CN108101923B - 一种光甘草定单体的分离提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以甘草为原料利用超临界CO2萃取技术提取制备粗产物并利用动态轴向压缩工业色谱从甘草超临界提取物中分离纯化光甘草定单体的方法。本发明对光甘草定进行提取、富集、分离、纯化，通过高效液相色谱法检测，其纯度在90％以上。本发明方法有效地避免了传统制备单体化合物过程中有机溶剂用量大，制备过程繁杂，生产周期长，制备单体纯度低及难以工业化推广等不足，是一种操作简单，制备效率高，生产周期短，产品质量可控且适用于工业化的分离提纯方法。
Description
技术领域
本发明涉及中药活性成分提取富集分离技术领域，特别涉及一种从甘草超临界CO2提取物中分离提纯光甘草定单体的方法。
背景技术
甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)为一种豆科甘草属多年生草本植物，主要分布在我国西部地区，目前主要应用于食品、医药、保健、化妆品等领域。本发明中使用的甘草采自新疆。甘草的主要有效成分为甘草酸等三萜类化合物、光甘草定等黄酮类化合物及甘草多糖等。光甘草定是光果甘草中异黄酮类成分之一，占甘草总黄酮类成分的11％，在光果甘草中含量约为0.1％-0.3％，研究显示，光甘草定具有多种药理活性，如抑菌、抗炎、抗氧化、雌激素样活性、抗动脉粥样硬化等。此外，光甘草定抑制酪氨酸酶活性作用显著，且对黑色素细胞毒性较低，是世上公认的安全的美白剂，用于美白和淡斑。目前关于甘草的提取研究多关注于甘草酸和甘草总黄酮的提取，对于甘草中光甘草定的分析、提取研究较少，也没有文献具体研究其相关的大规模的分离提纯方法，且由于其含量少，导致其提取纯化过程复杂且效率低，加上目前国内外对其含量检测只停留在昂贵、费时的高效液相色谱法上，所以该产品价格非常昂贵。因而开发一种简单、快速可提取、富集、分离、纯化高纯度光甘草定的方法是当前研究的重点。
相比于有机溶剂提取，超临界CO2萃取技术具有收率高、提取时间短、无残留溶剂、避免使用有机溶剂、绿色安全等优点。并且，有机溶剂萃取法、重结晶法、升华法、沉淀法和色谱法等传统分离纯化方法和技术，均存在有机溶剂用量大，制备过程繁琐，生产周期长，制备单体纯度不高及难以工业化推广等不足。动态轴向压缩工业色谱制备单体活性成分具有操作简单、制备单体纯度高、有机溶剂用量少等优点，所以采用超临界萃CO2萃取技术与动态轴向压缩工业色谱制备结合可以克服现有技术提取分离光甘草定单体的不足。
发明内容
为了解决光甘草定单体的分离提取方法中有机溶剂用量大，制备过程繁琐，生产周期长，制备单体纯度不高及难以工业化推广等不足，本发明提供了一种利用超临界CO2萃取技术提取制备粗产物并利用动态轴向压缩工业色谱分离光甘草定单体的方法。
本发明的目的将通过以下技术方案实现：一种光甘草定单体的分离提纯方法，包括以下步骤：
步骤一，超临界CO2萃取物的制备：将甘草装入超临界CO2萃取设备的萃取釜中，对萃取设备分别进行升温、升压至萃取条件，开始循环萃取，保持恒温恒压至萃取时间，萃取过程中以超临界CO2为萃取剂，乙醇为夹带剂进行萃取，萃取完成后从分离釜I和分离釜II中放料并称重，得到甘草萃取物；
步骤二，样品液制备：取甘草萃取物，加入有机溶剂将其溶解并配制成一定浓度样品液，将样品液过0.45μm滤膜，备用；
步骤三，动态轴向压缩工业色谱分离纯化：将步骤二中制备好的样品液，按一定进样量注入动态轴向压缩工业色谱中，有机溶剂洗脱，控制洗脱流速，用紫外在线检测器检测样品分离情况，根据光甘草定出峰时间及色谱峰的高度，确定所制光甘草定单体的洗脱液收集起止时间，并将洗脱液减压浓缩，真空干燥，得到光甘草定单体。
优选的，所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，所述步骤一中，萃取釜的温度为40～65℃，萃取压力为30～65MPa，萃取时间为0.5～3.0h。
优选的，所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，所述步骤一中，分离釜I的温度为40～65℃，压力为6～18MPa。
优选的，所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，所述步骤一中，分离釜II的温度为45～55℃，压力为4.5～8MPa。
优选的，所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，所述步骤二中，有机溶剂为甲醇、乙腈或50～100％乙醇。
