CN102050882A - 一种龙眼蛋白多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种龙眼蛋白多糖，其通过如下方法制备获得：选取龙眼果肉水提物，将龙眼果肉水提物经D301-F阴离子交换树脂除去大部分蛋白质和色素得龙眼粗多糖；将龙眼粗多糖经DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化后洗脱；收集龙眼蛋白多糖洗脱液透析、浓缩和真空冷冻干燥得龙眼蛋白多糖粉末。还公开了上述龙眼蛋白多糖的制备方法及其应用，该龙眼蛋白多糖得率和纯度高，可将龙眼产品深加工应用。
Description
技术领域
本发明属于农产品加工技术领域，具体涉及一种龙眼蛋白多糖及其制备方法和应用。
背景技术
龙眼主要分布于我国的广东、广西、福建和台湾等地，是典型的亚热带经济作物。龙眼是国家卫生部公布的药食两用植物，《本草纲目》中记载有“资益以龙眼为良”，并指出龙眼肉有“开胃健脾，补虚益智”的功效。且龙眼果肉在民间常用于治疗心血不足、心悸怔忡、失眠健忘、贫血、脾虚泄泻等症状。
目前，龙眼多糖的分离制备方法主要为水提醇沉，一般可以通过Sevag法、透析和醇沉等技术去除龙眼果肉水提液中的蛋白质和色素等杂质，提高多糖的纯度。但这些技术需多次重复或较长时间实现多糖的纯化，而且实施多为经验参数，存在多糖损失严重，操作繁琐，生产上难以大规模实施等缺点。如凌雪萍等分离得到的龙眼多糖纯度为80.96％，贾琦等分离得到的龙眼多糖中总糖含量为64.4％，纯度都相对较低，限制了多糖在应用。因此，龙眼多糖的高纯度制备方法还存在较大的技术改进空间。此外，香菇、九里香和红枣等植物来源的蛋白多糖都表现出优异的生物活性，而龙眼蛋白多糖的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种龙眼蛋白多糖，该龙眼多糖纯度高。
本发明的目的还在于提供上述龙眼蛋白多糖的制备方法，该制备方法工艺简单，可以在工业上大规模实施。
本发明的目的还在于提供上述龙眼蛋白多糖在制备具有免疫调节作用的保健食品中的应用。
本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种龙眼蛋白多糖，通过如下方法制备获得：选取龙眼果肉水提物，将龙眼果肉水提物经D301-F阴离子交换树脂除去大部分蛋白质和色素得龙眼粗多糖；将龙眼粗多糖经DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化后洗脱；收集龙眼蛋白多糖洗脱液透析、浓缩和真空冷冻干燥得龙眼蛋白多糖粉末。
本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：上述龙眼蛋白多糖的制备方法，选取龙眼原料先制成龙眼果肉水提物，将龙眼果肉水提物经D301-F阴离子交换树脂除去大部分蛋白质和色素得龙眼粗多糖；将龙眼粗多糖经DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化后洗脱；收集龙眼蛋白多糖洗脱液透析、浓缩和真空冷冻干燥得龙眼蛋白多糖粉末。
上述龙眼蛋白多糖的制备方法可以进一步包括如下步骤：
(1)选取龙眼果肉水提物，在龙眼果肉水提取物中加入水和D301-F阴离子交换树脂，调节溶液的pH值、温度及振荡器的转速，振荡去除龙眼果肉水提物中的大部分蛋白质和色素得龙眼粗多糖溶液，再经浓缩和真空冷冻干燥得龙眼粗多糖粉末；
(2)在龙眼粗多糖粉末中加入水、离心后取上清液，采用DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化后用NaCl溶液洗脱，并采用苯酚硫酸法监测洗脱液中的龙眼蛋白多糖，至NaCl洗脱液呈阴性；
(3)收集龙眼蛋白多糖洗脱液透析、浓缩和真空冷冻干燥得龙眼蛋白多糖粉末。
在上述制备方法中：
步骤(1)中所述的龙眼果肉水提物通过如下步骤制备获得：选择新鲜龙眼原料，烘干，除去皮及核，粉碎，得龙眼果肉；在龙眼果肉中加入30-40倍重量的水，加热至70-80℃，置于200-300W的超声波强度下浸提30-50min，取消超声继续浸提100-120min；浸提液经过滤与果肉残渣分离后，60-70℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼果肉水提物。
步骤(1)中水的用量为龙眼果肉提取物的20-30倍，所述D301-F阴离子交换树脂的用量为龙眼果肉水提取物的3-4倍，调节溶液pH值为5.0-6.0，温度为45-55℃，调节振荡器转速为100-120r/min振荡2-3h。分离溶液于55-65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼粗多糖。
步骤(1)中所述的D301-F阴离子交换树脂需经预处理，预处理过程为：先经水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，再用重量百分含量为4-5％的NaCl溶液浸泡3-4h后水洗；接着用重量百分含量为4-5％的NaOH溶液浸泡3-4h，水洗至pH值为7.0-8.0，最后50-55℃烘干备用。
