CN113549162A - 一种柘木精制多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种柘木精制多糖的制备方法，包括以下步骤：制备柘木粗多糖；配制高速逆流色谱双水相体系，设置高速逆流色谱仪参数；配制柘木粗多糖的样品溶液，经高速逆流色谱一步纯化柘木粗多糖；合并获得的柘木精制多糖溶液流分、透析、冷冻干燥，得到纯化后的柘木精制多糖。与现有技术相比，本发明操作简单，原料廉价易得，工艺绿色环保；所获得的柘木精制多糖纯度为60％左右，可用于柘木多糖的结构鉴定与分析。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物有效成分的提取、纯化领域，尤其是涉及一种柘木精制多糖的制备方法。
背景技术
柘树是桑科柘属植物。柘树中含有许多化学成分，如酮类化合物、生物碱类、多糖类和呫吨酮类等。它在传统中医中被用作“川婆石”，用于治疗淋病、风湿病、黄疸、疖子和疥疮等疾病。柘树的根具有化瘀止血、清肝明目的功效；柘树根皮已被广泛用于治疗腰痛、咯血和挫伤；柘树的茎也以糖浆、颗粒和注射剂的形式用于治疗消化道肿瘤。柘树在过去几十年中已经成为最普遍的抗癌民间药物之一。
学者们在对柘木多糖提取过程中，一般会采用Sevag法去除蛋白质，并且采用阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶树脂对粗多糖进行分离纯化。CN200410024199公开了提取柘木多糖的方法，涉及天然植物提取、纯化、分离技术。该方法包括以下技术方案：柘树根粉碎，浸泡提取、离心、过滤、合并滤液，滤液过pH＝4的大孔吸附树脂，减压浓缩，醇析，Sevag法去蛋白，透析及分离纯化。浸泡6-8小时，在70℃下提取，吸附树脂为pH＝4的3520树脂，去蛋白采用Sevag法，透析后经DEAE-SeohadexA-50凝胶柱，用水及NaCl溶液洗脱，洗脱液透析、冷冻干燥得纯品。该技术方案中，Sevag试剂重复操作去除蛋白质时，会造成多糖的损失，降低多糖的提取率；并且氯仿为易制毒溶液，不够绿色环保。葡聚糖凝胶树脂分离多糖，不仅操作复杂，还存在效率低，成本高等缺点。
CN101974094A公开了一种综合提取柘木多糖和黄酮的方法，涉及天然植物提取技术。该方法包括以下技术方案：取柘木药材于55℃烘箱烘干粉碎，过40-80目筛，加入不同浓度乙醇溶液梯度回流提取，提取液浓缩，依次用石油醚和水饱和正丁醇萃取，萃余液加入95％乙醇至沉淀完全，离心分离，得离心沉淀物和上清液；将沉淀物用丙酮反复洗涤，冷冻干燥，即得柘木多糖。该技术方案为柘木多糖的粗提取，没有进一步去除柘木多糖中的蛋白质、核苷酸等物质。并且，丙酮为有毒试剂，不够绿色环保。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种柘木精制多糖的制备方法，克服了现有的纯化方法在柘木多糖分离纯化过程中存在的操作复杂、提取率低、纯度低、多糖结构被破坏等不足。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本申请的目的是保护一种柘木精制多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备柘木粗多糖；
S2：配制高速逆流色谱双水相体系，设置高速逆流色谱仪参数；
S3：配制柘木粗多糖的样品溶液，经高速逆流色谱一步纯化柘木粗多糖；
S4：合并获得的柘木精制多糖溶液流分、透析、冷冻干燥，得到纯化后的柘木精制多糖。
进一步地，S1包括以下过程：
A.原材料的处理：将柘木碎屑放入载物托盘中，铺平，烘干；
B.破壁、过筛处理：将步骤A所烘干的柘木碎屑放入粉碎机中粉碎，过筛，筛出柘木粉末，密封保存；
C.柘木粗多糖的提取：将一定质量的B步骤处理的柘木粉末置入三口烧瓶中，加入一定体积的水作为提取剂，一定温度下加热回流一段时间，重复提取多次，抽滤，弃去滤渣，合并提取液，旋转蒸发得到浓缩提取液；
D.醇沉多糖：向C步骤得到的浓缩液中加入一定量的乙醇，低温静置一段时间，得到多糖沉淀；
E.多糖干燥：将D步骤得到的溶液离心，弃去上清液，烘干沉淀物，得到柘木粗多糖。
进一步地，S2包括以下过程：
