CN105294802B - 一种灵芝萜烯酮醇的制备方法 - Google Patents
一种灵芝萜烯酮醇的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种灵芝萜烯酮醇的制备方法，该方法包括步骤；(1)提取和富集灵芝萜烯酮醇：将灵芝子实体加入乙醇溶液加热提取，提取液浓缩；浓缩液经大孔树脂乙醇梯度洗脱吸附后，进行减压浓缩，再过柱层析获得富含灵芝萜烯酮醇的组分；(2)高速逆流色谱法分离灵芝萜烯酮醇：用高速逆流色谱仪进行灵芝萜烯酮醇分离；然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝萜烯酮醇。本发明的一种灵芝萜烯酮醇的制备方法操作简单，污染小，成本低，灵芝萜烯酮醇的得率、纯度高。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，具体的说涉及一种灵芝萜烯酮醇的制备方法。
背景技术
灵芝萜烯酮醇为三萜类化合物，CAS号104700-97-2，分子式C30H46O2，分子量438.685，分子结构式如下：
灵芝三萜是灵芝的次级代谢产物，具有多种药理活性。文献报道，灵芝萜烯酮醇在体外细胞实验中都具有良好的抗肿瘤、美白、消炎、防止紫外伤害的作用。
通过文献检索，目前还没有发现灵芝萜烯酮醇的规模化制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵芝萜烯酮醇的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)提取和富集灵芝萜烯酮醇：将灵芝子实体加入乙醇溶液加热提取，收集提取液并浓缩；浓缩的提取液经大孔树脂乙醇梯度洗脱后，洗脱液进行减压浓缩，再经硅胶柱层析获得富含灵芝萜烯酮醇的组分；
(2)高速逆流色谱法分离灵芝萜烯酮醇：用高速逆流色谱仪进行灵芝萜烯酮醇分离；然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝萜烯酮醇。
具体的说，本发明的一种灵芝萜烯酮醇的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取和富集灵芝萜烯酮醇：将灵芝子实体加入5-10倍体积的75-95％乙醇水溶液加热至50-70℃提取，每次1-3小时，重复2-3次；收集每次的提取液并将提取液加热减压浓缩，浓缩液经D101大孔树脂用50％、60％、70％、80％、90％、95％乙醇依次梯度洗脱，每个梯度用3-5倍体积的溶液洗脱；得到的洗脱液分别减压浓缩，然后合并95％和90％洗脱组分，过正相硅胶柱层析(100-200目)，氯仿与甲醇(氯仿：甲醇＝100:0-7:3(体积比))梯度洗脱，每份收集1000ml，共收集92个流份；根据薄层层析(TLC)检测结果合并相似流份，其中46-52流份(氯仿：甲醇＝98:2洗脱)中富含灵芝萜烯酮醇；
(2)高速逆流色谱法分灵芝萜烯酮醇：溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，按10-14：22-26：16-22：7-11体积比混合，取上相做固定相，下相为流动相，将富含灵芝萜烯酮醇的流份(46-52流份)用下相溶解并进样，转速700-1000rmp，流速为1-3ml/min，每4～10mL收集为一个馏分；然后用高效液相色谱法分析检测各试管收集液成分，按不同成分收集、浓缩、干燥，并与灵芝萜烯酮醇标准品作对比，确定分离得到灵芝萜烯酮醇。
高速逆流色谱是一种无固相载体的连续液-液分配色谱技术，与传统的色谱技术相比具有很多优势，利用该色谱技术来制备灵芝三萜化合物，不需固态支持物作载体，不存在不可逆吸附，灵芝三萜的分离效率高、回收率高、分离时间短，此外，在制备过程中，样品分解率较低；溶剂流失也较少，是一种经济实用获得灵芝三萜化合物的方法。
采用本发明的方法制备灵芝萜烯酮醇，成本低，污染小，操作简单，且灵芝萜烯酮醇的得率、纯度高。
附图说明：
图1为实施例1的高速逆流分离谱图
图2为实施例1中获得的灵芝萜烯酮醇的高效液相谱图
图3为实施例2的高速逆流分离谱图
图4为实施例2中获得的灵芝萜烯酮醇的高效液相谱图
具体实施方式
供试子实体：沪农灵芝1号Ganoderma lucidum,由上海市农业科学院食用菌研究所提供。
灵芝萜烯酮醇标准品购自国家标准物质标准样品信息中心。
D-101大孔树脂，净品级，天津海光化工有限公司。
正相硅胶(100-200目)，青岛海洋化工厂。
薄层层析(TLC)板(HSGF254)：烟台汇友硅胶开发有限公司。
其余试剂为普通市售产品。
中试提取设备：2000L提取罐，江苏天宇机械有限公司。
