CN104829656B - 一种从麻花艽中制备龙胆苦苷化学对照品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从麻花艽中制备龙胆苦苷化学对照品的方法，该方法包括以下步骤：⑴95%乙醇溶液提取：麻花艽全草阴干、粉碎后进行醇提、过滤、干燥至膏状，即得麻花艽醇提物；⑵树脂柱富集：将麻花艽醇提物用甲醇溶液溶解后经树脂柱分离，先以水溶液洗脱去除大极性杂质，然后用30%的甲醇溶液、50%甲醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%洗脱物，该50%洗脱物经减压干燥即得麻花艽粗品；⑶反相液相制备色谱精制：麻花艽粗品用甲醇溶液溶解后，经过滤、反相液相制备色谱分离，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于98%的白色粉末状的对照品。本发明分离时间短、分离效果好、产品纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种龙胆苦苷（Gentiopicroside）化学对照品的制备方法，尤其涉及一种从麻花艽中制备龙胆苦苷化学对照品的方法。
背景技术
麻花艽（Gentiana straminea Maxim.）系属龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gentiana (Tourn.) L）草本植物，麻花艽具有散风祛湿、清热利胆及舒筋止痛等功效。龙胆苦苷是麻花艽全草中含量约为8%的环烯醚萜苷类化合物，2010版中国药典已将龙胆苦苷作为麻花艽的质控指标成分之一，并规定龙胆苦苷与马钱苷酸总量在麻花艽药材中的含量应达2.5%以上。
目前龙胆苦苷的提取方法主要采用如下步骤：药材提取-柱层析富集-结晶。不同提取分离过程的区别在于提取所用方法及柱层析所用分离材料不同。刘东锋等（中国专利CN101704865A）采用超临界流体提取，大孔树脂分离，结晶的方法获得纯度约98%的龙胆苦苷标准品；朱吉满等（中国专利103848875A）采用水提取、大孔树脂，硅胶柱分离，结晶的方法获得纯度99%的龙胆苦苷及马钱酸的混合物；段文录等（中国专利CN 102675386A）采用硅胶柱选择性的收集馏分得到纯度98%以上的龙胆苦苷化合物。
以上方法均在不同程度上应用了硅胶柱层析及结晶的方法，虽然能获得纯度较高的龙胆苦苷纯品，但是分离过程中损失非常大；同时缺少高效的柱分离方法及相应检测方法，不能稳定、高效地获得纯度98%以上的龙胆苦苷化学对照品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种分离时间短、分离效果好、产品纯度高的从麻花艽中制备龙胆苦苷化学对照品的方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种从麻花艽中制备龙胆苦苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴95%乙醇溶液提取：
麻花艽全草阴干、粉碎后加入其质量4~10倍的体积浓度为80~95%的乙醇溶液，在60~95℃下提取1~3次，每次1~3 h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得麻花艽醇提物；
⑵树脂柱富集：
将所述麻花艽醇提物用体积分数5~30%的甲醇溶液溶解后经MCI或HP20SS树脂柱分离，先以2~5倍柱体积的水溶液洗脱去除大极性杂质，然后用2~5倍柱体积且体积分数30%的甲醇溶液、50%甲醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%洗脱物，该50%洗脱物经减压干燥即得麻花艽粗品；
⑶反相液相制备色谱精制：
所述麻花艽粗品用其质量5~10倍的体积分数为40~80%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为30~100 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经反相液相制备色谱分离，经检测波长为285 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于98%的白色粉末状的对照品。
所述步骤⑴、所述步骤⑵和所述步骤⑶中减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~70 ℃。
所述步骤⑶中反相液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20~50 mm，反相液相制备柱固定相为10 μm Megress C18，流动相为体积分数40%~50%的甲醇-水溶液，进样体积为2~10mL，流速为20~60 mL/min。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明工艺简单、回收率高。
第一步醇提取，龙胆苦苷属醇溶性化合物，采用95%的乙醇热回流提取；提取充分；第二步采用树脂柱富集，可获取高含量的龙胆苦苷粗品（参见图1），同时树脂具有脱色的功效。第三步采用反相高效液相制备，可获取高纯度对照品，且回收率高（90%）（参见图2）。
2、本发明采用的技术手段非常适宜放大进行规模化生产。
原料要求不高，麻花艽全草，易于批量备料；第一步醇提取，简单、易行；第二步采用树脂柱富集，树脂柱可以再生循环使用，易于规模化；第三步精制中采用反相高效液相制备，为快速的等度方法，也非常适宜放大规模生产。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明经树脂柱富集后龙胆苦苷的HPLC分析图谱（285 nm）。
图2为本发明高纯度龙胆苦苷的HPLC分析图谱（285 nm）。
具体实施方式
实施例1 一种从麻花艽中制备龙胆苦苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴95%乙醇溶液提取：
1 Kg麻花艽全草阴干、粉碎后加入其质量10倍的体积浓度为95%的乙醇溶液，在60℃下提取1次，每次3 h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得麻花艽醇提物。
其中：减压干燥的条件是指真空度为0.09 MPa，温度为50 ℃。
⑵树脂柱富集：
将麻花艽醇提物用体积分数30%的甲醇溶液溶解后经MCI树脂柱分离，先以2倍柱体积的水溶液洗脱去除大极性杂质，然后用2倍柱体积且体积分数30%的甲醇溶液、50%甲醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%洗脱物，该50%洗脱物经减压干燥即得麻花艽粗品114.3g。
其中：减压干燥的条件是指真空度为0.09 MPa，温度为50 ℃。
⑶反相液相制备色谱精制：
