CN110015959B - 一种从桑叶中高效分离纯化咖啡酰基奎宁酸异构体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然产物的分离纯化领域，提供了一种从桑叶中高效分离纯化咖啡酰基奎宁酸异构体的方法。本发明将桑叶进行超声强化提取后，采用独创性的pH诱导液液萃取技术、大孔吸附树脂富集技术以及高速逆流色谱快速分离技术进行分离纯化，得到纯度达93％以上的三种咖啡酰基奎宁酸异构体。本发明通过pH诱导液液萃取使咖啡酰基奎宁酸快速进入有机相，减少萃取次数，从而节约时间，减少化学试剂的消耗，降低工业成本；并且本发明首次实现了使用高速逆流色谱快速分离技术从桑叶中分离咖啡酰基奎宁酸异构体，该方法步骤简单、溶剂消耗少、分离周期短、产物纯度高、收率高，适用于产业化生产和应用。

Description

一种从桑叶中高效分离纯化咖啡酰基奎宁酸异构体的方法

技术领域

本发明涉及天然产物的分离纯化技术领域，特别涉及一种从桑叶中高效分离纯化咖啡酰基奎宁酸异构体的方法。

背景技术

桑叶(英文名：Mulberry Leaf，药材名：Folium Mori)为桑科植物桑的干燥叶片。在我国桑叶被广泛用来作为家蚕的饲料，也是传统的大宗中药材和药食同源植物，具有多种药理活性。据《中国药典-2015版一部》记载，桑叶性味甘、苦，寒，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效，常被用于风热感冒及目赤肿痛、肺热燥咳、风火目疾等疾病的治疗。现代医学用药经验表明，桑叶具有多种药理活性，主要包括降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤及抗病毒等，而这些药理活性与现代多种疾病的治疗密相关，如高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖症等慢性疾病。植物化学研究表明，桑叶中含有丰富的生物活性成分，主要包括黄酮、生物碱、多糖和咖啡酰基奎宁酸等，其中黄酮类成分含量为3.7～9.8mg/g，咖啡酰基奎宁酸的含量为6.8～8.5mg/g。

桑叶中含有丰富的咖啡酰基奎宁酸类成分，主要包括绿原酸(5-咖啡酰基奎宁酸)及新绿原酸(3-咖啡酰基奎宁酸)、隐绿原酸(4-咖啡酰基奎宁酸)等成分，研究表明桑叶中咖啡酰基奎宁酸部位(奎尼酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸等)具有较强的抗RSV活性。

硅胶柱色谱及液-液萃取方式是分离天然产物的传统方法，但是这两种方法存在样品不可逆性吸附、分离时间长、收益低、成本高等缺点。并且传统液液萃取方法均是直接将水相和萃取剂混合进行萃取，这种萃取方式萃取率低，需要萃取多次才能达到较高的萃取量，从而造成溶剂消耗量大、成本高等问题。

大孔吸附树脂又称全多孔树脂，是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，属于多孔交联聚合物，对有机物具有分离、富集的作用。大孔吸附树脂具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，是吸附性和分子筛性分离原理相结合的分离材料，不同极性不同孔径的大孔吸附树脂对不同种类的化合物选择性不同，从而可以有选择地吸附水溶液中的有机物，达到分离纯化的目的。并且树脂的吸附是物理作用，被吸附的物质容易从树脂上洗脱下来，树脂本身也容易再生。因此，大孔吸附树脂具有性能高效、操作简便、成本低、易回收以及对目标成分具有可选择性等优势，近些年被广泛应用于天然活性成分的分离富集。目前，大孔吸附树脂广泛应用于天然产物的分离及纯化中，如黄酮苷、芪类、异黄酮、紫杉醇及花青素等。

