CN103880895A - 一种利用高速逆流色谱分离纯化制备哈巴俄苷和斩龙剑苷a的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用高速逆流色谱分离纯化制备哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法，将玄参药材粉碎、乙醇提取后，经大孔吸附树脂富集得到粗提物，粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为1-5:5-10:1-10的溶剂A、溶剂B、溶剂C组成高速逆流溶剂体系，溶剂A为甲醇、乙醇、正丁醇或异丁醇，溶剂B为乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸正丁酯，溶剂C为水，上相为固定相，下相为流动相，分别制得哈巴俄苷、斩龙剑苷A。本发明采用采用高速逆流色谱法制备，不存在不可逆吸附，避免了样品的损耗，具有分离效果好，溶剂用量少，无污染，高效、快速的特点。

Description

一种利用高速逆流色谱分离纯化制备哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法

（一）技术领域

本发明属于天然药物分离领域，涉及一种分离纯化哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法，尤其涉及一种利用高速逆流色谱分离纯化高纯度哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法。

（二）背景技术

玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根。中医认为玄参味甘、苦、咸，其性微寒，具有滋阴凉血、泻火解毒等功效，一般用于热病烦躁、发斑、夜寐不宁，自汗盗汗，喉咙肿痛等症，为临床常用中药。

现代医学表明，玄参中含萜类、苷类、生物碱等成分，具有抗炎、抗肿瘤、保肝作用。

哈巴俄苷为环烯醚萜类物质，分子式C₂₀H₂₂O₈，淡黄色粉末，熔点189-190℃，分子结构式如下：

斩龙剑苷A为无色粉末，熔点110-112℃，分子式C₂₁H₂₈O₁₂，分子结构式如下：

现有技术一般采用普通色谱柱法、重结晶等传统的分离方法分离植物中的有效单体，不仅费时费力、污染环境，且所有固定相对样品有不可逆性吸附作用。高速逆流色谱（HSCCC）是近年来发展起来的一种连续的无需固体支撑物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点，已经广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。

（三）发明内容：

本发明的目的是提供高速逆流色谱制备哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法，以克服现有技术中存在的上述问题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种利用高速逆流色谱分离纯化制备哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法，由粗提物的制备和粗提物的分离纯化两部分组成，其特征在于粗提物的分离纯化应用高速逆流色谱来进行，具体的，所述方法包括以下步骤：

（1）将玄参药材粉碎成粗粉，加入体积分数10%-95%的乙醇溶剂中，加热至回流提取1-3次，提取液趁热过滤，冷却，滤液减压除去溶剂，得到乙醇提取物；

（2）哈巴俄苷、斩龙剑苷A的富集：将乙醇提取物加入填充有大孔吸附树脂的色谱柱中，用水和甲醇或乙醇的混合溶剂（优选水和乙醇的混合溶剂）梯度洗脱，收集含有哈巴俄苷、斩龙剑苷A的洗脱液，减压除去溶剂，干燥、得到哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物；

（3）哈巴俄苷、斩龙剑苷A的纯化：将哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为1-5:5-10:1-10的溶剂A、溶剂B、溶剂C组成高速逆流溶剂体系，所述溶剂A为甲醇、乙醇、正丁醇或异丁醇，所述溶剂B为乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸正丁酯，所述溶剂C为水，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速（优选800r/min转速）下，以0.5～5ml/min（优选2ml/min）的流速注入流动相，以波长190-380nm（优选210～254nm）的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形分别收集对应流出液，浓缩、干燥，分别制得哈巴俄苷、斩龙剑苷A。

所述步骤（1）中，乙醇溶剂的体积用量以粗粉的质量计为3～10L/kg，每次回流提取的时间为30-60min，提取次数为1-3次。

所述步骤（1）中，所述乙醇溶剂优选体积分数50%的乙醇溶剂。

所述步骤（2）中，所述大孔吸附树脂为非极性、弱极性或中极性的大孔吸附树脂，优选D101、AB-8、DM301等大孔吸附树脂，更优选AB-8大孔吸附树脂。

所述步骤（2）中，所述梯度洗脱条件为先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数10%-30%乙醇或甲醇的水溶液（优选乙醇水溶液）洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30%-50%乙醇或甲醇水溶液（优选乙醇水溶液）洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数40%-70%乙醇或甲醇水溶液（优选乙醇水溶液）洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数60%-95%乙醇或甲醇水溶液（优选乙醇水溶液）洗脱。