步骤(2)中DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化的条件为：所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱的有效柱体积为30-210mL，所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱有效交换容积即多糖/有效柱体积约为1.0mg/mL；所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱的有效柱体积与进样溶液体积比值为6.0-8.0∶1；去离子水清洗体积与所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱有效柱体积比为2-3∶1；洗脱液流速(mL/min)与有效柱体积(L)的比值为1∶3-4。
所述的DEAE-52纤维素离子交换层析柱需经预处理，所述的预处理过程是：DEAE-52填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质；用0.4-0.5mol/L NaOH溶液浸泡30-40min，水洗至近中性pH值；用0.4-0.5mol/L HCl溶液浸泡30-40min，水洗至近中性pH值；用0.4-0.5mol/LNaOH溶液浸泡30-40min，水洗至近中性pH值，采用湿法装柱即得OH-型DEAE-52纤维素离子交换层析柱。
步骤(3)中所述的透析过程为：将龙眼蛋白多糖洗脱液加入截留分子量为8000的再生纤维素透析袋中，浸没于流动自来水中2-4天及去离子水中2-4天，每天换水2-4次，收集透析液；步骤(3)中所述的浓缩和真空冷冻干燥过程为：将透析液在55-65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得粉末状龙眼多糖。
本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的：上述龙眼蛋白在制备具有免疫调节作用的保健食品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
①.本发明对制备的龙眼粗多糖进行纯化分级，得到的高纯度的蛋白多糖。在此条件下，龙眼蛋白多糖得率为21.89％，纯度高达99.66％，多糖与蛋白含量比约为16.8∶1，单糖组成包括核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖；
②.本发明有针对性地分离制备龙眼多糖的免疫调节活性功能因子(即蛋白多糖)为龙眼的精深加工开拓了新的途径。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
图1是实施例1中制备的龙眼蛋白多糖的洗脱曲线图；
图2是实施例2中制备的龙眼蛋白多糖的洗脱曲线图；
图3是实施例3中制备的龙眼蛋白多糖的洗脱曲线图；
图4是龙眼蛋白多糖的凝胶柱层析结果图。
具体实施方式
第一部分：龙眼蛋白多糖的分离制备方法
实施例1
选择新鲜龙眼原料，烘干，除去皮及核，粉碎，得龙眼果肉；在龙眼果肉中加入30倍重量的水，加热至80℃，置于300W的超声波强度下浸提30min，取消超声继续浸提120min；浸提液经过滤与果肉残渣分离后，60℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼果肉水提物。
D301-F阴离子交换树脂先经水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，再用重量百分含量为4％的NaCl溶液浸泡4h后水洗；接着用重量百分含量为4％的NaOH溶液浸泡4h，水洗至近中性pH值，最后50℃烘干备用。
将龙眼果肉提取物溶于20倍重量的水，加入3倍龙眼果肉水提取物重量的D301-F阴离子交换树脂，调节溶液pH值为5.0，温度为55℃，调节振荡器转速为120r/min振荡3h。分离溶液于55℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼粗多糖。
取DEAE-52填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质；用0.4mol/L NaOH溶液浸泡40min，水洗至近中性pH值；用0.4mol/L HCl溶液浸泡40min，水洗至近中性pH值；用0.4mol/L NaOH溶液浸泡40min，水洗至近中性pH值，采用湿法装于2.5×50cm中压层析柱中(有效柱体积约为210mL)，并采用去离子水以0.60mL/min流速平衡1天。
