CN103989740B - 蓝萼香茶菜在制备抗急性肺损伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蓝萼香茶菜在制备抗急性肺损伤药物中的应用。本发明将蓝萼香茶菜乙醇提取物和蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位分别制备成动物用药,对小鼠进行体内给药,利用脂多糖LPS诱导小鼠急性肺损伤,之后测定小鼠的肺湿/干重比;肺泡灌洗液(BALF)中一氧化氮(NO)和蛋白质含量;检测肺组织匀浆中髓过氧化酶(MPO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性;肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)、白介素‑6(IL‑6)和白介素‑1β(IL‑1β)含量;观测H&E染色后小鼠肺组织病理改变。表明蓝萼香茶菜具有抗急性肺损伤的活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种蓝萼香茶菜在制备抗急性肺损伤药物中的应用。
背景技术
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是以弥漫性肺细胞损伤为基础,肺血管损伤所致的肺水肿和肺组织炎性细胞浸润为其病理特征,临床主要表现为严重的低氧血症、弥漫性肺浸润和肺水肿;部分患者最终将会形成急性吸窘迫综合征(acute respiratorydistress syndrome,ARDS),造成机体不可逆的急性呼吸功能衰竭和多器官功能障碍,病死率高达30-40%;ALI发病机制错综复杂,ALI发病危险因素可以是来自肺的直接损伤,也可以是肺外因素通过全身性炎性反应对肺产生的间接损伤。(参见:Baffert F,Le T,Thurston G,et al.Angiopoietin-1decreases plasma leakage by reducing numberand size of endothelial gaps in venules.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(1):H107-H118;Ware L B,Matthay M A.Medical progress-The acute respiratorydistress syndrome.N Engl J Med,2000,342(18):1334-1349;Matthay M A,Zimmerman GA,Esmon C,et al.Future research directions in acute lung injury:summary of aNational Heart,Lung,and Blood Institute working group.Am J Respir Crit CareMed,2003,167(7):1027-1035.)
目前,国内外公认治疗ALI的方案:(1)去除病因;(2)在积极治疗原发病的基础上,尽早机械通气(Mechanical ventilation,MV)来纠正缺氧和改善组织供氧;MV是ALI经典治疗方式之一,能够纠正难治性缺氧,防治肺泡萎陷,对抗肺水肿,改善气体交换,减少自主呼吸作功,防止呼吸肌疲劳,但仅能维持机体生理呼吸,尚不能完全解决ALI全部问题;(3)药物治疗;临床上广泛使用肾上腺糖皮质激素、糖皮质激素、环磷酰胺、甲胺蝶呤等治疗急性肺损伤,能减少毛细血管渗出和抑制肺纤维化的形成,使肺功能得到快速的改善;但糖皮质激素等免疫抑制剂对急性肺损伤选择性差,长期应用会产生多种并发症和副作用(参见:杨永涛,汪正清。补体抑制剂研究进展。中国新药杂志,2008,17(24):2093;徐晗,章蕴毅,张建文等。天然产物中的抗补体活性成分。中国天然药物,2007,5(5):322.)。因此,寻找选择性高、毒副作用小的治疗急性肺损伤药物具有重要的临床意义。
蓝萼香茶菜(Rabdosia japonica var.glaucocalyx(Maxim.)Hara)为唇形科香茶菜属植物,作为一种低毒的民间药物在中国有悠久的使用历史,其性味苦、寒,具有抗菌消炎、清热解毒、抗肿瘤、活血化瘀、健胃等功效,用于肝炎初期、咽喉肿痛、扁桃体炎、感冒发热、脘腹胀痛等。现代药理研究认为,蓝萼香茶菜具有抑菌、抗缺血等作用(参见:崔婷婷,赵丽娟,刘岩等。蓝萼香茶菜的毒理学研究。中国医药指南,2010,8(19):246-249;刘兰娣,叶丽卡,潘东军等。蓝萼香茶菜对大鼠全心缺血-再灌注时心肌c-fos基因表达的影响。中国中药杂志,2003,6(4):73-76;金忠民,沙伟,胡修茵。蓝萼香茶菜提取液抑菌作用研究。广西科学,2007,14(2):160-162。)。但蓝萼香茶菜是否具有抗急性肺损伤作用,未见报道,本发明发现其具有抗急性肺损伤的活性。
发明内容
本发明目的是提供一种蓝萼香茶菜新的应用,即蓝萼香茶菜乙醇提取物及乙醇提取物的大孔树脂部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用。