进一步，所述梯度洗脱优选为以下之一：

A、先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数50%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数70%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数95%乙醇水溶液洗脱；

B、先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30%乙醇的水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数40%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数50%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数60%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数70%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数95%乙醇水溶液洗脱；

C、先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数10%乙醇的水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数40%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数60%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数95%乙醇水溶液洗脱；

D、先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数10%乙醇的水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数60%乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数95%乙醇水溶液洗脱。

所述步骤（3）中，所述溶剂A优选正丁醇，所述溶剂B优选乙酸乙酯，所述溶剂A、溶剂Ｂ、溶剂C的体积比优选为1:9:10。所述高速逆流溶剂体系优选为体积比1：9：10的正丁醇-乙酸乙酯-水体系。

本发明的有益效果在于：

（1）本分离过程可连续进行，操作简便，效率高；

（2）采用高速逆流色谱法制备，不存在不可逆吸附，避免了样品的损耗，具有分离效果好，溶剂用量少，无污染，高效、快速的特点。

（四）附图说明

图1为实施例1制得的乙醇提取物的高效液相色谱图。

图2为实施例1制得的哈巴俄苷、斩龙剑苷A的混合粗提物的HPLC图谱。

图3为实施例1的高速逆流色谱（HSCCC）图。

图4为实施例1制得的化合物1哈巴俄苷的HPLC图谱。

图5为实施例1制得的化合物2斩龙剑苷A的HPLC图谱。

（五）具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

实施例1：

1.取50g玄参药材粉碎成粗粉，加入500mL的体积分数50%乙醇加热回流提取3次，每次提取1h，合并提取液后过滤，冷却至常温，滤液用旋转蒸发仪中减压至无醇，得到乙醇提取物，其高效液相色谱图如图1所示。

2.将4.1g乙醇提取物加30mL水分散后，加入到AB-8大孔吸附树脂柱层析，吸附结束后，依次用5倍柱体积水→30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→95%乙醇溶液洗脱，收集含有目标产物哈巴俄苷、斩龙剑苷A的乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇，干燥得到哈巴俄苷、斩龙剑苷A的混合粗提物，HPLC图见图2。（%均指体积分数）

3.应用高速逆流色谱分离纯化粗提物。取正丁醇、乙酸乙酯、水，按体积比1：9：10混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min^-1，注入流动相，流动相流速2mL·min^-1,当明显有流动相流出时，取哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物80.4mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长210nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，见图3，对153min到215min，224min到256min对应的流出液分别进行合并收集，减压干燥，分别得到化合物1哈巴俄苷31.9mg和化合物2斩龙剑苷A10.5mg。（高速逆流色谱图见图3）

4.使用高效液相色谱仪对得到的化合物1和2的纯度进行检测。色谱柱C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈（A）-0.03%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序：0-10min，3%-10%A；10-20min，10%-33%A；20-25min，33%-50%A；25-30min，50%-80%A；30-35min，80%A；柱温30℃，体积流量1mL·min^-1，检测波长210nm。测得化合物1和2的纯度分别达到98%和97%。（图4和图5）

