CN103768826A

CN103768826A - 一种制备高纯度丹参酮化合物的三柱循环分离系统及其方法

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Publication number: CN103768826A
Application number: CN201310750853.2A
Authority: CN
Inventors: 吴世华; 孟杰
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-12-30
Filing date: 2013-12-30
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2033-12-30
Also published as: CN103768826B

Abstract

本发明涉及制备高纯度丹参酮化合物的三柱循环分离系统及其方法，三柱循环分离系统包括三个逆流色谱柱，三个泵，三个检测器，三个收集器和四个六通阀。以第一逆流色谱柱做起始分离柱，第二逆流色谱柱和第三逆流色谱柱做相互独立的循环分离柱，样品经第一逆流色谱柱进行第一维分离后，通过调节三个六通阀依次进入第二逆流色谱柱进行第二维分离，进入第三逆流色谱柱进行第三维分离，再次进入第一逆流色谱柱进行下一次循环分离，实现丹参酮类化合物多维循环分离。丹参酮类化合物包括二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参醌、丹参酮ⅡA、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯和丹参新醌A。本发明提取分离简单、时间短，产物纯度高，可连续化操作。

Description

一种制备高纯度丹参酮化合物的三柱循环分离系统及其方法

技术领域

本发明涉及一种制备高纯度丹参酮化合物的三柱循环分离系统及其方法。

背景技术

逆流色谱（Counter-current chromatography CCC）是一种不需要固体支持物的液液分配色谱，因此可以避免固体支持物带来的缺点，例如样品损失，活性变化，拖尾以及污染。相比于高效液相色谱（High performance liquid chromatography HPLC），CCC拥有更大的制备装载量和更好的选择性。因此，从微量分析到制备分离甚至工业生产，CCC仍是一种重要的分离纯化技术。然而，逆流色谱的分辨率仍然远远小于HPLC、气相色谱（Gas chromatography GC）和毛细管电泳（Capillary electrophoresis CE）。但是研究者采取了很多方法改善这一缺点，到目前为止，已经在柱子排列顺序，提高离心力，采用不同形状绕线圈等方面进行了改进。

通常情况下，增加柱子长度会提高分离效率，但是单纯增加柱子的物理长度不仅需要占用更大空间，同时需要耗费更多成本增加仪器及溶剂。循环分离则是一种有效的解决方法，它没有增加柱子的物理长度，而是将尾端洗脱液进入首端进行循环分离，这样既可以节省空间，又可以节约试剂，循环分离最大的风险是分开的物质因循环后导致混合在一起，因此如何避免返混是利用循环分离的最大技术难点。现有的循环色谱多是用单柱进行循环，同时采用填充柱色谱，柱尾端压力较大导致材料要求高，也因死吸附等使样品容易损失；有些循环分离中没有将检测器放在循环中，因此无法实时检测分离情况。

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科植物丹参的干燥根和茎，始载于《神农本草经》，被列为上品。其味苦，性微寒，归心、肝二经，具有活血通络，祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神等功效，中医有“一味丹参饮，功同四物汤”之说。丹参酮（Tanshinones）是丹参中具有橙黄色和橙红色特征的脂溶性二萜类化合物，按其结构不同分为丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、羟基丹参酮、丹参酮甲酯、异丹参酮、异隐丹参酮等10多种成分。由于醌类成分已被还原成二酚类衍生物，后者又被氧化为醌，因此起到电子传递的作用。它们作为新陈代新的产物，通过促进或干扰生物多种生化反应，表现出多种生物活性。药理活性研究表明，丹参酮在抗肿瘤、心血管疾病、抗菌消炎等方面均有良好的治疗作用。

