纤维化或硬化是慢性肾脏病进行性发展的病理特征，终至肾功能衰竭【Brenner BM.The Kidney.6th ed Philadelphia：Saundem Company．1999：2219-52.】。因此，慢性肾脏病的治疗目的主要是尽量减少尿蛋白及其相关并发症的发生、减轻肾小球硬化或肾间质纤维化、延缓肾功能不全的发生以及肾功能下降的进展速度。

慢性肾脏病病理类型可表现为系膜增生性肾小球肾炎（包括IgA和非IgA系膜增生性肾小球肾炎）、系膜毛细血管性肾小球肾炎、膜性肾病及局灶性肾小球硬化症等。

系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）是一组以弥漫性肾小球系膜细胞增生及不同程度系膜基质增多为主要特征的原发性肾小球疾病，可导致肾小球硬化及肾间质纤维化。系膜增生性肾小球肾炎根据免疫病理可将其分为IgA肾病及非IgA肾病两型，其中非IgA系膜增生性肾小球肾炎是我国最常见的原发性肾小球疾病，占成人原发性肾小球疾病肾活检病例的24.7％～30.3％。【胡忠仪，陈以平，查平，等．慢性肾小球肾炎病理分型与中医辨证分型相关性研究．中医杂志，1992，33(1)：41—43.】。重复活检证实系膜增生性肾炎可继发局灶阶段性肾小球硬化。【戴自英主编.实用内科学,北京:人民卫生出版社,1993,第九版：1549-1556.】。非IgA系膜增生性肾小球肾炎综合征治疗疗效首先取决于肾脏病理改变轻重，有否继发局灶节段性肾小球硬化（FSGS）是决定预后的主要因素，无FSGS者长期预后好，而有FSGS者10年存活率明显下降【王海燕.肾脏病学（第三版）.北京，人民卫生出版社，2009年，第3版：1020-1021.】。

局灶性肾小球硬化（FSGS）在国内原发性肾病综合征中可占10%～15%。【陈奇主编.中药药效研究思路与方法,北京:人民卫生出版社,2005,第1版：566.】。临床以大量蛋白尿或肾病综合征为特征，病因和发病机制不明，蛋白尿呈非选择性，反映了肾小球毛细管壁局部的结构损害。诊断依赖于肾活检，间质炎性浸润，肾小管萎缩和局灶性纤维化常见。【戴自英主编.实用内科学,北京:人民卫生出版社,1993,第九版：1550.】。到目前为止，尚没有公认的FSGS的治疗方案，治疗上仍颇为棘手。FSGS对激素治疗多不敏感，据报道其对足量激素治疗无效率高达60%以上。【谢席胜,樊均明.特发性局灶节段性肾小球硬化循证治疗,临床肾脏病杂志,2009，9(6)：252-253.】。FSGS预后较差，慢性肾衰竭为此类患者的最后转归。

目前现代医学治疗慢性肾病缺乏疗效满意的治疗方法和药物，主要采用支持疗法和对症治疗，针对感染、高血压积极给予治疗，避免使用肾毒性药物。激素、细胞毒性药物、非激素抗炎药目前仍未证明有确切疗效，长期应用具有反复性及较严重的副作用，如导致抵抗力下降，血糖升高、皮质类固醇征、消化道溃疡、电解质紊乱等。因此，研究开发治疗或延缓慢性肾炎进展，且毒副作用小的药物，仍然是国内外医药界亟待解决的问题。对于该病现代医学还无特效治疗方法，

与西医药相比，中医药在改善慢性肾炎临床症状，延缓病情进展，改善肾功能方面具有较明显的疗效，且毒副作用小。现代研究主要从以下几方面，证明中药防治慢性肾炎的作用：1、调节机体免疫功能，抑制免疫性因子；2、抗氧化，清除自由基；3、改善血液流变学；4、降血脂，减少蛋白尿。目前，有国家标准的治疗慢性肾炎临床常用的中成药大致有以下几种：具有清热祛湿作用的黄蜀葵花胶囊，具有免疫抑制作用的昆明山海棠和雷公藤多甙，具有益气补虚作用的肾炎康复片、百令胶囊、金水宝等，具有益气清热作用的肾炎四味片、肾炎宁等等。除了雷公藤多苷外，大多为传统中药复方制剂，组方及成分复杂，有效治疗成分尚不清楚。

