CN109549937B - 蓝萼甲素在制备消炎和抗光老化产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蓝萼甲素及具有蓝萼甲素类似结构化合物在制备消炎和抗光老化产品中的应用，涉及医药技术及化妆品技术领域，要解决的是没有关于蓝萼甲素及具有类似结构化合物对于消炎和抗光老化方面研究的问题。本发明通过以LPS诱导RAW264.7细胞释放NO和IL‑6为靶点，验证了蓝萼甲素及具有类似结构的化合物具有良好的消炎作用，证明蓝萼甲素及具有类似结构的化合物在制备消炎产品方面具有良好的应用前景；本发明通过以UVB诱导HaCaT细胞损伤以及分泌IL‑6为靶点，验证了蓝萼甲素及具有类似结构的化合物具有良好的抗光老化作用，证明蓝萼甲素及具有类似结构的化合物在制备抗光老化产品方面具有良好的应用前景。

Description

蓝萼甲素在制备消炎和抗光老化产品中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术及化妆品技术领域，具体是蓝萼甲素在制备消炎和抗光老化产品中的应用。
背景技术
蓝萼香茶菜又名山苏子和回菜花，是唇形科植物蓝萼香茶菜的干燥地上全草。其性凉，味苦、甘，功效为清热解毒，活血化瘀。临床上蓝萼香茶菜用于治疗感冒、咽喉肿痛、扁桃体炎以及蛇虫咬伤等。
现代研究发现蓝萼香茶菜具有多种生物活性包括抗肿瘤、抗病毒和改善心血管等，并且这些活性的物质基础多数是其所含有的贝壳杉烷型二萜类化合物如蓝萼甲素、乙素、丙素、丁素、戊素、庚素等。这些化合物中以蓝萼甲素含量最高，蓝萼甲素及具有蓝萼甲素
Figure BDA0001971191610000011
类似结构化合物的结构为
Figure BDA0001971191610000012
研究报道蓝萼甲素具有明显的抗肿瘤作用，可以抑制人早幼粒白血病细胞株HL-60和肝癌细胞株HEPG2细胞的增殖并诱导凋亡。
然而，目前尚没有关于蓝萼甲素及具有类似结构的化合物对于消炎和抗光老化方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蓝萼甲素在制备消炎和抗光老化产品中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
蓝萼甲素及具有类似结构的化合物在制备消炎产品中的应用。
作为本发明进一步的方案：所述蓝萼甲素及具有蓝萼甲素类似结构化合物在制备消炎产品时，蓝萼甲素及具有蓝萼甲素类似结构化合物的用量为0.5-1μmol/L。
作为本发明进一步的方案：所述蓝萼甲素及具有蓝萼甲素类似结构化合物在制备消炎产品时，蓝萼甲素及具有蓝萼甲素类似结构化合物的用量为1μmol/L。
蓝萼甲素及具有类似结构的化合物在制备抗光老化产品中的应用。
作为本发明进一步的方案：所述蓝萼甲素及具有蓝萼甲素类似结构化合物在制备抗光老化产品时，蓝萼甲素及具有蓝萼甲素类似结构化合物的用量为0.5-1μmol/L。
作为本发明进一步的方案：所述蓝萼甲素及具有蓝萼甲素类似结构化合物在制备抗光老化产品时，蓝萼甲素及具有蓝萼甲素类似结构化合物的用量为1μmol/L。
Figure BDA0001971191610000021
具有蓝萼甲素类似结构的化合物的结构式为
Figure BDA0001971191610000022
R1，R2，R3取代基团与蓝萼甲素不同。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
第一，本发明通过以LPS诱导RAW264.7细胞释放NO和IL-6为靶点，验证了蓝萼甲素及具有类似结构的化合物具有良好的消炎作用，证明蓝萼甲素及具有类似结构的化合物在制备消炎产品方面具有良好的应用前景；
第二，本发明通过以UVB诱导HaCaT细胞损伤以及分泌IL-6为靶点，验证了蓝萼甲素及具有类似结构的化合物具有良好的抗光老化和皮肤细胞保护的作用，证明蓝萼甲素及具有类似结构的化合物在制备抗光老化和皮肤屏障保护产品方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为蓝萼甲素对Raw264.7细胞活力的影响图。
图2为蓝萼甲素对LPS诱导Raw264.7细胞分泌NO的影响图。
图3为蓝萼甲素对LPS诱导Raw264.7细胞分泌IL-6的影响图。
图4为蓝萼甲素对HaCaT细胞活力的影响图。
图5为蓝萼甲素对HaCaT细胞分泌IL-6的影响图。
图6为蓝萼甲素对HaCaT细胞分泌IL-1α的影响图。
图7为化合物2对Raw264.7细胞活力的影响图。
图8为化合物2对LPS诱导Raw264.7细胞分泌NO的影响图。
图9为化合物2对LPS诱导Raw264.7细胞分泌IL-6的影响图。
图10为化合物2对HaCaT细胞活力的影响图。
图11为化合物2对HaCaT细胞分泌IL-6的影响图。
图12为化合物2对HaCaT细胞分泌IL-1α的影响图。
图13为化合物3对Raw264.7细胞活力的影响图。
图14为化合物3对LPS诱导Raw264.7细胞分泌NO的影响图。
图15为化合物3对LPS诱导Raw264.7细胞分泌IL-6的影响图。
图16为化合物3对HaCaT细胞活力的影响图。
图17为化合物3对HaCaT细胞分泌IL-6的影响图。