此外，高速逆流色谱(HSCCC)是一种液-液色谱分离技术，其建立在一种特殊的流体力学平衡的基础上，依靠聚四氟乙烯蛇形管的方向性及特定的高速行星式旋转产生的离心场作用，使无载体支持的固定相稳定的保留在蛇形管中，并使流动相单向、低速的通过固定相，使样品在两相之间不断反复的进行分配，由于样品中各组分在两相溶剂中的溶解度不同，导致在蛇形管中的迁移速度也不同，从而使样品中的组分得到高效、快速的分离。由于高速逆流色谱的固定相和流动相都是液体，因而可以消除样品的不可逆吸附，避免样品的损失、失活和变性等问题，并且由于被分离物质和液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高。高速逆流色谱是一种理想的制备分离手段，其具有分离迅速、回收率高、样品不易变性、重复性好及上样量大等一系列无可比拟的优势，被广泛应用于生物、医药、天然产物化学、环境分析、食品等领域。

近年来，国内外应用高速逆流色谱分离天然植物中活性物质的研究已有很多，比如公开号为CN103524594的专利申请公布了一种利用高速逆流色谱从藜芦属植物中分离环巴胺类似物的方法；公开号为CN102381974的专利申请公布了一种利用高速逆流色谱从忍冬中分离制备咖啡鞣酸的方法；公开号为CN103145677的专利申请公布了一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法；公开号为CN102702289的专利申请公开了应用高速逆流色谱从大叶白麻中分离纯化三种黄酮苷的方法；公开号为CN106866602的专利申请公开了一种利用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法；公开号为CN103450145的专利申请公开了一种利用高速逆流色谱从苏木中分离制备巴西木素和原苏木素B的方法。

但是，目前国内外对桑叶中咖啡酰基奎宁酸异构体的分离纯化研究较少，高速逆流色谱在咖啡酰基奎宁酸异构体的分离中尚没有得到应用，因此，建立一种高效快速的分离桑叶中的咖啡酰基奎宁酸异构体的高速逆流色谱方法十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种从桑叶中高效分离纯化咖啡酰基奎宁酸异构体的方法。本发明提供的方法利用高速逆流色谱结合大孔吸附树脂对桑叶中的咖啡酰基奎宁酸异构体进行高效、快速的分离纯化，操作方法简单，得到的咖啡酰基奎宁酸异构体纯度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种从桑叶中高效分离纯化咖啡酰基奎宁酸异构体的方法，包括以下步骤：

(1)将桑叶进行超声强化提取后浓缩，得到浓缩提取液；

(2)将所述浓缩提取液和水混合进行超声震荡絮凝，使所述浓缩提取液分散于水中，得到上清液；

(3)将所述上清液进行pH诱导液液萃取并将有机层浓缩至干，得到萃取产物；

(4)将所述萃取产物和水混合后进行超声震荡絮凝，使所述萃取产物分散于水中，得到上清液，然后进行大孔吸附树脂富集处理，得到富集产物；

(5)将所述富集产物进行高速逆流色谱快速分离，根据高速逆流色谱对应的色谱峰位置分段收集流出液并浓缩至干，分别得到5-咖啡酰基奎宁酸、4-咖啡酰基奎宁酸、3-咖啡酰基奎宁酸。

优选的，所述步骤(1)中超声强化提取用提取剂为乙醇；所述乙醇的体积浓度为30～60％。

优选的，所述超声强化提取的次数为1～5次，单次的提取时间为30～60min，单次提取用乙醇的体积和桑叶的质量之比为3～5L：1kg。

优选的，所述步骤(2)中浓缩提取液和水的体积比为1:5～10；所述超声震荡絮凝的温度为40～50℃，时间为5～30min，震荡频率为30～60KHz。

优选的，所述步骤(3)中pH诱导液液萃取所用萃取剂为石油醚、乙酸乙酯或正丁醇，萃取的pH值为4～7，萃取的次数为1～5次。

优选的，所述步骤(4)中大孔吸附树脂富集处理用的树脂包括NKA-9、NKA-II、HPD826、AB-8、D101或HPD100型大孔吸附树脂。

优选的，所述步骤(4)中大孔吸附树脂富集处理的装柱方法为湿法装柱，保留液面；所述大孔吸附树脂富集处理的上样量为1/3～13/3BV；

所述大孔吸附树脂富集处理的洗脱过程包括依次进行的水洗脱和乙醇洗脱；所述水洗脱用水的体积为1～5BV；所述乙醇洗脱用乙醇的体积浓度为10～40％；所述乙醇洗脱用乙醇的体积为4～10BV。

