CN102311327A - 一种蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素的制备方法，采用醇提——两相溶剂体系分配——高速逆流色谱分离纯化——结晶组合工艺，提取制备蓝萼香茶菜中的蓝萼甲素、蓝萼乙素和蓝萼丙素。两相溶剂体系分配先采用乙酸乙酯-水体系分配，上相浓缩后再用石油醚-甲醇体系分配，下相浓缩蒸干得甲醇萃取物。该制备方法通过两次不同溶剂体系分配，除去了部分杂质，高速逆流色谱法分离过程无产品损失，制备周期短，克服了传统硅胶柱分离过程中样品死吸附、工艺繁琐、重现性差的技术缺陷。

Description

一种蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素的制备方法

技术领域

本发明属于天然植物有效成分提取技术领域，涉及一种蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素的制备方法。

背景技术

蓝萼香茶菜Rabdosia japonica (Burm.f.)Hara var.glau-cocalyxi(Maxin)Hara为唇形科香茶菜属植物，又名山苏子，广布于我国北方，长期以来，我国民间作为毛叶香茶菜用，具有健胃、清热解毒、活血、抗菌消炎和抗癌活性。蓝萼香茶菜还具有与剂量相关的心肌保护作用。其化学成分主要为二萜和三萜类化合物。沈晓丹等从蓝萼香茶菜中分离得到蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素等贝壳杉烷型二萜类化合物，张滨等通过药理研究蓝萼甲素具有显著抑制ADP，AA，PAF等诱导的兔血小板聚集。中国专利申请号200910044882.0采用MTT法，用A549、LOVO、6T-CEM、HL-60细胞株对蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素、蓝萼丁素、蓝萼戊素、蓝萼己素进行了细胞毒活性实验，发现它们均具有显著的细胞毒活性，可用于制备抗癌药物。中国专利申请号200910044883.6采用乙肝表面抗原（HBsAg）诊断试剂盒和乙肝核心抗原（HBeAg）诊断试剂盒对上述蓝萼香茶菜二萜类化合物进行了抗乙肝表面抗原和乙肝核心抗原试验，发现它们均具有显著的抗乙肝病毒活性，可用于制备乙肝病毒的药物。

现有技术多采用硅胶柱反复层析进行分离，中国专利申请号201010264658.5采用常压乙醇回流提取，提取液浓缩、硅胶柱层析，无水乙醇重结晶的方法提取得到蓝萼甲素，该方法采用传统硅胶柱层析法，样品损失较大，得率低，且仅分离得到一种单体，原料利用率低。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种从蓝萼香茶菜中制备蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将蓝萼香茶菜叶粉碎，用乙醇加热回流提取，合并提取液，浓缩得浸膏；

（2）将浸膏用乙酸乙酯和水的混合溶液溶解，过滤，乙酸乙酯和水的体积比为10:1，滤液静置分层12-24h，分液，取上相减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物用石油醚-甲醇的混合溶液溶解，过滤，石油醚和甲醇的体积比为1:1，静置分层8-12h，分液，取下相，减压浓缩蒸干得甲醇萃取物；

（3）将甲醇萃取物通过高速逆流色谱仪进一步分离，所用的溶剂体系为正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水，其体积比为（3-5）：（1-2）：（3-5）：（2-4），置于分液漏斗中摇匀，静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将上相充满整个色谱柱中，调整主机转速，泵入流动相，待平衡后注入流动相溶解的甲醇萃取物，紫外检测器检测，分别收集蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素流分，减压浓缩得各单体成分粗晶；

（4）将蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素粗晶分别用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，冷冻干燥得到纯度95%以上的蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素结晶产品。

本发明的优势在于：通过两次不同的两相溶剂体系分配，提高了蓝萼香茶菜二萜化合物的保留率，同时减轻了后续工序的工作量；采用高速逆流色谱进行分离纯化，以正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水为溶剂体系，分离效果好，溶剂消耗少，可一次性制备大量蓝萼香茶菜二萜单体成分产品，原料利用率高，具有较高的经济价值。

