CN104865333A - 一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法 - Google Patents
一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104865333A CN104865333A CN201510245943.5A CN201510245943A CN104865333A CN 104865333 A CN104865333 A CN 104865333A CN 201510245943 A CN201510245943 A CN 201510245943A CN 104865333 A CN104865333 A CN 104865333A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- longan
- proteoglycan
- protein polysaccharide
- polysaccharide
- meat protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
本发明公开了一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法，包括龙眼肉蛋白多糖的制备、龙眼肉蛋白多糖的纯品制备、荧光标记龙眼肉蛋白多糖的纯品制备、龙眼肉蛋白多糖的检测。异硫氰酸荧光素能特异结合龙眼肉蛋白多糖分子中的结合蛋白，保障了定量检测的可行性和检测目标的专一性，采用高效分子排阻色谱结合荧光检测器分析检测龙眼肉蛋白多糖，在1～200μg/mL的浓度范围内线性关系良好，能实现龙眼蛋白多糖的定量分析，最低检出限为0.25μg/mL，最低定量限为0.85μg/mL；同时结合峰响应的保留时间，能有效表征蛋白多糖的分子量分布，达到对目标物质的定性分析。本发明不仅能同时实现蛋白多糖的定性、定量检测，而且方法检出限低、灵敏度高、专一性强。
Description
技术领域
本发明属于食品检测领域，尤其涉及一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法。
背景技术
龙眼(Dimocarpus longan Lour.)俗称桂圆，属于无患子科龙眼属常绿乔木，主要的商业种植在中国、泰国和越南。我国龙眼的种质资源丰富，种植面积和产量均居世界首位。由于龙眼果实采收季节性强且贮藏保鲜难度大，鲜果约70％在产地鲜销，其余主要加工为干果、果脯和果汁等，经济附加值较低。精深加工对龙眼产业的高效、持续发展十分迫切。
作为卫生部法定的药食同源水果，龙眼在我国民间和传统中医中多用于治疗或改善气血不足、心悸怔忡、失眠健忘、贫血、脾虚泄泻等症状，其功能活性成分的研究开发在食品、生物和医药领域引起广泛关注。蛋白多糖是重要的生物大分子，在现代药理学研究中表现出免疫调节、抗肿瘤、抗氧化和抗炎症等多种功能活性。龙眼干果肉中蛋白多糖含量高达35％，碳水化合物部分主要由(1→6)-α-D-Glcp、(1→4)-β-D-Manp、(1→4)-β-D-Rhap和(1→5)-α-L-Araf等糖苷键组成，结合蛋白含量约5％。蛋白多糖是龙眼肉免疫调节的主要物质基础，能显著增强免疫抑制和正常小鼠的免疫系统功能，并能在体外直接刺激脾淋巴细胞和巨噬细胞活化。龙眼肉蛋白多糖作为天然免疫调节功能因子具有广阔的开发利用前景。目前关于龙眼肉蛋白多糖的研究主要集中在提取分离、结构解析和活性评价，而对于其定量和定性检测方法研究则未见报道。
现有技术存在的问题是：
(1)传统的蛋白多糖定量检测方法是通过苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法测定其多糖含量，再换算相应蛋白多糖含量。该类化学分光光度法方法虽然操作简单，但极易受还原糖、低聚糖和其他多糖存在的干扰，而常用的样品处理方法(如醇沉法和凝胶层析法等)也很难消除相近分子量的高分子碳水合物的干扰。
(2)传统的蛋白多糖定性检测方法主要通过分子排阻色谱和示差检测器相结合测定其分子量分布，该方法需要较高的目标物质浓度(即检出限低)，且相近分子量的高分子物质都可能对检测造成干扰。
(3)关于龙眼肉蛋白多糖的定性定量检测方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法，旨在解决现有的蛋白多糖的定性定量检测方法检出限高、灵敏度低、专一性不强的问题。
本发明是这样实现的，一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法包括：
步骤一、取龙眼干果肉，加蒸馏水进行匀浆处理，龙眼肉匀浆保温浸提后，抽滤分离滤液；滤液浓缩后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于蒸馏水中低温透析；透析袋内溶液真空浓缩后冷冻干燥，得到龙眼粗蛋白多糖粉末；
步骤二、取龙眼粗蛋白多糖溶于蒸馏水中，充分溶解后离心后取上清液加入Sephadex G-100凝胶柱中，并以蒸馏水洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，测定洗脱液在280nm处的吸光值以表征其蛋白含量，收集合并同时出现多糖和蛋白信号的洗脱液，冷冻干燥得到龙眼肉蛋白多糖的纯品；
步骤三、取龙眼粗蛋白多糖溶于碳酸钠缓冲液中，加入异硫氰酸荧光素，于室温下避光搅拌反应，反应结束后，离心取上清液加入Sephadex G-100凝胶柱中，并以蒸馏水洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，并分别测定洗脱液在280nm和489.5nm处的吸光值以表征其蛋白和荧光素含量，收集合并同时出现多糖、蛋白和荧光素信号的洗脱液，冷冻干燥得到荧光标记龙眼肉蛋白多糖的纯品；
步骤四、采用硝酸钠溶液配制系列浓度的荧光标记龙眼肉蛋白多糖样液，分别经0.45μm微孔滤膜过滤后采用液相色谱仪结合荧光检测器分析，进行荧光标记龙眼肉蛋白多糖的标准曲线测定；
步骤五、以多糖浓度与峰面积对数对建立标准曲线进行定量分析，以响应峰的保留时间进行分子量的定性分析。
进一步，步骤一所述的龙眼肉匀浆在90℃下保温浸提2小时。
