CN105770695A - 达原饮在制备抗急性肺损伤药物中的应用 - Google Patents

达原饮在制备抗急性肺损伤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种达原饮在抗急性肺损伤药物中的应用，利用达原饮制备抗急性肺损伤药物，方法是：将所述达原饮置于水中回流，取提取液，将提取液浓缩制得达原饮水提物，或将所述达原饮置于水中回流，取提取液，将提取液浓缩制得总浸膏，所述总浸膏内加入乙醇后，静置，抽滤，所得滤液浓缩制得达原饮水提醇沉的上清液。达原饮可以减轻小鼠肺部水肿症状，降低肺泡灌洗液中一氧化氮和蛋白质的含量，降低了肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)、白介素‑6(IL‑6)和白介素‑1β(IL‑1β)的含量，降低血清中补体C3、C3c、C5a水平，对小鼠的肺组织、肺细胞、毛细血管均具有保护作用，改善肺组织中补体沉淀。

Description

达原饮在制备抗急性肺损伤药物中的应用
技术领域
本发明涉及达原饮在制备抗急性肺损伤药物中的应用。
背景技术
急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是以弥漫性肺细胞损伤为基础，肺血管损伤所致的肺水肿和肺组织炎性细胞浸润为其病理特征，临床主要表现为严重的低氧血症、弥漫性肺浸润和肺水肿；部分患者最终将会形成急性吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，造成机体不可逆的急性呼吸功能衰竭和多器官功能障碍，病死率高达30-40％；ALI发病机制错综复杂，ALI发病危险因素可以是来自肺的直接损伤，也可以是肺外因素通过全身性炎性反应对肺产生的间接损伤(参见：Baffert F,Le T,Thurston G,et al.Angiopoietin-1decreases plasma leakage by reducing number and size ofendothelial gaps in venules.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(1):H107-H118；Ware L B,Matthay M A.Medical progress-The acuterespiratory distress syndrome.N Engl J Med,2000,342(18):1334-1349；Matthay M A,Zimmerman G A,Esmon C,et al.Future researchdirections in acute lung injury:summary of a National Heart,Lung,andBlood Institute working group.Am J Respir Crit Care Med,2003,167(7):1027-1035.)。
目前，国内外公认治疗ALI的方案：(1)去除病因；(2)在积极治疗原发病的基础上，尽早机械通气(Mechanical ventilation，MV)来纠正缺氧和改善组织供氧；MV是ALI经典治疗方式之一，能够纠正难治性缺氧，防治肺泡萎陷，对抗肺水肿，改善气体交换，减少自主呼吸作功，防止呼吸肌疲劳，但仅能维持机体生理呼吸，尚不能完全解决ALI全部问题；(3)药物治疗；临床上广泛使用肾上腺糖皮质激素、糖皮质激素、环磷酰胺、甲胺蝶呤等治疗急性肺损伤，能减少毛细血管渗出和抑制肺纤维化的形成，使肺功能得到快速的改善；但糖皮质激素等免疫抑制剂对急性肺损伤选择性差，长期应用会产生多种并发症和副作用(参见：杨永涛，汪正清。补体抑制剂研究进展。中国新药杂志,2008,17(24):2093；徐晗，章蕴毅，张建文等。天然产物中的抗补体活性成分。中国天然药物,2007,5(5):322.)。因此，寻找选择性高、毒副作用小的治疗急性肺损伤药物具有重要的临床意义。
达原饮，原名达原散，为吴又可所创，始载《温疫论》，由槟榔、厚朴、草果、知母、芍药、黄芩、甘草，七味药组成，是治疗瘟疫初起，邪在膜原的名方。方中草果、厚朴、槟榔三味药，气味辛香苦降，辛能宣湿，香能化湿，苦能燥湿，降以利湿，且辛开苦降又能舒畅气机，故使秽湿浊气得以消散，湿消热自除，并可直达膜原，逐邪外出，再加知母以滋阴液，白芍以养营血，黄芩以清燥热，甘草以和中；全方共奏辟秽化浊、清透热毒、开达膜原之功；常用于瘴气，湿毒侵犯膜原之瘟疫，湿热俱盛之证者(参见：彭鑫,汤尔群.达原饮在疫病治疗中的运用.中国中医基础医学杂志.2011,17(9):978-979)。
