CN103864736A - 从欧亚旋覆花中提取活性倍半萜内酯的方法 - Google Patents

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师彦平
杨军丽
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Abstract

本发明涉及一种从欧亚旋覆花干燥头状花序中提取具有多种药理活性倍半萜内酯类化合物的方法。本发明以菊科植物欧亚旋覆花干燥头状花序为原料制备结构式如下的倍半萜内酯类化合物。采用有机溶剂提取、乙酸乙酯萃取、柱层析分离和重结晶手段提取纯化。该方法具有成本低、操作简便、转化率较高、产品纯度较高的特点，适宜作为标准品及药物开发应用。

Description

从欧亚旋覆花中提取活性倍半萜内酯的方法
技术领域
本发明涉及一种以菊科植物欧亚旋覆花干燥头状花序为原料提取纯化一种具有多种药理活性的倍半萜内酯的方法。 
背景技术
欧亚旋覆花【Inula britannica L.】，系菊科旋覆花属多年生草本植物。主要分布于新疆北部至南部、黑龙江（黑河、克山等）、内蒙古东部和南部、河北北部以及华北和东北的一些地区。其干燥花状头序为中药旋覆花的一种药材基源，具有降气、消痰、行水、止咳等功效，收入2010版《中国药典》。 
有研究表明，倍半萜内酯类化合物 I，化学名britanin，具有明显的催吐、刺激鼻粘膜和祛痰活性和明显的抑制霉菌（白色念珠菌、新型隐球菌、麯菌和石膏样癣菌）的活性[钱名堃, 等. 线叶旋复花化学成分的研究. 化学学报，1983，41（3），254-261]，并具有明显的抗原生动物（Entamoeba histolytica和Trichomonas vaginalis）的活性[Rubinchik, M. A., 等. Sesquiterpene lactones of higher plants as a possible source of new antiprotozoal drugs. Rastitel'nye Resursy, 1976, 12(2), 170-181.]。我们实验室近期的药理活性研究表明该倍半萜内酯还具有较强的抗体外肿瘤细胞（Hela细胞、HSC-T6细胞和B16细胞）的活性。上述研究表明该倍半萜内酯类化合物具有广阔的药用开发前景。 
发明内容
  本发明的目的是提供一种提取具有多种药理活性倍半萜内酯类化合物I的方法。
我们在对中药旋覆花进行系统研究中，发现该药材原料欧亚旋覆花干燥头状花序中富含大量假愈创木烷型倍半萜类化合物，其中化合物I的含量可达浸膏的3.2%。我们对该化合物的提取纯化工艺进行了研究，实现了快速、简便、大量地提取纯化化合物I，为进一步的药理学研究和药物开发奠定了基础。 
此外，我们还考察了工艺条件，整个工艺适合于大量提取纯化。  
一种以欧亚旋覆花干燥头状花序为原料，提取具有多种药理活性的倍半萜内酯的方法，其特征在于采用有机溶剂提取、乙酸乙酯萃取、柱层析分离和重结晶手段，快速、简捷、大量地提取纯化化合物I；
在上述方法中，总浸膏提取时溶剂与原料的物料比在5:1到10:1范围内，提取时如采用室温下浸提，则浸提3次，每次7天；亦可采用加热回流提取，提取3次，每次1小时；亦或采用超生提取其它现有技术进行提取；提取溶剂可选择80-95%乙醇或甲醇或工业丙酮。
在上述方法中，萃取溶剂选用工业乙酸乙酯。 
在上述方法中，硅胶柱层析时选用的溶剂体系为石油醚与乙酸乙酯的体积比8:1至1:4，或石油醚与丙酮体积比10:1至1:2，梯度洗脱；通过薄层层析检测，收集石油醚和乙酸乙酯展开体系下，Rf值约0.6，硫酸-乙醇显紫色的组分，于低于60oC条件下减压浓缩。 
该方法具有成本低、操作简便、转化率较高、产品纯度较高的特点。 
经上述各方法得到的化合物I粗品可通过以下步骤进行纯化精制：通过一步硅胶柱层析分离纯化，以石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1或石油醚与丙酮的体积比为3:1的溶剂洗脱，再经重结晶，用石油醚和丙酮混合溶剂体系，得到的产品晶型规则（无色块晶）、熔点范围窄（188~190oC），纯度可达95％以上（色谱测定）。 
本发明目标化合物提取纯化率约为88.7%，实现了快速、简捷、大量地提取纯化该化合物，该方法具有操作简便、成本低等优势，且得到的产品纯度高，适宜作为标准品及医药开发使用。 
附图说明
图1为倍半萜内酯类化合物 I结构式。 
图2为化合物I的单晶X-射线衍射结构图。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不局限于此实施例。 
实施例1：化合物I的提取纯化实验
① 欧亚旋覆花干燥头状花序30g ，用300mL 95%乙醇室温下提取3次，每次7天，滤出合并提取液，减压浓缩得总浸膏约2.9g 。
② 将该浸膏加3.2g 柱层析硅胶拌样，挥干溶剂后，用40g硅胶干法装柱，上样，以石油醚和乙酸乙酯体系（8:1-1:4，体积比）梯度洗脱。 
③ 通过薄层层析检测，收集石油醚-乙酸乙酯体积比1:2，展开体系下Rf值约0.6，硫酸-乙醇显紫色的组分，在低于60oC条件下减压蒸干溶剂，即得化合物I的粗品82.3mg； 
经核磁共振波谱和高分辨质谱结构解析确定其为倍半萜内酯类化合物britanin。
实施例2：化合物I提取分离的放大实验
    ① 欧亚旋覆花干燥头状花序1.2 Kg购自兰州中药材市场，自然风干，用95％的乙醇12L室温下提取，浸提液减压回收乙醇，共提取3次，每次7天，后共得总浸膏约115g；
② 总浸膏用600mL水分散，再用工业乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯萃取液得到55g浸膏，该浸膏用63g柱层析硅胶拌样，用700g硅胶湿法装柱，石油醚和乙酸乙酯（8:1-1:4，体积比）梯度洗脱，薄层层析检测合并相同流份；
③ 收集薄层层析检测，石油醚和乙酸乙酯（1:2，体积比）展开体系下Rf值约0.6，硫酸-乙醇显紫色的组分，在低于60oC条件下减压蒸干溶剂，得化合物I的粗品，再经重结晶，用石油醚和丙酮混合溶剂体系，得化合物I纯品约3.11g。
实施例3：化合物I在植物总浸膏中的含量测定实验
① 实验仪器与试剂：
   Agilent1100型高效液相色谱仪，UV-100DAD检测器，手动进样器。
   甲醇（色谱纯，天津化学试剂有限公司），水为二次重蒸水。所有试剂使用前均经0.45μm滤膜过滤。 
② 色谱条件 
   色谱柱： Kromasil C18柱（5μm , 4.6mm×250mm，中国科学院大连化学物理研究所）；流动相：甲醇和水（15:85, V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220nm；柱温：室温；进样量：10μL。氦气在线脱气。
③ 溶液的配置 
 精确配置1.0mg/mL化合物I的甲醇溶液；另取总浸膏10 mg溶于甲醇定容至10mL容量瓶，得1.0mg/mL溶液。样品溶液测试前均需过滤。
④ 实验结果 
   采用外标法，根据保留时间定性，利用峰面积定量，测得化合物I约占提取浸膏的3.2%，说明化合物I在欧亚旋覆花干燥头状花序中有很高的含量，确有开发利用的前景。结合实施例1的结果，提取化合物I的方法提取效率可达88.7%，说明提取分离步骤中化合物I实现了较大效率的提取富集。