进一步，步骤一所述的滤液在60℃下真空浓缩后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于大量4℃蒸馏水中低温透析12小时。
进一步，在步骤三中，龙眼粗蛋白多糖溶于0.5mol/L的pH为8.3的碳酸钠缓冲液中，加入异硫氰酸荧光素后于室温下避光搅拌反应24小时。
进一步，步骤四中采用0.1mol/L的硝酸钠溶液配制系列浓度为0.5–200μg/mL的多糖样液。
异硫氰酸荧光素(FITC)能特异结合龙眼肉蛋白多糖分子中的结合蛋白，赋予蛋白多糖稳定的荧光特征，保障了定量检测的可行性和检测目标的专一性。采用高效分子排阻色谱结合荧光检测器(HPSEC-FD)分析检测龙眼肉蛋白多糖：结合蛋白多糖浓度和峰面积对数建立标准曲线，在1～200μg/mL的浓度范围内线性关系良好，能实现龙眼蛋白多糖的定量分析，最低检出限为0.25μg/mL，最低定量限为0.85μg/mL；同时结合峰响应的保留时间，能有效表征蛋白多糖的分子量分布，达到对目标物质的定性分析。本发明的方法不仅能同时实现蛋白多糖的定性定量检测，而且方法检出限低、灵敏度高、专一性强。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法流程图；
图2是本发明实施例提供的标记前的龙眼肉蛋白多糖的凝胶过滤层析图；
图3是本发明实施例提供的标记后的龙眼肉蛋白多糖的凝胶过滤层析图；
图4是本发明实施例提供的荧光标记龙眼蛋白多糖检测的标准曲线；
图5是本发明实施例提供的龙眼肉蛋白多糖及其荧光标记物的HPSEC-FD色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
请参阅图1至图5：
本发明是这样实现的，一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法包括：
S101、取50g龙眼干果肉，加入400mL蒸馏水进行匀浆处理；龙眼肉匀浆在90℃下保温浸提2h后，抽滤分离滤液；滤液在60℃下真空浓缩至约100mL后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于大量4℃蒸馏水中低温透析12h；透析袋内溶液经60℃下真空浓缩至约50mL后冷冻干燥，得到龙眼粗蛋白多糖粉末；
S102、取150mg龙眼粗蛋白多糖溶于10mL蒸馏水中，在4500r/min的转速下充分离心10min，溶解后离心取上清液3mL，以0.3mL/min的流速加入1.6cm×50cm的Sephadex G-100凝胶柱中，并以蒸馏水在0.3mL/min流速下洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，测定洗脱液在280nm处的吸光值以表征其蛋白含量，收集合并同时出现多糖和蛋白信号的洗脱液，冷冻干燥得到龙眼肉蛋白多糖的纯品；
S103、取150mg龙眼粗蛋白多糖溶于10mL 0.5mol/L的pH为8.3的碳酸钠缓冲液中，加入10mg FITC，于室温下避光搅拌反应24h。反应结束后，在4500r/min的转速下离心10min，取上清液3mL，以0.3mL/min的流速加入1.6cm×50cm的Sephadex G-100凝胶柱中，并以蒸馏水在0.3mL/min流速下洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，并分别测定洗脱液在280和489.5nm处的吸光值以表征其蛋白和荧光素含量，收集合并同时出现多糖、蛋白和荧光素信号的洗脱液，冷冻干燥得到荧光标记龙眼肉蛋白多糖的纯品；
S104、采用0.1mol/L的硝酸钠溶液配制系列浓度0.5–200μg/mL的多糖样液，分别经0.45μm微孔滤膜过滤后自动进样检测；
检测条件为：
检测条件：采用高效液相色谱仪结合荧光检测器分析，色谱柱为Ultrahydrogel 1000凝胶色谱柱(7.8mm×300mm，Waters)。色谱分析条件为：流动相，0.10mol/L硝酸钠；流速，0.5mL/min；柱温，35℃；荧光检测器，λex 490nm，λem 518nm；进样量，25μL；
S105、以多糖浓度与峰面积对数对建立标准曲线进行定量分析，以响应峰的保留时间进行分子量的定性分析。
异硫氰酸荧光素(FITC)能特异结合龙眼肉蛋白多糖分子中的结合蛋白，赋予蛋白多糖稳定的荧光特征，保障了定量检测的可行性和检测目标的专一性。采用高效分子排阻色谱结合荧光检测器(HPSEC-FD)分析检测龙眼肉蛋白多糖：结合蛋白多糖浓度和峰面积对数建立标准曲线，在1～200μg/mL的浓度范围内线性关系良好(R2＝0.998，最低检出限为0.25μg/mL，最低定量限为0.85μg/mL)，能实现龙眼蛋白多糖的定量分析；同时结合峰响应的保留时间，能有效表征蛋白多糖的分子量分布，达到对目标物质的定性分析。故本发明的方法不仅能同时实现蛋白多糖的定性定量检测，而且方法检出限低、灵敏度高、专一性强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法包括：
步骤一、取龙眼干果肉，加蒸馏水进行匀浆处理，龙眼肉匀浆保温浸提后，抽滤分离滤液；滤液浓缩后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于蒸馏水中低温透析；透析袋内溶液真空浓缩后冷冻干燥，得到龙眼粗蛋白多糖粉末；
步骤二、取龙眼粗蛋白多糖溶于蒸馏水中，充分溶解后离心后取上清液加入Sephadex G-100凝胶柱中，并以蒸馏水洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，测定洗脱液在280nm处的吸光值以表征其蛋白含量，收集合并同时出现多糖和蛋白信号的洗脱液，冷冻干燥得到龙眼肉蛋白多糖的纯品；
步骤三、取龙眼粗蛋白多糖溶于碳酸钠缓冲液中，加入异硫氰酸荧光素，于室温下避光搅拌反应，反应结束后，离心取上清液加入Sephadex G-100凝胶柱中，并以蒸馏水洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，并分别测定洗脱液在280nm和489.5nm处的吸光值以表征其蛋白和荧光素含量，收集合并同时出现多糖、蛋白和荧光素信号的洗脱液，冷冻干燥得到荧光标记龙眼肉蛋白多糖的纯品；
步骤四、采用硝酸钠溶液配制系列浓度的荧光标记龙眼肉蛋白多糖样液，分别经0.45μm微孔滤膜过滤后采用液相色谱仪结合荧光检测器分析，进行荧光标记龙眼肉蛋白多糖的标准曲线测定；