现代临床中，达原饮可应用于各种类型发热。张士卿教授运用达原饮治疗小儿发热，名老中医黄明志教授不仅运用达原饮治疗小儿的外感发热，而且应用该方治疗儿童类风湿、无名发热等疑难杂病；孙玉信教授运用达原饮加减治疗长期发热的患者，疗效确切；潘琴用达原饮随症加减治疗病毒感染性发热(参见：王小荣，张弢，刘光炜，等.张士卿教授运用达原饮治疗小儿发热验案举隅.中医儿科杂志.2015,11(5):6-8；邢新婵.黄明志运用达原饮临床经验集要.辽宁中医杂志.2006,33(7):788；王鹏,孙玉信(指导).孙玉信教授运用达原饮加减治疗长期发热经验.中医临床研究.2013,5(1):49-52；潘琴.达原饮治疗病毒感染性发热226例.四川中医.2001,19(4):42-43.)。任慧玲等采用UPLC-Q-TOF/MS法，通过与对照品比较，质谱数据分析，参考相关文献初步分析达原饮乙醇提取物的化学成分，达原饮提取物对脂多糖诱导大鼠具有明显的解热作用，显著降低血清中TNF-α、IL-6含量(参见：任慧玲,严彪,梁之桃,等.达原饮解热作用研究及UPLC-Q-TOF/MS分析.中成药,2015,37(1):131-137.)。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，发现达原饮是具有抗急性肺损伤作用，且选择性高、毒副作用小，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种选择性高、毒副作用小的达原饮在抗急性肺损伤药物中的应用。
进一步的，所述抗急性肺损伤药物为达原饮水提物(DYY-H2O)或达原饮水提醇沉的上清液(DYY-CSL)。
进一步的，抗急性肺损伤药物的给药方式为口服。
进一步的，达原饮经水回流得到提取液，将提取液浓缩后得到所述达原饮水提物。
进一步的，达原饮经水回流得到提取液，浓缩提取液，并向浓缩后的提取液中添加乙醇得到混合溶液，静置、过滤所述混合溶液并浓缩滤液，得到所述达原饮水提醇沉的上清液。
进一步的，所添加的乙醇的体积为浓缩后的提取液的4-8倍。
进一步的，所述混合溶液中乙醇的质量分数为40-70％。
进一步的，所述抗急性肺损伤药物可减轻动物肺部水肿症状。
进一步的，所述抗急性肺损伤药物可降低动物肺泡灌洗液中一氧化氮和蛋白质的含量。
进一步的，所述抗急性肺损伤药物可降低动物肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α、白介素-6及白介素-1β的含量。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
将达原饮配制成动物用药，通过对小鼠体内给药，测定急性肺损伤小鼠的肺湿/干(W/D)重比，肺泡灌洗液(BALF)中一氧化氮(NO)和蛋白质含量；肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)含量；血清中补体C3、补体片段C3c和C5a含量；观测H&E染色后小鼠肺组织病理和免疫组化改变。结果表明，达原饮可以减轻小鼠肺部水肿症状，降低肺泡灌洗液中一氧化氮(NO)和蛋白质的含量，降低了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的含量，降低血清中补体C3、C3c、C5a水平，对小鼠的肺组织、肺细胞、毛细血管均具有保护作用，改善肺组织中补体沉淀。结果确定，达原饮具有选择性高、毒副作用小的抗急性肺损伤作用，可以用于制备抗急性肺损伤的药物。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明DYY-H2O对LPS诱导小鼠ALI在肺W/D重比影响的示意图；
图2是本发明DYY-H2O对LPS诱导小鼠ALI在BALF的NO含量影响的示意图；
图3是本发明DYY-H2O对LPS诱导小鼠ALI在BALF的蛋白质含量影响的示意图；
图4是本发明DYY-H2O对LPS诱导小鼠ALI在血清中C3含量影响的示意图；
图5是本发明DYY-H2O对LPS诱导小鼠ALI在血清中C3c含量影响的示意图；
图6是本发明DYY-H2O对LPS诱导小鼠ALI在血清中C5a含量影响的示意图；
图7是本发明DYY-H2O对LPS诱导小鼠ALI在BALF的炎症因子TNF-α水平影响的示意图；
图8是本发明DYY-H2O对LPS诱导小鼠ALI在BALF的炎症因子IL-6水平影响的示意图；
图9是本发明DYY-H2O对LPS诱导小鼠ALI在BALF的炎症因子IL-1β水平影响的示意图；
