CN1583798A - 提取柘树多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

一种提取柘树多糖的方法,包括对原料进行浸泡提取,离心、过滤,合并滤液,滤液过大孔吸附树脂,减压浓缩,醇析,去蛋白,透析及分离纯化。浸泡6-8小时,在70℃温度下提取,吸附树脂为pH=4的3520树脂,去蛋白采用Sevag法,透析后经DEAE-SephadexA-50凝胶柱,用水及NaCl溶液洗脱,洗脱液透析、冷冻干燥得纯品。

Description

提取柘树多糖的方法
技术领域:
本发明涉及一种植物多糖的提取方法,具体地讲是以柘数根为原料提取多糖的方法。
背景技术:
多糖类化合物可参与免疫细胞间信息的传递与感受,细胞的转化、分裂及再生活动等,具有免疫调节的功能;具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗凝血、抗辐射损伤的作用;具有降血糖、血脂和胆固醇,抗动脉粥样硬化的作用;保护胃肠道,具有抗溃疡的作用;具有防止肝损伤的作用;一些粘多糖可以调节体内阴离子的浓度,调节胶原纤维的生成,阻止重金属离子在动物消化道内的吸收等。大量的药理及临床研究表明,多糖类化合物是一种免疫调节剂,它能激活T、B淋巴细胞、Mφ、NKC等免疫细胞,活化补体,促进细胞因子生成等,对免疫系统发挥多方面的调节作用,从而改善机体的免疫功能,在癌症治疗中,它不像一般的化疗药物,直接杀死生长着的细胞,而是通过调节机体的免疫功能杀死肿瘤细胞,对正常的细胞影响很小,具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点,其作为免疫调节剂在治疗肿瘤和爱滋病等病毒方面显示出的优越性日益受到人们的重视。
柘树[Cudrania tricuspidata(Carr.)Bur.],别名柘木、柘、柘桑、柘刺、黑梅子、柞树、柞腮树及柞刺,为桑科植物,落叶灌木或小乔木,分布于中南、华东、西南至河北南部。在《本草纲目》、《中国药典》中记载它的根、根皮、茎、枝叶、果实可入药,其性味甘温无毒,可治疗关节疼痛、黄疸、劳伤咳血、结石、止咳祛痰等。70年代末浙江一带民间曾将柘树根水煎来治疗肿瘤,上海雷允上制药厂及上海中药二厂生产的柘木糖浆用于治疗胃癌等消化道肿瘤,发现柘木糖浆不仅有抑制肿瘤的作用,而且在与化疗药物同用时能明显减轻化疗的毒副作用,能抵抗化疗对血细胞的抑制,减轻化疗对免疫功能的抑制和损害。徐誉泰等在研究柘树黄酮的抗肿瘤作用时发现柘树粗多糖对小鼠腹腔巨噬细胞过氧化物酶活性、细胞毒性及吞噬功能均有所提高,并可抑制S180肿瘤。而柘树根多糖的分离纯化、理化性质、结构分析尚未见公开报道。
发明内容:
本发明的目的是提供一种从柘树根中提取多糖的方法。
本发明的目的是以如下方式实现的:该提取柘树多糖的方法,包括对原料进行浸泡提取,离心、过滤,合并滤液,滤液过大孔吸附树脂,减压浓缩,醇析,去蛋白,透析及分离纯化。
上述方法具体操作如下:
a.柘树根粉碎,加6-8倍体积的水浸泡6小时,70℃分次提取,合并提取液;
b.将上述提取液离心、过滤;
c.将上步提取液过3520大孔吸附树脂以除去黄酮;
d.将上步收集液减压浓缩至原体积的1/3,离心;
e.将上步的滤液用3倍体积95%的乙醇醇析,在4℃环境下静置12小时;
f.将上步醇析物离心处理,除去上清;
g.将上步所得沉淀物用75%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤,离心;
h.将上步所得沉淀物用蒸馏水溶解,Sevag法去蛋白,反复多次直至交界处无沉淀出现;
i.将上步所得溶液去有机溶剂,干燥得粗多糖;
j.将粗多糖溶于水,透析48-72小时;
k.将上步透析液离心,上清液过DEAE-SephadexA-50柱,依次用H2O,0.1mol/L NaCl,0.2mol/L NaCl,0.3mol/L NaCl洗脱,分别收集高峰部分;
l.分别将上步收集的溶液透析,浓缩,冷冻干燥得柘树多糖系列纯品。
在a步分次提取是2-3次,第1次2小时,第2次1小时,第3次0.5-1小时。
在c步的3520树脂PH=4。
在d步减压浓缩是在40℃-50℃进行。
在g步的沉淀物依次用75%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤2-3次。