中国专利CN101766678A中公开了黄芪总黄酮在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。CN1857394A中公开了黄芪、三七及丹参中多糖和皂苷配比的药物组合物及其制备方法。上述专利仅公开了治疗系膜增生性慢性肾炎的疗效。

发明内容

本发明的目的是公开一种防治系膜增生性肾小球肾炎、局灶性肾小球硬化症的药物组合物及其制法，以满足临床应用的需要。

本发明所述的防治系膜增生性肾小球肾炎、局灶性肾小球硬化症的药物组合物，是黄芪、三七和丹参的提取物配伍而成，其中，有效成分为黄酮类、皂苷类和酚酸类，所用的药材重量份数为：

黄芪9～30份、三七3～10份和丹参3～20份。

优选重量份数为：黄芪10份、三七3份和丹参4份；

最佳重量份数是：黄芪27份、三七9份和丹参18份。

所述黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.或蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根；三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎；丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiz Bge.的干燥根和根茎。

优选的，采用LC-MS联用技术，通过DAD及MS检识、标准品对照，所述药物药物组合物中，主要含以下化学成分：

黄酮类，主要包括毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和(3R)-2＇-羟基-3＇,4＇-二甲氧基异黄烷7-O-β-D-葡萄糖苷等；

皂苷类，主要包括三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd和黄芪甲苷等；

酚酸类，主要包括丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸、紫草酸、原儿茶醛和丹参素等。

采用高效液相色谱法测定含量，以重量百分比计：

毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含量为0.03～3.6%；

芒柄花苷含量为0.01～1.2%；

毛蕊异黄酮含量为0.01～1.3%；

三七皂苷R1含量为0.9～9.6%；

人参皂苷Rg1含量为3.1～31.5%；

人参皂苷Rb1含量为3.0～30.3%；

丹酚酸B含量为0.1～10.00%.

分析方法，可参见文献：【张靖,徐文,丘小惠,卢传坚,等.HPLC法分析不同提取方法黄芪三七配伍的化学成分变化，药物分析杂志,2011,31(6):1131-1136.2、徐文,丘小惠,卢传坚,等.超高压液相/电喷雾-LTQ-Orbitrap质谱联用技术分析三七根中皂苷类成分》，药学学报2012,47(6)：773-778.】。

采用紫外-可见分光光度法测定，所述的药物组合物中各类化学成分重量百分比含量为：

以毛蕊异黄酮为对照品，总黄酮含量为0.30～30.0%；

以三七总皂苷为对照品，总皂苷含量为18.0～98.0%；

以咖啡酸为对照品，总酚酸含量为1.7～52.0%。

分析方法可参见文献：【1、田芳,窦德强,迟玉新,等.亚贡叶中总黄酮及总酚酸的含量测定,时珍国医围药,2008,19(8):2013-2014.2、王淑杰,王淑华,刘钢.双波长紫外分光光度法测定甘草中总黄酮的含量,宁夏医学院报,2005,27(6):506-508.3、沈岚,冯怡,徐德生,等.比色法测定三七花中总皂苷的含量,中成药,29(9):1368-1370.】。

本发明药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

方法一：

（1）将黄芪、三七和丹参混合，加5-15重量倍的体积浓度为30-100%的乙醇渗漉或回流提取1-5次，合并提取液，过滤或离心，过滤液或上清液减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.05-1.35，获得提取物；或者加2-15倍量的水于60-100℃温浸或回流提取1-5次，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.05～1.35，加乙醇至浓度为30—90%，静置沉淀，过滤（或离心），过滤液（或上清液）减压回收乙醇，浓缩，获得提取物A；