优选的，所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，所述步骤三中，动态轴向压缩工业色谱的色谱填料为C18-100AA、UniQ-50、UniSi10-300、NM100、UniPSA30-300中的一种或几种。
优选的，所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，所述步骤三中，紫外在线检测器的检测波长为283nm。
优选的，所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，所述步骤三中，样品液的进样量为1～10mL。
优选的，所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，所述步骤三中，有机溶剂为乙醇，甲醇或乙腈，有机溶剂洗脱流速为2～10mL/min。
优选的，所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，所述步骤三中，洗脱剂中水与有机溶剂的体积比(V/V)为0:100～80:20。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明利用超临界CO2萃取技术提取到甘草粗产品，并且将超临界CO2提取样品直接通过动态轴向压缩工业色谱分离纯化，得到了纯度90％以上的光甘草定单体。本发明提供的分离提纯方法具有重复性好、稳定性好、操作简单、制备时间短，并且可以大批量工业化生产。
本发明利用超临界CO2萃取技术提取到甘草粗产品，该方法操作简单、绿色安全，克服了传统工艺中污染重、产品纯度低等缺点，处理量大同时避免了高温对有效成分的影响，适合大规模生产。并且，本发明利用动态轴向压缩工业色谱提纯光甘草定单体，其操作简单、有机溶剂用量少、光甘草定单体纯度高等，是目前从多组分复杂体系中分离纯化光甘草定单体最有效的方法之一。
附图说明
附图1为本发明工艺流程；
附图2为甘草萃取物的动态轴向压缩工业色谱图；
附图3为所制备的光甘草定单体液相色谱分析图谱。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
实施例1
一种光甘草定单体的分离提纯方法，包括以下步骤：
(1)超临界CO2萃取物的制备：将甘草装入超临界CO2萃取设备的萃取釜中，对萃取釜、分离釜I、分离釜II分别进行加热，并对冷机制冷，当萃取釜、分离釜I、分离釜II分别升温至40℃，40℃和45℃，通过高压泵对萃取釜、分离釜I、分离釜II进行升压，当萃取釜、分离釜I、分离釜II压力分别升压至30MPa，6MPa，4.5MPa时开始循环萃取，保持恒温恒压，萃取0.5h，萃取过程中以超临界的CO2为萃取剂，乙醇为夹带剂进行萃取，萃取完成后从分离釜I和分离釜II放料并称重，得到甘草萃取物。
(2)样品液制备：取甘草萃取物，加入甲醇将其溶解并配制成50mg/mL浓度样品液，将样品液过0.45μm滤膜，备用。
(3)动态轴向压缩工业色谱分离纯化：将上述(2)中制备好的样品液，按2mL进样量注入动态轴向压缩工业色谱中，以NM100为填料，乙醇-水(体积比20：80)为洗脱剂，2mL/min流速，紫外在线监测器在检测波长为283nm下检测样品分离情况，根据光甘草定成分出峰时间及色谱峰的高度，确定所制光甘草定单体的洗脱液收集起止时间，并将光甘草定洗脱液在60℃减压浓缩至干，回收有机溶剂后40℃真空干燥12h，得到光甘草定单体化学成分，纯度大于90％。
实施例2
一种光甘草定单体的分离提纯方法，包括以下步骤：
(1)超临界CO2萃取物的制备：将甘草装入超临界CO2萃取设备的萃取釜中，对萃取釜、分离釜I、分离釜II分别进行加热，并对冷机制冷，当萃取釜、分离釜I、分离釜II分别升温至60℃，45℃和50℃，通过高压泵对萃取釜、分离釜I、分离釜II进行升压，当萃取釜、分离釜I、分离釜II压力分别升压至40MPa，8MPa，5MPa时开始循环萃取，保持恒温恒压，萃取2h，萃取过程中以超临界的CO2为萃取剂，乙醇为夹带剂进行萃取，萃取完成后从分离釜I和分离釜II放料并称重，得到甘草萃取物。
(2)样品液制备：取甘草萃取物，加入甲醇将其溶解并配制成100mg/mL浓度样品液，将样品液过0.45μm滤膜，备用。
(3)动态轴向压缩工业色谱分离纯化：将上述(2)中制备好的样品液，按5mL进样量注入动态轴向压缩工业色谱中，以C18-100AA为填料，无水乙醇为洗脱剂，5mL/min流速，紫外在线监测器在紫外检测波长为283nm下检测样品分离情况，根据光甘草定成分出峰时间及色谱峰的高度，确定所制光甘草定单体的洗脱液收集起止时间，并将每一种光甘草定洗脱液在60℃减压浓缩至干，回收有机溶剂后40℃真空干燥12h，得到光甘草定单体化学成分，纯度大于95％。