本发明的技术方案是:将蓝萼香茶菜乙醇提取物、蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位配制成动物用药。通过对小鼠体内给药,测定急性肺损伤小鼠的肺湿/干重比,肺泡灌洗液(BALF)中一氧化氮(NO)和蛋白质含量;检测肺组织匀浆中髓过氧化酶(MPO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性;肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)含量;观测H&E染色后小鼠肺组织病理改变。实验结果表明,蓝萼香茶菜乙醇提取物及乙醇提取物的大孔树脂部位均可以减轻小鼠肺部水肿症状,降低肺泡灌洗液中一氧化氮(NO)和蛋白质的含量,显著地增强了小鼠肺组织内超氧化物歧化酶(SOD)的活性,抑制过氧化酶(MPO)的活性,降低了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的含量,对小鼠的肺组织、肺细胞、毛细血管均具有保护作用。实验结果确定,蓝萼香茶菜具有抗急性肺损伤作用,可以用于制备抗急性肺损伤的药物。
本发明中蓝萼香茶菜乙醇提取物制备方法为:取蓝萼香茶菜干燥叶和茎,切段2~3cm,加体积百分数为60%~80%乙醇水溶液回流提取1~3次,每次回流提取1~3小时,过滤,将粗提液合并,40℃~60℃减压回收得蓝萼香茶菜提取物(RJ)。经UHPLC-Q-TOF-MS分析,其主要成分为黄酮、萜类化合物。
本发明中蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位制备方法为:取上述蓝萼香茶菜乙醇提取物经大孔吸附树脂吸附,先以水洗脱除去大分子化合物,后用体积百分数为60%~65%乙醇水溶液洗脱,40℃~60℃减压回收得到蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位(RJFs)。经UHPLC-Q-TOF-MS分析,其主要成分为黄酮、二萜类化合物。
本发明的优点是为抗急性肺损伤提供了一种新的药物来源。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
图1为实施例1各实验组肺湿干重比W/D ratio的对比;
图2为实施例1各实验组肺泡灌洗液中一氧化氮(NO)含量对比;
图3为实施例1各实验组肺泡灌洗液中总蛋白含量的对比;
图4为实施例1各实验组肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α水平的对比;
图5为实施例1各实验组肺泡灌洗液中炎症因子IL-6水平的对比;
图6为实施例1各实验组肺泡灌洗液中炎症因子IL-1β水平的对比;
图7为实施例1各实验组肺组织中MPO的活性对比;
图8为实施例1各实验组肺组织中SOD的活性对比;
其中图1-8,对应的Control为空白组,RJ为对照组,LPS为模型组,LPS+RJ为不同剂量的药物组,LPS+DXM为阳性组;
图9为实施例1中各实验组肺组织切片放大400倍的显微镜照片的对比图:
图10为实施例2各实验组肺湿干重比W/D ratio的对比;
图11为实施例2各实验组肺泡灌洗液中一氧化氮(NO)含量对比;
图12为实施例2各实验组肺泡灌洗液中总蛋白含量的对比;
图13为实施例2各实验组肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α水平的对比;
图14为实施例2各实验组肺泡灌洗液中炎症因子IL-6水平的对比;
图15为实施例2各实验组肺泡灌洗液中炎症因子IL-1β水平的对比;
图16为实施例2各实验组肺组织中MPO的活性对比;
图17为实施例2各实验组肺组织中SOD的活性对比;
其中图10-17,对应的Control为空白组,RJFs为对照组,LPS为模型组,LPS+RJFs组为不同剂量的药物组,LPS+DXM为阳性组;
图18为实施例2中各实验组肺组织切片放大400倍的显微镜照片的对比图;
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明应用作具体描述。
实施例1:
蓝萼香茶菜乙醇提取物(RJ)抗小鼠急性肺损伤实验
1、实验药品与试剂:蓝萼香茶菜乙醇提取物;0.5%羧甲基纤维素钠;脂多糖(LPS),美国Sigma-Aldrich公司;对照药,醋酸地塞米松片,浙江仙琚制药股份有限公司;蒸馏水;生理盐水;20%乌拉坦-生理盐水;4%福尔马林,H-E染色液等。
2、实验小鼠:昆明小鼠,雄性,体重24~28克,由苏州大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证:XCYK(苏)2002-0008。实验动物饲养在温度24±1℃,相对湿度40%~80%的环境下,自由采食和饮水。在实验前,适应性饲养7天。
3、其他材料:ELISA试剂盒,上海船夫贸易有限公司;一氧化氮(NO)、BCA、超氧化物歧化酶(SOD)和抑制过氧化酶(MPO)试剂盒,南京建成生物工程研究所;手术刀片、注射器、滤纸、匀浆机等。
4、实验方法