（2）提取物A经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量5～10倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量3～5倍的体积浓度为9～15%，优选10%的乙醇洗脱杂质；

（3）再用大孔树脂重量3～8倍体积的30%～90%的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，即可获得所述的发明药物组合物：

或者：

将黄芪、三七和丹参单味药材，采用上述的方法，分别提取后混合，获得所述的明药物组合物；

方法二：

（1）将黄芪、三七和丹参单味药材，采用方法一所述的提取方法，分别提取，获得黄芪提取物、三七提取物和丹参提取物。

（2）丹参提取物经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量5～10倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量3～5倍的体积浓度为9～15%，优选10%的乙醇洗脱杂质；再用大孔树脂重量3～8倍体积的20-40%乙醇洗脱；洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，获得BW-1组分，以咖啡酸计算总酚酸含量≥50%。分析方法可参见文献：【田芳,窦德强,迟玉新,等.亚贡叶中总黄酮及总酚酸的含量测定,时珍国医国药,2008,19(8):2013-2014.】。

（3）黄芪提取物经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量5～10倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量3～5倍的体积浓度为9～25%，优选20%的乙醇洗脱杂质；再用大孔树脂重量3～8倍体积的40-60%乙醇洗脱；洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，获得BW-2组分，以毛蕊异黄酮计算总黄酮含量≥25%。分析方法可参见文献：【田芳,窦德强,迟玉新,等.亚贡叶中总黄酮及总酚酸的含量测定,时珍国医国药,2008,19(8):2013-2014.2、王淑杰,王淑华,刘钢.双波长紫外分光光度法测定甘草中总黄酮的含量,宁夏医学院报,2005,27(6):506-508.】。

（4）三七提取物经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量5～10倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量3～5倍的体积浓度为9～25%，优选20%的乙醇洗脱杂质；再用大孔树脂重量3～8倍体积的60-90%乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，获得BW-3组分，以三七总皂苷计算总皂苷含量≥60%。分析方法可参见文献：【沈岚,冯怡,徐德生,等.比色法测定三七花中总皂苷的含量,中成药,29(9):1368-1370.】。

将BW-1、BW-2、BW-3组分混合，获得所述的发明药物组合物（BW4）。

所述大孔树脂选自D-101、D-301、D401、D1300、D1400、AB-8、HPD-100、HPD-200、HPD300、HPD-400、DA-201、DM-301、DM-130、ADS-7、ADS-17、NKA-2、NKA-9、ZTC-1、SP825、HZ-816等型号的大孔树脂或聚酰胺树脂。优选为大孔树脂D-101、AB-8、D1400。所述大孔树脂均可采用商业化产品，如沧州宝恩材料科技有限公司、扬州制药有限公司的产品；

动物试验证明，本发明的药物组合物以相当于临床剂量的1-9倍剂量均可以明显降低系膜增生性肾炎模型大鼠和阿霉素致局灶性肾小球硬化大鼠的蛋白尿。病理检查表明，本发明的药物组合物具有减轻模型大鼠肾纤维化的作用，防治肾小球硬化的作用，可以用于制备防治系膜增生性肾小球肾炎、局灶性肾小球硬化症的药物。

本发明还涉及一种药物制剂，包括所述的药物组合物和医药学上可接受的载体，所述载体，所述载体包括填充剂，如淀粉、微晶纤维素或糖粉等；赋形剂，如甘露醇、乳糖或硫酸钙；崩解剂，如羧甲基淀粉钠、改良淀粉或低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂硬脂酸镁；增塑剂聚氧乙烯二醇（PEG）等。