步骤五、以多糖浓度与峰面积对数对建立标准曲线进行定量分析，以响应峰的保留时间进行分子量的定性分析。
2.如权利要求1所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，步骤一所述的龙眼肉匀浆在90℃下保温浸提2小时。
3.如权利要求1所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，步骤一所述的滤液在60℃下真空浓缩后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于大量4℃蒸馏水中低温透析12小时。
4.如权利要求1所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，在步骤三中，龙眼粗蛋白多糖溶于0.5mol/L的pH为8.3的碳酸钠缓冲液中，加入异硫氰酸荧光素后于室温下避光搅拌反应24小时。
5.如权利要求1所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，步骤四中采用0.1mol/L的硝酸钠溶液配制系列浓度为0.5–200μg/mL的多糖样液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510245943.5A CN104865333B (zh) | 2015-05-14 | 2015-05-14 | 一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510245943.5A CN104865333B (zh) | 2015-05-14 | 2015-05-14 | 一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104865333A true CN104865333A (zh) | 2015-08-26 |
| CN104865333B CN104865333B (zh) | 2016-08-24 |
Family
ID=53911311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510245943.5A Expired - Fee Related CN104865333B (zh) | 2015-05-14 | 2015-05-14 | 一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104865333B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105194048A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-30 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法 |
| CN109030445A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-12-18 | 广东药科大学 | 一种测定壳寡糖含量的方法 |
| CN110132680A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-08-16 | 山东大学 | 一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2286799A2 (en) * | 2000-03-24 | 2011-02-23 | Biosphere Medical, Inc. | Microspheres for active embolization |
| CN102050882A (zh) * | 2010-12-24 | 2011-05-11 | 广东省农业科学院农业生物技术研究所 | 一种龙眼蛋白多糖及其制备方法和应用 |
| CN102070724A (zh) * | 2010-12-24 | 2011-05-25 | 广东省农业科学院农业生物技术研究所 | 一种中性龙眼多糖级分的分离方法 |
| CN102775513A (zh) * | 2012-08-24 | 2012-11-14 | 广西医科大学 | 磷酸酯化龙眼肉多糖及其合成方法 |
| CN103301290A (zh) * | 2013-06-25 | 2013-09-18 | 广西医科大学 | 复方龙眼多糖免疫固本方剂及其制备方法 |
-
2015
- 2015-05-14 CN CN201510245943.5A patent/CN104865333B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2286799A2 (en) * | 2000-03-24 | 2011-02-23 | Biosphere Medical, Inc. | Microspheres for active embolization |
| CN102050882A (zh) * | 2010-12-24 | 2011-05-11 | 广东省农业科学院农业生物技术研究所 | 一种龙眼蛋白多糖及其制备方法和应用 |
| CN102070724A (zh) * | 2010-12-24 | 2011-05-25 | 广东省农业科学院农业生物技术研究所 | 一种中性龙眼多糖级分的分离方法 |
| CN102775513A (zh) * | 2012-08-24 | 2012-11-14 | 广西医科大学 | 磷酸酯化龙眼肉多糖及其合成方法 |
| CN103301290A (zh) * | 2013-06-25 | 2013-09-18 | 广西医科大学 | 复方龙眼多糖免疫固本方剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| YANG YI等: "Physicochemical characteristics and immunomodulatory activities of three polysaccharide-protein complexes of Longan Pulp", 《MOLECULES》, vol. 16, 21 July 2011 (2011-07-21), pages 6148 - 6164 * |
