CN104758373B - 肾康注射液在制备治疗肝病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肾康注射液在制备治疗肝病药物中的应用。该注射液有由下述重量份配比的原料药制成：大黄、丹参、红花和黄芪（7‑15：6‑15：8‑15：15‑45）。经动物和临床实验证实，肾康注射液可明显保护肝纤维化大鼠的肝脏，减少TGF‑β1含量及改善肝脏指标，临床应用于治疗肝炎、肝硬化、脂肪肝和原发性肝癌。

Description

肾康注射液在制备治疗肝病药物中的应用

技术领域

本发明涉及肾康注射液的一种新用途，具体涉及肾康注射液在制备治疗肝病药物中的应用，属于药物用途领域。

背景技术

肝病是指发生在肝脏的病变，常见的肝病有肝炎、肝硬化、原发性肝癌等，目前肝病已被列为主要引起死亡的疾病之一，肝病的治疗也被医学界列为重要的研究课题。据世界卫生组织统计表明：全世界约有3.5亿人患有肝病，肝病每年造成100多万人死亡，在我国约有1.2亿慢性病毒携带者，约3000万肝病患者，并且每年新增肝病患者约200万。随着肝病患者逐年增加，现已成为严重的社会问题，临床需要更多有效的治疗药物。肾康注射液临床多用于治疗慢性肾功能衰竭等肾脏疾病，但在长期的临床使用过程中，发现对肝病也有较好的治疗效果。

发明内容

本发明是通过大量试验研究，并经过临床验证证实肾康注射液的新用途，即提供肾康注射液在制备治疗肝病药物中的应用，包括治疗肝炎、肝硬化、脂肪肝和原发性肝癌。

肾康注射液临床主要用于治疗慢性肾功能衰竭，它是由下述重量份配比的原料药制成：大黄、丹参、红花和黄芪（7-15：6-15：8-15：15-45）。产品上市后，在多年的临床运用过程中，发现它对肝病也有较好的预防和治疗作用，经过大量的动物实验和临床观察试验，也证实了这一点。中医对肝病的治疗原则主要是扶正驱邪、活血化瘀，通过研究肾康注射液的药物组成和作用机制可以得出，大黄具有利胆保肝，抗病原微生物的作用，兼有驱邪之功；黄芪补中益气，可以扶正，还可改善肝脏微循环，增强网状内皮系统的吞噬作用，促进肝再生；丹参、红花活血化瘀，可促进组织的修复与再生，改善肝脏微循环，具有保肝作用，还有抗菌作用。因此，大黄、丹参、黄芪和红花配伍应用符合肝病的发病机理，可有效治疗肝病。

本发明的目的在于提供肾康注射液在治疗肝病药物中的应用。该注射液是由下述重量份配比的原料药制成：大黄7-15、丹参6-15、红花8-15和黄芪15-45。

本发明肾康注射液优选的制备方法如下：取大黄、丹参，经1-3次水提，合并水提液，浓缩后经过两次醇沉和明胶除鞣后，取上清液过滤澄明，回收乙醇，加入注射用水，冷藏，取上清液浓缩，加入90-95%乙醇，静置，回收乙醇，再次加入注射用水；取上清液，加入活性炭，调pH值，灭菌，得到大黄和丹参提取液，备用；取红花、黄芪，经1-3次水提，合并水提液，浓缩，经过两次醇沉，回收乙醇，再次加入注射用水，冷藏，取上清液，加入活性炭，过滤，冷藏，调pH值，灭菌，得到红花和黄芪提取液，备用；将上述得到大黄和丹参提取液以及红花和黄芪提取液合并，再加入注射用水稀释，搅拌均匀，超滤，调pH值，药液依次经装有微孔滤膜的过滤器过滤后灌封，经灭菌，制成肾康注射液。

本发明的肾康注射液也可采用常规的制备注射液的方法制备。

具体实施例

实施例1

（1）取大黄1500g、丹参1500g，经3次水提，合并水提液，浓缩后经过两次醇沉和明胶除鞣后，取上清液过滤澄明，回收乙醇，加入注射用水，冷藏，取上清液浓缩，加入95%乙醇，静置，回收乙醇，再次加入注射用水；取上清液，加入活性炭，调pH值，灭菌，得到大黄和丹参提取液，备用；