优选的，所述步骤(5)中高速逆流色谱快速分离用两相溶剂体系为乙酸乙酯-水溶剂体系。

优选的，所述步骤(5)中的富集产物上样量为50～500mg。

优选的，所述步骤(5)中浓缩至干后还包括：将浓缩得到的分离产物依次进行低温析晶和重结晶；所述低温析晶和重结晶用溶剂独立地为甲醇、乙醇或乙酸乙酯；所述低温析晶和重结晶的温度独立地为-4～20℃。

有益效果：

本发明以桑叶为原料，经超声强化提取后，将提取液浓缩至干并超声波振荡絮凝分散于水中，然后采用独创性的pH诱导液液萃取技术、大孔吸附树脂富集技术以及高速逆流色谱快速分离技术等一系列高效的分离纯化手段，得到纯度达93％以上的5-咖啡酰基奎宁酸(绿原酸)、4-咖啡酰基奎宁酸(隐绿原酸)、3-咖啡酰基奎宁酸(新绿原酸)。本发明利用高速逆流色谱结合大孔吸附树脂对桑叶中的绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸进行高效、快速的分离，首次实现了利用高速逆流色谱分离咖啡酰基奎宁酸异构体；本发明的方法采用独创的pH诱导液液萃取技术，通过调节萃取过程的pH值使咖啡酰基奎宁酸快速进入有机相，减少萃取次数，从而节约时间，减轻化学试剂的消耗，降低工业成本；此外本发明所用原料为我国常用中药桑叶，资源丰富，廉价易得，采用的分离纯化方法简单易行，效率高，在短周期内即可获得高纯度和高收率的产品，适用于产业化生产和应用。实施例结果表明，高速逆流色谱快速分离后绿原酸的收率可以达到99.56％，新绿原酸的收率可以达到80.59％，隐绿原酸的收率可以达到94.21％，纯度均可以达到93％以上，并且高速逆流色谱快速分离的一个分离周期仅为150min左右。

附图说明

图1为本发明实施例1中高速逆流色谱分离3种咖啡酰基奎宁酸的逆流色谱图；

图2为实施例1中3种咖啡酰基奎宁酸分离前后的高效液相色谱图；

图3为实施例1得到的新绿原酸(A)、绿原酸(B)和隐绿原酸(C)的ESI-MS^-谱图；

图4为实施例1得到的新绿原酸的¹H NMR和¹³C NMR谱(氘代甲醇)；

图5为实施例1得到的绿原酸的¹H NMR和¹³C NMR谱(氘代甲醇)；

图6为实施例1得到的隐绿原酸的¹H NMR和¹³C NMR谱(氘代甲醇)；

图7为实施例1中pH诱导液液萃取的萃取率图。

具体实施方式

本发明提供了一种从桑叶中高效分离纯化咖啡酰基奎宁酸异构体的方法，包括以下步骤：

(1)将桑叶进行超声强化提取后浓缩，得到浓缩提取液；

(2)将所述浓缩提取液和水混合进行超声震荡絮凝，使所述浓缩提取液分散于水中，得到上清液；

(3)将所述上清液进行pH诱导液液萃取并将有机层浓缩至干，得到萃取产物；

(4)将所述萃取产物和水混合后进行超声震荡絮凝，使所述萃取产物分散于水中，得到上清液，然后进行大孔吸附树脂富集处理，得到富集产物；

(5)将所述富集产物进行高速逆流色谱快速分离，根据高速逆流色谱对应的色谱峰位置分段收集流出液并浓缩至干，分别得到5-咖啡酰基奎宁酸、4-咖啡酰基奎宁酸、3-咖啡酰基奎宁酸。