丹参酮易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂。传统的制备方法是粉碎浸泡提取后用柱层析（薄层色谱、硅胶柱色谱、制备液相色谱）反复富集纯化，但是这些制备方法经常耗时而且会因为柱填料的吸附而造成样品损失，专利CN200610017897.4提供一种用正相硅胶柱、乙酸乙酯、苯、氯仿、60-90规格的石油醚多次提取的方法分离丹参酮，其分离次数过多，操作繁琐，且使用了苯、氯仿等对环境污染较大的溶剂；专利CN201210549910.6中提供的丹参酮提取物及其水溶物的制备方法中只是用乙醇浸提、回流提取、减压浓缩、纯水洗涤等步骤，得到的产物中丹参酮ⅡA含量仅有10.0%～15.0%，隐丹参酮物质含量为8.0%～11.0%。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有丹参酮分离制备过程中分离流程长、所用溶剂环境危害性大、回收率不高等缺陷，而提供一种提取分离简单、可连续化操作的制备高纯度丹参酮化合物的三柱循环分离系统及其方法。

本发明的目的是这样实现的：

本发明的制备高纯度丹参酮化合物的三柱循环分离系统，包括三个逆流色谱柱，三个泵，三个检测器，三个收集器和四个六通阀；其中第一六通阀做进样阀，该进样阀与第二六通阀的第Ⅰ节点以及第一盛装流动相容器相连；第二六通阀的第Ⅱ节点与第一泵的输入端相连，第一泵的输出端与第一逆流色谱柱的首端相连，第一逆流色谱柱的尾端与第一检测器的输入端相连，第一检测器的输出端与第三六通阀的第Ⅰ节点相连，第三六通阀的第Ⅱ节点与第一收集器相连；第三六通阀的第Ⅴ节点与第二盛装流动相的容器相连，第三六通阀的第VI节点与第二泵的输入端相连，第二泵的输出端与第二逆流色谱柱的首端相连，第二逆流色谱柱的尾端与第二检测器的输入端相连，第二检测器的输出端与第四六通阀的第Ⅰ节点相连，第四六通阀的第Ⅱ节点与第二收集器相连；第四六通阀的第Ⅴ节点与第三盛装流动相容器相连，第四六通阀的第VI节点与第三泵的输入端相连，第三泵的输出端与第三逆流色谱柱的首端相连，第三逆流色谱柱的尾端与第三检测器的输入端相连，第三检测器的输出端与第二六通阀的第Ⅲ节点相连，第二六通阀的第Ⅳ节点与第三收集器相连。

利用本发明的三柱循环分离系统制备高纯度丹参酮化合物的方法，该丹参酮类化合物包括结构式(1)二氢丹参酮Ⅰ、结构式(2)隐丹参酮、结构式(3)丹参酮Ⅰ、结构式（4）1,2-二氢丹参醌、结构式（5）丹参酮ⅡA、结构式（6）三叶鼠尾酮B、结构式（7）甲基丹参酮酯和结构式（8）丹参新醌A，

其制备包括以下步骤：

（1）将丹参根茎粉碎后，用体积浓度95%的乙醇充分浸泡提取；

（2）减压浓缩乙醇提取液，得到富含二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参醌、丹参酮ⅡA、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯和丹参新醌A的丹参酮提取物；

（3）配制四元溶剂体系：将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按体积百分比分别为68.70%、24.91%、3.64%和2.75%配制的四元溶剂体系作为上相，按体积百分比分别为2.53%、24.77%、49.04%和23.66%配制的四元溶剂体系作为下相，将配制好的上下相分别加入到三个逆流色谱柱中，加入到每个逆流色谱柱中上相的量为其柱体积的60%，下相的量为其柱体积的40%，其中上相做固定相，下相做流动相；

（4）将步骤（2）制得的丹参酮提取物首先经过第一逆流色谱柱分离，得到前后洗脱顺序依次为丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参醌、丹参酮ⅡA的洗脱液；

（5）观察第一检测器，当含有丹参新醌A以及二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参醌和丹参酮ⅡA的洗脱液从第一逆流色谱柱开始被洗出后，调节第三六通阀将第一逆流色谱柱尾端与第二逆流色谱柱首端连接，调节第四六通阀将第二逆流色谱柱尾端与第三逆流色谱柱首端连接，调节第二六通阀将第三逆流色谱柱尾端与第一逆流色谱柱首端连接，使第一、第二和第三逆流色谱柱组成三柱循环分离体系，在线直接将洗脱液转入第二逆流色谱柱；观察第一检测器，当含有1,2-二氢丹参醌、丹参酮ⅡA的洗脱液开始从第一逆流色谱柱被洗出后，调节第三六通阀将第一逆流色谱柱与第二逆流色谱柱断开，第一收集器收集1,2-二氢丹参醌和丹参酮ⅡA洗脱液；