实施例3
一种光甘草定单体的分离提纯方法，包括以下步骤：
(1)超临界CO2萃取物的制备：将甘草装入超临界CO2萃取设备的萃取釜中，对萃取釜、分离釜I、分离釜II分别进行加热，并对冷机制冷，当萃取釜、分离釜I、分离釜II分别升温至55℃，50℃和50℃，通过高压泵对萃取釜、分离釜I、分离釜II进行升压，当萃取釜、分离釜I、分离釜II压力分别升压至30MPa，10MPa，8MPa时开始循环萃取，保持恒温恒压，萃取3h，萃取过程中以超临界的CO2为萃取剂，乙醇为夹带剂进行萃取，萃取完成后从分离釜I和分离釜II放料并称重，得到甘草萃取物。
(2)样品液制备：取甘草萃取物，加入甲醇将其溶解并配制成200mg/mL浓度样品液，将样品液过0.45μm滤膜，备用。
(3)动态轴向压缩工业色谱分离纯化：将上述(2)中制备好的样品液，按10mL进样量注入动态轴向压缩工业色谱中，以UniPSA30-300为填料，乙腈-水(体积比45:55)为洗脱剂，10mL/min流速，紫外在线检测器在检测波长为283nm下检测样品分离情况，根据光甘草定成分出峰时间及色谱峰的高度，确定所制光甘草定单体的洗脱液收集起止时间，并将光甘草定洗脱液在60℃减压浓缩至干，回收有机溶剂后40℃真空干燥12h，得到光甘草定单体化学成分，纯度大于90％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种光甘草定单体的分离提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，超临界CO2萃取物的制备：将甘草装入超临界CO2萃取设备的萃取釜中，对萃取设备分别进行升温、升压至萃取条件，开始循环萃取，保持恒温恒压至萃取时间，萃取过程中以超临界CO2为萃取剂，乙醇为夹带剂进行萃取，萃取完成后从分离釜I和分离釜II中放料并称重，得到甘草萃取物；
步骤二，样品液制备：取甘草萃取物，加入有机溶剂将其溶解并配制成一定浓度样品液，将样品液过0.45μm滤膜，备用；
步骤三，动态轴向压缩工业色谱分离纯化：将步骤二中制备好的样品液，按一定进样量注入动态轴向压缩工业色谱中，有机溶剂洗脱，控制洗脱流速，用紫外在线检测器检测样品分离情况，根据光甘草定出峰时间及色谱峰的高度，确定所制光甘草定单体的洗脱液收集起止时间，并将洗脱液减压浓缩，真空干燥，得到光甘草定单体；
所述步骤三中，动态轴向压缩工业色谱的色谱填料为C18-100AA、UniQ-50、UniSi10-300、NM100、UniPSA30-300中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤一中，萃取釜的温度为40～65℃，萃取压力为30～65MPa，萃取时间为0.5～3.0h。
3.根据权利要求1所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤一中，分离釜I的温度为40～65℃，压力为6～18MPa。
4.根据权利要求1所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤一中，分离釜II的温度为45～55℃，压力为4.5～8MPa。
5.根据权利要求1所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤二中，有机溶剂为甲醇、乙腈或50～100％乙醇。
6.根据权利要求1所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤三中，紫外在线检测器的检测波长为283nm。
7.根据权利要求1所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤三中，样品液的进样量为1～10mL。
8.根据权利要求1所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤三中，有机溶剂为乙醇，甲醇或乙腈，有机溶剂洗脱流速为2～10mL/min。
9.根据权利要求1所述的一种光甘草定单体的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤三中，洗脱剂中水与有机溶剂的体积比为0:100～80:20。
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