图10是本发明各组肺组织的H&E染色和C3c沉积免疫组化切片对比图；
图11是本发明DYY-H2O和DYY-CSL对LPS诱导小鼠ALI在肺W/D重比影响的示意图；
图12是本发明DYY-H2O和DYY-CSL对LPS诱导小鼠ALI在BALF的蛋白质含量影响的示意图；
图13是本发明DYY-H2O和DYY-CSL对LPS诱导小鼠ALI在BALF的炎症因子TNF-α含量影响的示意图；
图14是本发明DYY-H2O和DYY-CSL对LPS诱导小鼠ALI在BALF的炎症因子IL-6含量影响的示意图；
图15是本发明DYY-H2O和DYY-CSL对LPS诱导小鼠ALI在BALF的炎症因子IL-1β含量影响的示意图；
图16是本发明DYY-H2O和DYY-CSL对LPS诱导小鼠ALI在血清中C3水平影响的示意图；
图17是本发明DYY-H2O和DYY-CSL对LPS诱导小鼠ALI在血清中C3c水平影响的示意图；
图18是本发明DYY-H2O和DYY-CSL对LPS诱导小鼠ALI在血清中C5a水平影响的示意图；
图19是本发明各组肺组织的H&E染色和C3c沉积免疫组化切片对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
一、实验药品与试剂
达原饮水提物的制备：将配方为槟榔142.5g，厚朴71.5g，知母71.5g，草果35.74g，甘草35.75g，白芍71.5g，黄芩71.5g的达原饮置于水中回流两次，每次2h，分别取提取液，合并两次提取液，并将提取液浓缩得达原饮水提物(DYY-H2O)116.8g。
达原饮水提醇沉的上清液物的制备：将配方为槟榔570g，厚朴286g，知母286g，草果143g，甘草143g，白芍286g，黄芩286g的达原饮置于水中回流两次，每次2h，分别取提取液，合并两次提取液，浓缩提取液得到总浸膏，加乙醇至醇浓度为60％，静置，抽滤，所得滤液浓缩得到达原饮水提醇沉的上清液(DYY-CSL)120g。
对照药：醋酸地塞米松片(DXM)，浙江仙琚制药股份有限公司。
0.5％羧甲基纤维素钠；脂多糖(LPS)，美国Sigma-Aldrich公司；蒸馏水；生理盐水(NS)；20％乌拉坦-生理盐水(20％乌拉坦-NS)；4％福尔马林；H-E染色液等。
二、实验小鼠
Balb/c小鼠，雄性，体重20～24克，由苏州大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：XCYK(苏)2002-0008。实验动物饲养在温度24±1℃，相对湿度40％～80％的环境下，自由采食和饮水，实验前，适应性饲养7天。
三、其他材料
小鼠TNF-α、IL-6和IL-1βELISA试剂盒，上海船夫贸易有限公司；小鼠补体蛋白C3、补体片段C3c、补体片段C5a ELISA试剂盒，上海源叶生物科技有限公司；NO BCA试剂盒，南京建成生物工程研究所；多抗兔抗人C3c补体，上海瑞齐生物技术有限公司。
四、实验方法
1、药剂配制
准确称取5mg LPS粉末溶于0.9％灭菌的生理盐水(NS)中，并定容至5ml，得0.001％LPS-NS；
达原饮水提物(DYY-H2O)，混悬溶于0.5％羧甲基纤维素钠水溶液中，制得供试品浓度2mg/ml；
达原饮水提醇沉的上清液(DYY-CSL)混悬溶0.5％羧甲基纤维素钠水溶液中，制得供试品浓度2mg/ml；
阳性组(DXM)，醋酸地塞米松混悬于0.5％羧甲基纤维素钠水溶液中，制得供试品浓度0.2mg/ml。
2、实验步骤
实验小鼠随机分为空白组(Control)、模型组(LPS)、达原饮水提物组(DYY-H2O，剂量(按体重)30mg·kg-1)、达原饮水提醇沉的上清液组(DYY-CSL，剂量(按体重)30mg·kg-1)、及阳性组(DXM，剂量5mg·kg-1)，每组10只小鼠，每只小鼠接受4ml·kg-1剂量的20％乌拉坦-NS，腹腔注射轻微麻醉小鼠；除空白组外，其它各组小鼠打开颈部，往气管内注入2ml·kg-1剂量的0.001％LPS-NS，诱导急性肺损伤模型，空白组同法气管注入2ml·kg-1剂量的NS。
LPS刺激30min后，空白组和模型组给予蒸馏水，其它各组按剂量给药；LPS刺激60min后，除空白组和模型组外，各组第二次给药，但剂量减半。
LPS刺激24h后，各组小鼠过量麻醉，眼球取血约1ml用于测定补体蛋白C3、补体片段C3c、补体片段C5a含量；收集右肺的肺泡灌洗液(BALF)用于测定NO含量、蛋白质含量和炎症因子含量；收集左肺用于测定肺湿/干重量比；收集右肺下叶于4％福尔马林中固定，待做病理和免疫组化观察。