（2）取红花1500g、黄芪4500g药材，经3次水提，合并水提液，浓缩，经过两次醇沉，回收乙醇，再次加入注射用水，冷藏，取上清液，加入活性炭，过滤，冷藏，调pH值，灭菌，得到红花和黄芪提取液，备用；

（3）将上述大黄和丹参提取液以及红花和黄芪提取液合并，再加入注射用水稀释，搅拌均匀，超滤，调pH值，药液依次经2个装有0.22μm微孔滤膜的过滤器过滤后灌封，经灭菌，制成肾康注射液。

实施例2

原料药组成为：大黄700g、丹参1500g、红花1500g、黄芪4500g，制备方法同实施例1。

实施例3

原料药组成为：大黄1500g、丹参1000g、红花1000g、黄芪4000g，制备方法同实施例1。

实施例4

原料药组成为：大黄700g、丹参600g、红花800g、黄芪1500g，制备方法同实施例1。

本发明肾康注射液对肝病的治疗作用，实验资料如下：

一、肾康注射液对免疫性肝纤维化大鼠的保护作用

实验材料Wistar大鼠，清洁级，180-220g（西安交通大学实验动物中心）；肾康注射液，由西安世纪盛康药业有限公司提供，包括组方一（大黄1500g、丹参1500g、红花1500g、黄芪4500g）、组方二（大黄700g、丹参1500g、红花1500g、黄芪4500g）、组方三（大黄1500g、丹参1000g、红花1000g、黄芪4000g）、组方四（大黄700g、丹参600g、红花800g、黄芪1500g）；TGF-β1单克隆抗体。

实验动物及分组取SD大鼠60只，除其中10只大鼠做为正常对照组外，其余大鼠腹腔注射0.5ml/只猪血清，每周2次，连续给药6周，制备大鼠肝纤维化模型，模型成功后，随机分为模型组和肾康注射液组方一、二、三、四组，每组各10只，肾康注射液四个组分别腹腔注射给予肾康注射液2g/kg干预治疗，给药体积为0.6ml/100g，正常对照组和模型组给予同体积的葡萄糖注射液。

观察指标及检测方法

（1）末次给药后，禁食12h，称重，用3.5%水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，心脏采血，分离血清，-20℃冻存，然后取肝右叶相同部位肝组织二块，一块4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，做HE染色。

（2）用生化分析仪测定血清肝功能指标，用免疫组化方法检测肝组织TGF-β1的表达情况。HE染色后对纤维增生程度进行分期，0级：无纤维化；1级：纤维结缔组织局限于汇管区或有汇管区扩大，有向小叶扩大倾向；2级：纤维结缔组织进入小叶2/3及有1级同样改变；3级：纤维结缔组织进入肝小叶中央静脉周围并有2级同样改变；4级：纤维结缔组织在全小叶多区弥漫性增生，假小叶形成，并有3级同样改变。

实验结果

（1）大鼠病理形态改变正常对照组大鼠肝脏具有正常的肝小叶结构，肝细胞形态大小正常，肝小叶结构正常，无炎性细胞浸润。模型组大鼠肝细胞坏死及炎细胞浸润明显，肝小叶结构正常，肝细胞索排列紊乱，小叶呈散在性坏死，胶原纤维增生明显，并可见厚薄不一的纤维分隔包绕肝小叶，肝细胞再生和假小叶形成。肾康注射液四个组别肝脏组织内炎性细胞浸润、肝细胞坏死和纤维组织增生程度均较模型组大鼠减轻，有部分纤维分割肝小叶，但未见完整的假小叶形成，肝组织再生不明显。病理分级结果见表1。

表1肾康注射液对肝纤维化大鼠病理结果的影响

（2）肾康注射液对大鼠肝脏TGF-β1含量的影响，见表2

表2肾康注射液对肝纤维化大鼠TGF-β1的影响

组别	动物数	TGF-β1（ng/mL）
			正常对照组	10	5.12±1.13**
模型组	9	26.93±6.45
			组方一	10	12.64±3.27**
组方二	10	15.18±4.06**
			组方三	10	13.77±3.89**
组方四	10	16.03±4.17**