可采用本领域公知的方法，将所述药物组合物制备成为口服制剂，如片剂、硬胶囊、软胶囊、滴丸或颗粒剂等。或制备成注射剂，经皮下及静脉注射给药。

所述药物组合物中，所述的由黄芪、三七和丹参组成的药物的重量含量为1～99.9%，优选的为50％～99.9%；

本发明可以通过口服、皮下给药及静脉注射等途径，施加于需要治疗的患者，剂量为15～180生药材/（天·人），具体可根据患者的病情、年龄等由医师决定。

本发明的发明人在长期的临床治疗中，将辩病施治与辨证施治相结合，根据中医“久病多瘀”，“久病入络”的理论，认为慢性肾脏疾病病程较长，多存在血瘀。又“久病多虚”，慢性肾脏病以肺脾肾三脏虚损为主，脾虚运化失常，湿浊内生；肾虚气化失常，水湿内生；肺虚不能通调水道，水液内停。水湿、湿浊之邪日久，气血运行不畅，血行迟滞而成瘀。对临床慢性肾小球肾炎气虚证及其兼夹标证分析显示，气虚证约占56.3%，而约85%以上气虚证患者夹杂有血瘀证。因此，认为气虚血瘀是导致疾病反复或加重的主要因素。这也与现代医学对慢性肾炎的发现机制研究结果相类似，即免疫反应是引起肾小球疾病的关键，由免疫反应介导的凝血启动则是病变持续发展和肾功能进行性减退的重要因素。针对慢性肾炎基本病机，制订了由黄芪、三七、丹参组成的防治慢性肾炎的方药配比。三药配伍益气活血、标本兼治。本发明的药物组合物的药效，优于其中任何一种药用组分单用或其中两种药用组分合用。而且毒性较小，适合长期服用。

附图说明

图1为本发明组合物的高效液相色谱（HPLC）图；

图2为本发明组合物治疗系膜增生性肾炎模型大鼠的肾组织病理形态图；

图3为本发明组合物治疗阿霉素致肾小球硬化模型大鼠的肾组织病理形态图。

具体实施方式

实施例1

配方：

黄芪27份、三七9份和丹参18份；

制备方法：

（1）处方量黄芪药材加入8倍重量体积浓度为60%的乙醇回流提取3小时，提取3次，获得黄芪提取物。三七药材加入8倍重量体积浓度为80%的乙醇回流提取3小时，提取3次，获得三七提取物。丹参药材加入6倍重量体积浓度为50%的乙醇回流提取3小时，提取3次，获得丹参提取物。提取液分别减压回收乙醇，浓缩至以药材量计1.8±0.5g·mL^-1浓度。

（2）将提取物分别经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量10倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量5倍的体积浓度为10%的乙醇洗脱杂质。

（3）丹参提取物用大孔树脂重量4倍体积的30%乙醇洗脱；洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，获得BW-1组分。

黄芪提取物用大孔树脂重量8倍体积的60%乙醇洗脱；洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，获得BW-2组分。

三七提取物用大孔树脂重量6倍体积的80%乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，获得BW-3组分。

将三者混合，获得所述的发明药物组合物（BW4）。

所述大孔树脂为AB-8。

采用LC-MS联用技术，通过DAD及MS检识、标准品对照，确定BW-1、BW-2、BW-3主要化学成分为：

BW-1：主要含酚酸类成分丹酚酸B，丹酚酸A，迷迭香酸、紫草酸、原儿茶醛、丹参素等。

BW-2：主要含黄酮类成分毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮，芒柄花素、(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、(3R)-2＇-羟基-3＇,4＇-二甲氧基异黄烷7-O-β-D-葡萄糖苷等；及皂苷类成分黄芪甲苷等。

BW-3：主要含皂苷类成分三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，Rb1，Re，Rd等；

分析方法，可参见文献：【张靖,徐文,丘小惠,卢传坚,等.HPLC法分析不同提取方法黄芪三七配伍的化学成分变化，药物分析杂志,2011,31(6):1131-1136.2、徐文,丘小惠,卢传坚,等.超高压液相/电喷雾-LTQ-Orbitrap质谱联用技术分析三七根中皂苷类成分》，药学学报2012,47(6)：773-778.】。