图18为化合物3对HaCaT细胞分泌IL-1α的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症是常用的炎症研究的细胞模型。LPS可以通过结合巨噬细胞膜受体TLR4，激活NF-κb和MAPK等炎症信号通路，从而诱导下游炎症基因表达，分泌一系列炎症因子如一氧化氮(nitric oxide，NO)和白介素-6(interleukin 6)等。本发明以LPS诱导RAW264.7细胞释放NO和IL-6为靶点，考察蓝萼甲素及其类似结构化合物的抗炎作用。
皮肤老化包括自然老化和光老化，其中光老化除造成皮肤的色泽、纹理、弹性、厚度等的变化外，甚至可能使皮肤出现各种良性或恶性肿瘤，影响严重。皮肤光老化与UV照射关系密切，中波紫外线UVB主要作用于皮肤表皮层中的角质形成细胞，使皮肤外观发生上述变化及相应的分子生物学改变，引起细胞的凋亡并分泌炎症因子IL-6等。HaCaT是常用的人表皮角质细胞系，本发明以UVB诱导HaCaT细胞分泌IL-6为靶点，考察蓝萼甲素及其类似结构化合物的抗光老化作用。
材料和试剂：RAW264.7细胞株购自中国科学院上海细胞所；HaCaT购自中国科学院上海细胞所，蓝萼甲素和化合物2以及化合物3购自成都普思生物，地塞米松和DMSO购自Sigma公司，DMEM高糖培养基、胎牛血清FBS、胰酶等购自Gibco公司，CCK-8购自上海前尘生物科技有限公司；IL-6等细胞因子ELISA试剂盒购自美国eBiosience公司。
药液配制：蓝萼甲素、化合物2和化合物3用DMSO配制成10mmol/L的母液备用，加药时用DMEM培养基稀释成需要的浓度。
细胞培养：RAW264.7细胞用含10％FBS的DMEM培养，置于质量分数为5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期进行传代，2～3d传代1次。取至少3代后的细胞用于实验。HaCaT细胞用含质量分数为10％FBS的DMEM培养，置于质量分数为5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期进行传代，2～3d传代1次。取至少3代后的细胞用于实验，结果见图1、图7和图13，图1中可以看出与空白对照组相比，不同浓度蓝萼甲素对RAW264.7细胞的生长无明显影响，说明无细胞毒作用。图7中可以看出与空白对照组相比，不同浓度化合物2对RAW264.7细胞的生长无明显影响，说明无细胞毒作用。图13中可以看出与空白对照组相比，不同浓度化合物3对RAW264.7细胞的生长无明显影响，说明无细胞毒作用。
药物对RAW264.7细胞生长的影响：取对数生长期的RAW264.7细胞采用质量分数为0.25％胰酶和质量分数为0.02％EDTA消化2min后，弃胰酶，用质量分数为10％的FBS DMEM培养基中和胰酶作用，轻轻吹打成单细胞悬液，离心弃上清，用完全培养基重悬细胞并计数后，调整细胞悬液至8×105/mL，按每孔100μL接种至96孔培养板，37℃、质量分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养24h，吸尽每孔上清，每孔加入100μL DMEM培养基，随机分为阴性对照组(含质量分数为0.1％DMSO的DMEM培养基)、毒性对照组(含质量分数为5％DMSO的DMEM培养基)、药物组；加入相应药物后，每组设4个复孔，质量分数为5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养24h后，提前4h按每孔10μL加入CCK-8，4h后酶标仪检测450nm处吸光度值(A450)。
炎症因子检测：取对数生长期的RAW264.7细胞，采用质量分数为0.25％胰酶和质量分数为0.02％EDTA消化2min后，弃胰酶，用质量分数为10％FBS DMEM培养基中和胰酶作用，轻轻吹打成单细胞悬液，离心弃上清液，用完全培养基重悬细胞并计数后，调整细胞悬液至8×105/mL，按每孔100μL接种至96孔培养板，37℃、质量分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养8h左右使细胞贴壁，吸尽每孔上清液，每孔加入100μL无血清DMEM培养基，随机分为空白对照组、LPS(1μg/mL)组、LPS+阳性对照组(5μmol/L Dex)、LPS(1μg/mL)+药物组，加入相应药物后，每组设4个复孔，质量分数为5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养24h后，取上清液用于NO、白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子的检测，结果见图2、图3、图8、图9、图14和图15，图2表明不同浓度蓝萼甲素可以显著抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞的NO分泌，并呈剂量依赖效果，1μmol/L的蓝萼甲素效果最佳。图3表明不同浓度蓝萼甲素可以显著抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞的IL-6分泌，1μmol/L的蓝萼甲素效果最佳。图8表明不同化合物2可以显著抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞的NO分泌，并呈剂量依赖效果。图9表明不同浓度化合物2可以显著抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞的IL-6分泌。图14表明不同浓度化合物3可以显著抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞的NO分泌，并呈剂量依赖效果。图15表明不同浓度化合物3可以显著抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞的IL-6分泌。