本发明将桑叶进行超声强化提取后浓缩，得到浓缩提取液。在本发明中，所述桑叶优选为桑叶粉末；本发明对所述桑叶粉末的粒度没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的粒度即可；所述超声强化提取用提取剂优选为乙醇；所述乙醇的体积浓度优选为30～60％，更优选为50％；所述超声强化提取的次数优选为1～5次，更优选为3次；单次的提取时间优选为30～60min，更优选为45min；单次提取用乙醇的体积和桑叶的质量之比优选为3～5L：1kg，更优选为4L：1kg；当提取次数＞1次时，本发明优选将多次提取得到的提取液合并。

超声强化提取完成后，本发明优选将得到的提取液过滤，然后将滤液进行浓缩；本发明对所述过滤没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的过滤方法即可；本发明对所述浓缩的方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的浓缩方法，浓缩至无醇味即可。

得到浓缩提取液后，本发明将所述浓缩提取液和水混合进行超声震荡絮凝，得到上清液。在本发明中，所述浓缩提取液和水的体积比优选为1:5～10，更优选为1:6～8；所述超声震荡絮凝的温度优选为40～50℃，更优选为45℃；本发明优选向浓缩提取液中加入40～50℃的水，然后在该温度下进行超声震荡絮凝；所述超声震荡絮凝的时间优选为5～30min，更优选为10～25min，震荡频率优选为30～60KHz，更优选为40～50KHz。

超声震荡絮凝完成后，本发明优选通过静置使混合液分层，得到上清液。在本发明中，所述静置的时间优选为15～25min，更优选为20min。本发明通过超声震荡絮凝充分溶解浓缩提取液，除去不溶的残渣和难溶物，防止在后续步骤中对大孔吸附树脂产生污染和阻塞。

得到上清液后，本发明将所述上清液进行pH诱导液液萃取并将有机层浓缩至干，得到萃取产物。在本发明中，所述pH诱导液液萃取用萃取剂优选为石油醚、乙酸乙酯或正丁醇，更优选为正丁醇；所述萃取的pH值优选为4～7，更优选为4～5，最优选为4；所述萃取的次数优选为1～5次，更优选为2～3次；单次萃取用萃取剂和上清液的体积比优选为1:1；本发明优选先将上清液和萃取剂混合后调节pH值至4～7，然后再进行萃取；在本发明中，所述调节pH值用调节剂优选为冰醋酸；当萃取次数＞1次时，本发明优选将多次萃取得到的有机层合并。

在本发明中，咖啡酰奎宁酸属于多羟基酚酸，酸度较低，在酸性条件下，咖啡酰基奎宁酸大多以分子状态存在，疏水性增强，更有利于进入有机相，咖啡酰基奎宁酸在弱酸性条件下萃取效果最好，尤其是在pH＝4时达到最高，本发明通过调节pH值进行诱导萃取，可以使咖啡酰基奎宁酸快速进入有机相，减少萃取次数，从而节约时间，减轻化学试剂的消耗，降低工业成本；在本发明的具体实施例中，随着萃取次数的增加，咖啡酰基奎宁酸萃取率呈现逐渐下降的趋势，在pH＝4条件下进行萃取，第2次萃取的萃取率可以达到第1次萃取的50％。