（6）观察第二检测器，当含丹参新醌A以及二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的洗脱液从第二逆流色谱柱洗出后，通过第四六通阀进入第三逆流色谱柱，当含有丹参酮Ⅰ洗脱液从第二逆流色谱柱开始被洗出后，调节第四六通阀将第二逆流色谱柱与第三逆流色谱柱断开，第二收集器收集丹参酮Ⅰ洗脱液；

（7）观察第三检测器，当含丹参新醌A以及二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯和隐丹参酮的洗脱液从第三逆流色谱柱洗出后，通过第二六通阀进入第一逆流色谱柱，当含有甲基丹参酮酯和隐丹参酮以及丹参酮Ⅰ洗脱液从第三逆流色谱柱开始被洗出后，调节第二六通阀将第三逆流色谱柱与第一逆流色谱柱断开，第三收集器收集甲基丹参酮酯和隐丹参酮以及丹参酮Ⅰ洗脱液；

（8）观察第一检测器，当含丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第一逆流色谱柱洗出后，通过第三六通阀进入第二逆流色谱柱，当含有三叶鼠尾酮B的洗脱液从第一逆流色谱开始洗出后，调节第三六通阀将第一逆流色谱柱与第二逆流色谱柱断开，第一收集器收集三叶鼠尾酮B洗脱液；

（9）观察第二检测器，当含丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第二逆流色谱柱开始洗出后，调节第四六通阀将第二逆流色谱柱与第三逆流色谱柱断开，第二收集器收集丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ洗脱液。

本发明的有益效果在于：

（1）采用循环分离，不仅可以节省溶剂，也可以简化寻找合适溶剂系统的过程，从而可以使用样品溶解度大的溶剂以加大上样量，提高了单位时间的产量；

（2）采用三柱循环分离，能够满足不增加分离柱物理长度的情况下实现提取物的直接纯化，省去了柱层析富集过程；

（3）通过设计仪器组合使得三维分离与循环分离结合在一起，通过调节三个六通阀即可实现三维分离与循环分离的切换，操作简单，节省分离时间。

（4）分离柱即可用逆流色谱，还可用常见的高效液相色谱，应用范围广。

附图说明

图1为双柱循环分离系统示意图，图中：A1为第一逆流色谱柱，B1为第二逆流色谱柱，C1为第三逆流色谱柱，1为第一泵，2为第二泵，3为第三泵，4为第一检测器，5为第二检测器，6为第三检测器，7为第一收集器，8为第二收集器，9为第三收集器，10为第一六通阀，11为第二六通阀，12为第三六通阀，13为第四六通阀，14为第一盛装流动相的容器，15为第二盛装流动相的容器，16为第三盛装流动相的容器。

图2为六通阀处于位置1状态示意图；

图3为六通阀处于位置2状态示意图；

图4为实施例样品的HPLC分析图，图中：1为二氢丹参酮Ⅰ，2为隐丹参酮，3为丹参酮Ⅰ，4为1,2-二氢丹参醌，5为丹参酮ⅡA，6为三叶鼠尾酮B，7为甲基丹参酮酯，8为丹参新醌A；

