CN102381974A - 高速逆流色谱法用于忍冬中分离制备出咖啡鞣酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种高速逆流色谱法用于忍冬中分离制备出咖啡鞣酸的方法，该方法包括制备忍冬水取液、制备忍冬醇沉提取液、萃取制备咖啡鞣酸粗提液、制备固定相和流动相的溶剂体系、高速逆流色谱法分离纯化过程五个工艺步骤。从忍冬中提取咖啡鞣酸粗提液，在确定分离咖啡鞣酸的最佳溶剂体系的基础上，通过控制高速逆流色谱仪的分离参数如主机转速、流动相流速和恒温循环器的温度等，最终一次性制备出纯度达95%以上的咖啡鞣酸。本发明的方法具有操作简便，过程温和，分离效果好，纯度高，安全可靠之特点。

Description

高速逆流色谱法用于忍冬中分离制备出咖啡鞣酸的方法

技术领域

本发明属于植物分离技术领域，尤其涉及到一种高速逆流色谱法用于忍冬中分离制备出咖啡鞣酸的方法。

 

背景技术

2005年版《中国药典》规定：忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb）为金银花药材的法定植物来源。

忍冬是一种“药食同源”的绿色天然产物，忍冬含有咖啡鞣酸，化学名称为：1，3，4，5-四羟基环己烷羧酸-（3，4-二羟基肉桂酸酯）；属于咖啡酰奎尼酸衍生物。

咖啡鞣酸被认为是众多药材和中成药中抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分。据报道，咖啡鞣酸的主要生物活性有：

（1）对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶具有抑制作用；

（2）对自由基的清除及抗脂质具有过氧化作用；

（3）具有抗诱变作用；

（4）具有保肝利胆作用；

（5）具有抗菌、抗病毒及解痉挛作用。

咖啡鞣酸是保健食品、药品、化妆品的重要原料。所以从忍冬中提取咖啡鞣酸可以大大提高忍冬的经济价值。目前从忍冬中分离制备咖啡鞣酸的方法有溶剂提取法、大孔吸附树脂法以及高效液相色谱法等。溶剂提取法操作麻烦，耗费大量溶剂，污染环境，产量低，且产品纯度也不高；大孔吸附树脂法分离周期长，耗费大量溶剂，污染环境，而且柱子清洗麻烦，生产成本高操作麻烦；高效液相色谱（制备型）法虽然具有处理时间短、产品纯度高的优点，但高昂的成本使其不能用于大规模生产。

高速逆流色谱（High-speed countercurrent chromatography, HSCCC）法是一种连续的无需固体支撑体的高效、快速的液液分配色谱分离技术，其原理是利用流体动力学平衡现象来实现对化合物的高速分离。在这样的动力平衡中，两种互不混溶的溶剂在转动螺旋管中单向地分布。高速逆流色谱仪工作时，色谱仪中的螺旋管做行星运动，由于重力及螺旋管力的作用，固定相移向螺旋管的入端，使得固定相得以保留，同时两相溶剂在螺旋管中得以混合。由于不同溶质在两相中的分配系数不同，溶质在两相溶剂中进行分配平衡，从而使不同成分得以分离。但高速逆流色谱法用于忍冬中分离制备出咖啡鞣酸的方法未见报道。

 

发明内容

为解决上述利用忍冬分离制备咖啡鞣酸技术存在的不足，本发明提供了一种高速逆流色谱法用于忍冬中分离制备出咖啡鞣酸的方法，该方法先从忍冬中提取咖啡鞣酸粗提液；在确定高速逆流色谱法中固定相和流动相的溶剂体系的基础上，通过控制高速逆流色谱仪的分离参数分离咖啡鞣酸粗提液，最终制备出纯度达95%以上的咖啡鞣酸。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种高速逆流色谱法用于忍冬中分离制备出咖啡鞣酸的方法，该方法包括制备忍冬水取液、制备忍冬醇沉提取液、萃取制备咖啡鞣酸粗提液、制备固定相和流动相的溶剂体系、高速逆流色谱法分离纯化过程五个工艺步骤，该五个工艺步骤分述如下： 

①制备忍冬水取液

将忍冬干燥粉碎并过40目筛后装于提取罐中并用去离子水进行浸提，忍冬与所述去离子水的重量比为1:8~10，所述去离子水的温度控制在60~90℃，所述浸提的时间控制在1~2h，将所述去离子水+忍冬形成的浸提液趁热过滤并冷却，分别制备出忍冬水取液和忍冬残留液；