本发明对所述浓缩的具体方法和浓缩程度没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的浓缩方法即可。

得到萃取产物后，本发明将所述萃取产物和水混合后进行超声震荡絮凝，使所述萃取产物分散于水中，得到上清液，然后进行大孔吸附树脂富集处理，得到富集产物。在本发明中，所述超声震荡絮凝的条件优选和上述方案一致，在此不再赘述；本发明优选向超声震荡絮凝所得上清液中加水定容至2000mL，得到静态吸附样品溶液，然后再进行大孔吸附树脂富集处理；所述大孔吸附树脂富集处理用的树脂优选包括NKA-9、NKA-II、HPD826、AB-8、D101或HPD100型大孔吸附树脂；在本发明中，新购买的大孔吸附树脂一般含有未聚合的单体、交联剂、制孔剂、残留的有机溶剂等脂溶性杂质，在使用前需要预处理以除去其中的杂质，所述预处理优选包括以下步骤：

将大孔吸附树脂用水溶性溶剂浸泡，使树脂充分溶胀；

将溶胀的大孔吸附树脂装柱，使用水性溶剂进行冲洗，洗至无白色浑浊产生；

使用去离子水继续冲洗至无溶剂为止，备用。

在本发明中，所述浸泡用水溶溶剂优选为甲醇；所述浸泡用水性溶剂的体积优选为2～3BV(BV为树脂的柱床体积)；所述浸泡的时间优选为2h，浸泡期间不断搅动，以使树脂充分溶胀；所述冲洗用水性溶剂优选为甲醇；所述冲洗用水性溶剂的体积优选为5～8BV，所述冲洗用水性溶剂的流速优选为3～4BV/h。在本发明中，所述去离子水的流速优选为6～8BV/h。在本发明的具体实施例中，必要时还要对大孔吸附树脂进行酸碱液洗涤，根据大孔树脂说明书配制相应浓度的酸碱液进行交替处理，最后用蒸馏水洗至中性即可。

在本发明中，所述大孔吸附树脂富集处理的装柱方法优选为湿法装柱，保留液面；所述大孔吸附树脂富集处理的上样量优选为1/3～13/3BV，更优选为5/3～10/3BV，最优选为8/3BV，上样流速优选为4BV/h；所述大孔吸附树脂富集处理的洗脱过程优选包括依次进行的水洗脱和乙醇洗脱；所述水洗脱用水的体积优选为1～5BV，更优选为2～4BV，最优选为3BV；所述乙醇洗脱用乙醇的体积浓度优选为10～40％，更优选为20～30％，最优选为25％；所述乙醇洗脱用乙醇的体积优选为4～10BV，更优选为5～8BV，最优选为6～7BV；所述水洗脱和乙醇洗脱的流速均优选为4BV/h。

在本发明的具体实施例中，优选将加水定容后得到的静态吸附样品溶液上样进入大孔吸附树脂柱，吸附达到饱和后，依次用水和乙醇洗脱树脂柱，在乙醇洗脱过程中每1BV分段收集洗脱液，直至全部洗脱完全。

本发明通过大孔吸附树脂富集处理将咖啡酰基奎宁酸异构体进行高效富集。大孔吸附树脂具有高效、操作简便、成本低且易回收等优势，本发明将其应用于咖啡酰基奎宁酸异构体的分离纯化中，能够进一步降低本发明的成本，提高分离效率。

得到洗脱液后，本发明将收集的洗脱液浓缩，得到富集产物。本发明优选将洗脱液浓缩至干，所得固形物即为富集产物。本发明对所述浓缩的方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的浓缩方法即可。

得到富集产物后，本发明将所述富集产物进行高速逆流色谱快速分离，根据高速逆流色谱对应的色谱峰位置分段收集流出液并浓缩至干，得到分离产物。在本发明中，高速逆流色谱快速分离用两相溶剂体系优选为乙酸乙酯-水溶剂体系；所述乙酸乙酯和水的体积比优选为1:1；所述富集产物的上样量优选为50～500mg，更优选为100～400mg。