20L旋转蒸发仪：BC-R2001，上海贝凯生物化工设备有限公司；配用SHB-B95型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。
高速逆流色谱仪购自上海同田生物技术股份有限公司，仪器型号为：TBE-300B。
高效液相色谱仪为Waters公司产品，仪器型号为2695-717-600E。
实施例1：
将50kg灵芝子实体切片，投料进入中试提取设备中，加入8倍体积的87％乙醇水溶液提取2次，第一次2h，第二次1h。提取温度均为65℃。将两次的提取液合并，在蒸煮罐中加热蒸煮浓缩后再用20L旋蒸仪减压加热浓缩，获得灵芝子实体提取物。
将灵芝子实体提取物过大孔树脂D101，用50％、60％、70％、80％、90％、95％乙醇依次梯度洗脱，洗脱液分别减压浓缩，然后合并95％和90％洗脱组分(共194g)，过正相硅胶柱层析(100-200目，2200g)，氯仿：甲醇(100:0-7:3)梯度洗脱，每份收集1000ml，共收集92个流份。根据薄层层析(TLC)检测结果合并相似流份，其中46-52流份(氯仿：甲醇＝98:2洗脱)中富含灵芝萜烯酮醇。
取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，按12：24：18：9的体积比混合，充分分层后，取上相做固定相，注满高速逆流色谱管后，开转主机，转速900rpm，同时泵入下相做流动相，流速为2ml/min，用流动相溶解样品500mg，待出口处流出流动相且系统稳定后，由进样阀进样，紫外检测器在线监测，每8ml收集为一个馏分。HPLC分析检测分离情况，并与灵芝萜烯酮醇标准品作对比，确定收集合并灵芝萜烯酮醇的馏分，浓缩干燥，用高效液相面积归一化法测得纯度为90.9％的灵芝萜烯酮醇52.1mg。
实施例2：
将50kg灵芝子实体切片，投料进入中试提取设备中，加入8倍体积的87％乙醇水溶液提取2次，第一次2h，第二次1h。提取温度均为65℃。将两次的提取液合并，在蒸煮罐中加热蒸煮浓缩后再用20L旋蒸仪减压加热浓缩，获得灵芝子实体提取物。
将灵芝子实体提取物过大孔树脂D101，用50％、60％、70％、80％、90％、95％乙醇依次梯度洗脱，洗脱液分别减压浓缩，然后合并95％和90％洗脱组分(194g)，过正相硅胶柱层析(100-200目，2200g)，氯仿：甲醇(100:0-7:3)梯度洗脱，每份收集1000ml，共收集92个流份。根据薄层层析(TLC)检测结果合并相似流份，其中46-52流份(氯仿：甲醇＝98:2洗脱)中富含灵芝萜烯酮醇。
取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，按12：24：20：9的体积比混合，充分分层后，取上相做固定相，注满高速逆流色谱管后，开转主机，转速900rpm，同时泵入下相做流动相，流速为2ml/min，用流动相溶解样品200mg，待出口处流出流动相且系统稳定后，由进样阀进样，紫外检测器在线监测，每8ml收集为一个馏分。HPLC分析检测分离情况，并与灵芝萜烯酮醇标准品作对比，确定收集合并灵芝萜烯酮醇的馏分，浓缩干燥，用高效液相面积归一化法测得纯度为92.1％的灵芝萜烯酮醇17.5mg。
Claims (1)
1.一种灵芝萜烯酮醇的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)提取和富集灵芝萜烯酮醇：将灵芝子实体加入5-10倍75-95％乙醇溶液加热50-70℃提取，每次1-3小时，重复2-3次，将提取液加热减压浓缩，浓缩液经过D101大孔树脂用50％、60％、70％、80％、90％、95％乙醇依次梯度洗脱，每个梯度用3-5倍溶液体积洗脱，将洗脱液分别减压浓缩，然后将95％和90％洗脱组分合并，过正相硅胶柱层析100-200目，氯仿与甲醇梯度洗脱，每份收集1000ml，共收集92个流份，根据薄层层析检测结果合并相似流份，其中46-52流份中富含灵芝萜烯酮醇；
(2)高速逆流色谱法分离灵芝萜烯酮醇：溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，按10-14：22-26：16-22：7-11体积比混合，取上相做固定相，下相为流动相，将富含灵芝萜烯酮醇的流份，46-52流份，用下相溶解并进样，转速700-1000rmp，流速为1-3ml/min，每4～10mL收集为一个馏分；然后用高效液相色谱法分析检测各试管收集液成分，按不同成分收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝萜烯酮醇。
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