Claims (4)

1.一种以欧亚旋覆花干燥头状花序为原料，提取具有多种药理活性的倍半萜内酯的方法，其特征在于采用有机溶剂提取、乙酸乙酯萃取、柱层析分离和重结晶手段，提取纯化化合物I；
                                                           
Figure 674980DEST_PATH_IMAGE001
                                    化合物I
在上述方法中，总浸膏提取时溶剂与原料的物料比在5:1到10:1范围内，提取时如采用室温下浸提，则浸提3次，每次7天；亦可采用加热回流提取，提取3次，每次1小时；亦或采用超生提取其它现有技术进行提取；提取溶剂可选择80-95%乙醇或甲醇或工业丙酮。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于萃取溶剂选用工业乙酸乙酯。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于硅胶柱层析时选用的溶剂体系为石油醚与乙酸乙酯的体积比8:1至1:4，或石油醚与丙酮体积比10:1至1:2，梯度洗脱；通过薄层层析检测，收集石油醚和乙酸乙酯展开体系下，Rf值约0.6，硫酸-乙醇显紫色的组分，于低于60oC条件下减压浓缩。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于得到的化合物I粗品可通过以下步骤进行纯化精制：通过一步硅胶柱层析分离纯化，以石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1或石油醚与丙酮的体积比为3:1的溶剂洗脱，再经重结晶，用石油醚和丙酮混合溶剂体系得到。
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