在本发明中，优选以两相溶剂体系中的上相(乙酸乙酯)为固定相，下相(水)为流动相；在本发明的具体实施例中，优选将两相溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀，静置，当两相溶剂达到平衡后，将两相溶剂分离到溶剂瓶中并超声脱气30分钟，备用。

在本发明的具体实施例中，在进行高速逆流色谱分离时，优选先将上相通过恒流泵泵入高速逆流色谱主机的多层螺旋柱内作为固定相，然后将下相泵入，待两相体系平衡后，将富集产物样品溶液注入主机，并进行UV检测，根据逆流色谱对应的色谱峰位置分段收集，得到分离产物。在本发明中，所述下相的流速优选为2mL/min；所述富集产物样品溶液优选通过将富集产物溶解于两相溶剂体系中得到；所述富集产物的上样量优选为50～500mg/20mL，更优选为400mg/20mL；所述UV检测的波长优选为365nm。

本发明根据高速逆流色谱对应的色谱峰位置分段收集，可以分别得到绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸，将收集到的流出液分别浓缩至干，即可得到分离产物，即：5-咖啡酰基奎宁酸、4-咖啡酰基奎宁酸和3-咖啡酰基奎宁酸，三种分离产物的纯度均可以达到93％以上。

本发明利用高速逆流色谱对三种咖啡酰基奎宁酸异构体进行分离，具有分离迅速、回收率高、样品不易变性、重复性好、上样量大等优势；并且其固定相和流动相都是液体，可以消除样品的不可逆吸附，本发明建立了一种高效快速分离桑叶中的咖啡酰基奎宁酸异构体的高速逆流色谱方法，适用于产业化生产和应用，可为医药工业提供有药用价值的先导化合物。

得到分离产物后，本发明优选还包括：将所述分离产物依次进行低温析晶和重结晶，得到更高纯度的5-咖啡酰基奎宁酸、4-咖啡酰基奎宁酸、3-咖啡酰基奎宁酸。在本发明中，所述低温析晶和重结晶用溶剂独立地优选为甲醇、乙醇或乙酸乙酯；所述低温析晶和重结晶的温度独立地优选为-4～20℃，更优选为-2～10℃；在本发明的具体实施例中，优选将分离产物溶解于溶剂中，然后置于低温下进行析晶，过滤得到晶体后再次溶解于溶剂中，再次放置于低温下进行重结晶，依次类推；在本发明的具体实施例中，重结晶2～3次即可得到更高纯度的5-咖啡酰基奎宁酸(5-CQA，绿原酸，结构式如式I所示)、4-咖啡酰基奎宁酸(4-CQA，隐绿原酸，结构式如式II所示)和3-咖啡酰基奎宁酸(3-CQA，新绿原酸，结构式如式III所示)。

下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)超声强化提取：准确称取桑叶样品粉末1kg，以4L体积浓度为50％的乙醇为溶剂，在室温下超声处理45分钟，提取3次，合并3次提取液并过滤，浓缩滤液至无醇味，得到浓缩提取液；

(2)超声震荡絮凝：将浓缩提取液用2000mL 40℃的水溶解进行超声波震荡絮凝，超声震荡时间为5min，频率为30KHz，超声震荡完成后静置25min，分层后得到上清液。

(3)pH诱导液液萃取：使用正丁醇对上清液进行萃取，正丁醇和上清液的体积比为1:1，萃取的pH值为4，萃取次数为5次，浓缩正丁醇层至干，得到萃取产物，将萃取产物和水混合后进行超声震荡絮凝，使所述萃取产物分散于水中，得到上清液，然后用水定溶至2000mL，得到大孔吸附树脂静态吸附样品溶液，样品溶液中新绿原酸初始浓度为0.47mg/mL，绿原酸初始浓度为1.29mg/mL，隐绿原酸初始浓度为0.65mg/mL。