HaCaT细胞活力检测：取对数生长期的Hacat细胞，采用质量分数为0.25％胰酶和质量分数为0.02％EDTA消化2min后，弃胰酶，用质量分数为10％FBS DMEM培养基中和胰酶作用，轻轻吹打成单细胞悬液，离心弃上清液，用完全培养基重悬细胞并计数后，调整细胞悬液至8×104/mL，按每孔400μL接种至24孔培养板，37℃、质量分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养24h，吸尽每孔上清液，每孔加入500μL PBS洗两次后，加少量PBS覆盖细胞，使用UVB辐照仪照射细胞(照射强度8mJ/cm2)，照射完使用PBS洗一次，空白组和UVB模型组加入400μL培养基，给药组加入含不同浓度蓝萼甲素、化合物2以及化合物3的培养基。继续培养24小时后，每孔加入10μLCCK-8，置于培养箱中孵育1小时左右，取出，每孔吸取100μL于96孔板中，使用酶标仪在450nmol/L处读取吸光度值。
UVB光老化炎症因子检测：取对数生长期的Hacat细胞，采用质量分数为0.25％胰酶和质量分数为0.02％EDTA消化2min后，弃胰酶，用质量分数为10％FBS DMEM培养基中和胰酶作用，轻轻吹打成单细胞悬液，离心弃上清液，用完全培养基重悬细胞并计数后，调整细胞悬液至8×104/mL，按每孔400μL接种至24孔培养板，37℃、质量分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养24h，吸尽每孔上清液，每孔加入500μL PBS洗两次后，加少量PBS覆盖细胞，使用UVB辐照仪照射细胞(照射强度8mJ/cm2)，照射完使用PBS洗一次，空白组和UVB模型组加入400μL培养基，给药组加入含不同浓度蓝萼甲素、化合物2和化合物3的培养基。继续培养24小时后，吸取上清液用于IL-6和IL-1α检测，结果见图4-6、图10-12以及图16-18。
图4中表明UVB照射可以明显降低HaCaT细胞活力，而1μmol/L和0.5μmol/L的蓝萼甲素可以明显保护UVB造成的HaCaT细胞损伤，且具有一定的剂量依赖性，1μmol/L的蓝萼甲素效果最佳。图5中表明不同浓度蓝萼甲素可以显著抑制UVB照射引起的Hacat细胞的IL-6分泌，并呈一定的剂量依赖效果，1μmol/L的蓝萼甲素效果最佳。图6中表明不同浓度的蓝萼甲素可以显著抑制UVB照射引起的Hacat细胞的IL-1α分泌且具有明显的剂量依赖性，1μmol/L的蓝萼甲素效果最佳，其中1μmol/的蓝萼甲素IL-1α抑制率达23.5％。
图10表明UVB照射可以明显降低HaCaT细胞活力，化合物2并不能够很好的保护UVB造成的HaCaT细胞损伤。图11表明不同浓度化合物2可以显著抑制UVB照射引起的Hacat细胞的IL-6分泌，并呈一定的剂量依赖效果。图12表明不同浓度的化合物2可以显著抑制UVB照射引起的Hacat细胞的IL-1α分泌且具有明显的剂量依赖性。
图16表明UVB照射可以明显降低HaCaT细胞活力，而1μmol/L和0.5μmol/L的化合物3可以明显保护UVB造成的HaCaT细胞损伤，且具有一定的剂量依赖性。图17表明不同浓度化合物3可以显著抑制UVB照射引起的Hacat细胞的IL-6分泌。图18表明不同浓度的化合物3可以显著抑制UVB照射引起的Hacat细胞的IL-1α分泌且具有明显的剂量依赖性。
综上所述，本发明选取两种细胞，首先，利用LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞系，我们发现蓝萼甲素和化合物2及化合物3对炎症因子均有良好的抑制作用。其次，在抗炎结果的基础上我们又检测了蓝萼甲素在UVB诱导的人表皮角化细胞系HaCaT光老化的保护作用，研究显示，蓝萼甲素和化合物2及化合物3均能抑制UVB引起的老化相关炎症因子分泌。两项研究数据支持蓝萼甲素及其类似结构化合物在抗炎和保护光老化领域的创新发现。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.蓝萼甲素在制备抗光老化产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的蓝萼甲素在制备抗光老化产品中的应用，其特征在于，蓝萼甲素的用量为0.5-1μmol/L。
3.根据权利要求2所述的蓝萼甲素在制备抗光老化产品中的应用，其特征在于，蓝萼甲素的用量为1μmol/L。
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