图5为实施例中分离过程在线检测示意图，其中：图（a）A1体系分离；图（b）B1体系分离；图（c）C1体系分离；

图6为纯化后的物质液相色谱分析图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

参照图1，本发明的制备高纯度丹参酮化合物的三柱循环分离系统，包括三个逆流色谱柱A1、B1、C1，三个泵1、2、3，三个检测器4、5、6，三个收集器7、8、9和四个六通阀10、11、12、13；其中第一六通阀10做进样阀，该进样阀与第二六通阀11的第Ⅰ节点以及第一盛装流动相容器14相连；第二六通阀11的第Ⅱ节点与第一泵1的输入端相连，第一泵1的输出端与第一逆流色谱柱A1的首端相连，第一逆流色谱柱A1的尾端与第一检测器4的输入端相连，第一检测器4的输出端与第三六通阀12的第Ⅰ节点相连，第三六通阀12的第Ⅱ节点与第一收集器7相连；第三六通阀12的第Ⅴ节点与第二盛装流动相的容器15相连，第三六通阀12的第VI节点与第二泵2的输入端相连，第二泵2的输出端与第二逆流色谱柱B1的首端相连，第二逆流色谱柱B1的尾端与第二检测器5的输入端相连，第二检测器5的输出端与第四六通阀13的第Ⅰ节点相连，第四六通阀13的第Ⅱ节点与第二收集器8相连；第四六通阀13的第Ⅴ节点与第三盛装流动相容器16相连，第四六通阀13的第VI节点与第三泵3的输入端相连，第三泵3的输出端与第三逆流色谱柱C1的首端相连，第三逆流色谱柱C1的尾端与第三检测器6的输入端相连，第三检测器6的输出端与第二六通阀11的第Ⅲ节点相连，第二六通阀11的第Ⅳ节点与第三收集器9相连。

实施例1：

步骤如下：

1.提取：

取干燥丹参根茎9.5公斤，粉碎成60目的粗粉，室温下置于30L体积浓度95%的乙醇浸提3次，每次24小时，定期搅拌，合并浸提液减压浓缩，得到得到富含二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参醌、丹参酮ⅡA、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯和丹参新醌A的丹参酮提取物（HPLC分析图见图4），用于制备分离。

2.配制溶剂系统：

按照正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积百分比分别是68.70%、24.91%、3.64%、2.75%的比例配制上相800ml，按照四者体积百分比分别是2.53%、24.77%、49.04%、23.66%的比例配制下相2L，其中上相做固定相，下相做流动相。

3.三柱循环逆流色谱制备：

（1）配好溶剂系统后，上相和下相分别用第一泵1同时推入三个逆流色谱柱（A1-220ml，B1-180ml，C1-210ml）内，加入到第一逆流色谱柱A1中上相的量为132ml，下相的量为88ml，加入到第二逆流色谱柱B1中上相的量为108ml，下相的量为72ml，加入到第三逆流色谱柱C1中上相的量为126ml，下相的量为84ml。