采用紫外-可见分光光度法测定所述的发明药物组合物（BW4）中各类化学成分总含量：

总黄酮含量（毛蕊异黄酮为对照品）≥0.7%；

总皂苷含量（三七总皂苷为对照品）≥56.1%；

总酚酸含量（咖啡酸为对照品）≥9.1%。

分析方法可参见文献：【1、田芳,窦德强,迟玉新,等.亚贡叶中总黄酮及总酚酸的含量测定,时珍国医围药,2008,19(8):2013-2014.2、王淑杰,王淑华,刘钢.双波长紫外分光光度法测定甘草中总黄酮的含量,宁夏医学院报,2005,27(6):506-508.3、沈岚,冯怡,徐德生,等.比色法测定三七花中总皂苷的含量,中成药,29(9):1368-1370.】。

实施例2

配方：

黄芪18份、三七6份和丹参6份；

制备方法：

将处方量黄芪、三七和丹参药材混合，然后加入10倍重量体积浓度为80%的乙醇回流提取4小时，提取2次，提取液减压回收乙醇，浓缩至以药材量计1.8±0.3g·mL^-1浓度，获得提取物；

（2）将提取物经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量5倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量4倍的体积浓度为10%的乙醇洗脱杂质；

（3）再用大孔树脂重量10倍的体积浓度为75%的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，即可获得所述的发明药物组合物。

所述大孔树脂为D1400。

采用LC-MS联用技术，通过DAD及MS检识、标准品对照，确定所述的发明药物组合物主要化学成分为：

酚酸类成分，主要有丹酚酸B，丹酚酸A，迷迭香酸、紫草酸、原儿茶醛、丹参素等；黄酮类成分，主要有毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，芒柄花苷，毛蕊异黄酮，芒柄花素，(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷，(3R)-2＇-羟基-3＇,4＇-二甲氧基异黄烷7-O-β-D-葡萄糖苷等；皂苷类成分，主要有三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，Rb1，Re，Rd，黄芪甲苷等。

分析方法，可参见文献：【张靖,徐文,丘小惠,卢传坚,等.HPLC法分析不同提取方法黄芪三七配伍的化学成分变化，药物分析杂志,2011,31(6):1131-1136.2、徐文,丘小惠,卢传坚,等.超高压液相/电喷雾-LTQ-Orbitrap质谱联用技术分析三七根中皂苷类成分》，药学学报2012,47(6)：773-778.】。

采用高效液相法测定组和物中主要化学成分含量：

毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷≥0.36%，芒柄花苷≥0.12%，毛蕊异黄酮≥0.13%，三七皂苷R1≥5.08%，人参皂苷Rg1≥17.15%，Rb1≥16.52%，丹酚酸B≥1.20%。

分析方法可参见文献：【张靖,徐文,丘小惠,卢传坚,等.HPLC法分析不同提取方法黄芪三七配伍的化学成分变化，药物分析杂志,2011,31(6):1131-1136.】。

图1是HPLC色谱图，图1-1是色谱图（205nm），图1-2是色谱图（250nm）。

实施例3

配方：

黄芪10份、三七3份和丹参4份；

制备方法：

将处方量黄芪、三七和丹参药材混合，然后加入10倍重量体积水100℃提取3小时，提取4次，合并提取液，减压浓缩至以药材量计1.5±0.5g·mL^-1浓度，加乙醇至70-80%，静置沉淀，过滤（或离心），过滤液减压回收乙醇，浓缩至以药材量计1.8±0.3g·mL^-1浓度，获得提取物。

（2）将提取物经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量10倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量5倍的体积浓度为10%的乙醇洗脱杂质；

（3）再用大孔树脂重量8倍的体积浓度为70%的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，即可获得所述的发明药物组合物；