血清中补体C3和补体片段C3c、C5a含量的测定：将收集的小鼠眼球血液样本，室温(25℃)下静置10min，离心(4℃，1400×g，20min)，吸取血清，按照ELISA试剂盒说明要求，测定C3、C3c、C5a含量。
肺泡灌洗液(BALF)的制备：分离气管，自环状软骨下方用手术刀片作斜向切口(选切口位置时，避免血液进入气管，影响灌洗液的成分)，将平头针插入气管，用缝合线固定(避免漏气)，分离心肺(不触及肺脏以免影响灌洗)，结扎左侧支气管，分离右肺，用注射器吸取0.8mlNS缓慢注入右肺再缓慢抽出，往复多次灌洗，重复3次，得总量约1.5ml的BALF。
肺湿/干重量比(Lung W/D ratio)的测定：将收集的小鼠肺组织样本，用滤纸吸干其表面的组织液和血液，称重，重量为“湿重”，然后将其置于80℃干燥箱内，48h后取出，称重，重量为“干重”。以肺“湿重”和“干重”的比值大小用来评估肺水肿的情况。
一氧化氮(NO)和蛋白质含量的测定：将收集的小鼠BALF样本离心(4℃，1400×g，10min)，吸取上清液，按照NO和BCA试剂盒说明要求，测定NO和蛋白质含量。
肺泡灌洗液中炎症因子含量水平的测定：将收集的小鼠BALF样本，离心(4℃，1400×g，10min)，吸取上清液，按照ELISA试剂盒说明要求，测定炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量水平。
肺部组织切片病理和免疫组化观察：将收集肺组织样本，置于4％福尔马林中固定3天，石蜡固定，切片，H&E染色，×400显微镜下观察拍照。采用辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)系统来检测组织上的补体C3c沉积。5μm肺部石蜡切片经二甲苯中脱蜡、酒精梯度水化，与兔抗人补体C3c在4℃下过夜孵育，然后3,3'-二氨基联苯胺(DAB)显色，×400显微镜下观察拍照。
五、实验结果
所有数据用平均数±标准差(mean±S.D.)表示，应用SPSS 19软件对数据进行单因素方差分析，组间比较采用Fisher’s PLSD法，当P<0.05认为有显著性差异。
1、达原饮水提物组与空白组、模型组以及阳性组实验结果比较：
(1)小鼠Lung W/D ratio、BALF中NO和蛋白质的含量
如附图1、2和3所示，相对于空白组，模型组的LungW/D重比、NO和蛋白质的含量均有显著升高，其差异具有统计学意义(P<0.01)；DYY-H2O在30mg·kg-1剂量下对肺部水肿、BALF中NO和蛋白质的含量有显著的抑制和减少的效果(P<0.01)。
(2)小鼠血清中C3、C3c、C5a水平
如附图4、5和6所示，相对于空白组，模型组的C3、C3c、C5a水平均有显著升高，其差异具有统计学意义(P<0.01)；DYY-H2O在30mg·kg-1剂量下对血清中补体C3、C3c、C5a水平有显著的抑制效果(P<0.01)。
(3)小鼠BALF中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平
附如图7、8和9所示，相对于空白组，模型组的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均有显著升高，其差异具有统计学意义(P<0.01)；DYY-H2O在30mg·kg-1剂量下对BALF中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平有显著的抑制效果(P<0.01)。
(4)肺部组织切片病理和免疫组化观察
附如图10所示，相对于空白组，模型组的肺组织不完整，细胞变大、破裂，毛细管内壁增厚，肺纤毛中空变形，细胞内部充斥着介质，伴有褐色补体沉淀斑点，然而药物组的情况有所改善。
在小鼠脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤模型中，达原饮水提物可以减轻小鼠肺部水肿症状，降低肺泡灌洗液中NO和蛋白质的含量，降低了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的含量，降低血清中补体C3、C3c、C5a水平，对小鼠的肺组织、肺细胞、毛细血管均具有保护作用，改善肺组织中补体沉淀。达原饮通过抑制炎症介质和因子的释放，降低补体水平，改善小鼠急性肺损伤。
2、达原饮水提物组、达原饮水提醇沉的上清液组和与空白组、模型组以及阳性组的实验结果比较：
(1)小鼠Lung W/D ratio、BALF中蛋白质的含量