5.目标化合物的结构鉴定。对化合物1和2进行¹H-NMR和¹³C-NMR分析，经结构解析并与与文献数据比对，可确定化合物1和2分别为哈巴俄苷和斩龙剑苷A。

具体数据如下：

化合物1，¹H-NMR（DMSO-d₆，500MHz，δ）ppm：5.98（1H，d，J=1.0Hz，H-1），6.40（1H，d，J=6.0Hz，H-3)，4.91（1H，dd，J=1.0Hz，6.0Hz，H-4)，1.86（1H，dd，J=4.0Hz，14.5Hz，H-7a)，2.20（1H，d，J=14.5Hz，H-7b)，6.55（1H，d，J=16.0Hz，H-α)，7.61（1H，d，J=16.0Hz，H-β），1.46（3H，s），7.20（2H，m，H-2，6），7.42（3H，m，H-3，4，5）。¹³C-NMR（DMSO-d₆，125MHz，δ）ppm:92.38（C-1），144.10（C-3），107.39（C-4），71.32（C-5），77.18（C-5），44.57（C-7），86.77（C-8），54.35（C-9），22.18（C-10），165.86（C=O），134.08（C-1′），128.95（C-2′，6′），128.29（C-3′，5′），130.36（C-4′），119.45（C-α），141.19（C-β），97.19（Glc-1″），73.06（Glc-2″），76.16（Glc-3″），70.10（Glc-4″），75.68（Glc-5″），61.08（Glc-6″）。

化合物2，¹H-NMR（CH₃OD，500MHz，δ）:δ7.53（2H，m，H-2，6），7.36（3H，m，H-3，4，5），6.52（1H，d，J=16.0Hz，H-α），7.49（1H，d，J=16.0Hz，H-β），5.36（1H，d，J=4.5Hz，glc-1'），3.39（1H，dd，J=9.5Hz，4.5Hz，glc-2'），3.70（1H，m，glc-3'），3.20（1H，m，glc-4'），4.05（1H，m，glc-5'），3.53（1H，dd，J=11.0Hz，5.0Hz，glc-6a'），4.23（1H，m，glc-6b'），3.18（2H，m，fru-1''），3.76（1H，m，fru-3''），4.07（1H，m，fru-4''），3.85（1H，m，fru-5''），3.70（2H，m，fru-6''）;¹³C-NMR（CH₃OD，125MHz，δ）:135.4（C-1），128.9（C-2，6），129.3（C-3，4，5），118.5（C-α），145.9（C-β），168.0（C=O），92.8（C-1′），72.4（C-2′），74.0（C-3′），70.7（C-4′），71.6（C-5′），64.7（C-6′），63.8（C-1″），104.5（C-2″），83.3（C-3″），78.7（C-4″），75.5（C-5″），63.6（C-6″）。

实施例2：

1.取50g玄参药材粉碎成粗粉，加入500mL体积分数50%乙醇加热回流提取3次，每次提取1h，合并提取液后过滤，冷却至常温。滤液用旋转蒸发仪减压至无醇，得到乙醇提取物醇提物。

2.将10.2g乙醇提取物加40mL水分散后，加入到AB-8大孔吸附树脂柱层析，吸附结束后，依次用5倍柱体积水→30%乙醇→40%乙醇→50%乙醇→60%乙醇→70%乙醇→95%乙醇溶液洗脱，收集含有目标产物哈巴俄苷、斩龙剑苷A的乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇，干燥得到哈巴俄苷、斩龙剑苷A的混合粗提物。

3.应用高速逆流色谱分离纯化粗提物。取正丁醇、乙酸乙酯、水，按体积比1：9：10混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min^-1，注入流动相，流动相流速2mL·min^-1,当明显有流动相流出时，取哈巴俄苷、斩龙剑苷A混和粗提物115.0mg，溶于5mL上相与5mL下相的混合液后进样，，以波长210nm的紫外检测器检测连续流出液，根据紫外检测器光谱图的峰形收集对应流出液，减压干燥，分别得到化合物1哈巴俄苷46.1mg和化合物2斩龙剑苷A15.2mg。

4.按上述条件得到的得到化合物1和2的纯度用HPLC进行检测，结果都≥97%。

HPLC分析条件同实施例1。

实施例3：

1.玄参药材提取同实施例1。

2.将10.3g乙醇提取物加40mL水分散后，加入到AB-8大孔吸附树脂柱层析，吸附结束后，依次用5倍柱体积水→10%乙醇→30%乙醇→40%乙醇→60%乙醇→95%乙醇溶液洗脱，收集含有目标产物哈巴俄苷、斩龙剑苷A的乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇，干燥得到哈巴俄苷、斩龙剑苷A的混合粗提物。