②制备忍冬醇沉提取液

将①中制备出的所述忍冬水取液装入第一反应皿中，再向第一反应皿加入无水乙醇直至反应皿中乙醇浓度达到体积百分比60~80%时为止，放置过夜后对所述忍冬水+乙醇进行过滤得到过滤液，再对所述过滤液进行减压回收出乙醇并制备出忍冬醇沉提取液；

③萃取制备咖啡鞣酸粗提液

将②中制备出的所述忍冬醇沉提取液装入第二反应皿中，再向第二反应皿中加入乙酸乙酯进行萃取，所加乙酸乙酯与忍冬醇沉提取液的重量比为2:1，然后用质量百分比浓度为37.5%的盐酸调节第二反应皿中的pH值直至达到pH=1~3为止，所述萃取时间控制在1~2h，最后收集出乙酸乙酯层并制备出咖啡鞣酸粗提液；

④制备固定相和流动相的溶剂体系

按体积比将乙酸乙酯:乙醇:水=1~5:1~2:2~5放在第三反应皿中进行混合组成溶剂体系，待静置后第三反应皿中所述溶剂体系自然分为上相和下相，所述上相简称为固定相，所述下相简称为流动相，将所述固定相置于第四反应皿中，将所述流动相置于第五反应皿中；

⑤高速逆流色谱法分离纯化过程

在第四反应皿中接入第一泵，在第五反应皿中接入第二泵，设定第一泵和第二泵的流速同为10ml/min，同时开启第一泵和第二泵汇入高速逆流色谱仪的螺旋管；当所述溶剂体系从高速逆流色谱仪的管路出口流出时关闭第一泵，将第二泵的流速调节到1~3ml/min，然后同时启动高速逆流色谱仪的主电机，主电 机转速控制在700~1000r/min，高速逆流色谱仪的恒温循环器温度控制在20~50℃，待所述管路出口处只有所述流动相流出时其管路内溶剂体系达到动态平衡；最后通过高速逆流色谱仪的进样阀注入10~30ml所述咖啡鞣酸粗提液，设定高速逆流色谱仪的检测波长为327nm，最后根据高速逆流色谱仪显示的检测图谱收集咖啡鞣酸。

由于采用如上所述技术方案，本发明具有如下优点：

1、本发明的方法可连续进行，具有操作简便、效率高之特点；

2、本发明制备出的咖啡鞣酸具有纯度高、制备量大之特点；

3、本发明的制备方法不存在不可逆吸附现象，避免了忍冬的损耗，具有分离效果好，溶剂用量少，无污染，高效，快捷之优点。

具体实施方式

本发明是一种高速逆流色谱法用于忍冬中分离制备出咖啡鞣酸的方法，该方法先从忍冬中提取咖啡鞣酸粗提液，在确定分离咖啡鞣酸的最佳溶剂体系的基础上，通过控制高速逆流色谱仪的分离参数如主机转速、流动相流速和恒温循环器的温度等，最终一次性制备出纯度达95%以上的咖啡鞣酸。本发明的方法具有操作简便，过程温和，分离效果好，纯度高，安全可靠。

以下结合实例对本发明的方法作进一步阐述。

实施例1：

将忍冬干燥粉碎并过40目筛后装于提取罐中并用去离子水进行浸提，忍冬与所述去离子水的重量比为1:8，所述去离子水的温度控制在60℃，所述浸提的时间控制在2h，将所述去离子水+忍冬形成的浸提液趁热过滤并冷却，分别制备出忍冬水取液和忍冬残留液。

将制备出的所述忍冬水取液装入第一反应皿中，再向第一反应皿加入无水乙醇直至反应皿中乙醇浓度达到体积百分比60%时为止，放置过夜后对所述忍冬水+乙醇进行过滤得到过滤液，再对所述过滤液进行减压回收出乙醇并制备出忍冬醇沉提取液。

将制备出的所述忍冬醇沉提取液装入第二反应皿中，再向第二反应皿中加入乙酸乙酯进行萃取，所加乙酸乙酯与忍冬醇沉提取液的重量比为2:1，然后用质量百分比浓度为37.5%的盐酸调节第二反应皿中的pH值直至达到pH=1为止，所述萃取时间控制在1h，最后收集出乙酸乙酯层并制备出咖啡鞣酸粗提液。

按体积比将乙酸乙酯:乙醇:水=1:1:2放在第三反应皿中进行混合组成溶剂体系，待静置后第三反应皿中所述溶剂体系自然分为上相和下相，所述上相简称为固定相，所述下相简称为流动相，将所述固定相置于第四反应皿中，将所述流动相置于第五反应皿中。