注：与模型组比较^*p<0.05，^**p<0.01

结果表明：正常对照组大鼠TGF-β1主要见于血管壁、肝窦壁、脂肪变性肝细胞膜及异形增生肝细胞胞质内，胆管壁及其周围血管网强阳性表达。有些血管及肝窦内亦有阳性染色。模型组大鼠广泛分布于坏死灶的周围、汇管区及纤维间隔；肾康注射液四个组别在纤维间隔及汇管区有少量表达。

（3）肾康注射液对肝纤维化大鼠血清生化指标的影响

表3肾康注射液对肝纤维化大鼠血清ALT、AST的影响

组别	动物数	ALT（μ/L）	AST（μ/L）
				正常对照组	10	28.42±1.23**	126.56±14.09**
模型组	9	67.91±4.83	247.10±33.02
				组方一	10	40.15±2.69*	174.22±20.43**
组方二	10	39.23±2.34*	181.31±23.40*
				组方三	10	45.06±3.21*	178.53±22.72*
组方四	10	43.54±2.76*	170.11±21.39**

注：与模型组比较^*p<0.05，^**p<0.01

结果表明：与模型组比较，正常对照组大鼠血清ALT、AST含量明显低于模型组，说明肝纤维化模型复制成功；肾康注射液组四个组别大鼠血清ALT、AST与模型组比较，也显著降低，且有显著性差异（p<0.01或p<0.05）。说明肾康注射液对肝纤维化大鼠有一定治疗作用。

实验结果表明：肾康注射液对肝纤维化有较好地治疗作用。

二、肾康注射液对肝硬化模型大鼠的保护作用

实验材料SD大鼠，清洁级，180-220g（西安交通大学实验动物中心）；肾康注射液，由西安世纪盛康药业有限公司提供，包括组方一（大黄1500g、丹参1500g、红花1500g、黄芪4500g）、组方二（大黄700g、丹参1500g、红花1500g、黄芪4500g）、组方三（大黄1500g、丹参1000g、红花1000g、黄芪4000g）、组方四（大黄700g、丹参600g、红花800g、黄芪1500g）；四氯化碳，无锡多利源化工有限公司；谷氨酸氨基转移酶、总胆红素、一氧化氮和内皮素试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

复制肝硬化大鼠模型及分组取SD大鼠100只，适应性喂养3天后，随机取90只用于造模和正常对照组10只。造模组大鼠每周2次皮下注射四氯化碳，0.3ml/100g体重，共10周。造模开始第1-2周均以20%猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料喂养，第3-9周以0.5%胆固醇和99.5%玉米面混合饲料喂养。整个造模期间以30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用，复制大鼠肝硬化模型。正常组则以正常饲料和自来水喂养。实验10周后，造模组随机抽取2只经肝组织病理切片确认造模成功后予以分组治疗。将造模组随机分为五组，每组15只，即肾康注射液组方一、二、三、四组、模型组，肾康注射液四个组别大鼠分别腹腔注射肾康注射液2g/kg，正常对照组和模型组大鼠腹腔注射等体积的葡萄糖注射液。共给药8周，末次给药后1h，10%水合氯醛麻醉动物，颈总动脉取血,制备血清。

检测指标测定血ALT/GPT、血总胆红素(TBL)、一氧化氮(NO)、内皮素(ET)。

统计方法实验数据通过excel进行统计分析，数据均以均数±标准差（X±S）表示，组间采用t检验。

实验结果

（1）肾康注射液对肝硬化模型大鼠肝功能的影响

表4肾康注射液对肝硬化模型大鼠肝功能的影响

组别	动物数	ALT/GPT（U/L）	TBL（μmol/L）
				正常对照组	15	85.34±11.90**	50.36±9.17**
模型组	12	127.48±7.31	90.64±12.05
				组方一	14	105.88±9.63**	74.52±10.88**
组方二	15	110.23±10.21**	80.13±11.25*
				组方三	14	109.12±9.21**	76.46±10.25**
组方四	14	112.50±8.36*	73.84±12.34**