取210mg龙眼粗多糖溶于35mL去离子水中，4500rmp离心10min，取上清液进样；用3倍柱体积的去离子水以0.60mL/min流速洗脱，弃去洗脱液；用0.1mol/L的NaCl溶液以0.60mL/min流速洗脱，采用苯酚硫酸法(280nm吸光值)监测洗脱液中多糖(或蛋白)，从反应呈阳性开始收集洗脱液至反应呈阴性(如附图1所示)；将洗脱液加入截留分子量8000的再生纤维素透析袋中，浸没于流动自来水中2天及去离子水中4天，每天换水2次，收集透析液；透析液在55℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得粉末状龙眼蛋白多糖。
实施例2
选择新鲜龙眼原料，烘干，除去皮及核，粉碎，得龙眼果肉；在龙眼果肉中加入35倍重量的水，加热至75℃，置于250W的超声波强度下浸提40min，取消超声继续浸提110min；浸提液经过滤与果肉残渣分离后，65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼果肉水提物。
D301-F阴离子交换树脂先经水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，再用重量百分含量为4.5％的NaCl溶液浸泡3.5h后水洗；接着用重量百分含量为4.5％的NaOH溶液浸泡3.5h，水洗至近中性pH值，最后52.5℃烘干备用。
将龙眼果肉提取物溶于25倍重量的水，加入3.5倍龙眼果肉水提取物重量的D301-F阴离子交换树脂，调节溶液pH值为5.5，温度为50℃，调节振荡器转速为110r/min振荡2.5h。分离溶液于60℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼粗多糖。
DEAE-52填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质；用0.45mol/L NaOH溶液浸泡35min，水洗至近中性pH值；用0.45mol/L HCl溶液浸泡35min，水洗至近中性pH值；用0.45mol/L NaOH溶液浸泡35min，水洗至近中性pH值，采用湿法装于2.0×40cm中压层析柱中(有效柱体积约为120mL)，并采用去离子水以0.36mL/min流速平衡1天。
取120mg龙眼粗多糖溶于15mL去离子水中，4500rmp离心10min，取上清液进样；先用2.5倍柱体积的去离子以0.36mL/min流速洗脱，弃去洗脱液；再用0.1mol/L的NaCl溶液以0.36mL/min流速洗脱，采用苯酚硫酸法(或280nm吸光值)监测洗脱液中多糖(或蛋白)，从反应呈阳性开始收集洗脱液至反应呈阴性；将洗脱液加入截留分子量8000的再生纤维素透析袋中，浸没于流动自来水中3天及去离子水中3天，每天换水3次，收集透析液；透析液在60℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得粉末状龙眼蛋白多糖。
实施例3
选择新鲜龙眼原料，烘干，除去皮及核，粉碎，得龙眼果肉；在龙眼果肉中加入40倍重量的水，加热至70℃，置于200W的超声波强度下浸提50min，取消超声继续浸提100min；浸提液经过滤与果肉残渣分离后，70℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼果肉水提物。
D301-F阴离子交换树脂先经水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，再用重量百分含量为5％的NaCl溶液浸泡3h后水洗；接着用重量百分含量为5％的NaOH溶液浸泡3h，水洗至近中性pH值，最后55℃烘干备用。
将龙眼果肉提取物溶于30倍重量的水，加入4倍龙眼果肉水提取物重量的D301-F阴离子交换树脂，调节溶液pH值为6.0，温度为45℃，调节振荡器转速为100r/min振荡2h。分离溶液于65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼粗多糖。
DEAE-52填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质；用0.50mol/L NaOH溶液浸泡30min，水洗至近中性pH值；用0.50mol/L HCl溶液浸泡30min，水洗至近中性pH值；用0.50mol/L NaOH溶液浸泡30min，水洗至近中性pH值，采用湿法装于1.5×20cm中压层析柱中(有效柱体积约为30mL)，并采用去离子水以0.12mL/min流速平衡1天。
取30mg龙眼粗多糖溶于4mL去离子水中，4500rmp离心10min，取上清液进样；先用2倍柱体积的去离子以0.12mL/min流速洗脱，弃去洗脱液；再用0.1mol/L的NaCl溶液以0.12mL/min流速洗脱，采用苯酚硫酸法(或280nm吸光值)监测洗脱液中多糖(或蛋白)，从反应呈阳性开始收集洗脱液至反应呈阴性；将洗脱液加入截留分子量8000的再生纤维素透析袋中，浸没于流动自来水中4天及去离子水中2天，每天换水4次，收集透析液；透析液在65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得粉末状龙眼蛋白多糖。