具体实施方式

实施例1：

取1kg蓝萼香茶菜叶粉碎过20目筛，用70%乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏。将浸膏用乙酸乙酯和水的混合溶液（乙酸乙酯和水的体积比为10:1）搅拌溶解，过滤，滤液静置分层15h，分液，取上相，减压浓缩蒸干得到乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物用石油醚和甲醇的混合溶液（石油醚和甲醇的体积比为1:1）搅拌溶解，过滤，滤液静置分层10h，分液，取下相，减压浓缩蒸干得到甲醇萃取物。将甲醇萃取物通过高速逆流色谱分离纯化，以正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水为溶剂系统，按体积比为3:1:4:3置于分液漏斗中摇匀，静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将上相充满整个色谱柱中，调整主机转速，泵入流动相，待平衡后注入流动相溶解的甲醇萃取物，紫外检测器检测，分别收集蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素流分，将蓝萼甲素流分减压回收试剂，用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，得到975mg蓝萼甲素；将蓝萼乙素流分减压回收试剂，用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，得到489mg蓝萼乙素；将蓝萼丙素流分减压回收试剂，用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，得到101.7mg蓝萼丙素。

实施例2：

取1kg蓝萼香茶菜叶粉碎过20目筛，用60%乙醇加热回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，减压浓缩得浸膏。将浸膏用乙酸乙酯和水的混合溶液（乙酸乙酯和水的体积比为10:1）搅拌溶解，过滤，滤液静置分层12h，分液，取上相，减压浓缩蒸干得到乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物用石油醚和甲醇的混合溶液（石油醚和甲醇的体积比为1:1）搅拌溶解，过滤，滤液静置分层12h，分液，取下相，减压浓缩蒸干得到甲醇萃取物。将甲醇萃取物通过高速逆流色谱分离纯化，以正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水为溶剂系统，按体积比为4:2:3:4置于分液漏斗中摇匀，静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将上相充满整个色谱柱中，调整主机转速，泵入流动相，待平衡后注入流动相溶解的甲醇萃取物，紫外检测器检测，分别收集蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素流分，将蓝萼甲素流分减压回收试剂，用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，得到1013mg蓝萼甲素；将蓝萼乙素流分减压回收试剂，用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，得到496mg蓝萼乙素；将蓝萼丙素流分减压回收试剂，用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，得到107.3mg蓝萼丙素。

实施例3：

取1kg蓝萼香茶菜叶粉碎过20目筛，用90%乙醇加热回流提取2次，每次3h，合并提取液，减压浓缩得浸膏。将浸膏用乙酸乙酯和水的混合溶液（乙酸乙酯和水的体积比为10:1）搅拌溶解，过滤，滤液静置分层24h，分液，取上相，减压浓缩蒸干得到乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物用石油醚和甲醇的混合溶液（石油醚和甲醇的体积比为1:1）搅拌溶解，过滤，滤液静置分层8h，分液，取下相，减压浓缩蒸干得到甲醇萃取物。将甲醇萃取物通过高速逆流色谱分离纯化，以正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水为溶剂系统，按体积比为5:1:5:2置于分液漏斗中摇匀，静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将上相充满整个色谱柱中，调整主机转速，泵入流动相，待平衡后注入流动相溶解的甲醇萃取物，紫外检测器检测，分别收集蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素流分，将蓝萼甲素流分减压回收试剂，用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，得到873mg蓝萼甲素；将蓝萼乙素流分减压回收试剂，用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，得到422mg蓝萼乙素；将蓝萼丙素流分减压回收试剂，用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，得到103.1mg蓝萼丙素。

Claims (1)

1.一种蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将蓝萼香茶菜叶粉碎，用乙醇加热回流提取，合并提取液，浓缩得浸膏；

（2）将浸膏用乙酸乙酯和水的混合溶液溶解，过滤，乙酸乙酯和水的体积比为10:1，滤液静置分层12-24h，分液，取上相减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物用石油醚-甲醇的混合溶液溶解，过滤，石油醚和甲醇的体积比为1:1，静置分层8-12h，分液，取下相，减压浓缩蒸干得甲醇萃取物；

（3）将甲醇萃取物通过高速逆流色谱仪进一步分离，所用的溶剂体系为正庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水，其体积比为（3-5）：（1-2）：（3-5）：（2-4），置于分液漏斗中摇匀，静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将上相充满整个色谱柱中，调整主机转速，泵入流动相，待平衡后注入流动相溶解的甲醇萃取物，紫外检测器检测，分别收集蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素流分，减压浓缩得各单体成分粗晶；

（4）将蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素粗晶分别用二氯甲烷-乙酸乙酯结晶，冷冻干燥得到纯度95%以上的蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素结晶产品。