所述大孔树脂为D101。

实施例4

药效学研究：

本发明的药物组合物(BW4)药效优于其中任何一种药用组分单用或其中两种药用组分合用，可明显降低系膜增生性肾炎模型大鼠和阿霉素致局灶性肾小球硬化大鼠的蛋白尿。

1、改善MsPGN模型大鼠蛋白尿作用的比较

实验动物：SD大鼠，雄性，体重(150±10)g

实验药物：BW1、BW2、BW3、BW4为实施例1的药物。另将BW1、BW2、BW3分别两两组合为BW1+BW2、BW1+BW3、BW2+BW3，给药剂量按临床剂量换算为大鼠等效剂量的3倍。用双蒸水溶解为所需浓度。

实验方法：除正常组外，经SD大鼠尾静脉注射兔抗thy-1血清，按1:2稀释后，每只注射1ml，实验当天开始测尿蛋白，于第二天补注射1:2的血清1ml/只。给药组及阳性对照组第二天开始给药，于给药后第1天，第3天，第5天，第7天测定24小时平均尿蛋白量。

实验分组：正常组、模型组、BW1、BW2、BW3、BW1+2、BW1+3、BW2+3、BW4及阳性对照组(地塞米松)。

实验结果：BW4具有较好的降低尿蛋白的作用，在给药第3天即产生效果，其作用效果略低于阳性组；BW1+3与BW2+3组在给药第7天产生作用。结果见下表：

表1.各组SD大鼠平均尿蛋白量（mg）

*,表示P<0.05；**，表示P<0.01

（1）改善阿霉素致肾小球硬化模型大鼠蛋白尿作用的比较

实验动物：SD大鼠，雌性，体重(150±10)g。

实验药物：BW1、BW2、BW3、BW4及两种有效组分的组合物：BW1+2、BW1+3、BW2+3。用双蒸水溶解为所需浓度。对照品：雷公藤多甙片，上海复旦复华药业有限公司，批号：100503。用双蒸水溶解为所需浓度。

实验分组：正常组（不切肾）、空白对照组(切肾)、模型组（切肾+尾静脉注射阿霉素）、雷公藤多甙组(切肾+尾静脉注射阿霉素)、BW1、BW2、BW3、BW1+2、BW1+3、BW2+3、BW4组。

实验方法：除正常组外，其余各组将大鼠麻醉后，行左肾摘除术。10天后，待大鼠伤口愈合，状态恢复，除空白对照组外，其余各组经尾静脉注射阿霉素5mg/kg，注射三周后将大鼠分组分组。从注射阿霉素第三周末开始分别给予雷公藤多甙片和BW1、BW2、BW3、BW1+2、BW1+3、BW2+3、BW4灌胃，给药剂量按临床剂量换算为大鼠等效剂量的9倍。灌胃一周后开始测定尿蛋白，每周一次，连续五周(共测六次)。

实验结果：三种药物的醇提部分中BW4具有较好的降低尿蛋白的作用，在给药第3周即产生效果，其降尿蛋白效果略优于阳性组，亦优于其它各组。结果见表2：

表2.各组SD大鼠每周平均尿蛋白量（mg）

*,表示P<0.05；**，表示P<0.01

表2续.各组SD大鼠每周平均尿蛋白量（mg）

*,表示P<0.05；**，表示P<0.01

实施例5

高、中、低剂量BW4对系膜增生性肾炎模型大鼠的药效研究：

实验动物：SD大鼠，雌性，体重(150±10)g。

实验药物：BW4(实施例3的药物)给药剂量按临床剂量换算为大鼠等效剂量为低剂量，中剂量和高剂量分别为低剂量的3倍和9倍。阳性对照为雷公藤多甙片（上海复旦复华药业有限公司，批号：100503）。用双蒸水溶解为所需浓度。

实验分组：正常组、模型组、BW4高剂量组、中剂量组、低剂量组及雷公藤多甙组。

实验方法：除正常组外，经SD大鼠尾静脉注射兔抗thy-1血清，按1:2稀释后，每只注射1ml，实验当天开始测尿蛋白，于第二天补注射1:2的血清1ml/只。给药组及阳性对照组第二天开始给药，于给药后第1天，第3天，第5天，第7天测定24小时平均尿蛋白量。