在h步的由氯仿和正丁醇按体积比5比1构成的Sevag试剂脱蛋白过程是将试剂与溶液按1∶5的体积比加入,加入试剂后震荡20-30分钟,使试剂与溶液充分混合,离心后,去交界处沉淀的蛋白,如此反复多次直至交界处无沉淀出现。
在i步去有机溶剂是在50℃减压浓缩至溶液少量时加入蒸馏水继续浓缩,反复3次。所谓溶液少量,是指略微能看到溶液的状态。
得到的多糖纯品以以下代号表示:CPS-1,CPS-2,CPS-3。它们的碘-碘化钾反应呈阴性,说明三者不含淀粉;双缩脲反应呈阴性,说明三者不含蛋白质;紫外光谱UV扫描分析表明CPS-1,CPS-2,CPS-3溶液在260nm和280nm处无吸收峰,说明三者不含蛋白质和核酸;高效液相色谱HPLC分析表明CPS-1为均一组分,数均分子量为4461,重均分子量为6572,CPS-2含有少量杂质,数均分子量为24709,重均分子量为68110,CPS-3为一混合组分;GCMS分析表明CPS-1含有鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal),摩尔(Rha-Ara-Xyl-Man-Glu-Gal)比依次为1.00∶14.02∶0.74∶2.62∶30.06∶17.72,CPS-2中含有鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal),摩尔(Rha-Ara-Xyl-Man-Glu-Gal)比依次为1.00∶2.68∶0.11∶0.16∶0.27∶3.83;元素分析表明CPS-1、CPS-2均为含硫的氨基糖;IR、1HNMR和13CNMR光谱分析表明CPS-1具有吡喃型糖环的特征吸收峰和α-糖苷键的特征吸收峰,C-2,C-3,C-4中某一碳上发生取代,而C-6未发生取代;CPS-2具有呋喃型糖环的特征吸收峰,其糖苷键可能是β-构型。无论在有没有丝分裂原ConA或LPS存在的情况下,CPS-1,CPS-2,CPS-3均可显著增强小鼠脾淋巴细胞的增殖,比已用于临床的香菇多糖效果更为明显;在对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响中,CPS-1,CPS-2在某些浓度与香菇多糖作用效果相同。
具体实施方式:
实施例1:
柘树根粉碎,加6倍体积的水浸泡6小时,70℃提取3次,第1次浸取2小时,第2次第3次加水各浸提1小时,合并提取液,4000r/min离心15分钟,砂心漏斗过滤。用缓冲液平衡3520吸附柱至pH=4,滤液过3520柱,收集滤出液,40℃减压浓缩至原体积的1/3,4000r/min离心15分钟,收集上清液加3倍体积95%的乙醇,在4℃环境下静置过夜,4000r/min离心15分钟得沉淀物,将沉淀物用75%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤2-3次,4000r/min离心15分钟得到的沉淀物用蒸馏水溶解,使之充分复溶,Sevag法去蛋白,反复多次直至交界处无沉淀出现,将所得溶液去有机溶剂,冷冻干燥得粗多糖;粗多糖溶于水,透析48-72小时,透析液4000r/min离心15分钟,上清液过DEAE-SephadexA-50凝胶柱,依次用H2O,0.1mol/L NaCl,0.2mol/L NaCl,0.3mol/L NaCl洗脱,分别收集高峰部分,经透析,浓缩,冷冻干燥得柘树多糖纯品。
实施例2:
柘树根粉碎,加8倍体积的水浸泡6小时,70℃提取2次,第1次浸取2小时,第2次加水浸提1小时,合并提取液,4000r/min离心15分钟,砂心漏斗过滤。用缓冲液平衡3520吸附柱至pH=4,滤液过3520柱,收集滤出液,40℃减压浓缩至原体积的1/3,4000r/min离心15分钟,收集上清液加3倍体积95%的乙醇,在4℃环境下静置过夜,4000r/min离心15分钟得沉淀物,将沉淀物用75%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤2-3次,4000r/min离心15分钟得到的沉淀物用蒸馏水溶解,使之充分复溶,Sevag法去蛋白,反复多次直至交界处无沉淀出现,将所得溶液去有机溶剂,冷冻干燥得粗多糖;粗多糖溶于水,透析48-72小时,透析液4000r/min离心15分钟,上清液过DEAE-SephadexA-50凝胶柱,依次用H2O,0.1mol/L NaCl,0.2mol/L NaCl,0.3mol/L NaCl洗脱,分别收集高峰部分,经透析,浓缩,冷冻干燥得柘树多糖纯品。