（2）将步骤（1）中制得的500mg样品用8ml上相与8ml下相溶解后注入进样阀，开启三个逆流色谱柱，下相做流动相并以3ml/min流速洗脱。调节第二、第三、第四六通阀11、12、13均置于位置1（如图2），第一、第二和第三逆流色谱柱A1，B1，C1断开，样品首先进入第一逆流色谱柱A1进行分离，观察第一检测器4，36min时，被分离物开始洗出，56min时，含丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参醌、丹参酮ⅡA这8种物质的洗脱液按顺序开始先后被洗出，调节第二、第三、第四六通阀11、12、13均置于位置2（如图3），将第一逆流色谱柱A1尾端与第二逆流色谱B1首端连接，第二逆流色谱柱B1尾端与第三逆流色谱柱C1首端连接，第三逆流色谱柱C1尾端与第一逆流色谱柱A1首端连接，使含有丹参新醌A以及二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参醌和丹参酮ⅡA的洗脱液进入第二逆流色谱柱B1；观察第二检测器5，80min时，含有丹参新醌A以及二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参醌和丹参酮ⅡA的洗脱液从第二逆流色谱柱B1洗出进入第三逆流色谱柱C1；观察第一检测器4，116min时，1,2-二氢丹参醌和丹参酮ⅡA从第一逆流色谱柱A1开始被洗出，调节第三六通阀12返回位置1，将第一逆流色谱柱A1尾端与第二逆流色谱柱B1首端断开，第一收集器7在第一逆流色谱柱A1尾端收集1,2-二氢丹参醌和丹参酮ⅡA，丹参新醌A以及二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ继续分离；观察第四检测器13，132min时，含有丹参新醌A的洗脱液从第三逆流色谱柱C1洗出进入第一逆流色谱柱A1；观察第二检测器5，172min时，含丹参酮Ⅰ的洗脱液从第二逆流色谱柱B1开始被洗出，调节第四六通阀13返回位置1，将第二逆流色谱柱B1尾端与第三逆流色谱柱C1首端断开，第二收集器8从第二逆流色谱柱B1尾端收集丹参酮Ⅰ，丹参新醌A以及二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮继续分离；观察第一检测器4，194min时，第一逆流色谱柱A1中的1,2-二氢丹参醌和丹参酮ⅡA已经收集完毕，调节第三六通阀12置于位置2，将第一逆流色谱柱A1与第二逆流色谱柱B1连接；观察第一检测器4，200min时，含丹参新醌A等化合物的洗脱液从第一逆流色谱柱A1开始洗出进入第二逆流色谱柱B1；观察第三检测器6，212min时，甲基丹参酮酯与隐丹参酮开始从第三逆流色谱柱C1尾端洗出，调节第二六通阀11返回位置1，将第一逆流色谱柱A1首端与第三逆流色谱柱C1尾端断开，第三收集器9从C1柱尾端收集以上两者的洗脱液，丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B这3种化合物继续分离；观察第二检测器5，235min时，丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ从第二逆流色谱柱B1开始洗出，调节第四六通阀13返回位置1，将第二逆流色谱柱B1与第三逆流色谱柱C1断开，第二收集器8从第二逆流色谱柱B1尾端收集丹参新醌A与二氢丹参酮Ⅰ；观察第一检测器4，273min时，三叶鼠尾酮 B从第一逆流色谱柱A1开始洗出，调节第三六通阀12返回位置1，使第一逆流色谱柱A1与第二逆流色谱柱B1断开，第一收集器7收集三叶鼠尾酮B（分离过程在线检测图见图5）。

浓缩冻干后测定纯度，纯度分别为二氢丹参酮Ⅰ100%；隐丹参酮98.7%；丹参酮Ⅰ96.3%；1,2-二氢丹参醌100%；丹参酮ⅡA100%；三叶鼠尾酮B84.5%；甲基丹参酮酯82.7%；丹参新醌A92.3%(见图6)。

Claims

1.一种制备高纯度丹参酮化合物的三柱循环分离系统，其特征在于包括三个逆流色谱柱（A1、B1、C1），三个泵（1、2、3），三个检测器（4、5、6），三个收集器（7、8、9）和四个六通阀（10、11、12、13）；其中第一六通阀（10）做进样阀，该进样阀与第二六通阀（11）的第Ⅰ节点以及第一盛装流动相容器（14）相连；第二六通阀（11）的第Ⅱ节点与第一泵（1）的输入端相连，第一泵（1）的输出端与第一逆流色谱柱（A）的首端相连，第一逆流色谱柱（A）的尾端与第一检测器（4）的输入端相连，第一检测器（4）的输出端与第三六通阀（12）的第Ⅰ节点相连，第三六通阀（12）的第Ⅱ节点与第一收集器（7）相连；第三六通阀（12）的第Ⅴ节点与第二盛装流动相的容器（15）相连，第三六通阀（12）的第VI节点与第二泵（2）的输入端相连，第二泵（2）的输出端与第二逆流色谱柱（B）的首端相连，第二逆流色谱柱（B）的尾端与第二检测器（5）的输入端相连，第二检测器（5）的输出端与第四六通阀（13）的第Ⅰ节点相连，第四六通阀（13）的第Ⅱ节点与第二收集器（8）相连；第四六通阀（13）的第Ⅴ节点与第三盛装流动相容器（16）相连，第四六通阀（13）的第VI节点与第三泵（3）的输入端相连，第三泵（3）的输出端与第三逆流色谱柱（C）的首端相连，第三逆流色谱柱（C）的尾端与第三检测器（6）的输入端相连，第三检测器（6）的输出端与第二六通阀（11）的第Ⅲ节点相连，第二六通阀（11）的第Ⅳ节点与第三收集器（9）相连。