实验结果：BW4低、中、高剂量均有降低模型大鼠尿蛋白的作用，以中、高剂量较为显著。其疗效与用药剂量有一定关系，但量-效关系尚不明确。结果见表3.。

表3.各组SD大鼠平均尿蛋白量

与正常组比较*P<0.01,与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01

对肾脏病理切片进行PAS染色并在光镜下观察，正常大鼠肾小球血管袢薄而清晰，系膜区有1-3个系膜细胞。模型组系膜宽度超过毛细血管直径，使毛细血管腔有挤压现象，系膜细胞增加。BW4高、中、低剂量组与模型组比较病变程度明显减轻，但高、中、低剂量各组之间无明显差异。阳性对照组与模型组比较无明显改善。具体见图2，其中：图2A为正常组，图2B为模型组（×400PAS染色），图2C为阳性对照组（×400PAS染色）(雷公藤多甙)，图2D为BW4高剂量（×400PAS染色，）图2E为BW4中剂量（×400PAS染色），图2F为BW4低剂量（×400PAS染色）。

实施例6

高、中、低剂量BW4对阿霉素致SD大鼠肾小球硬化模型大鼠的药效研究：

实验方法：

实验动物：SD大鼠，雌性，体重(150±10)g。

实验药物：BW4（实施例2的药物）给药剂量按临床剂量换算为大鼠等效剂量为低剂量，中剂量和高剂量分别为低剂量的3倍和9倍。阳性对照为雷公藤多甙片（上海复旦复华药业有限公司，批号：100503）。用双蒸水溶解为所需浓度。

实验分组：正常组、模型组、BW4高剂量组、中剂量组、低剂量组及雷公藤多甙组。

实验方法：除正常组外，其余各组将大鼠麻醉后，行左肾摘除术。10天后，待大鼠伤口愈合，状态恢复，除空白对照组外，其余各组经尾静脉注射阿霉素5mg/kg，注射三周后将大鼠分组分组。从注射阿霉素第三周末开始分别给予雷公藤多甙片和BW4高、中、低剂量灌胃。灌胃一周后开始测定尿蛋白，每周一次，连续五周(共测六次)。。测定六次蛋白尿。于实验结束时取大鼠肾脏做病理切片。

实验结果:

BW4低、中、高剂量及雷公藤多甙组均有降低模型大鼠尿蛋白的作用，中剂量有显著性差异。其量-效关系不明确。结果见表4.。

表4.各组SD大鼠平均尿蛋白量

与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，^△P<0.05。

HE染色后检查肾组织病理形态，结果显示：模型组大鼠肾小球严重损害，系膜增宽、硬化、玻璃样变，系膜内和毛细血管内常有脂滴和玻璃样物质沉积。扩张的肾小管腔内有各种管型,肾小管上皮肿胀、增生、颗粒变性明显，肾间质小血管管壁增厚、管腔狭窄，局部可见明显的淋巴细胞浸润及纤维化。阳性对照组(雷公藤多甙片组)肾小球细胞数轻度增加，肾小球充血减轻，小球内大量蛋白渗出减少，肾间质淋巴、浆细胞浸润较多，小管轻、中度的透明变性、颗粒变性(比模型组轻)，部分小球增生性病变较重，局部可见轻中度间质纤维化，与模型组比较无明显改善。BW4用药组肾小球结构较为清晰，毛细血管腔未被完全填充，有轻度挤压。肾小管管腔出现少量管型,仅见部分透明变性、颗粒变性，间质纤维化程度较轻，与模型组比较有较为明显的改善。高、中、低剂量之间无明显差别。具体见图3，图3A为正常组（×200HE染色），图3B为模型组（×200HE染色），图3C为阳性对照组（×200HE染色），图3D为BW4高剂量（×200HE染色），图3E为BW4中剂量（×200HE染色），图3F为BW4低剂量（×200HE染色）。