(4)大孔吸附树脂富集

大孔吸附树脂的预处理：将新购买的D101大孔吸附树脂用2BV的甲醇浸泡2h，并不时搅动，使树脂充分溶胀。将溶胀后的吸附树脂装柱，用5BV的甲醇以4BV/h的流速通过树脂层，洗至无白色浑浊产生。最后以6BV/h流速的去离子水冲洗至无溶剂为止，备用。

将预处理好的250g D101湿树脂装入玻璃层析柱(φ50×600mm，240mm)中，将8/3BV吸附样品溶液加入层析柱中，在流速为4BV/h下上柱，至树脂吸附饱和为止。当样品溶液达到吸附平衡后，首先以2BV的去离子水冲洗大孔吸附树脂柱，再用8BV 10％乙醇以4BV/h流速进行洗脱，每1BV分段收集洗脱液，浓缩至干，得到富集产物。

(5)高速逆流色谱快速分离

将乙酸乙酯：水＝1:1置于1000mL的分液漏斗中，摇匀，静置。当两相溶剂达到平衡后，将两相溶剂分离到溶剂瓶中，上相做固定相，下相做流动相，超声脱气30分钟，备用。取20mL两相溶剂体系将400mg的富集产物充分溶解作为上样溶液。

上层有机相通过恒流泵泵入主机的多层螺旋柱内作为固定相，然后以900rpm的转速将下相以2mL/min的流速泵入主机。待两相体系平衡后，将样品注入主机，并在325nm处用UV检测器连续监测。根据逆流色谱对应的色谱峰位置分段收集流份，浓缩旋干，得到分离纯化的三种咖啡酰基奎宁酸，该步骤中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的收率分别可以达到80.59％、99.56％、94.21％，纯度分别可以达到93.75％、93.62％、95.22％。

(6)将三种分离产物进行低温析晶和重结晶，其中低温析晶和重结晶用的溶剂为甲醇，析晶和重结晶温度均为-4℃，重结晶后得到的更高纯度的新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸。

图1为3种咖啡酰基奎宁酸的逆流色谱图，其中1为新绿原酸的色谱峰，2为隐绿原酸的色谱峰，3为绿原酸的色谱峰。根据图1可以看出，一个高速逆流色谱分离周期约为150min，其中在40～50min左右新绿原酸被洗出，在68～85min左右隐绿原酸被洗出，88～117min左右绿原酸被洗出。

图2为3种咖啡酰基奎宁酸分离前后的高效液相色谱图；其中a为分离前样品的高效液相色谱图；b为分离后新绿原酸的高效液相色谱图；c为分离后绿原酸的高效液相色谱图；d为分离后隐绿原酸的高效液相色谱图。根据图2可以看出，三种咖啡酰基奎宁酸被有效分离。

图3为所得产物新绿原酸(A)、绿原酸(B)和隐绿原酸(C)的ESI-MS^-图，图4为新绿原酸的¹HNMR和¹³C NMR谱(氘代甲醇)，图5为绿原酸的¹H NMR和¹³C NMR谱(氘代甲醇)，图6为隐绿原酸的¹H NMR和¹³C NMR谱(氘代甲醇)。根据图3～6可知，本实施例最终分离得到的纯品为新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸。

图7为pH诱导液液萃取过程的萃取率图，图7中自下向上的柱形模块分别代表第1～5次的萃取率，根据图7可以看出，萃取的pH值为4时，萃取5次后3-CQA的萃取率可以达到65％左右，5-CQA的萃取率可以达到90％左右，4-CQA的萃取率可以达到73％左右。说明本发明的pH诱导液液萃取有较高的萃取率，在pH为4的条件下萃取2次的萃取量和pH为7的条件下萃取5次的萃取量相当。

实施例2

高速逆流色谱分离(HSCCC)方法的分离效果主要依赖于两相溶剂体系的选择，两相溶剂体系的选择主要考虑分离物质在溶剂体系中的分配系数K及分离因子α。HSCCC最佳的K值一般为0.2～2.0，如果K值>2.0，则目标成分分离时间延长；当K值<0.2时，目标成分与其他成分重叠而不能分开，为了使相邻峰获得较好的分离，分离因子α最好大于1.5。