昆明小鼠随机分为空白组、对照组、模型组、样品大剂量组、样品中剂量组、样品小剂量组和阳性组7个实验组,每组20只。样品大剂量组、样品中剂量组、样品小剂量组统称为药物组。空白组和模型组连续给予蒸馏水7天,剂量为0.5ml/25g;阳性组连续给予蒸馏水6天,剂量为0.5ml/25g;对照组和药物组按照剂量给予蓝萼香茶菜乙醇提取物配制的药品,连续灌胃给药7天,其中,蓝萼香茶菜乙醇提取物具体剂量对照组为64mg/kg、样品小、中、大剂量组分布为16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg。阳性组在第7天给予地塞米松5mg/kg;第7天药物组和阳性组在给药后2h,模型组给予蒸馏水后2h,药物组、阳性组与模型组,以20%乌拉坦-生理盐水(4ml/kg)腹腔注射轻微麻醉小鼠,打开颈部,往气管内注入LPS(2ml/kg,1mg/mlLPS-生理盐水),空白组和对照组同法气管注入生理盐水(2ml/kg)。6h后,过量麻醉小鼠,收集右肺的肺泡灌洗液(BALF)用于测定一氧化氮(NO)和蛋白质含量,收集左肺用于测定肺湿/干重比W/D ratio。24h后,过量麻醉小鼠,收集右肺下叶于4%福尔马林中固定,待做病理和免疫组化观察,收集右肺上叶BALF,用于测定炎症因子含量,收集左肺制成做组织匀浆,用于测定MPO和SOD活性。
上述肺泡灌洗液(BALF)的制备方法为:分离气管,自环状软骨下方用手术刀片作斜向切口,将自制的平头针插入气管,用缝合线固定,分离心肺,结扎左侧支气管,分离右肺,用注射器吸取0.8ml生理盐水缓慢注入右肺再缓慢抽出往复多次灌洗,重复3次,得总量为1.5ml的肺泡灌洗液BALF。
肺湿干重比W/D ratio的测定方法为:造模后6h,过量麻醉处死小鼠,收集左肺,用滤纸吸干其表面的组织液和血液,称重,重量为“湿重”,然后将其置于80℃干燥箱内,48h后取出,称重,重量为“干重”。以肺“湿重”和“干重”的比值即肺湿干重比W/D大小用来评估肺水肿的情况。
肺泡灌洗液中一氧化氮(NO)和总蛋白含量的测定方法为:造模后6h,过量麻醉处死小鼠,收集BALF,离心(4℃,1400×g,10min),吸取上清液,按照一氧化氮NO和总蛋白含量BCA试剂盒说明要求,测定一氧化氮(NO)和总蛋白含量。
肺泡灌洗液中炎症因子含量水平的测定方法为:造模后24h,过量麻醉处死小鼠,收集BALF,离心(4℃,1400×g,10min),吸取上清液,按照ELISA试剂盒说明要求,测定炎症因子TNF-α,IL-6和IL-1β含量水平。
肺组织中MPO和SOD活性的测定为:造模后24h,过量麻醉处死小鼠,收集左肺,用匀浆器制成10%组织匀浆,按照MPO试剂盒说明要求,测定MPO活性;将10%组织匀浆离心(4℃,1400×g,20min),吸取上清液,按照SOD试剂盒说明要求,测定SOD活性。
肺部组织切片病理观察:造模后24h,过量麻醉处死小鼠,收集右肺下叶,置于4%福尔马林中固定3天,常规方法石蜡固定,切片,H-E染色,400X显微镜下观察拍照。如图9所示为本实施例各实验组肺部组织切片显微镜照片的对比图。
6、实验结果
所有数据用平均数±标准差(mean±S.D.)表示,应用SPSS19软件对数据进行单因素方差分析,组间比较采用Fisher’s PLSD法,当P<0.05认为有显著性差异。
实验数据采用上述方法进行处理后,对各实验组之间,评定急性肺损伤的指标进行了对比,如图1-9所示。
从图1-3中可以看出,相对于空白组,模型组的W/D重比、NO(一氧化氮)和蛋白质的含量均有显著升高,其差异具有统计学意义(P<0.01)。比较对照组与空白组可以看出,RJ对正常小鼠在这三方面无显著影响。RJ在64mg/kg剂量下对肺部水肿、BALF中NO和蛋白质的含量有显著的抑制和减少的效果(P<0.01)。图1-3中,##表示相较于空白组,P<0.01;**表示相较于模型组,P<0.01;*表示相较于模型组,P<0.05。
从图4-6中可以看出,相对于空白组,模型组的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均有显著升高,其差异具有统计学意义(P<0.01)。比较对照组与空白组,发现RJ对正常小鼠在这三方面无显著影响。RJ在32mg/kg和64mg/kg剂量下对BALF中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平有显著的抑制效果(P<0.01)。图4-6中,##表示相较于空白组,P<0.01;**表示相较于模型组,P<0.01;*表示相较于模型组,P<0.05。
从图7-8中可以看出,相对于空白组,模型组的MPO和SOD活性均有显著升高,其差异具有统计学意义(P<0.01)。比较对照组与空白组,发现RJ对正常小鼠在这两方面无显著影响。RJ在32mg/kg和64mg/kg剂量下对肺组织中MPO和SOD活性有显著的抑制效果(P<0.01)。图7-8中,##表示相较于空白组,P<0.01;**表示相较于模型组,P<0.01;*表示相较于模型组,P<0.05。
从图9肺部组织切片显微镜照片中可以看出,相对于空白组,模型组的肺组织不完整,细胞变大、破裂,毛细管内壁增厚,肺纤毛中空变形,细胞内部充斥着介质。然而药物组情况有所改善,RJ在64mg/kg剂量下肺部情况与对照组和空白组差异甚小。