F.高速逆流色谱双水相体系两相溶液的配制：将乙醇、无机盐和水按照一定质量比例混合、静置分层，其中上层作为固定相，下层作为流动相，分离两相，将固定相和流动相都进行超声脱气处理。
进一步地，S3包括以下过程：
G.进样样品的配制：取一定质量的E步骤所得的柘木粗多糖，将其溶解到一定体积的F步骤所得下相中，离心弃去不溶物，得到进样样品；
H.高速逆流色谱分离样品：先将固定相泵入色谱柱中，色谱柱中充满固定相之后，转动主机，再将流动相泵入色谱柱中，待两相溶液在色谱柱中达到平衡状态时，将G步骤制得的样品从进样口注入色谱柱中，同时开启自动收集器收集流分。
进一步地，S4包括以下过程：
I.流分的检测：使用苯酚-硫酸法检测H步骤中收集的流分；
J.流分的合并：将步骤I中相同的流分合并；
K.流分的处理：透析步骤J中合并的流分，之后进行冷冻干燥，得到精制柘木多糖。
进一步地，过程B中使用100目筛子，以此筛选出大于100目的柘木粉末；
C过程中加热回流按照液料比为10-40mL/g加入提取剂，温度为70-100℃，时间为1-5h，重复2次得到浓缩提取液。
进一步地，过程D中加入浓缩液3倍体积的乙醇，采用乙醇的浓度为95％，低温静置过程为在4℃下静置12h，得到多糖沉淀；
过程E中在60℃下烘干沉淀物，得到柘木粗多糖。
进一步地，过程F中的双水相体系中，无水乙醇、硫酸铵和水按照30％：(16-20)％：(50-54)％的质量比配制，两相超声脱气时间均为20min。
进一步地，过程G中柘木粗多糖在流动相中的溶解比例为100mg柘木粗多糖/10mL流动相；
过程H中以20mL/min的流速将固定相泵入色谱柱中，以2mL/min的流速将流动相泵入色谱柱中，主机正转转速为800r/min，分离温度为30℃，自动收集器5min收集一管流分。
进一步地，过程K中使用截留分子量为7000Da的透析袋对步骤J中合并的流分透析3天。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：
1)本发明所提供的基于高速逆流色谱技术一步纯化柘木粗多糖的方法，实验操作简单，所用药品为乙醇、硫酸铵，无毒无害且廉价易得。
2)本发明构建了一种新型的去蛋白方法，样品损失小，多糖结构不被破坏。
3)本发明中方法可一步将蛋白质、核苷酸去除，整体过程高效、绿色、环保且成本低。
附图说明
图1为实施例1中柘木粗多糖紫外全波长扫描图；
图2为实施例1中柘木精制多糖紫外全波长扫描图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
本技术方案所采用的高速逆流色谱仪(High-SpeedCountercurrentChromatography,HSCCC)与传统的固-液色谱技术相比，具有样品无损失、无污染、适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。
本技术方案包括以下步骤：
A、原材料的处理：将柘木碎屑放入载物托盘中，铺平，烘干；
B、破壁、过筛处理：将步骤A所烘干的柘木碎屑放入粉碎机中粉碎，过筛，筛出柘木粉末，密封保存。
C、柘木粗多糖的提取：将一定质量的B步骤处理的柘木粉末置入三口烧瓶中，加入一定体积的水作为提取剂，一定温度下加热回流一段时间，重复提取几次，抽滤，弃去滤渣，合并提取液，旋转蒸发得到浓缩提取液。
D、醇沉多糖：向C步骤得到的浓缩液中加入一定量的乙醇，低温静置一段时间，得到多糖沉淀。
E、多糖干燥：将D步骤得到的溶液离心，弃去上清液，烘干沉淀物，得到柘木粗多糖。
F、高速逆流色谱双水相体系两相溶液的配制：将乙醇、无机盐和水按照一定质量比例混合、静置分层，其中上层作为固定相，下层作为流动相，分离两相，上下相都进行超声脱气处理。
G、进样样品的配制：取一定质量的E步骤所得的柘木粗多糖，将其溶解到一定体积的F步骤所得下相中，离心弃去不溶物，得到进样样品。
H、高速逆流色谱分离样品：先将固定相泵入色谱柱中。色谱柱中充满固定相之后，转动主机，再将流动相泵入色谱柱中。待两相溶液在色谱柱中达到平衡状态时，将G步骤制得的样品从进样口注入色谱柱中，同时开启自动收集器收集流分。
I、流分的检测：使用苯酚-硫酸法检测H步骤中收集的流分。
J、流分的合并：将步骤I中相同的流分合并。