实施例7

毒性试验

采用的药物为实施例6的药物。

实验动物：昆明种小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g

实验方法：将小鼠随机分为三组，雌雄各半，每组20只。正常给药剂量按临床剂量换算为小鼠等效剂量。毒性实验的三个剂量分别为正常给药剂量的25倍、50倍、100倍。给药后常规饲养14天，记录动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物及中毒等反应。第14天，称重，处死，解剖小鼠，肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾等脏器外观。

实验结果：在给药后连续14天的观察中，小鼠无死亡，动物的外观、食欲、行为活动、排泄均未见异常，处死后解剖，各器官未见异常。

Claims (3)

1.防治系膜增生性肾小球肾炎、局灶性肾小球硬化症的药物组合物，其特征在于，是黄芪、三七和丹参的提取物配伍而成，其中，有效成分为黄酮类、皂苷类和酚酸类，所用的药材重量份数为：黄芪9～30份、三七3～10份和丹参3～20份；

各类化学成分重量百分比含量为：

以毛蕊异黄酮为对照品，总黄酮含量为    0.3～30.0％；

以三七总皂苷为对照品，总皂苷含量为    18.0～98.0％；

以咖啡酸为对照品，总酚酸含量为        1.7～52.0％；

其中：

毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含量为0.03～3.6％；

芒柄花苷含量为0.01～1.2％；

毛蕊异黄酮含量为0.01～1.3％；

三七皂苷R1含量为0.9～9.6％；

人参皂苷Rg1含量为3.1～31.5％；

人参皂苷Rb1含量为3.0～30.3％；

丹酚酸B含量为0.1～10.00％

制备方法，包括如下步骤：

方法一：

(1)将黄芪、三七和丹参混合，加5-15重量倍的体积浓度为30-100％的乙醇渗漉或回流提取1-5次，合并提取液，过滤或离心，过滤液或上清液减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.05-1.35，获得提取物；或者加2-15倍量的水于60-100℃温浸或回流提取1-5次，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.05～1.35，加乙醇至浓度为30—90％，静置沉淀，过滤或离心，过滤液或上清液减压回收乙醇，浓缩，获得提取物；

(2)提取物经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量5～10倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量3～5倍的体积浓度为9～15％的乙醇洗脱杂质；

(3)再用大孔树脂重量3～8倍体积浓度为30％～90％的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，即可获得所述的药物组合物：

方法二：

(1)将黄芪、三七和丹参单味药材，采用方法一中步骤(1)所述的提取方法，分别提取，获得黄芪提取物、三七提取物和丹参提取物；

(2)丹参提取物经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量5～10倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量3～5倍的体积浓度为9～15％的乙醇洗脱杂质；再用大孔树脂重量3～8倍体积浓度为20-40％乙醇洗脱；洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，获得BW-1组分，

(3)黄芪提取物经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量5～10倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量3～5倍的体积浓度为9～25％的乙醇洗脱杂质；再用大孔树脂重量3～8倍体积浓度为40-60％乙醇洗脱；洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，获得BW-2组分，

(4)三七提取物经大孔树脂吸附，先用大孔树脂重量5～10倍的水洗脱杂质，然后再用大孔树脂重量3～5倍的体积浓度为9～25％的乙醇洗脱杂质；再用大孔树脂重量3～8倍体积浓度为60-90％乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥，获得BW-3组分，将BW-1、BW-2、BW-3组分混合，获得所述的药物组合物。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述大孔树脂选自D-101、

D-301、D401、D1300、D1400、AB-8、HPD-100、HPD-200、HPD300、HPD-400、DA-201、DM-301、DM-130、ADS-7、ADS-17、NKA-2、NKA-9、ZTC-1、SP825或HZ-816。

3.一种药物制剂，包括治疗有效量的权利要求1或2所述的药物组合物和医药学上可接受的载体。