第二部分本发明龙眼蛋白多糖的成分分析
2.1、试验条件
2.11样品实施例1中制备的龙眼蛋白多糖粉末。
2.1.2方法(1)龙眼蛋白多糖的鉴定采用凝胶柱层析法；(2)龙眼蛋白多糖的组成测定：多糖测定采用苯酚硫酸法；单糖组成采用GC-MS测定；水解氨基酸组成采用HPLC测定。
2、试验结果
(1)龙眼蛋白多糖的凝胶柱层析结果如附图4所示，图中多糖峰和蛋白峰所对应的洗脱体积一致，与离子交换层析柱的结果一致，可判定样品为多糖-蛋白复合物。
(2)龙眼蛋白多糖的组成如表1所示，龙眼蛋白多糖中多糖与蛋白含量比值约为16.8，单糖组成包括核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。
表1龙眼蛋白多糖的组成
第三部分本发明龙眼蛋白多糖的药效试验
3.1、试验条件
3.11样品本发明实施例1中制备的龙眼蛋白多糖粉末。
3.1.2实验动物及细胞成年雄性KM小鼠，体重36-40g，SPF级，由南方医科大学实验动物中心提供。YAC-1淋巴瘤细胞株由中山大学实验动物中心提供。
3.1.3方法
(1)淋巴细胞增殖实验
常规分离小鼠脾淋巴细胞，采用MTT法检测龙眼蛋白多糖对正常/ConA诱导/LPS诱导的淋巴增殖体系的影响。
(2)NK细胞杀伤活性实验
常规分离小鼠脾淋巴细胞，采用MTT法检测龙眼蛋白多糖对NK细胞杀伤YAC-1细胞活性的影响。
(3)巨噬细胞吞噬功能实验
常规分离并纯化小鼠腹腔巨噬细胞，采用中性红吞噬指数检测龙眼蛋白多糖对巨噬细胞吞噬功能的影响。
1.4数据分析
采用SPSS软件进行数据统计分析。
3.2、试验结果
龙眼蛋白多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖、NK细胞杀伤活性和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响见下表2：
表2龙眼蛋白多糖对小鼠免疫细胞的影响
注：同一免疫指标中的不同小写英文字母表示005水平显著差异；淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬的活性水平均以570nm OD值表征，NK细胞活性(％)＝[靶细胞对照孔OD-(实验孔OD-效应细胞对照孔OD)]/靶细胞对照孔OD×100％。
试验结果表明：
(1)龙眼蛋白多糖在100-400μg/mL剂量范围内能显著增强小鼠脾淋巴细胞增殖(P＜0.05)，以100和200μg/mL剂量效果最佳，且两者无显著差异(P＞0.05)。
(2)龙眼蛋白多糖在100-400μg/mL剂量范围内能显著增强小鼠NK细胞杀伤活性(P＜0.05)，以100和200μg/mL剂量效果最佳，且两者无显著差异(P＞0.05)。
(3)龙眼蛋白多糖在100-400μg/mL剂量范围内能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能(P＜0.05)，且量效关系呈一定正相关性。
综上，龙眼蛋白多糖在100-400μg/mL剂量范围内表现出良好的体外免疫调节活性，可应用于免疫调节作用相关的保健食品研制中。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种龙眼蛋白多糖，其特征是：通过如下方法制备获得：选取龙眼果肉水提物，将龙眼果肉水提物经D301-F阴离子交换树脂除去大部分蛋白质和色素得龙眼粗多糖；将龙眼粗多糖经DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化后洗脱；收集龙眼蛋白多糖洗脱液透析、浓缩和真空冷冻干燥得龙眼蛋白多糖粉末。
2.一种权利要求1所述的龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征是：选取龙眼果肉水提物，将龙眼果肉水提物经D301-F阴离子交换树脂除去大部分蛋白质和色素得龙眼粗多糖；将龙眼粗多糖经DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化后洗脱；收集龙眼蛋白多糖洗脱液透析、浓缩和真空冷冻干燥得龙眼蛋白多糖粉末。
3.根据权利要求2所述的龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征是：包含以下步骤：
(1)取龙眼果肉水提物，加入水和D301-F阴离子交换树脂，调节溶液的pH值、温度及振荡器的转速，振荡去除龙眼果肉水提物中的大部分蛋白质和色素得龙眼粗多糖溶液，再经浓缩和真空冷冻干燥得龙眼粗多糖粉末；
(2)在龙眼粗多糖粉末中加入水、离心后取上清液，采用DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化后用NaCl溶液洗脱，并采用苯酚硫酸法监测洗脱液中的龙眼蛋白多糖，至NaCl洗脱液呈阴性；
(3)收集龙眼蛋白多糖洗脱液透析、浓缩和真空冷冻干燥得龙眼蛋白多糖粉末。