实施例2:
蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位(RJFs)抗小鼠急性肺损伤实验
本实施例中所用的实验药品与试剂、实验小鼠、其他器材、试验方法以及实验数据的处理均同实施1。其中,将蓝萼香茶菜乙醇提取物(RJ)改为蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位(RJFs),同时对照组给药剂量改为25.6mg/kg,样品大、中、小剂量组的给药剂量分别为6.4mg/kg、12.8mg/kg、25.6mg/kg。
实验数据处理后,各实验组之间,评定急性肺损伤的指标进行对比,结果如图10-18所示。
从图10-12中可以看出,相对于空白组,模型组的W/D重比、NO(一氧化氮)和蛋白质的含量均有显著升高,其差异具有统计学意义(P<0.01)。比较对照组与空白组,可以看出RJFs对正常小鼠在这三方面无显著影响。RJFs在25.6mg/kg剂量下对肺部水肿、BALF中NO和蛋白质的含量有显著的抑制和减少的效果(P<0.01)。图10-12中,##表示相较于空白组,P<0.01;**表示相较于模型组,P<0.01;*表示相较于模型组,P<0.05。
从图13-15中可以看出,相对于空白组,模型组的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均有显著升高,其差异具有统计学意义(P<0.01)。比较对照组与空白组,发现RJFs对正常小鼠在这三方面无显著影响。RJFs在25.6mg/kg剂量下对BALF中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平有显著的抑制效果(P<0.01)。图13-15中,##表示相较于空白组,P<0.01;**表示相较于模型组,P<0.01;*表示相较于模型组,P<0.05。
从图16-17中可以看出,相对于空白组,模型组的MPO和SOD活性均有显著升高,其差异具有统计学意义(P<0.01)。比较对照组与空白组,发现RJFs对正常小鼠在这两方面无显著影响。RJFs在25.6mg/kg剂量下对肺组织中MPO和SOD活性有显著的抑制效果(P<0.01)。图16-17中,##表示相较于空白组,P<0.01;**表示相较于模型组,P<0.01;*表示相较于模型组,P<0.05。
从图18中肺部组织切片显微镜照片的对比图中以看出,相对于空白组,模型组的肺组织不完整,细胞变大、破裂,毛细管内壁增厚,肺纤毛中空变形,细胞内部充斥着介质。然而药物组的情况有所改善,RJFs在12.8mg/kg和25.6mg/kg剂量下肺部情况与对照组和空白组差异甚小。
通过上述实施例可以得出,在小鼠脂多糖LPS诱导的急性肺损伤模型中,蓝萼香茶菜乙醇提取物(RJ)、蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位(RJFs)减轻了小鼠肺部水肿症状,降低小鼠肺泡灌洗液(BALF)中一氧化氮(NO)和蛋白质的含量,增强了小鼠肺组织内超氧化物歧化酶(SOD)的活性,抑制过氧化酶(MPO)的活性,降低了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的含量,对小鼠的肺组织、肺细胞、毛细血管均具有保护作用。蓝萼香茶菜乙醇提取物(RJ)、蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位(RJFs)通过提高机体自由基清除能力,抑制炎症介质和因子的释放,改善小鼠急性肺损伤。因此蓝萼香茶菜乙醇提取物(RJ)以及蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位(RJFs)可用于制备抗急性肺损伤药物。
Claims (3)
1.一种蓝萼香茶菜在制备抗急性肺损伤药物中的应用,所述蓝萼香茶菜为蓝萼香茶菜乙醇提取物中的黄酮、萜类化合物,或者为蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位中的黄酮、二萜类化合物。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,蓝萼香茶菜乙醇提取物提取步骤为,取蓝萼香茶菜干燥叶和茎,切段2~3cm,加体积百分数为60%~80%乙醇水溶液回流提取1~3次,每次回流提取1~3小时,过滤,将粗提液合并,40℃~60℃减压回收得蓝萼香茶菜乙醇提取物。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位提取步骤为,取蓝萼香茶菜乙醇提取物经大孔吸附树脂吸附,先以水洗脱除去大分子化合物,后用体积百分数为60%~65%乙醇水溶液洗脱,40℃~60℃减压回收得到蓝萼香茶菜乙醇提取物的大孔树脂部位。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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