在第四反应皿中接入第一泵，在第五反应皿中接入第二泵，设定第一泵和第二泵的流速同为10ml/min，同时开启第一泵和第二泵汇入高速逆流色谱仪的螺旋管。当所述溶剂体系从高速逆流色谱仪的管路出口流出时关闭第一泵，将第二泵的流速调节到1ml/min，然后同时启动高速逆流色谱仪的主电机，主电 机转速控制在700r/min，高速逆流色谱仪的恒温循环器温度控制在20℃，待所述管路出口处只有所述流动相流出时其管路内溶剂体系达到动态平衡；最后通过高速逆流色谱仪的进样阀注入10ml所述咖啡鞣酸粗提液，设定高速逆流色谱仪的检测波长为327nm，最后根据高速逆流色谱仪显示的检测图谱收集咖啡鞣酸。

实施例2: 

将忍冬干燥粉碎并过40目筛后装于提取罐中并用去离子水进行浸提，忍冬与所述去离子水的重量比为1:9，所述去离子水的温度控制在75℃，所述浸提的时间控制在1.5h，将所述去离子水+忍冬形成的浸提液趁热过滤并冷却，分别制备出忍冬水取液和忍冬残留液。

将制备出的所述忍冬水取液装入第一反应皿中，再向第一反应皿加入无水乙醇直至反应皿中乙醇浓度达到体积百分比70%时为止，放置过夜后对所述忍冬水+乙醇进行过滤得到过滤液，再对所述过滤液进行减压回收出乙醇并制备出忍冬醇沉提取液。

将制备出的所述忍冬醇沉提取液装入第二反应皿中，再向第二反应皿中加入乙酸乙酯进行萃取，所加乙酸乙酯与忍冬醇沉提取液的重量比为2:1，然后用质量百分比浓度为37.5%的盐酸调节第二反应皿中的pH值直至达到pH=2为止，所述萃取时间控制在1.5h，最后收集出乙酸乙酯层并制备出咖啡鞣酸粗提液。

按体积比将乙酸乙酯:乙醇:水=3:1.5:3.5放在第三反应皿中进行混合组成溶剂体系，待静置后第三反应皿中所述溶剂体系自然分为上相和下相，所述上相简称为固定相，所述下相简称为流动相，将所述固定相置于第四反应皿中，将所述流动相置于第五反应皿中。

在第四反应皿中接入第一泵，在第五反应皿中接入第二泵，设定第一泵和第二泵的流速同为10ml/min，同时开启第一泵和第二泵汇入高速逆流色谱仪的螺旋管。当所述溶剂体系从高速逆流色谱仪的管路出口流出时关闭第一泵，将第二泵的流速调节到2ml/min，然后同时启动高速逆流色谱仪的主电机，主电 机转速控制在850r/min，高速逆流色谱仪的恒温循环器温度控制在35℃，待所述管路出口处只有所述流动相流出时其管路内溶剂体系达到动态平衡；最后通过高速逆流色谱仪的进样阀注入20ml所述咖啡鞣酸粗提液，设定高速逆流色谱仪的检测波长为327nm，最后根据高速逆流色谱仪显示的检测图谱收集咖啡鞣酸。

实施例3:

将忍冬干燥粉碎并过40目筛后装于提取罐中并用去离子水进行浸提，忍冬与所述去离子水的重量比为1:10，所述去离子水的温度控制在90℃，所述浸提的时间控制在1h，将所述去离子水+忍冬形成的浸提液趁热过滤并冷却，分别制备出忍冬水取液和忍冬残留液。

将制备出的所述忍冬水取液装入第一反应皿中，再向第一反应皿加入无水乙醇直至反应皿中乙醇浓度达到体积百分比80%时为止，放置过夜后对所述忍冬水+乙醇进行过滤得到过滤液，再对所述过滤液进行减压回收出乙醇并制备出忍冬醇沉提取液。

将制备出的所述忍冬醇沉提取液装入第二反应皿中，再向第二反应皿中加入乙酸乙酯进行萃取，所加乙酸乙酯与忍冬醇沉提取液的重量比为2:1，然后用质量百分比浓度为37.5%的盐酸调节第二反应皿中的pH值直至达到pH=3为止，所述萃取时间控制在2h，最后收集出乙酸乙酯层并制备出咖啡鞣酸粗提液。