K、流分的处理：透析步骤J中合并的流分，之后进行冷冻干燥，得到精制柘木多糖。
实施例1
称取过100目筛的柘木粉末10.0g于三口烧瓶中，接着向反应体系中加入一定量的去离子水，在加热回流条件下提取柘木多糖。其中液料比为40mL/g，提取温度为100℃，提取时间为2h，重复提取两次。提取结束后，抽滤，收集两次提取所得提取液，减压浓缩。向浓缩液中加入3倍体积的95％乙醇，在4℃下醇沉12h。醇沉结束后，离心，弃去上清液，沉淀在60℃下烘干。最终得到柘木粗多糖0.2832g，，柘木粗多糖紫外全波长扫描图参见图1，图中260nm、280nm处有核苷酸和蛋白质的紫外吸收。
配制高速逆流色谱双水相体系，选用体系为30％乙醇-18％(NH4)2SO4-52％H2O(w/w/w)，将乙醇、硫酸铵和水混合，在分液漏斗中分层。上层为固定相，下层为流动相。将两相分开，分别超声脱气20min。称取200mg柘木粗多糖，溶解到20mL下相中。离心弃去不溶物，得到进样样品。设置高速逆流色谱仪分离温度为30℃，先以20mL/min的流速将固定相泵入色谱柱，待固定相充满色谱柱后，开机正转10min，转速为800r/min。再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱柱内。待到两相在色谱柱内达到平衡时，在进样口进样。与此同时开启自动收集器收集流分，设置为5min/管。收集结束后，用苯酚-硫酸法对每管流分进行检测，合并相同流分。用截留分子量为7000Da的透析袋对已收集的流分进行透析处理，透析3天。冷冻干燥透析后的溶液，得到柘木精制多糖。多糖含量为58.5％，柘木精制多糖紫外全波长扫描图参见图2，图中260nm、280nm处没有核苷酸和蛋白质的紫外吸收峰。
实施例2
称取过100目筛的柘木粉末10.0g于三口烧瓶中，接着向反应体系中加入一定量的去离子水，在加热回流条件下提取柘木多糖。其中液料比为30mL/g，提取温度为90℃，提取时间为3h，重复提取两次。提取结束后，抽滤，收集两次提取所得提取液，减压浓缩。向浓缩液中加入3倍体积的95％乙醇，在4℃下醇沉12h。醇沉结束后，离心，弃去上清液，沉淀在60℃下烘干。最终得到柘木粗多糖0.2040g。
配制高速逆流色谱双水相体系，选用体系为30％乙醇-16％(NH4)2SO4-54％H2O(w/w/w)，将乙醇、硫酸铵和水混合，在分液漏斗中分为两层。上层为固定相，下层为流动相。将两相分开，分别超声脱气20min。称取200mg柘木粗多糖，溶解到20mL下相中。离心弃去不溶物，得到进样样品。设置高速逆流色谱仪分离温度为30℃，先以20mL/min的流速将固定相泵入色谱柱，待固定相充满色谱柱后，开机正转10min，转速为800r/min。再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱柱内。待到两相在色谱柱内达到平衡时，在进样口进样。与此同时开启自动收集器收集流分，设置为5min/管。收集结束后，用苯酚-硫酸法对每管流分进行检测，合并相同流分。用截留分子量为7000Da的透析袋对已收集的流分进行透析处理，透析3天。冷冻干燥透析后的溶液，得到柘木精制多糖。多糖含量为62.4％。
实施例3
称取过100目筛的柘木粉末10.0g于三口烧瓶中，接着向反应体系中加入一定量的去离子水，在加热回流条件下提取柘木多糖。其中液料比为20mL/g，提取温度为100℃，提取时间为5h，重复提取两次。提取结束后，抽滤，收集两次提取所得提取液，减压浓缩。向浓缩液中加入3倍体积的95％乙醇，在4℃下醇沉12h。醇沉结束后，离心，弃去上清液，沉淀在60℃下烘干。最终得到柘木粗多糖0.2248g。