如附图11和12所示，相对于空白组，模型组的LungW/D ratio和蛋白质含量均显著升高，其差异具有统计学意义(P<0.01)；DYY-H2O和DYY-CSL对小鼠肺部水肿和蛋白质水平都有显著的抑制和减少的效果(P<0.01)；DYY-H2O和DYY-CSL对小鼠肺部水肿和蛋白质水平的抑制和减少作用没有显著差异。
(2)小鼠BALF中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平
如附图13、14和15所示，相对于空白组，模型组的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均有显著升高，其差异具有统计学意义(P<0.01)；DYY-H2O和DYY-CSL对BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β水平有显著的抑制效果(P<0.01)；DYY-H2O和DYY-CSL对小鼠肺部促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的抑制和减少作用没有显著差异。
(3)小鼠血清中C3、C3c和C5a水平
如图16、17和18所示，相对于空白组，模型组的C3、C3c、C5a水平均有显著升高，其差异具有统计学意义(P<0.01)；DYY-H2O和DYY-CSL对血清中补体C3、C3c、C5a水平有显著的抑制效果(P<0.01)，且DYY-H2O和DYY-CSL的抑制效果之间没有显著差异。
(4)肺组织切片病理和免疫组化观察
如附图19所示，相较于空白组，模型组的肺组织不完整，细胞变大、破裂，毛细管内壁增厚，肺纤毛中空变形，细胞内部充斥着介质，伴有褐色补体沉淀斑点；DYY-H2O和DYY-CSL组的情况均有所改善。
在小鼠脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤模型中，达原饮水提物与达原饮水提醇沉的上清液均可以减轻小鼠肺部水肿症状和蛋白质的含量，降低了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的含量，降低血清中补体C3、C3c、C5a水平，对小鼠的肺组织、肺细胞、毛细血管均具有保护作用，改善肺组织中补体沉淀。达原饮水提物与达原饮水提醇沉的上清液均通过抑制炎症介质和因子的释放，降低补体水平，改善小鼠急性肺损伤，两者的作用没有显著差异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.达原饮在制备抗急性肺损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗急性肺损伤药物为达原饮水提物或达原饮水提醇沉的上清液。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抗急性肺损伤药物的给药方式为口服。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：达原饮经水回流得到提取液，将提取液浓缩后得到所述达原饮水提物。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：达原饮经水回流得到提取液，浓缩提取液，并向浓缩后的提取液中添加乙醇得到混合溶液，静置、过滤所述混合溶液并浓缩滤液，得到所述达原饮水提醇沉的上清液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所添加的乙醇的体积为浓缩后的提取液的4-8倍。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述混合溶液中乙醇的质量分数为40-70％。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗急性肺损伤药物可减轻动物肺部水肿症状。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗急性肺损伤药物可降低动物肺泡灌洗液中一氧化氮和蛋白质的含量。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗急性肺损伤药物可降低动物肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α、白介素-6及白介素-1β的含量。
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