4.根据权利要求3所述的龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征是：步骤(1)中所述的龙眼果肉水提物通过如下步骤制备获得：选择新鲜龙眼原料，烘干，除去皮及核，粉碎，得龙眼果肉；在龙眼果肉中加入30-40倍重量的水，加热至70-80℃，置于200-300W的超声波强度下浸提30-50min，取消超声继续浸提100-120min；浸提液经过滤与果肉残渣分离后，60-70℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼果肉水提物。
5.根据权利要求3所述的龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征是：步骤(1)中水的用量为龙眼果肉提取物的20-30倍，所述D301-F阴离子交换树脂的用量为龙眼果肉水提取物的3-4倍，所述龙眼粗多糖粉末的具体提取过程是：调节溶液pH值为5.0-6.0，温度为45-55℃，调节振荡器转速为100-120r/min振荡2-3h后，分离溶液于55-65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼粗多糖。
6.根据权利要求3所述的龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征是：步骤(1)中所述的D301-F阴离子交换树脂需经预处理，预处理过程为：先经水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，再用重量百分含量为4-5％的NaCl溶液浸泡3-4h后水洗；接着用重量百分含量为4-5％的NaOH溶液浸泡3-4h，水洗至pH值为7.0-8.0，最后50-55℃烘干备用。
7.根据权利要求3所述的龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征是：步骤(2)中DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化的条件为：所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱的有效柱体积为30-210mL，所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱有效交换容积即多糖/有效柱体积为1mg/mL；所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱的有效柱体积与进样溶液体积比值为6.0-8.0∶1；去离子水清洗体积与所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱有效柱体积比为2-3∶1；洗脱液流速与有效柱体积的比值为1∶3-4。
8.根据权利要求3所述的龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征是：步骤(2)中所述的DEAE-52纤维素离子交换层析柱需经预处理，所述的预处理过程是：将DEAE-52填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质；用0.4-0.5mol/L NaOH溶液浸泡30-40min，水洗至中性；用0.4-0.5mol/L HCl溶液浸泡30-40min，水洗至中性；用0.4-0.5mol/L NaOH溶液浸泡30-40min，水洗至中性，采用湿法装柱即得OH-型DEAE-52纤维素离子交换层析柱。
9.根据权利要求3所述的龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征是：步骤(3)中所述的透析过程为：将龙眼蛋白多糖洗脱液加入截留分子量为8000的再生纤维素透析袋中，浸没于流动自来水中2-4天及去离子水中2-4天，每天换水2-4次，收集透析液；步骤(3)中所述的浓缩和真空冷冻干燥过程为：将透析液在55-65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得粉末状龙眼多糖。
10.权利要求1所述的龙眼蛋白在制备具有免疫调节作用的保健食品中的应用。
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| CN101433620A (zh) * | 2008-12-10 | 2009-05-20 | 广东省农业科学院农业生物技术研究所 | 一种龙眼水溶性活性物质及其提取方法和应用 |
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2010
- 2010-12-24 CN CN2010106036598A patent/CN102050882B/zh active Active
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