注：与模型组比较^*p<0.05，^**p<0.01

结果表明：模型组大鼠ALT/GPT、TBL含量明显高于正常对照组，且有显著性差异（p<0.01），表明已对造模大鼠造成肝脏损伤。肾康注射液四个组别大鼠ALT/GPT、TBL含量明显低于模型组，且有显著性差异（p<0.01或p<0.05），表明肾康注射液对受损的肝脏有一定的保护作用。

（2）肾康注射液对肝硬化模型大鼠血管活性物质的影响

表5肾康注射液对肝硬化模型大鼠血管活性物质的影响

组别	动物数	NO（μmol/L）	ET（pg/mL）
				正常对照组	15	57.18±6.10**	6.55±0.71**
模型组	12	99.58±12.15	12.82±1.34
				组方一	14	88.94±10.47*	8.21±0.98**
组方二	15	85.33±9.48**	7.56±0.78**
				组方三	14	76.32±10.25**	9.26±0.47*
组方四	14	80.69±12.34**	9.84±0.69*

注：与模型组比较^*p<0.05，^**p<0.01

结果表明：模型组大鼠NO、ET含量明显高于正常对照组，且有显著性差异（p<0.01），表明已对造模大鼠造成肝脏损伤。肾康注射液四个组大鼠NO、ET含量明显低于模型组，且有显著性差异（p<0.01或p<0.05），表明肾康注射液可以改善受损的血管。

实验结果证实，肾康注射液可有效改善肝硬化模型大鼠的肝肾功能，减少血管损伤，对肝硬化疾病就较好地治疗作用。

三、肾康注射液对脂肪肝模型大鼠的保护作用

实验材料SD大鼠，清洁级，180-220g（西安交通大学实验动物中心）；肾康注射液，由西安世纪盛康药业有限公司提供，包括组方一（大黄1500g、丹参1500g、红花1500g、黄芪4500g）、组方二（大黄700g、丹参1500g、红花1500g、黄芪4500g）、组方三（大黄1500g、丹参1000g、红花1000g、黄芪4000g）、组方四（大黄700g、丹参600g、红花800g、黄芪1500g）；血清总胆固醇（TC）、甘油三酯(TG)、谷氨酸氨基转移酶、总胆红素均购自南京建成生物工程研究所。

复制脂肪肝动物模型和分组取SD大鼠70只，取10只做为空白对照组，其余大鼠均给予高脂饲料喂养，高脂饲料是在普通饲料基础上加10%猪油,2%胆固醇、0.12%胆酸钠。连续喂养8周后，造模组随机抽取2只经肝组织病理切片确认造模成功后予以分组治疗。将造模组随机分为五组，每组10只，即肾康注射液组方一、二、三、四组、模型组，肾康注射液四个组别大鼠分别腹腔注射肾康注射液2g/kg，正常对照组和模型组大鼠腹腔注射等体积的葡萄糖注射液。共给药4周，末次给药后1h，10%水合氯醛麻醉动物，颈总动脉取血，制备血清。

检测指标测定血TC、TG、ALT、AST。

统计方法实验数据通过excel进行统计分析，数据均以均数±标准差表示，组间采用t检验。

实验结果

（1）肾康注射液对脂肪肝模型大鼠TC、TG含量的影响

表6肾康注射液对脂肪肝模型大鼠TC、TG含量的影响

组别	动物数	TC（mmol/L）	TG（mmol/L）
				正常对照组	15	1.13±0.35**	0.48±0.04**
模型组	12	6.82±1.24	1.85±0.05
				组方一	14	2.53±0.88**	1.12±0.08*
组方二	15	3.20±1.09**	0.84±0.07**
				组方三	14	3.39±1.26**	1.02±0.10*
组方四	14	3.50±1.37**	1.04±0.68*

注：与模型组比较^*p<0.05，^**p<0.01

结果表明：模型组大鼠TC、TG含量明显高于正常对照组，且有显著性差异（p<0.01）。肾康注射液四个组大鼠TC、TG含量明显低于模型组，且有显著性差异（p<0.01或p<0.05），表明肾康注射液对受损的肝脏有保护作用。