Claims (8)

1、一种提取柘树多糖的方法,包括对原料进行浸泡提取,离心、过滤,合并滤液,滤液过大孔吸附树脂,减压浓缩,醇析,去蛋白,透析及分离纯化。
2、根据权利要求1所述的提取柘树多糖的方法,其特征在于由以下具体步骤构成:
a.柘树根粉碎,加6-8倍体积的水浸泡6小时,70℃分次提取,合并提取液;
b.将上述提取液过滤;
c.将上步滤液过3520大孔吸附树脂以除去黄酮;
d.将上步收集液减压浓缩至原体积的1/3,过滤;
e.将上步的滤液用3倍体积95%的乙醇醇析,在4℃环境下静置12小时;
f.将上步醇析物离心处理,除去上清;
g.将上步所得沉淀物用75%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤,离心15分钟;
h.将上步所得沉淀物用蒸馏水溶解,Sevag法去蛋白,反复多次直至交界处无沉淀出现;
i.将上步所得溶液去有机溶剂,干燥得粗多糖;
j.将粗多糖溶于水,透析48-72小时;
k.将上步透析液离心,上清液过DEAE-SephadexA-50柱,依次用H2O,0.1mol/L NaCl,0.2mol/L NaCl,0.3mol/L NaCl洗脱,分别收集高峰部分;
1.分别将上步收集的溶液透析,浓缩,冷冻干燥得柘树多糖系列纯品。
3、根据权利要求2所述的提取柘树多糖的方法,其特征在于:在a步70℃提取时分2-3次,第1次2小时,第2次1小时,第3次0.5-1小时。
4、根据权利要求2所述的提取柘树多糖的方法,其特征在于:在c步的3520树脂PH=4。
5、根据权利要求2所述的提取柘树多糖的方法,其特征在于:在d步减压浓缩是在40℃-50℃进行。
6、根据权利要求2所述的提取柘树多糖的方法,其特征在于:在g步的沉淀物用75%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤2-3次。
7、根据权利要求2所述的提取柘树多糖的方法,其特征在于:在h步的由氯仿和正丁醇按体积比5∶1构成的Sevag试剂脱蛋白过程是将试剂与溶液按1∶5的体积比加入,加入试剂后震荡20-30分钟,使试剂与溶液充分混合,离心后去除交界处沉淀的蛋白,如此反复多次直至交界处无沉淀出现。
8、根据权利要求2所述的提取柘树多糖的方法,其特征在于:在i步去有机溶剂是在50℃减压浓缩至溶液少量时加入蒸馏水继续浓缩,反复3次。
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