2.利用权利要求1所述的三柱循环分离系统制备高纯度丹参酮化合物的方法，该丹参酮类化合物包括结构式(1)二氢丹参酮Ⅰ、结构式(2)隐丹参酮、结构式(3)丹参酮Ⅰ、结构式（4）1,2-二氢丹参醌、结构式（5）丹参酮ⅡA、结构式（6）三叶鼠尾酮B、结构式（7）甲基丹参酮酯和结构式（8）丹参新醌A，

其制备包括以下步骤：

（3）配制四元溶剂体系：将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按体积百分比分别为68.70%、24.91%、3.64%和2.75%配制的四元溶剂体系作为上相，按体积百分比分别为2.53%、24.77%、49.04%和23.66%配制的四元溶剂体系作为下相，将配制好的上下相分别加入到三个逆流色谱柱（A1、B1、C1）中，加入到每个逆流色谱柱中上相的量为其柱体积的60%，下相的量为其柱体积的40%，其中上相做固定相，下相做流动相；

（4）将步骤（2）制得的丹参酮提取物首先经过第一逆流色谱柱（A1）分离，得到前后洗脱顺序依次为丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参醌、丹参酮ⅡA的洗脱液；

（5）观察第一检测器（4），当含有丹参新醌A以及二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参醌和丹参酮ⅡA的洗脱液从第一逆流色谱柱（A1）开始被洗出后，调节第三六通阀（12）将第一逆流色谱柱（A1）尾端与第二逆流色谱柱（B1）首端连接，调节第四六通阀（13）将第二逆流色谱柱（B1）尾端与第三逆流色谱柱（C1）首端连接，调节第二六通阀（11）将第三逆流色谱柱（C1）尾端与第一逆流色谱柱（A1）首端连接，使第一、第二和第三逆流色谱柱（A1、B1、C1）组成三柱循环分离体系，在线直接将洗脱液转入第二逆流色谱柱B1；观察第一检测器（4），当含有1,2-二氢丹参醌、丹参酮ⅡA的洗脱液开始从第一逆流色谱柱（A1）被洗出后，调节第三六通阀（12）将第一逆流色谱柱（A1）与第二逆流色谱柱（B1）断开，第一收集器（7）收集1,2-二氢丹参醌和丹参酮ⅡA洗脱液；

（6）观察第二检测器（5），当含丹参新醌A以及二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的洗脱液从第二逆流色谱柱（B1）洗出后，通过第四六通阀（13）进入第三逆流色谱柱（C1），当含有丹参酮Ⅰ洗脱液从第二逆流色谱柱（B1）开始被洗出后，调节第四六通阀（13）将第二逆流色谱柱（B1）与第三逆流色谱柱（C1）断开，第二收集器（8）收集丹参酮Ⅰ洗脱液；

（7）观察第三检测器（6），当含丹参新醌A以及二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B、甲基丹参酮酯和隐丹参酮的洗脱液从第三逆流色谱柱（C1）洗出后，通过第二六通阀（11）进入第一逆流色谱柱（A1），当含有甲基丹参酮酯和隐丹参酮以及丹参酮Ⅰ洗脱液从第三逆流色谱柱（C1）开始被洗出后，调节第二六通阀（11）将第三逆流色谱柱（C1）与第一逆流色谱柱（A1）断开，第三收集器（9）收集甲基丹参酮酯和隐丹参酮以及丹参酮Ⅰ洗脱液；

（8）观察第一检测器（4），当含丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第一逆流色谱柱（A1）洗出后，通过第三六通阀（12）进入第二逆流色谱柱（B1），当含有三叶鼠尾酮B的洗脱液从第一逆流色谱（A1）开始洗出后，调节第三六通阀（12）将第一逆流色谱柱（A1）与第二逆流色谱柱（B1）断开，第一收集器（7）收集三叶鼠尾酮B洗脱液；

（9）观察第二检测器（5），当含丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第二逆流色谱柱（B1）开始洗出后，调节第四六通阀（13）将第二逆流色谱柱（B1）与第三逆流色谱柱（C1）断开，第二收集器（8）收集丹参新醌A、二氢丹参酮Ⅰ洗脱液。