| 康迪等: "荧光标记法测定大鼠血浆中海胆黄多糖研究", 《药物生物技术》, vol. 19, no. 4, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 343 - 347 * |
| 陈忱等: "枸杞多糖的组成分析及其荧光标记研究", 《时珍国医国药》, vol. 25, no. 10, 31 December 2014 (2014-12-31), pages 2312 - 2315 * |
| 黄岛平等: "高效液相色谱法测定龙眼肉多糖的单糖组成", 《广西科学院学报》, vol. 26, no. 3, 31 August 2010 (2010-08-31), pages 234 - 236 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105194048A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-30 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法 |
| CN105194048B (zh) * | 2015-10-22 | 2018-12-21 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法 |
| CN109030445A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-12-18 | 广东药科大学 | 一种测定壳寡糖含量的方法 |
| CN110132680A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-08-16 | 山东大学 | 一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用 |
| CN110132680B (zh) * | 2019-06-05 | 2020-06-30 | 山东大学 | 一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104865333B (zh) | 2016-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106872233B (zh) | 一种5-羟甲基糠醛-半胱氨酸加合物及其制备方法与应用和检测方法 | |
| CN104865333A (zh) | 一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法 | |
| CN105037577B (zh) | 一种促凝血黑莓籽多糖及其提取分离方法、应用 | |
| CN102676613A (zh) | 一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法 | |
| Fan et al. | Purification, composition and antioxidant activity of polysaccharides from wolfberry, cherry, kiwi and cranberry fruits | |
| CN101957347B (zh) | 一种食用菌中单糖、寡糖的检测方法 | |
| CN109400753A (zh) | 大鲵软骨制剂 | |
| CN104387493B (zh) | 一种采用逆流色谱技术一步纯化大蒜多糖的方法 | |
| CN102286588B (zh) | 甲鱼肽的制备方法 | |
| Imam et al. | Extraction of an antidiabetic polysaccharide from seeds of Ocimum basilicum and determination of the monosaccharide composition by precolumn high-efficiency capillary electrophoresisa | |
| CN104250286A (zh) | 一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽及其制备方法和用途 | |
| CN103467618A (zh) | 一种虫草菌丝体多糖分离纯化的方法 | |
| CN112358553B (zh) | 一种多糖sm-0.2m及其制备的抗肿瘤产品 | |
| CN103352065A (zh) | 一种怀山药抗氧化多肽及其制备方法 | |
| CN102372765B (zh) | 菲律宾蛤仔酶解多肽的制备方法 | |
| CN104293871A (zh) | 一种制备紫菜抗氧化肽及副产物综合利用的方法 | |
| CN116987204A (zh) | 一种均一银耳多糖的制备方法 | |
| CN110551233B (zh) | 一种广东紫珠多糖及其提取方法和用途 | |
| CN104744601A (zh) | 一种阿魏菇多糖提取与纯化的方法 | |
| CN102495169A (zh) | 一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法 | |
| CN102827305A (zh) | 一种具有减少泡沫细胞脂质积累的杏鲍菇多糖及其制备方法 | |
| CN101962402A (zh) | 一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN108048518B (zh) | 鸡血球抗氧化肽及其酶解制备方法 | |
| CN105648004A (zh) | 赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法 | |
| CN113564219B (zh) | 活性海星肽的分离纯化方法、活性海星肽及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160824 Termination date: 20210514 |