按体积比将乙酸乙酯:乙醇:水=5:2:5放在第三反应皿中进行混合组成溶剂体系，待静置后第三反应皿中所述溶剂体系自然分为上相和下相，所述上相简称为固定相，所述下相简称为流动相，将所述固定相置于第四反应皿中，将所述流动相置于第五反应皿中。

在第四反应皿中接入第一泵，在第五反应皿中接入第二泵，设定第一泵和第二泵的流速同为10ml/min，同时开启第一泵和第二泵汇入高速逆流色谱仪的螺旋管。当所述溶剂体系从高速逆流色谱仪的管路出口流出时关闭第一泵，将第二泵的流速调节到3ml/min，然后同时启动高速逆流色谱仪的主电机，主电 机转速控制在1000r/min，高速逆流色谱仪的恒温循环器温度控制在50℃，待所述管路出口处只有所述流动相流出时其管路内溶剂体系达到动态平衡；最后通过高速逆流色谱仪的进样阀注入30ml所述咖啡鞣酸粗提液，设定高速逆流色谱仪的检测波长为327nm，最后根据高速逆流色谱仪显示的检测图谱收集咖啡鞣酸。

以上三例所得咖啡鞣酸经高效液相色谱仪检测纯度均达95%以上。可以看出高速逆流色谱仪具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点，本发明是一种非常有前景的忍冬咖啡鞣酸制备方法。

高效液相色谱分析条件为：色谱柱C18反相柱；流动相为1%磷酸甲醇溶液；检测波长为327nm。

Claims (1)

1.一种高速逆流色谱法用于忍冬中分离制备出咖啡鞣酸的方法，该方法包括制备忍冬水取液、制备忍冬醇沉提取液、萃取制备咖啡鞣酸粗提液、制备固定相和流动相的溶剂体系、高速逆流色谱法分离纯化过程五个工艺步骤，其特征是：所述五个工艺步骤分述如下：

①制备忍冬水取液

将忍冬干燥粉碎并过40目筛后装于提取罐中并用去离子水进行浸提，忍冬与所述去离子水的重量比为1:8~10，所述去离子水的温度控制在60~90℃，所述浸提的时间控制在1~2h，将所述去离子水+忍冬形成的浸提液趁热过滤并冷却，分别制备出忍冬水取液和忍冬残留液；

②制备忍冬醇沉提取液

将①中制备出的所述忍冬水取液装入第一反应皿中，再向第一反应皿加入无水乙醇直至反应皿中乙醇浓度达到体积百分比60~80%时为止，放置过夜后对所述忍冬水+乙醇进行过滤得到过滤液，再对所述过滤液进行减压回收出乙醇并制备出忍冬醇沉提取液；

③萃取制备咖啡鞣酸粗提液

将②中制备出的所述忍冬醇沉提取液装入第二反应皿中，再向第二反应皿中加入乙酸乙酯进行萃取，所加乙酸乙酯与忍冬醇沉提取液的重量比为2:1，然后用质量百分比浓度为37.5%的盐酸调节第二反应皿中的pH值直至达到pH=1~3为止，所述萃取时间控制在1~2h，最后收集出乙酸乙酯层并制备出咖啡鞣酸粗提液；

④制备固定相和流动相的溶剂体系

按体积比将乙酸乙酯:乙醇:水=1~5:1~2:2~5放在第三反应皿中进行混合组成溶剂体系，待静置后第三反应皿中所述溶剂体系自然分为上相和下相，所述上相简称为固定相，所述下相简称为流动相，将所述固定相置于第四反应皿中，将所述流动相置于第五反应皿中；

⑤高速逆流色谱法分离纯化过程

在第四反应皿中接入第一泵，在第五反应皿中接入第二泵，设定第一泵和第二泵的流速同为10ml/min，同时开启第一泵和第二泵汇入高速逆流色谱仪的螺旋管；当所述溶剂体系从高速逆流色谱仪的管路出口流出时关闭第一泵，将第二泵的流速调节到1~3ml/min，然后同时启动高速逆流色谱仪的主电机，主电 机转速控制在700~1000r/min，高速逆流色谱仪的恒温循环器温度控制在20~50℃，待所述管路出口处只有所述流动相流出时其管路内溶剂体系达到动态平衡；最后通过高速逆流色谱仪的进样阀注入10~30ml所述咖啡鞣酸粗提液，设定高速逆流色谱仪的检测波长为327nm，最后根据高速逆流色谱仪显示的检测图谱收集咖啡鞣酸。