麻花艽粗品用其质量10倍的体积分数为40%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为30 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经反相液相制备色谱分离，经检测波长为285 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于98%的白色粉末状的对照品98.3 g。
其中：减压干燥的条件是指真空度为0.09 MPa，温度为50 ℃。
反相液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20 mm，反相液相制备柱固定相为10 μm Megress C18，流动相为体积分数40%的甲醇-水溶液，进样体积为2mL，流速为20 mL/min。
实施例2 一种从麻花艽中制备龙胆苦苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴95%乙醇溶液提取：
0.5 Kg麻花艽全草阴干、粉碎后加入其质量4倍的体积浓度为90%的乙醇溶液，在95℃下提取3次，每次1 h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得麻花艽醇提物。
其中：减压干燥的条件是指真空度为0.06 MPa，温度为70 ℃。
⑵树脂柱富集：
将麻花艽醇提物用体积分数5%的甲醇溶液溶解后经HP20SS树脂柱分离，先以5倍柱体积的水溶液洗脱去除大极性杂质，然后用5倍柱体积且体积分数30%的甲醇溶液、50%甲醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%洗脱物，该50%洗脱物经减压干燥即得麻花艽粗品56.9g。
其中：减压干燥的条件是指真空度为0.06 MPa，温度为70 ℃。
⑶反相液相制备色谱精制：
麻花艽粗品用其质量5倍的体积分数为80%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为100 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经反相液相制备色谱分离，经检测波长为285 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于98%的白色粉末状的对照品52.3 g。
其中：减压干燥的条件是指真空度为0.06 MPa，温度为70 ℃。
反相液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径30 mm，反相液相制备柱固定相为10 μm Megress C18，流动相为体积分数50%的甲醇-水溶液，进样体积为4mL，流速为40 mL/min。
实施例3 一种从麻花艽中制备龙胆苦苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴95%乙醇溶液提取：
2.5 Kg麻花艽全草阴干、粉碎后加入其质量8倍的体积浓度为80%的乙醇溶液，在75℃下提取2次，每次2h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得麻花艽醇提物。
其中：减压干燥的条件是指真空度为0.08 MPa，温度为60 ℃。
⑵树脂柱富集：
将麻花艽醇提物用体积分数10%的甲醇溶液溶解后经MCI树脂柱分离，先以3倍柱体积的水溶液洗脱去除大极性杂质，然后用3倍柱体积且体积分数30%的甲醇溶液、50%甲醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%洗脱物，该50%洗脱物经减压干燥即得麻花艽粗品284.5g。
其中：减压干燥的条件是指真空度为0.08 MPa，温度为60 ℃。
⑶反相液相制备色谱精制：
麻花艽粗品用其质量8倍的体积分数为60%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为55mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经反相液相制备色谱分离，经检测波长为285 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于98%的白色粉末状的对照品259.5 g。
其中：减压干燥的条件是指真空度为0.08 MPa，温度为60 ℃。
反相液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径50 mm，反相液相制备柱固定相为10 μm Megress C18，流动相为体积分数45%的甲醇-水溶液，进样体积为10mL，流速为60 mL/min。
Claims (1)
1.一种从麻花艽中制备龙胆苦苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴95%乙醇溶液提取：
麻花艽全草阴干、粉碎后加入其质量4~10倍的体积浓度为80~95%的乙醇溶液，在60~95℃下提取1~3次，每次1~3 h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得麻花艽醇提物；所述减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~70 ℃；
⑵树脂柱富集：
将所述麻花艽醇提物用体积分数5~30%的甲醇溶液溶解后经MCI或HP20SS树脂柱分离，先以2~5倍柱体积的水溶液洗脱去除大极性杂质，然后用2~5倍柱体积且体积分数30%的甲醇溶液、50%甲醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%洗脱物，该50%洗脱物经减压干燥即得麻花艽粗品；所述减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~70 ℃；
⑶反相液相制备色谱精制：
所述麻花艽粗品用其质量5~10倍的体积分数为40~80%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为30~100 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经反相液相制备色谱分离，经检测波长为285 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于98%的白色粉末状的对照品；所述减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~70 ℃；所述反相液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20~50 mm，反相液相制备柱固定相为10 μm Megress C18，流动相为体积分数40%~50%的甲醇-水溶液，进样体积为2~10mL，流速为20~60 mL/min。
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