配制高速逆流色谱双水相体系，选用体系为30％乙醇-20％(NH4)2SO4-50％H2O(w/w/w)，将乙醇、硫酸铵和水混合，在分液漏斗中分为两层。上层为固定相，下层为流动相。将两相分开，分别超声脱气20min。称取200mg柘木粗多糖，溶解到20mL下相中。离心弃去不溶物，得到进样样品。设置高速逆流色谱仪分离温度为30℃，先以20mL/min的流速将固定相泵入色谱柱，待固定相充满色谱柱后，开机正转10min，转速为800r/min。再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱柱内。待到两相在色谱柱内达到平衡时，在进样口进样。与此同时开启自动收集器收集流分，设置为5min/管。收集结束后，用苯酚-硫酸法对每管流分进行检测，合并相同流分。用截留分子量为7000Da的透析袋对已收集的流分进行透析处理，透析3天。冷冻干燥透析后的溶液，得到柘木精制多糖。多糖含量为61.8％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种柘木精制多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备柘木粗多糖；
S2：配制高速逆流色谱双水相体系，设置高速逆流色谱仪参数；
S3：配制柘木粗多糖的样品溶液，经高速逆流色谱一步纯化柘木粗多糖；
S4：合并获得的柘木精制多糖溶液流分、透析、冷冻干燥，得到纯化后的柘木精制多糖。
2.根据权利要求1所述的一种柘木精制多糖的制备方法，其特征在于，S1包括以下过程：
A.原材料的处理：将柘木碎屑放入载物托盘中，铺平，烘干；
B.破壁、过筛处理：将步骤A所烘干的柘木碎屑放入粉碎机中粉碎，过筛，筛出柘木粉末，密封保存；
C.柘木粗多糖的提取：将一定质量的B步骤处理的柘木粉末置入三口烧瓶中，加入一定体积的水作为提取剂，一定温度下加热回流一段时间，重复提取多次，抽滤，弃去滤渣，合并提取液，旋转蒸发得到浓缩提取液；
D.醇沉多糖：向C步骤得到的浓缩液中加入一定量的乙醇，低温静置一段时间，得到多糖沉淀；
E.多糖干燥：将D步骤得到的溶液离心，弃去上清液，烘干沉淀物，得到柘木粗多糖。
3.根据权利要求1所述的一种柘木精制多糖的制备方法，其特征在于，S2包括以下过程：
F.高速逆流色谱双水相体系两相溶液的配制：将乙醇、无机盐和水按照一定质量比例混合、静置分层，其中上层作为固定相，下层作为流动相，分离两相，将固定相和流动相都进行超声脱气处理。
4.根据权利要求1所述的一种柘木精制多糖的制备方法，其特征在于，S3包括以下过程：
G.进样样品的配制：取一定质量的E步骤所得的柘木粗多糖，将其溶解到一定体积的F步骤所得下相中，离心弃去不溶物，得到进样样品；
H.高速逆流色谱分离样品：先将固定相泵入色谱柱中，色谱柱中充满固定相之后，转动主机，再将流动相泵入色谱柱中，待两相溶液在色谱柱中达到平衡状态时，将G步骤制得的样品从进样口注入色谱柱中，同时开启自动收集器收集流分。
5.根据权利要求1所述的一种柘木精制多糖的制备方法，其特征在于，S4包括以下过程：
I.流分的检测：使用苯酚-硫酸法检测H步骤中收集的流分；
J.流分的合并：将步骤I中相同的流分合并；
K.流分的处理：透析步骤J中合并的流分，之后进行冷冻干燥，得到精制柘木多糖。
6.根据权利要求2所述的一种柘木精制多糖的制备方法，其特征在于，过程B中使用100目筛子，以此筛选出大于100目的柘木粉末；
C过程中加热回流按照液料比为10-40mL/g加入提取剂，温度为70-100℃，时间为1-5h，重复2次得到浓缩提取液。
7.根据权利要求2所述的一种柘木精制多糖的制备方法，其特征在于，过程D中加入浓缩液3倍体积的乙醇，采用乙醇的浓度为95％，低温静置过程为在4℃下静置12h，得到多糖沉淀；
过程E中在60℃下烘干沉淀物，得到柘木粗多糖。
8.根据权利要求3所述的一种柘木精制多糖的制备方法，其特征在于，过程F中的双水相体系中，无水乙醇、硫酸铵和水按照30％：(16-20)％：(50-54)％的质量比配制，两相超声脱气时间均为20min。
9.根据权利要求4所述的一种柘木精制多糖的制备方法，其特征在于，过程G中柘木粗多糖在流动相中的溶解比例为100mg柘木粗多糖/10mL流动相；
过程H中以20mL/min的流速将固定相泵入色谱柱中，以2mL/min的流速将流动相泵入色谱柱中，主机正转转速为800r/min，分离温度为30℃，自动收集器5min收集一管流分。
10.根据权利要求5所述的一种柘木精制多糖的制备方法，其特征在于，过程K中使用截留分子量为7000Da的透析袋对步骤J中合并的流分透析3天。
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