3.应用高速逆流色谱分离纯化粗提物。取正丁醇、乙酸乙酯、水，按体积比1：9：10混合，混合充分后静置，按上下相分开，去上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min^-1，注入流动相，调整流动相流速1.5mL·min^-1,，当明显有流动相流出时，取哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物136.2mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长210nm的紫外检测器检测流出液，连续分离，根据紫外检测器光谱图的峰形收集对应流出液，减压干燥，分别得到得到化合物1哈巴俄苷51.5mg和2斩龙剑苷A17.1mg。

4.按上述条件得到的得到化合物1和2的纯度用HPLC进行检测，结果都≥97%。

HPLC分析条件同实施例1。

实施例4：

1.玄参药材提取同实施例1。

2.将20.1g乙醇提取物加40mL水分散后，加入到AB-8大孔吸附树脂柱层析，吸附结束后，依次用5倍柱体积水→10%乙醇→30%乙醇→60%乙醇→95%乙醇溶液洗脱，收集含有目标产物哈巴俄苷、斩龙剑苷A的乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇，干燥得到哈巴俄苷、斩龙剑苷A的混合粗提物。

3.应用高速逆流色谱分离纯化粗提物。取正丁醇、乙酸乙酯、水，按体积比1：9：10混合，混合充分静置后，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min^-1，注入流动相，注入流动相流动相流速2mL·min^-1,当明显有流动相流出时，取哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物121.7mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，用波长254nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图的峰形收集对应流出液，减压干燥，分别得到化合物1哈巴俄苷45.4mg和化合物2斩龙剑苷A15.3mg。

4.按上述条件得到的得到化合物1和2的纯度用HPLC进行检测，结果都≥97%。

HPLC分析条件同实施例1。

Claims (10)

1.一种利用高速逆流色谱分离纯化制备哈巴俄苷和斩龙剑苷A的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）将玄参药材粉碎成粗粉，加入体积分数10%-95%的乙醇溶剂中，加热至回流提取1-3次，提取液趁热过滤，冷却，滤液减压除去溶剂，得到乙醇提取物；

（2）哈巴俄苷、斩龙剑苷A的富集：将步骤（1）的乙醇提取物加入填充有大孔吸附树脂的色谱柱中，用水和甲醇或乙醇的混合溶剂梯度洗脱，收集含有哈巴俄苷、斩龙剑苷A的洗脱液，减压除去溶剂，干燥、得到哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物；

（3）哈巴俄苷、斩龙剑苷A的纯化：将哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为1-5:5-10:1-10的溶剂A、溶剂B、溶剂C组成高速逆流溶剂体系，所述溶剂A为甲醇、乙醇、正丁醇或异丁醇，所述溶剂B为乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸正丁酯，所述溶剂C为水，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速下，以0.5～5ml/min的流速注入流动相，以波长190-380nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取哈巴俄苷、斩龙剑苷A混合粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形分别收集对应流出液，浓缩、干燥，分别制得哈巴俄苷、斩龙剑苷A。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，乙醇溶剂的体积用量以粗粉的质量计为3～10L/kg，每次回流提取的时间为30-60min，提取次数为1-3次。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述乙醇溶剂为体积分数50%的乙醇溶剂。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中，所述大孔吸附树脂为非极性、弱极性或中极性的大孔吸附树脂。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中，所述大孔吸附树脂为D101、AB-8或DM301大孔吸附树脂。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中，所述梯度洗脱条件为先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数10%-30%乙醇或甲醇的水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30%-50%乙醇或甲醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数40%-70%乙醇或甲醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数60%-95%乙醇或甲醇水溶液洗脱。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中，所述溶剂A为正丁醇，所述溶剂B为乙酸乙酯。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中，所述溶剂A、溶剂Ｂ、溶剂C的体积比为1:9:10。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中，所述高速逆流溶剂体系为体积比1：9：10的正丁醇-乙酸乙酯-水体系。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中，所述紫外检测器的波长为210～254nm。

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