（2）肾康注射液对脂肪肝模型大鼠肝功能的影响

表7肾康注射液对脂肪肝模型大鼠肝功能的影响

组别	动物数	ALT（μ/L）	AST（μ/L）
				正常对照组	15	25.16±1.34**	131.37±15.33**
模型组	12	81.05±3.69	283.04±32.17
				组方一	14	51.04±2.03*	209.12±22.53*
组方二	15	44.13±2.11*	197.26±18.48**
				组方三	14	43.51±2.61*	216.62±27.71*
组方四	14	47.82±2.38*	189.11±19.49**

注：与模型组比较^*p<0.05，^**p<0.01

结果表明：各组与模型组比较，大鼠血清ALT、AST含量明显低于模型组；肾康注射液组四个组别大鼠血清ALT、AST与模型组比较，也显著降低，且有显著性差异（p<0.01或p<0.05）。说明肾康注射液对脂肪肝大鼠有一定治疗作用。

实验结果表明：肾康注射液对脂肪肝有较好的治疗作用。

四、肾康注射液对肝病患者的治疗作用

观察2010年-2012年泰安市中医医院采用肾康注射液治疗肝病患者108例的情况。其中肝炎患者46例，肝硬化患者21例，脂肪肝患者23例，原发性肝癌患者18例。

纳入标准（1）肝炎诊断纳入标准：临床症状为非特异性，可无症状，或有右上腹胀痛，食欲不振、乏力、体质量减轻、黄疸等；随着病情加重，可有神经精神症状和蜘蛛痣、肝掌等症状表现；血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素（TBil）、凝血酶原时间(PT)和平均红细胞容积(MCV)和缺糖转铁蛋白（CDT）等指标升高；肝脏B超或CT检查有典型表现。

（2）脂肪肝诊断纳入标准：符合《实用中医消化病学》；且有B超诊断依据；肝功能检查血清AST、ALT异常；血脂异常；排除病毒性肝炎。

（3）肝硬化诊断纳入标准：符合《肝纤维化中西医结合诊疗指南》诊断标准。

（4）原发性肝癌诊断纳入标准：均经影像学检查及甲胎蛋白测定确诊为原发性肝癌。

观察治疗的96例患者，随机分为常规治疗组和肾康注射液治疗组，常规治疗组53例，其中男30例，女23例，年龄35-70岁；肾康注射液治疗组55例，其中男31例，女24例，年龄38-67岁。两组患者年龄、性别均无明显差异，具有可比性。

表8具体分组人数情况见下表。

组别	肝炎	肝硬化	脂肪肝	原发性肝癌
					肾康注射组	23	11	12	9
常规治疗组	23	10	11	9

治疗方法常规治疗组常规给予干扰素，胸腺肽制剂等常规治疗药物。肾康注射液组仅采用组方一（大黄1500g、丹参1500g、红花1500g、黄芪4500g）治疗，用10%葡萄糖注射液或5%葡萄糖注射液或0.9%氯化钠注射液300ml配肾康注射液80-100ml静脉滴注，治疗4周。

检测指标 观察治疗前后肝病患者的肝功能。

治疗结果 两组患者治疗前后的肝功能的检查比较

表9两组肝病患者治疗前后肝功能主要指标的变化

注：与本组治疗前比较^*P＜0.05P＜0.01；与常规治疗组治疗后比较^△P＜0.05^△△P＜0.05

结果证实：两治疗组治疗前后比较，对肝功能部分指标有较好的改善作用，ALT、AST、TBil含量有所减少，Alb含量升高。肾康注射液组和常规治疗组比较，对肝病患者的肾脏有更好地保护作用，表现在更好地减少ALT和TBil含量，且有显著性差异（p<0.01或p<0.05）。临床实验结果表明，肾康注射液对肝病有较好地治疗作用。

Claims (9)

1.肾康注射液在制备治疗肝病药物中的应用，其特征在于该注射液是由下述重量份配比的原料药制成：大黄7-15、丹参6-15、红花8-15和黄芪15-45。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝病指肝炎。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝病指肝硬化。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝病指脂肪肝。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝病指原发性肝癌。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：各原料药的重量配比为：大黄15、丹参15、红花15和黄芪45。

7.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：各原料药的重量配比为：大黄7、丹参15、红花15和黄芪45。

8.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：各原料药的重量配比为：大黄15、丹参10、红花10和黄芪40。

9.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：各原料药的重量配比为：大黄7、丹参6、红花8和黄芪15。