本实施例用HPLC法测定了不同咖啡酰基奎宁酸在不同的两相溶剂体系中的分配系数K，结果见表1。

表1不同咖啡酰基奎宁酸在不同的两相溶剂体系中的分配系数表

从表1中可以看出，乙酸乙酯：水＝1:1时K值在0.25～0.56之间，并且α₁>1.5，即新绿原酸与绿原酸有较好的分离，且α₂>1.5，即绿原酸和隐绿原酸也有较好的分离，而在其他两相溶剂体系中，三种物质均不能得到较好的分离。因此，本发明选择的乙酸乙酯-水体系适合HSCCC的分离。

根据以上实施例可知，本发明建立了一种高效快速的分离制备桑叶中的咖啡酰基奎宁酸异构体的高速逆流色谱方法，利用pH诱导液液萃取及高速逆流色谱结合大孔吸附树脂技术高效、快速地从桑叶中分离纯化咖啡酰基奎宁酸异构体，所得产物纯度高、收率高，并且本发明的分离纯化方法容易操作、步骤简单、溶剂消耗少、分离周期短，适合进行工业化生产，具有广阔的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种从桑叶中高效分离纯化咖啡酰基奎宁酸异构体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将桑叶进行超声强化提取后浓缩，得到浓缩提取液；

(2)将所述浓缩提取液和水混合进行超声震荡絮凝，使所述浓缩提取液分散于水中，得到上清液；

(3)将所述上清液进行pH诱导液液萃取并将有机层浓缩至干，得到萃取产物；所述pH诱导液液萃取的pH值为4～7；

(4)将所述萃取产物和水混合进行超声震荡絮凝，使所述萃取产物分散于水中，得到上清液，然后进行大孔吸附树脂富集处理，得到富集产物；

(5)将所述富集产物进行高速逆流色谱快速分离，根据高速逆流色谱对应的色谱峰位置分段收集流出液并浓缩至干，分别得到5-咖啡酰基奎宁酸、4-咖啡酰基奎宁酸、3-咖啡酰基奎宁酸；所述高速逆流色谱快速分离用两相溶剂体系为乙酸乙酯-水溶剂体系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中超声强化提取用提取剂为乙醇；所述乙醇的体积浓度为30～60％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述超声强化提取的次数为1～5次，单次的提取时间为30～60min，单次提取用乙醇的体积和桑叶的质量之比为3～5L：1kg。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中浓缩提取液和水的体积比为1:5～10；

所述步骤(2)和步骤(4)中超声震荡絮凝的温度独立地为40～50℃，时间独立地为5～30min，震荡频率独立地为30～60KHz。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中pH诱导液液萃取所用萃取剂为石油醚、乙酸乙酯或正丁醇，萃取的次数为1～5次。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中大孔吸附树脂富集处理用的树脂包括NKA-9、NKA-II、HPD826、AB-8、D101或HPD100型大孔吸附树脂。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中大孔吸附树脂富集处理的装柱方法为湿法装柱，保留液面；所述大孔吸附树脂富集处理的上样量为1/3～13/3BV；

所述大孔吸附树脂富集处理的洗脱过程包括依次进行的水洗脱和乙醇洗脱；所述水洗脱用水的体积为1～5BV；所述乙醇洗脱用乙醇的体积浓度为10～40％；所述乙醇洗脱用乙醇的体积为4～10BV。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的富集产物上样量为50～500mg。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中浓缩至干后还包括：将浓缩得到的分离产物依次进行低温析晶和重结晶；所述低温析晶和重结晶用溶剂独立地为甲醇、乙醇或乙酸乙酯；所述低温析晶和重结晶的温度独立地为-4～20℃。

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